Plataforma bioanalítica híbrida basada en cultivos celulares 3D para imagen óptica utilizando esponjas de fibroína de seda

Resumen

El artículo describe una metodología sencilla, accesible y reproducible para la producción y cultivo de andamios de seda de células de cáncer de mama 4T1-iRFP720 bajo condiciones de flujo controlado, con el fin de apoyar el cultivo dinámico. El crecimiento y migración celular se evaluaron como prueba de concepto utilizando un instrumento de imagen óptica in vivo como principal lectura no invasiva.

Resumen

Presentamos una innovadora plataforma híbrida bioanalítica diseñada para la evaluación preclínica de características celulares. El sistema combina un cultivo celular tridimensional (3D) cultivado sobre una matriz extracelular artificial con una configuración de matriz inspirada en cromatografía. Las esponjas, hechas de la proteína estructural seda fibroína, sirven tanto como matriz extracelular biomimética como como fase estacionaria. Las esponjas de fibroína de seda se producían internamente mediante un proceso de varios pasos que implicaba la eliminación de proteínas inherentes de sericina de fibras de seda crudas, seguida de disolución y diálisis para purificar la solución de fibroína, disolución en disolvente orgánico y posterior fundición en lecho salino para generar esponjas a base de seda con porosidad y porosidad controlada de 500–800 μm. Las líneas celulares de cáncer de mama modificadas genéticamente 4T1-iRFP720 y 4T1-wt (control no fluorescente) se cultivaron en andamios de seda utilizando un flujo continuo de medio mediante una bomba, y su crecimiento y características celulares se analizaron de forma no invasiva mediante técnicas de imagen óptica (instrumento de imagen óptica in vivo ). Al combinar las principales ventajas de los sistemas cromatográficos (automatización, reproducibilidad) con la relevancia biológica de cultivos celulares 3D avanzados, la plataforma permite el modelado in vitro de la arquitectura y morfología tisular, facilitando al mismo tiempo el monitoreo del comportamiento celular dinámico. Paralelamente, la aplicación de tecnología de imagen médica permite un monitoreo en tiempo real y prolongado de la migración y crecimiento celular, entre otros factores. Este enfoque ofrece un potencial considerable para investigar comportamientos celulares a escala macroscópica en un sistema de flujo similar a laminar. Al mejorar la relevancia fisiológica de los modelos in vitro , este método puede ayudar a cerrar la brecha traslacional hacia los estudios in vivo y es coherente con el marco reducir, reemplazar, refinar (3R) para la experimentación con animales.

Introducción

En los tejidos vivos, la migración y el crecimiento celular ocurren dentro de una matriz extracelular (ECM) tridimensional y heterogénea, guiada por señales biofísicas y bioquímicas, como el flujo intersticial de fluidos y las interacciones célula-célula. Estos factores regulan la polaridad celular, la mecanotransducción y el movimiento coordinado, sustentando procesos biológicos clave como la reparación tisular y la invasión del cáncer 1,2,3,4.

A pesar de su importancia, la mayoría de los ensayos de migración in vitro, como los de scratch y Transwell, evalúan el movimiento de células individuales en sustratos planos y estáticos. Aunque simples y rentables, estos enfoques 2D reproducen mal las características estructurales y dinámicas del microambiente^{in vivo 5,6}. Esta limitación se vuelve especialmente crítica en el contexto de la metástasis cancerosa, donde las células tumorales migran colectivamente a través de matrices tisulares mecánica y químicamente^{diversas 3,7,8}. Aunque los ensayos de scratch 2D siguen siendo populares por ser fáciles de realizar, no reflejan la complejidad del ECM ni los efectos del flujo^{de fluidos 6}. Los enfoques basados en transwell proporcionan lecturas cuantitativas, pero solo en puntos finales fijos, impidiendo la observación continua de la^{migración 6,9}.

Estudios recientes han demostrado que el flujo intersticial mejora el potencial metastásico, mientras que la rigidez y composición de la ECM promueven la transición epitelial-mesenquimalesa y la migración colectiva ^4,10. Sistemas 3D más avanzados, como esferoides y organoides, se aproximan mejor a los entornos ECM nativos; sin embargo, su uso suele estar limitado por la variabilidad, la accesibilidad experimental limitada y las dificultades en el análisis^{estandarizado 11,12}. Las plataformas microfluídicas ofrecen un control superior sobre las condiciones mecánicas y fluídicas, pero su dependencia de métodos y equipos de fabricación especializados limita su uso^{generalizado 13}. Por tanto, recrear estas señales integradas in vitro de manera controlada, accesible, no invasiva y rentable sigue siendo un gran desafío ^5,14.

Para abordar esos retos y cerrar la brecha entre los ensayos 2D convencionales y los complejos modelos in vivo , desarrollamos una plataforma celular 3D sencilla habilitada para flujo basada en un andamiaje de esponja de fibroína de seda. El sistema emplea una esponja de seda con propiedades mecánicas ajustables como andamiaje similar a un ECM. Se seleccionó la seda por su estructura porosa, que permite una perfusión suave y sostiene un flujo intersticial fisiológicamente^{relevante 15}. Su biocompatibilidad y su consolidado uso en ingeniería biomédica y de tejidos lo convierten en un material adecuado para esta aplicación. Una publicación reciente demostró además el potencial de sostenibilidad ambiental y reciclaje del^{andamio 16}. En otro estudio, demostramos además su adaptabilidad a diferentes modalidades de imagen, como la tomografía por emisión^{de positrones 17}. Este trabajo previo sirvió como base para la presente descripción metodológica, en la que nos basamos en el mismo concepto de plataforma en una configuración simplificada basada en imágenes ópticas in vivo . En conjunto, estos estudios demuestran el potencial del sistema para la evaluación basada en imagen multimodal de constructos tisulares modificados y apoyan su uso como plataforma experimental versátil para integrar cultivo in vitro y lecturas relevantes in vivo entre diferentes modelos de células cancerosas.

Como prueba de concepto, cultivamos células de cáncer de mama triple negativas 4T1 marcadas con iRFP720 dentro del andamio bajo dos condiciones de flujo de bajo esfuerzo cortante durante cinco días. La monitorización óptica no invasiva in vivo reveló patrones de crecimiento dirigidos por flujo y cambios significativos en la dinámica de poblaciones celulares en comparación con los controles estáticos. Al enfatizar la simplicidad y reproducibilidad de la ingeniería, este modelo proporciona un puente práctico entre los ensayos 2D y los estudios in vivo , permitiendo a los investigadores examinar, a escala macroscópica y de forma no invasiva, las características celulares mediadas por flujo en un formato fisiológicamente relevante pero accesible. A diferencia de metodologías anteriores que a menudo se basan en análisis destructivos de endpoints o carecen de criterios de siembra estandarizados, este protocolo introduce un marco sistemático para optimizar la producción de andamios y, posteriormente, la siembra y la obtención de imágenes celulares. Este enfoque mejora la robustez experimental y proporciona una visión más completa y longitudinal de la dinámica celular colectiva dentro de matrices 3D, representando un refinamiento significativo respecto a los métodos existentes para monitorizar el crecimiento y la migración.

Protocolo

La primera sección describe la preparación de andamios de fibroína sedosa basándose en trabajos publicados^{previos 16}. Las secciones siguientes describen la optimización de la densidad de siembra celular, la integración del flujo y la imagen óptica para monitorizar el movimiento y crecimiento celular. Este estudio utilizó exclusivamente líneas celulares de cáncer de mama murinos establecidas (4T1-wt y 4T1-iRFP720) y no involucró participantes humanos, muestras de pacientes, tejidos primarios ni animales vivos. De acuerdo con las directrices institucionales y nacionales, no se requería aprobación ética. Una visión general esquemática del flujo de trabajo se muestra en la Figura 1.

1. Preparación de la esponja de fibroína de seda

1. Limpieza y despejado de capullos.
   1. Corta los capullos del gusano de seda Bombyx mori L. usando un bisturí de seguridad.
   2. Retira las larvas y extrae la capa más interna del capullo (capa compacta que rodea directamente la cavidad larval) usando una aguja estándar de disección.
   3. Llena un vaso con 1,6 L de agua destilada doblemente (ddH₂O).
   4. Añade una barra magnética y lleva el agua a ebullición mientras remueves; Cubre el vaso con papel de aluminio para acelerar el calentamiento y reducir la pérdida de agua.
   5. Añade 3,4 g de Na₂CO₃ cuando la temperatura del agua alcance aproximadamente los 70 °C.
   6. Cuando la mezcla empiece a hervir, añade 4 g de capullos preparados en la solución y remueve con una varilla de vidrio.
   7. Hervir los capullos durante 30 minutos, removiendo con una varilla de vidrio cada 10 minutos para asegurar la exposición adecuada.
   8. Retira la seda de la solución y enjuágala varias veces con agua del grifo para eliminar la sericina que queda.
   9. Exprime el exceso de agua y extiende las fibras de seda sobre un plato de papel de aluminio preparado.
   10. Seca las fibras de seda en un horno precalentado a 50 °C hasta que estén completamente secas (aproximadamente 18 horas).
2. Disolución y diálisis
   1. Usa etanol absoluto y_{CaCl 2} anhidro para los siguientes pasos. La matriz de disolución consta de 1 parte de_{CaCl 2}, 2 partes de etanol y 8 partes de ddH₂O. La proporción de seda seca degomada a matriz de disolución es de 1:10 [p/w].
   2. Pesa la seda seca y calcula en consecuencia las cantidades correctas de los componentes para la matriz de disolución.
   3. Llena la cantidad correspondiente de CaCl₂ en un matraz de fondo redondo equipado con una barra de agitación.
   4. Mide la cantidad necesaria de etanol y_{ddH 2O}y combínalos.
   5. Añade la mezcla etanol-ddH_2Oal_{CaCl 2} mientras se remueve.
   6. Instala un aparato de reflujo y calienta la mezcla a 100 °C en un baño de aceite, dejando que el CaCl₂ se disuelva y llevando la mezcla a ebullición.
   7. Cuando la mezcla empiece a hervir, añade la seda seca y caliéntala bajo reflujo durante 45 minutos.
   8. Prepara tubos de diálisis de celulosa de 15 cm de largo y 3,5 kDa enjuagándolos varias veces con agua para rehidratarlos y luego sujeta un extremo enrollado alrededor de una varilla de cristal con un clip de sellado.
   9. Después de hervir, transfiere la solución de seda caliente al tubo y sella el extremo opuesto con un clip, dejando un espacio de 2–3 cm entre el líquido y el clip de sellado, sin ningún tipo de carcasas de aire.
   10. Coloca el tubo de diálisis lleno en un vaso de precipitados de 2 L lleno de ddH₂O y realiza diálisis a temperatura ambiente durante 72 horas, cambiando el agua dos veces al día para asegurar una purificación eficaz.
   11. Centrifuga la solución a 4500 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   12. Vierte suavemente el sobrenadante en tubos de centrífuga sin molestar el pellet, y guarda los tubos a -20 °C.
       NOTA: Llena los tubos de la centrifugadora hasta no más de la mitad de su capacidad y congélalos en posición horizontal.
3. Liofilización
   1. Precalienta la bomba de vacío durante 20 minutos y acciona el liofilizador según las instrucciones del fabricante.
   2. Coloca los tubos de la centrífuga congelados, directamente fuera del congelador, en un matraz de fondo redondo.
   3. Coloca el matraz al liofilizador y liofiliza durante 24 horas.
   4. Hasta que se use de nuevo, guarda la fibroína sedosa liofilizada en un lugar seco a temperatura ambiente.
4. Colada de disolventes y lixiviación de partículas
   1. Añadir la cantidad requerida de seda liofilizada a 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP) en un recipiente de muestra de orina bajo una campana extractora para obtener una solución al 16 % [p/v] con un volumen final de 30 mL, y cerrar el recipiente con una tapa.
      PRECAUCIÓN: El HFIP es corrosivo y perjudicial si se inhala, ingiere o absorbe a través de la piel; Manipula el disolvente en una campana extractora mientras llevas el equipo de protección individual (EPP) adecuado, y evita el contacto con la piel, los ojos y los vapores. En caso de derrame, recoge el líquido utilizando materiales absorbentes y limpia las zonas afectadas. Transfiere los materiales contaminados a contenedores de residuos peligrosos designados.
   2. Sella bien el recipiente y colócalo sobre el agitador orbital a 70 rpm durante 18 horas para que la seda se disuelva.
   3. Tamiza NaCl usando diferentes mallas y reserva la fracción de 500–800 μm.
   4. Rellena una placa de Petri (9 cm de diámetro, 8,5 cm de fondo) con 100 g de sal tamizada (fracción de 500–800 μm), obteniendo una altura de 1,2 cm. Asegúrate de que la superficie esté nivelada de forma uniforme.
   5. Vierte suavemente 25,5 mL de la solución de seda preparada sobre el lecho de sal (porógeno para la formación de poros en esponja).
   6. Cubre la placa de Petri con la tapa y colócala sobre un agitador orbital durante 10 minutos a 70 rpm para una infiltración uniforme de la solución de seda en el lecho de sal.
   7. Incubar la placa de Petri a 37 °C durante 1 hora con la tapa cerrada; después incubar la placa de Petri descubierta a 37 °C durante otras 18 horas.
   8. Para inducir la formación de láminas beta, sumerge el compuesto de seda en un vaso que contenga metanol durante 20 minutos, luego sácalo y sécalo en un horno a 50 °C (aproximadamente 1 hora).
      PRECAUCIÓN: El metanol es altamente tóxico; Maneja en una campana extractora usando el EPI adecuado, evita el contacto con la piel y la exposición al vapor. En caso de derrame, recoge el líquido utilizando materiales absorbentes y limpia las zonas afectadas. Transfiere los materiales contaminados a contenedores designados como residuos tóxicos.
   9. Retira el NaCl de porógeno sumergiendo el compuesto de seda en un vaso que contenga agua tibia del grifo durante al menos 3 horas, con intercambio de agua cada 20–30 minutos hasta que el material alcanza una textura suave y esponjosa, sin partes duras restantes.
   10. Conserva la esponja de seda en etanol al 70% para su desinfección y conservación a corto plazo a 4 °C.
       NOTA: Las soluciones que contenían HFIP se recogieron como residuos solventes halogenados, mientras que los residuos de metanol se eliminaron por separado como residuos orgánicos no halogenados según las directrices de seguridad química institucional. Para la descontaminación posterior al uso, los recipientes y superficies de trabajo expuestos a HFIP o metanol se enjuagaron con un disolvente compatible y se limpiaron con una solución detergente. Los primeros enjuagues y los consumibles contaminados se recogieron como residuos químicos peligrosos.

2. Preparación y equilibrio de andamios de seda

1. Corta esponjas de fibroína de seda usando una punzón de biopsia de 6 mm de diámetro para obtener andamios cilíndricos de 6 mm de diámetro y 12 mm de altura.
   NOTA: Los andamios preparados de esponja de fibroína de seda pueden almacenarse en etanol al 70 % a 4 °C hasta 4 meses; Para almacenamiento prolongado, se recomienda un reemplazo periódico por etanol fresco. Los andamios equilibrados pueden almacenarse en un medio de cultivo celular a 4 °C durante hasta 1 mes.
2. Coloca las muestras en tubos de centrífuga con etanol al 70 % para desinfectarlas.
3. Realiza los siguientes pasos en un gabinete certificado de seguridad biológica para evitar la contaminación.
4. Aspira etanol con una pipeta mientras presionas la esponja con pinzas.
5. Coloca las esponjas en una placa de Petri que contiene 10–20 mL con medios suplementados del Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 para sumergirlas completamente.
6. Intercambia el medio tres veces con un pequeño movimiento entre cada intercambio.
7. Después del tercer lavado, añade material fresco, cierra bien la tapa y envuélvelo con película de parafina.
8. Guarda las esponjas al menos una semana en la nevera a 4 °C antes de usarlas para cultivo celular. Durante este tiempo, intercambia medios de comunicación 4 o 5 veces.
   NOTA: Asegurar la eliminación completa del etanol, ya que el etanol residual es citotóxico y afecta la unión y viabilidad celular.

3. Medición de fondos y optimización de imágenes

1. Transportar tubos de filtración vacíos ópticamente transparentes y tubos de filtración ópticamente transparentes que contienen andamios de seda sin sembrar a la imagen óptica in vivo .
   NOTA: La imagen se realizó mediante una imagen óptica in vivo en modo epifluorescencia 2D.
2. Realizar imágenes en diferentes pares de filtros (excitación: 675 nm, 745 nm; emisión: 720 nm, 800 nm), tiempos de exposición (4–60 s), números de paso (1–8), campo de visión (13,5–22,5 cm) y niveles variables de lámpara (bajo y alto).
3. Evalúa la autofluorescencia mediante imágenes de ambas plataformas bajo condiciones idénticas antes de utilizar andamios con siembra celular.
4. Sustituye la entrada Luer-lock macho por un conector Luer-lock hembra de corte para configuraciones solo de imagen, eliminando artefactos de autofluorescencia de alta intensidad del conector Luer-lock macho. Si los materiales son los mismos para todos los experimentos, este paso solo se requiere una vez.
    

4. Preparación de suspensiones celulares y siembra en andamios de fibroína de seda

NOTA: Realizar todos los pasos posteriores en un armario de seguridad biológica en condiciones estériles, ya que estos procedimientos implican manipular células vivas y muestras que contienen células.

1. Monitorizar regularmente las células murinos de cáncer de mama triple negativas 4T1 tipo (4T1-wt) y 4T1-iRFP720 para detectar contaminación y estabilizar la expresión de iRFP720.
2. Mantener células de cáncer de mama murino triple negativas 4T1-wt y 4T1-iRFP720 en medio RPMI-1640 suplementadas con suero fetal de terneros al 10%, 1% de L-glutamina y 1% de penicilina/estreptomicina al 1% a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂.
3. Las células del paso están aproximadamente en 80% de confluencia usando 0,25% de tripsina-EDTA, siguiendo procedimientos estándar de cultivo aséptico de células.
4. Utiliza números de paso idénticos y condiciones de cultivo para las células 4T1-wt y 4T1-iRFP720 para todos los experimentos comparativos.
5. Prepara una densidad de siembra de celda que va de 5 × 10⁴ a 5 × 10⁷ celdas/mL (correspondiente a un rango de 1 × 10⁴ a 1 × 10⁷ celdas por 200 μL). Preparar las siguientes concentraciones para análisis de imagen para evaluar la intensidad de la señal en diferentes densidades celulares y determinar la concentración óptima: 5 × 10⁴, 3,38 × 10⁵, 6,25 × 10⁵, 1,25 × 10⁶, 2,5 × 10⁶, 3,75 × 10⁶, 5 × 10⁶, 1,25 × 10⁷, 2,5 × 10⁷ y 5 × 10⁷ células/mL.
6. Preparar suspensiones correspondientes de células 4T1-wt en el mismo rango de concentración que las pilas 4T1-iRFP720 para que sirvan como controles no fluorescentes.
7. Colocar andamios individuales (preparados en la Sección 2) en placas de Petri estériles y sin tratar.
   NOTA: Utiliza placas de Petri sin tratar para minimizar la unión celular a la superficie plástica y para promover la unión celular al andamio de seda.
8. Retira el exceso de medio alrededor de cada andamio y del andamio usando una pipeta, teniendo cuidado de no deformar la estructura.
9. Una pipeta de 200 μL de la celda correspondiente suspendida directamente sobre la superficie superior de cada andamio, asegurando que todo el volumen sea absorbido por el andamio.
10. Incubar andamios durante 4 horas a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ sin alterar los platos para permitir la unión celular.
11. Tras 4 horas, transfiere cuidadosamente cada andamio con semillas celulares a un pozo de una placa de 24 pozos que contiene 1 mL de medio completo precalentado.
12. Incubar andamios durante la noche (16–24 horas) a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de_CO2.

5. Montaje de plataformas de calibración con frits

NOTA: Realiza todos los pasos de montaje en un armario de seguridad biológica usando guantes estériles, pinzas estériles y herramientas estériles.

1. Retira los andamios de seda con semillas celulares de las placas de 24 pozos usando pinzas estériles, sosteniendo cada andamio suavemente para evitar la compresión.
2. Inserta un andamio con semilla en la parte inferior de un tubo de extracción en fase sólida ópticamente transparente usando una varilla de empuje estéril en columna.
3. Coloca una frita estéril de polietileno directamente encima del andamio usando la varilla de empuje.
   NOTA: Utilice fritas de polietileno solo durante la optimización de señales, ya que su tamaño de poro es menor que el diámetro de la célula y evita la migración celular o cualquier otro contacto célula-célula. Esto también permite una separación clara de la señal, permitiendo identificar la concentración exacta de la celda correspondiente a cada señal.
4. Repite la secuencia de apilamiento, un andamiaje seguido de un frit, hasta que se hayan insertado cinco andamios con semillas de celdas y cinco frits.
5. Cierra la parte inferior del tubo de filtración con un conector Luer-lock hembra estéril.
6. Cierra la parte superior del tubo de extracción con un conector Luer-lock macho estéril.

6. Optimización de señales mediante instrumento de imagen óptica in vivo utilizando plataformas de calibración con frits (solo una vez para validación del sistema)

1. Transportar plataformas sembradas por células para calibración a la sala de imagen óptica in vivo dentro de una caja oscura hermética para proteger las células fluorescentes del fotoblanqueamiento.
2. Preparar la imagen óptica in vivo según la seguridad institucional y los procedimientos operativos.
3. Colocar plataformas ensambladas con siembra celular en la plataforma de imagen.
4. Adquirir imágenes de epifluorescencia 2D usando excitación a 675 nm y emisión a 720 nm y optimizar los parámetros de imagen, incluyendo el tiempo de exposición, el factor de agrupación y el número f, para lograr la máxima intensidad de señal dentro del rango de detección lineal (véase la Figura Suplementaria 1 y la Figura Suplementaria 2).
5. Incluir al menos un tubo de extracción ópticamente transparente que contenga andamios sembrados con células 4T1-wt a densidades celulares iguales como control de referencia no fluorescente.
6. Adquiere imágenes de todas las muestras usando la misma configuración de adquisición para permitir la comparación cuantitativa de la intensidad de fluorescencia (véase la Figura Suplementaria 3 y la Figura Suplementaria 4).
7. Cuantificar las señales de fluorescencia utilizando software de análisis de imagen óptica in vivo y determinar la densidad óptima de siembra celular (es decir, 5 × 10⁶ celdas por andamiaje) que proporcione la máxima señal sin saturación (véase la Figura Suplementaria 5).
   NOTA: Los ajustes finales del sistema de imagen óptica in vivo se seleccionaron en base a experimentos de optimización para asegurar la adquisición de señales dentro del rango dinámico lineal del sistema, evitando la saturación de la capacidad del andamiaje y manteniendo una relación señal-fondo estable en condiciones experimentales y de control. Según configuraciones optimizadas, semilla todos los biorreactores experimentales con 5 × 10⁶ celdas/andamiaje. Realizar imágenes en modo epifluorescencia 2D con los siguientes ajustes: excitación: 675 nm (ancho de banda 30 nm); Emisión: 720 nm (ancho de banda 20 nm), tiempo de exposición: 10 s, factor de agrupación: 8, número f: 8.

7. Montaje experimental de plataformas (sin frits)

1. Tras la optimización de la señal, semen andamios experimentales con la densidad óptima de celdas determinada (es decir, 5 × 10⁶ celdas/200 μL, véase la sección 4).
2. Montar la plataforma experimental utilizando un total de cinco esponjas de seda: un andamio con semillas celulares y cuatro andamios vacíos sin fritas de polietileno para permitir la comunicación celular.
3. Sella la parte superior del tubo de filtración con un conector Luer-lock macho estéril.
4. Configura el sistema de cultivo para condiciones de cultura estáticas o dinámicas
   1. Cultivo estático: Sella el puerto inferior con un conector estéril hembra Luer-lock. El sistema se coloca entonces en un tubo de centrífuga con una tapa ajustada de forma floja.
      NOTA: Como el Luer-lock macho tiene una abertura, esta configuración permite el intercambio de gases minimizando el riesgo de contaminación. En esta configuración, el medio se intercambia manualmente en la campana una vez al día.
   2. Cultivo dinámico: Conecte el puerto inferior a un tubo estéril y conecte la línea de entrada al Luer-lock macho en el puerto superior para permitir el cultivo por perfusión. Suministrar y eliminar continuamente medios mediante un sistema de bomba peristáltica (Figura suplementaria 6).

8. Cultura dinámica en la plataforma

1. Comienza la desinfección de la bomba y la tubería asociada enjuagando con etanol al 70% al caudal máximo durante 10 minutos.
2. Enjuaga la bomba y el tubo con medio completo estéril durante al menos 10 minutos para eliminar el etanol residual. Sustituye por un medio fresco y continúa la perfusión durante 10 minutos adicionales para asegurar un equilibrio completo del sistema antes de su uso.
   NOTA: Asegúrese de que todos los componentes estén completamente llenos de medio y libres de burbujas de aire antes de la siembra de las celdas.
3. Conecta la entrada macho de Luer-lock (la parte superior) del reactor ensamblado a la línea de salida de la bomba usando tubos estériles y conectores Luer-lock.
4. Conecta la entrada de la bomba a un depósito estéril que contiene un medio completo.
5. Conecta la salida del reactor (inferior) al depósito del medio para establecer un circuito de perfusión de recirculación. Esta configuración permite una perfusión continua del medio a través del andamiaje manteniendo un sistema de lazo cerrado.
   NOTA: En este protocolo, la perfusión se realiza mediante una configuración de recirculación, donde el medio se cicla continuamente entre el yacimiento y el reactor. Este enfoque minimiza el consumo de medio manteniendo el flujo continuo.
6. Ajusta el caudal deseado en la bomba para que apunte a la tensión cortante nominal de pared (por ejemplo, 1 dyn/^{cm 2} y 4 dyn/cm²), usando el radio interno del canal ( = 3 mm) basado en la suposición del flujo de Poiseuille¹⁹:
   
   donde τ es la tensión cortante en pared (dyn/cm²), y Q es el caudal volumétrico (cm³/s), es la viscosidad del fluido del medio RPMI-1640 (0,958 × ^10-3 N·s/^{m 2} a 37 °C)²⁰. Aunque el sistema real contiene un andamiaje de seda poroso y, por tanto, se desvía de esta geometría idealizada, los valores calculados se utilizaron como referencias operativas estandarizadas para permitir comparaciones reproducibles entre condiciones de flujo. Los caudales correspondientes eran de 0,133 mL/min y 0,531 mL/min y se usaban como condiciones de perfusión para el cultivo.
7. Inicia la perfusión y monitoriza el sistema para detectar fugas, formación de burbujas y flujo estable.
8. Inicia la perfusión con inhibidor de migración o un compuesto de prueba (por ejemplo, Cucurbitacina E (CuE) a 0,05 μmol/L en medio completo) o sin (control) y mantén todo el montaje a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ hasta cinco días. Por lo tanto, conecta la entrada de la bomba a un depósito estéril que contenga un medio completo incluyendo el compuesto de prueba correspondiente, y arranca la bomba con ajustes similares a los usados anteriormente.
   NOTA: Asegure la eliminación completa del etanol de la bomba y la tubería realizando los pasos de lavado definidos en el medio. Desecha la fracción inicial del medio tras el enjuague antes de conectarla a los reactores con siembra de celda y asegúrate de que el sistema esté completamente lleno con medio fresco y libre de burbujas de aire.

9. Imagen de fluorescencia de la plataforma experimental

1. Para la bomba, desconecta todas las tuberías manteniendo condiciones estériles.
2. Sella la parte inferior del tubo SPE usando un conector Luer-lock hembra, coloca todo el sistema en un tubo centrífugo estéril de 50 mL y cierra el tubo de forma segura.
3. Transfiere el sistema a un armario de bioseguridad para continuar todos los pasos posteriores. Dentro del capó, sustituye el conector Luer-lock macho por un conector Luer-lock hembra cortado para cerrar completamente el sistema.
4. Coloca el sistema sellado de nuevo en un tubo centrífugo estéril de 50 mL y cierra el tubo de forma segura para el transporte.
   NOTA: Dependiendo de las condiciones de laboratorio, no es necesario detener el flujo para la toma de imágenes cuando el sistema está ajustado. Sin embargo, esto no era posible en los entornos experimentales dados.
5. Transportar reactores sellados a la sala del sistema de imagen óptica in vivo dentro de una caja oscura hermética para proteger las células fluorescentes del fotoblanqueamiento.
6. Coloque los reactores en la plataforma del sistema de imagen óptica in vivo en el soporte correspondiente.
7. Adquirir imágenes de epifluorescencia 2D usando los parámetros previamente optimizados (es decir, excitación 675 nm, emisión 720 nm, tiempo de exposición 10 s, binning 8, número f 8).
8. Incluir 4T1-wt sembrado, andamiaje sin sembrar y controles vacíos del reactor para cada sesión de imagen.
9. Cuantifiquen las señales de fluorescencia mediante análisis de imagen óptica in vivo .
10. Grafica los resultados cuantitativos para los grupos de control y tratamiento y genera gráficos comparativos para visualizar el efecto del compuesto de prueba en el resultado medido.

10. Análisis de imágenes de plataformas experimentales

1. Adquirir imágenes de fluorescencia en el Día 0, Día 3 y Día 5 y analizarlas utilizando software de análisis de imágenes.
2. Para cada imagen, realiza la calibración espacial antes del análisis. Mide la longitud física conocida de la plataforma experimental en píxeles usando la herramienta línea y introduce la distancia real correspondiente (85 mm) mediante Analizar > Set Scale para definir la conversión píxel a longitud.
3. Tras la calibración, cuantifica el área fluorescente delineando manualmente la región de interés (ROI) usando la herramienta de selección a mano alzada.
4. Para minimizar el sesgo del usuario, delimitar los ROI usando criterios visuales consistentes basados en la intensidad de la señal de fluorescencia respecto al fondo. Realizar todos los análisis bajo idénticos ajustes y, cuando sea posible, que un único operador entrenado realice el análisis.
5. Identifica la señal fluorescente como regiones brillantes claramente distinguibles del fondo oscuro en las imágenes del software de análisis de imagen óptica in vivo, y utiliza estas señales para guiar una segmentación manual consistente.
6. Mide las regiones seleccionadas usando Analizar > Medir y registrar los valores de área para cada punto temporal. Repite este procedimiento para todas las imágenes de todos los grupos experimentales.
7. Normalizar las mediciones de área al valor correspondiente del Día 0 para cada muestra utilizando software de hoja de cálculo para tener en cuenta las diferencias en el tamaño inicial, y expresar los resultados como un cambio de pliegue respecto a la línea base (Día 0 = 1).

11. Análisis estadístico

1. Realiza todos los experimentos al menos en triplicado.
2. Repite todos los experimentos al menos tres veces (n = 3), determina los valores medios así como las desviaciones estándar (DS).
3. Determinar la significación estadística usando ANOVA bidireccional seguida de la prueba de comparación múltiple de Tukey con α = 0,05.

Resultados

Este protocolo describe una plataforma fácil de usar y de bajo coste para la observación macroscópica del crecimiento y movimiento celular en un entorno 3D fisiológicamente relevante. El método utiliza esponjas de fibroína de seda como imitador de la ECM e incorpora un flujo intersticial controlado para modelar condiciones dinámicas del tejido. En la Figura 1 se muestra una visión esquemática de los procedimientos paso a paso, desde la fabricación de esponja...

Discusión

El proceso de producción de esponjas de seda descrito en este protocolo está estandarizado, asegurando la fabricación reproducible de andamios, según se informó en un estudio^{previo 16}. La producción de esponjas bajo condiciones totalmente estandarizadas, como altura/cantidad de lecho salino, volumen de solución de seda e incubación de metanol, es crucial para obtener esponjas uniformes y comparables. Las esponjas producidas deben seguir los criterios del protocolo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	Precaución: Peligroso. Usado para la disolución de seda liofilizada
Placa de 24 pocillos	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	Almacenamiento de andamios sembrados con células durante la incubación
Células de cáncer de mama triple negativo murino 4T1-iRFP720	Laboratorio de Terapéutica Macromolecular del Cáncer (MMCT), Universidad de Viena	N/A	Experimentos de cultivo celular; 4T1-iRFP720 fue derivado internamente del 4T1 parental (ATCC: CRL-2539)
Células de cáncer de mama triple negativo murino 4T1-wt	Laboratorio de Terapéutica Macromolecular del Cáncer (MMCT), Universidad de Viena	ATCC: CRL-2539	Experimentos de cultivo celular
Bruker Alpha Compact FTIR con módulo de muestreo Platinum-ATR	Bruker	A220/D-01	Análisis FT-IR
Cloruro de calcio, anhidro, grado reactivo >93%	Sigma-Aldrich	902179	Para la preparación de la matriz de disolución
Matraz de cultivo celular, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	Consumibles; para el cultivo celular
Matraz de cultivo celular, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	Consumibles; para el cultivo celular
Centrífuga 5804 R	Eppendorf	5805000010	Utilizada para la separación de muestras por centrifugación
Tapón Combi (conector Luer-lock hembra)	Braun Melsungen AG	4495101	Utilizado para el ensamblaje de la plataforma
Cucurbitacina E	Sigma-Aldrich	SML0577	Inhibidor de la migración celular
Puño de biopsia dérmica, Ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	Utilizado para obtener andamios de esponja cilíndrico
Tubos de diálisis (3,5 kDa, celulosa)	Spectra/Por de Spectrum Labs	SPEC132724	Para la diálisis de la solución de fibroína de seda
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	Para el mantenimiento de células
Etanol absoluto	Merck	1.07017	Para la preparación de la matriz de disolución
Excel	Microsoft	v2604	Organización de datos, cálculos básicos y trazado
Suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor	Biowest	S181H-500	Suplemento para medios de cultivo celular
Fiji (anteriormente ImageJ)	Código abierto (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	Procesamiento y análisis de imágenes
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	Análisis estadístico y generación de gráficos
Bomba HPLC Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	Para condiciones de cultivo dinámicas en la plataforma ensamblada
Sistema IVIS 200 Spectrum CT	PerkinElmer	128201	Sistema de imagen óptica con capacidad de TC
Software IVIS Living Image	PerkinElmer	v4.5.2	Software para la adquisición, visualización y análisis cuantitativo de los datos de imagen IVIS
Microscopio electrónico de barrido JEOL JSM-6510	JEOL GmbH	JSM-6510	Imágenes SEM
L-glutamina, solución de 200 mM, adecuada para cultivo celular (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	Suplemento para medios de cultivo celular
Liofilizador Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	Para la liofilización de la fibroína de seda
Conector Luer-lock macho	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	Adaptador para reservorios de muestra
Metanol, >99,9 %, Grado Gradiente HPLC	Carl Roth	7342.1	Precaución: Tóxico. Inducción de la formación de beta-hojas en compuestos de seda
Tubos de extracción en fase sólida (SPE) ópticamente transparentes sin filtros	Sigma Aldrich	57240-U	Utilizado para el ensamblaje de la plataforma
Software de espectroscopía OPUS	Bruker	v7.5	Análisis FT-IR
Agitador orbital y lineal MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	Distribución/mezcla uniforme
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	Para sellar/envolver platos y contenedores para almacenamiento (por ejemplo, refrigeración)
Penicilina-Estreptomicina, líquida, adecuada para cultivo celular (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Suplemento para medios de cultivo celular
Placa Petri, 9 cm	VWR	391-0598	Para el moldeo de esponjas de sal; para sembrar en andamios de seda
Fritas de polietileno para tubos SPE de 1 mL	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	Utilizado para el ensamblaje de la plataforma
Medio RPMI-1640, adecuado para cultivo celular	Sigma-Aldrich	R0883	Los medios suplementados se utilizan para el equilibrado de esponjas de seda, el mantenimiento del cultivo celular y experimentos relacionados
Pipeta serológia, 10 mL	Sarstedt	86.1254.025	Consumibles; para el mantenimiento de células
Pipeta serológia, 25 mL	Sarstedt	86.1685.020	Consumibles; para el mantenimiento de células
Pipeta serológia, 5 mL	Sarstedt	86.1253.025	Consumibles; para el mantenimiento de células
Capullos de seda de Bombyx mori L.	Estación Experimental de Sericultura y Agricultura, Vratsa, Bulgaria	N/A	Materia prima para la producción de esponjas de fibroína de seda
Carbonato de sodio, anhidro, >99,5% ACS	VWR	11552.A3	Utilizado para la degomado químico, es decir, la eliminación de la sericin
Cloruro de sodio, >98%, técnico	VWR	27788.366	Para el moldeo de esponjas de sal
Varilla de empuje para columna SPE	Carl ROTH	36P9.1	Utilizado para el ensamblaje de la plataforma
Cribas analíticas de acero inoxidable, 500 μm (ISO 3310-