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Microinyección de interleucina-6 en el torrente sanguíneo de larvas de pez cebra con TSC para estudiar comportamientos similares a trastornos neuropsiquiátricos

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DOI:

10.3791/71524

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26 de junio de 2026

 , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

En este artículo

Resumen

Para modelar cómo las señales inflamatorias influyen en el neurodesarrollo en organismos genéticamente susceptibles, presentamos un protocolo para microinyectar IL-6 en el conducto de Cuvier (vena cardinal común) de larvas de pez cebra, permitiendo la inducción controlada de la inflamación y la evaluación de su impacto en el desarrollo en el contexto del complejo de esclerosis tuberosa (TSC).

Resumen

Los pacientes con complejo de esclerosis tuberosa (mutaciones TSC1/TSC2) presentan una expresividad variable del trastorno del espectro autista (TEA), y se sabe que la activación inmune materna aumenta el riesgo de TEA. La interleucina-6 (IL-6) es una citoquina pleiotrópica con funciones bien establecidas en la regulación inmunitaria, la inflamación y los procesos neuroinflamatorios. Es producida por múltiples tipos de células inmunitarias en respuesta a una infección o lesión tisular, y comúnmente se caracteriza como mediador proinflamatorio. Cabe destacar que la IL-6 puede atravesar la barrera hematoencefálica y ha estado implicada en la neuroinflamación y en condiciones neuropsiquiátricas asociadas a la inflamación, incluyendo el trastorno del espectro autista (TEA) y la discapacidad intelectual (DI). Aquí describimos un protocolo para inducir la señalización inflamatoria sistémica en el pez cebra mediante la entrega de IL-6 al torrente sanguíneo mediante la inyección en el conducto de Cuvier. Este enfoque permite respuestas inflamatorias controladas y reproducibles para estudiar los cambios provocados por inflamación en el desarrollo temprano. El protocolo detalla los pasos esenciales para la preparación de IL-6, la microinyección y aplicaciones experimentales posteriores en modelos de enfermedad y neuroinflamación de pez cebra, incluyendo estudios diseñados para sondar las interacciones gen-ambiente. Al permitir la inducción controlada de la señalización inflamatoria sistémica, este enfoque proporciona una plataforma versátil para examinar cómo la susceptibilidad genética y las exposiciones inflamatorias se cruzan para moldear los resultados del desarrollo.

Introducción

Comprender cómo las señales inflamatorias moldean el neurodesarrollo temprano es esencial para analizar los mecanismos subyacentes a los trastornos del neurodesarrollo, especialmente en contextos genéticamente susceptibles. El objetivo principal de este protocolo es proporcionar un enfoque preciso y reproducible para inducir la señalización inflamatoria sistémica en larvas de pez cebra mediante la microinyección directa de interleucina-6 (IL-6) en el conducto de Cuvier (la vena cardinal común).

El complejo de esclerosis tuberosa (TSC) ejemplifica estas interacciones génico-ambiente. El TSC es un trastorno genético raro causado por mutaciones en TSC1 o TSC2, que codifican hamartin y tuberina, respectivamente, proteínas que forman un complejo que normalmente suprime la señalización de mTORC1. La pérdida de esta inhibición conduce a la hiperactivación de la vía mTORC1, lo que resulta en un crecimiento celular anormal y un amplio espectro de manifestaciones clínicas, incluyendo el trastorno del espectro autista (TEA)1,2. Se estima que el TEA afecta al ~1,5% de las personas con una edad media de diagnóstico de ~3 años en paísesdesarrollados 3. El TEA se caracteriza por conductas repetitivas, interacciones sociales deterioradas y una flexibilidad cognitivareducida 4, y los pacientes suelen presentar desafíos neuroconductuales adicionales como ansiedad, depresión o discapacidadintelectual 3. Cabe destacar que entre el 40% y el 60% de las personas con TSC presentan características relacionadas con elTEA 2, pero la gravedad de los síntomas varía mucho —incluso entre pacientes con mutaciones similares—, lo que sugiere que los factores ambientales modulan el riesgo impulsado genéticamente.

Uno de esos factores es la inflamación. Aunque la etiología del TEA sigue siendo en gran medida desconocida, la neuroinflamación en múltiples regiones cerebrales lleva mucho tiempoimplicada 5. La creciente evidencia preclínica y clínica indica que la neuroinflamación fetal desencadenada por la activación inmunitaria materna (MIA) y la consiguiente elevación de la señalización de las citocinas pueden contribuir significativamente a la patogénesis delTEA 6. Así, modelar la exposición a citocinas inflamatorias en sistemas genéticamente susceptibles, como el TSC, proporciona un marco potente para analizar cómo las señales inmunitarias se intersectan con la alteración de la regulación de mTORC1 para influir en el desarrollo cerebral temprano.

La razón para desarrollar este protocolo se debe al creciente reconocimiento de que la inflamación mediada por citocinas, incluida la señalización de IL-6, puede interactuar con vulnerabilidades genéticas para influir en las trayectorias neurodesarrollativas. Las citocinas son glicoproteínas de bajo peso molecular que coordinan la comunicación dentro del sistema inmunitario. En el TEA, múltiples estudios han reportado consistentemente niveles elevados de citocinas proinflamatorias, incluyendo IL-6 en la sangreperiférica 7,8,9,10, apoyando la hipótesis de que una señalización desregulada de IL-6 puede contribuir a las características neurodesarrollativas y conductuales características del trastorno. La IL-6 es un mediador clave de la activación inmunitaria producida por diversos tipos de células inmunitarias en respuesta a una infección o daño tisular. Dado que la IL-6 puede atravesar la barrera hematoencefálica e influir directamente en neuronas, astrocitos y microglías, la elevación sostenida de esta citoquina se ha implicado en la alteración de las vías neurodesarrollativas, la plasticidad sináptica y la homeostasis neuroinmune, mecanismos cada vez más explorados en la fisiopatología delTEA 11,12. Estos vínculos se refuerzan aún más con estudios de AMN, donde un aumento de la IL-6 materna durante el embarazo interrumpe el desarrollo cerebral fetal y aumenta el riesgo relacionado con elTEA 13. Sin embargo, los modelos existentes de vertebrados suelen depender de la estimulación inmunitaria sistémica a través de moléculas asociadas a patógenos o paradigmas de exposición materna, que pueden introducir variabilidad, activar múltiples vías inmunitarias simultáneamente y limitar la capacidad de aislar la contribución específica de IL-6. La microinyección directa de IL-6 en peces cebra supera estas limitaciones al permitir la manipulación dirigida de una sola citoquina dentro de un organismo transparente y manejable genéticamente.

El pez cebra ofrece varias ventajas para estudiar los efectos del desarrollo impulsados por citocinas. Su transparencia óptica permite la visualización en tiempo real de las respuestas inmunitarias y neuronales; su rápido desarrollo permite experimentación de alto rendimiento; y sus vías conservadas de señalización de citoquinas los convierten en un modelo vertebrado potente para diseccionar mecanismosinflamatorios 14,15,16,17,18. En estudios experimentales, es necesario administrar materiales exógenos (bacterias, células cancerosas, ADN, nanopartículas, etc.) en larvas de pez cebra. Un enfoque consiste en exponer las larvas a una solución que contiene el material de interés, permitiendo una absorción pasiva a través de la piel, las branquias o el tracto gastrointestinal. El segundo método y más directo es la microinyección, en la que materiales externos se administran en compartimentos embrionarios o larvales específicos utilizando agujas finas de vidrio 19,20,21. Es importante destacar que la microinyección en el conducto de Cuvier proporciona una vía fiable para la entrega sistémica, asegurando una rápida distribución de IL-6 a lo largo de la circulación sin los efectos de confusión de la estimulación inmune de organismos completos.

En este protocolo, presentamos un procedimiento paso a paso desde la preparación de jeringuillas de inyección hasta las inyecciones de IL-6 en el torrente sanguíneo a través del conducto de Cuvier de larvas de pez cebra a los 2 y 3 días de la fertilización (dpf). Este método es especialmente útil para investigadores que investigan cómo señales inflamatorias específicas influyen en los procesos tempranos de desarrollo, las interacciones gen-entorno en modelos de trastornos neurodesarrollativos o relacionados con el sistema inmunológico, las consecuencias celulares y moleculares de la exposición a citocinas in vivo, o la interacción entre mutaciones genéticas y vías de señalización inflamatoria. Al ofrecer un enfoque controlado, específico para citocinas y precisamente en el desarrollo, este protocolo proporciona una plataforma versátil para sondar los mecanismos a través de los cuales la IL-6 y las señales inmunitarias relacionadas moldean los resultados inmunes, neuronales y conductuales tempranos.

Protocolo

Para el procedimiento descrito aquí, se utilizó la línea tsc2 vu242/+ pez cebra22,23. Todos los experimentos realizados se realizaron de acuerdo con toda la legislación relevante, y no se requiere aprobación adicional de un comité de ética específicamente porque la etapa de desarrollo utilizada (<5 dpf) queda fuera del alcance de la revisión ética obligatoria. La Figura 1 presenta un esquema del protocolo.

1. Extracción de micropipetas

  1. Preparar agujas de microinyección a partir de capilares de vidrio borosilicato utilizando un extractor de micropipeta, siguiendo los procedimientosestablecidos 24.
  2. Utiliza capilares de vidrio borosilicato de 10 cm de largo (1,0 mm de diámetro exterior, pared fina) y cárgalos en un extractor de micropipetas.
  3. Coloca cuidadosamente el capilar dentro del carro de tirador, asegurando una alineación precisa dentro de la ranura designada, y fijalo firmemente usando las abrazaderas para instrumentos para evitar movimientos durante el tirado.
  4. Ajusta el capilar para que quede centrado dentro del filamento calefactor, asegurando un calentamiento uniforme a lo largo de la zona a extraer para una formación uniforme de la aguja.
  5. Inicia el programa de extracción usando parámetros optimizados (por ejemplo, para instrumentos Sutter usa calor: 533, tirada: 50, velocidad: 60, retardo: 90 y presión: 200) para generar agujas de microinyección de punta fina.
    PRECAUCIÓN: Las microagujas extraídas de capilares de vidrio son frágiles y pueden agrietarse, obstruirse o desarrollar formas irregulares de las puntas que alteran el volumen de inyección. Inspecciona cada aguja bajo un estereomicroscopio antes de usarla, evita tocar la punta con superficies duras y cambia las agujas inmediatamente si observas resistencia, fuga o un tamaño de gota inconsistente.
    NOTA: Tras el proceso de extracción, se forman las puntas de aguja cónicas en ambos extremos del capilar. Antes de su uso, la punta debe abrirse cuidadosamente rompiéndola suavemente con pinzas finas bajo un estereomicroscopio para lograr el tamaño de apertura deseado para la microinyección.

2. Preparación de tampones y solución de stock

  1. Prepara una solución estándar al 60× del medio embrionario E3 (véase la Tabla 1). Esteriliza la solución mediante autoclav y guárdala a 4 °C. Para su uso, diluye la solución original en agua ultrapura para obtener una solución de trabajo de 1× E3.
    NOTA: El 60× solución de base del medio embrionario E3 puede almacenarse a 4 °C para almacenamiento a largo plazo.
  2. Prepara una solución de tricaína (MS-222) 20x como se describe en la Tabla 1. Guarda la solución a 4 °C en la oscuridad para evitar su degradación. Antes de su uso, diluir a 1× concentración de trabajo en medio E3.
    NOTA: Ajusta el pH de la solución de la base de tricaína a 7,5 usando 1 M de Tris pH 9,0. Esta solución puede alicotarse y mantenerse a -20 °C (congelada) para almacenamiento a largo plazo o almacenada a 4 °C. La tricaína se degrada en RT y bajo luz hasta convertirse en un compuesto tóxico.
    PRECAUCIÓN: Se debe tener especial cuidado al usar tricaína (MS-222) para la anestesia, ya que tanto la subexposición como la sobreexposición pueden afectar negativamente a la fisiología y comportamiento larval. La exposición excesiva puede deprimir la función cardíaca y alterar el comportamiento posterior, mientras que la anestesia insuficiente aumenta el riesgo de lesión durante el montaje. Utilice solo la concentración y duración mínimas efectivas, y permita la recuperación completa en un medio embrionario fresco antes de los ensayos conductuales.
  3. Prepara una solución de agarosa al 1% (p/v) en un medio E3 calentándola hasta que esté completamente disuelta.
    NOTA: Si se prepara con antelación, la solución puede almacenarse a 4 °C y recalentarse antes de su uso. El día del experimento, mantener la agarosa en estado líquido a 55–60 °C para evitar una solidificación prematura.
  4. Prepara una solución de NaCl al 0,9% (p/v) y guárdala a temperatura ambiente hasta 1 semana o a 4 °C para un almacenamiento prolongado. Antes de su uso, equilibrar la solución a temperatura ambiente o incubar a 28,5 °C para ajustarse a las condiciones fisiológicas de los embriones.
  5. Prepara una solución de 2 pg/nL de IL-6 con 0,9% de NaCl. Alicota la solución para evitar ciclos repetidos de congelación-deshielo y almacenar a -20 °C. Antes de usarla, descongela y lleva la alicuota a temperatura ambiente.
  6. Prepara una solución de trabajo de pronasa de 0,5 mg/mL en medio E3 a partir de una solución de 20 mg/mL preparada en agua ultrapura.

3. Obtención y crianza de embriones hasta 2 dpf

  1. Organiza la reproducción en grupo colocando varios pez cebra adultos TSC2vu242/vu242 en un acuario de desove.
    NOTA: Machos y hembras pueden separarse durante la noche usando un divisor para evitar la desove prematura, retirando el divisor a la mañana siguiente para inducir el apareamiento sincronizado. Alternativamente, los peces pueden mantenerse sin separador en un entorno controlado por la luz, donde la transición de la oscuridad (noche) a la luz (mañana) actúa como señal de desove.
  2. Al día siguiente, retira el divisor (si se usa) y permite que la puesta de desove continúe durante aproximadamente 1 hora.
  3. Recoger embriones fecundados rápidamente y transferirlos a placas de Petri de 100 mm que contienen 40 mL de medio embrionario E3, manteniendo una densidad no superior a ~60 embriones por plato para asegurar un desarrollo óptimo.
  4. Incubar embriones a 28,5 °C bajo un ciclo diurno controlado de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad.
  5. A 1 dpf y 2 dpf, examinar embriones bajo un estereomicroscopio y retirar embriones muertos, huevos no fertilizados y restos para mantener la calidad del cultivo.
  6. Sustituye el medio E3 por una solución fresca para minimizar la acumulación de residuos y apoyar el desarrollo embrionario normal.

4. Preparación de placas de agarosa para microinyecciones y decorionización

  1. Prepara una solución de agarosa al 1% (p/v) en un medio E3 y caliéntala hasta que la agarosa se disuelva completamente y la solución se despeje.
  2. Deja que la solución se enfríe brevemente y luego vierte aproximadamente 30 mL en una placa de Petri de 100 mm, asegurando una capa uniforme en la superficie.
  3. Mientras la agarosa aún está líquida pero empieza a solidificarse, coloca suavemente un molde de silicona sobre la superficie para crear ranuras uniformes.
    NOTA: Aquí se utilizan moldes de silicona con patrones piramidales (Figura 2) para generar pozos capaces de retener el exceso de E3 durante la microinyección. Estos pozos están diseñados para proporcionar estabilidad transitoria durante la manipulación e inyección, manteniendo suficiente humedad para evitar la desecación y garantizar la viabilidad del embrión durante varios minutos fuera de las condiciones estándar de incubación.
  4. Prepara placas de Petri recubiertas de agarosa para la decorionación enzimática (50 mm de diámetro) vertiendo aproximadamente 5 mL de solución fundida de agarosa al 1% (p/v) y girando suavemente la placa para recubrir uniformemente la superficie.
  5. Elimina cualquier exceso de agarosa.
  6. Deja que la agarosa solidifique a temperatura ambiente durante 10–15 minutos. Una vez cuajados, los platos están listos para su uso en la descorionación enzimática de embriones.

5. Descorionación enzimática de 2 peces dpf

  1. Transfiere aproximadamente 100 embriones en coriones a 2 dpf a una pequeña placa de Petri recubierta de agarosa (50 mm).
  2. Eliminar la mayor cantidad posible de medio E3 para minimizar la dilución de la solución enzimática y asegurar una decorionación eficiente.
  3. Añadir 4 mL de solución de pronasa recién preparada (concentración de stock: 20 mg/mL [preparada en agua ultrapura], concentración de trabajo: 0,5 mg/mL [diluida en E3]) al recipiente, asegurando que los embriones queden completamente sumergidos.
    PRECAUCIÓN: El tratamiento con pronasa debe controlarse cuidadosamente, ya que la sobredigestión puede dañar los tejidos larvales, aumentando la fragilidad durante la manipulación y potencialmente afectando la supervivencia o el comportamiento. Utilice solo el tiempo mínimo de exposición efectiva y enjuague bien los embriones después para evitar la continuidad de la actividad enzimática.
  4. Incubar a temperatura ambiente durante 3–5 minutos, monitorizando la liberación de los coriones bajo un estereomicroscopio.
  5. Gira o gira suavemente el plato de forma intermitente para facilitar la eliminación enzimática de los coriones. Continúa hasta que la mayoría de los embriones se liberen de sus coriones.
    NOTA: Asegúrate de que los embriones desnudos estén siempre sumergidos en solución; de lo contrario, el saco vitelino puede romperse, lo que provoca la muerte de los embriones.
  6. Una vez lograda la dechorionación, lava bien los embriones transfiriéndolos a través de 5–6 cambios de medio E3 fresco.
    NOTA: Asegúrate de que los embriones desnudos estén siempre sumergidos en solución; de lo contrario, el saco vitelino puede romperse, lo que provoca la muerte de los embriones.
  7. Asegúrese de que se eliminen todos los coriones y residuos de pronasa para evitar daños a las larvas y mantener condiciones óptimas de cultivo.
  8. Transfiere ~50 larvas descoriionadas a una placa de Petri de 100 mm que contenga 40 mL de medio E3 usando una pipeta Pasteur de vidrio.
  9. Mantén las larvas en estas condiciones hasta que se microinyectan.

6. Inyección de embriones de pez cebra

  1. Bajo un estereomicroscopio (≥150× ampliación), se utilizan pinzas finas para romper cuidadosamente la punta del capilar de vidrio extraído (sección 1), generando una micropipeta con una abertura de aproximadamente 3 μm de diámetro.
    NOTA: Se puede reconocer una micropipeta adecuada asegurando que la punta esté finamente abierta, sin aplanamiento visible ni una gran superficie abierta en la punta. Si la punta está rota demasiado, no penetrará eficazmente en la piel del pez y puede provocar inyecciones deficientes o inconsistentes. Por lo tanto, la apertura de la punta debe realizarse cuidadosamente bajo un estereomicroscopio a alta aumentación, asegurando una ruptura mínima y controlada en el extremo del capilar.
  2. Preparar soluciones de inyección de 0,9% (p/v) de NaCl (control) o IL-6 (2 pg/nL) en 0,9% de NaCl y añadir 1 μL de azul de tripán al 0,1% por cada 10 μL de solución para facilitar la visualización durante la inyección.
  3. Rellena la micropipeta preparada con ~3 μL de la solución de inyección usando una punta de microcargador, asegurando que no se introduzcan burbujas de aire.
  4. Fija la micropipeta cargada en el soporte capilar (Figura 2) conectado al sistema de microinyección.
  5. Coloca una pequeña gota de aceite mineral sobre una lámina de calibración.
  6. Calibra el volumen de inyección expulsando gotas en el aceite mineral y midiendo su diámetro usando una lámina de calibración (Figura 2) con una escala de 0,01 mm. Ajusta la presión de inyección (entre 300–500 hPa) para lograr un volumen de gotas de ~1 nL.
  7. Añadir tricaína (MS-222) al medio que contiene larvas con E3 hasta una concentración final de 1× para anestesia. Para minimizar el estrés y asegurar una sedación constante, utiliza larvas en pequeños lotes.
  8. Transfiere 2 larvas individuales de dpf a una placa de inyección de agarosa solidificada. Se pueden colocar varias larvas (por ejemplo, hasta 10) por plato, dependiendo de la capacidad de manipulación.
  9. Coloca el plato bajo el estereomicroscopio. Utilizando una pipeta de cristal, orienta suavemente cada larva de modo que el conducto de Cuvier sea claramente visible y accesible.
    NOTA: Al trabajar con varias larvas, asegúrese de que la superficie de agarosa permanezca hidratada añadiendo periódicamente gotas de medio E3 que contenga tricaína (1×) para evitar la desecación.
  10. Coloca la punta de la micropipeta en el punto de entrada del conducto de Cuvier (como se muestra en la Figura 3), identificable siguiendo las células sanguíneas que se dirigen hacia el corazón bajo el estereomicroscopio.
  11. Inyectar dos gotas consecutivas (~1 nL cada una) de la solución preparada en el conducto de Cuvier, con un intervalo de aproximadamente 20 s entre inyecciones para permitir una distribución adecuada.
  12. Tras la inyección, transfiere suavemente las larvas de la placa de agarosa a una nueva placa de Petri de 100 mm que contenga 40 mL de medio E3. Minimiza el estrés mecánico durante la transferencia.
  13. Devolver las larvas a la incubadora a 28,5 °C para su recuperación.
  14. Al día siguiente (3 dpf), repita el procedimiento de microinyección tal como se describe en los pasos 6.8–6.13.
    NOTA: Una sola inyección produce solo señalización de corta duración y no una respuesta conductual consistente, mientras que la segunda inyección asegura una activación sostenida de las vías inflamatorias a lo largo de la ventana temprana de desarrollo larval relevante para el neurodesarrollo y produce cambios de comportamiento como se describe en la sección de resultados representativos.
  15. A 5 dpf, utiliza las larvas para aplicaciones posteriores, incluyendo ensayos conductuales, imágenes cerebrales o análisis de inmunofluorescencia.

Resultados

Para evaluar los efectos de la microinyección de IL-6 en la fisiología y comportamiento larval, comparamos larvas inyectadas con IL-6 con controles inyectados con NaCl en toda la supervivencia y dos lecturas conductuales comúnmente utilizadas para evaluar comportamientos similares a la ansiedad y repetitivos en peces cebra. La microinyección de IL-6 no afectó la viabilidad larvaria en comparación con las inyecciones de NaCl (Figura 4A). Las tasas de supervivencia a 5 dpf fueron indistinguibles entre los grupos inyectados con IL-6 e inyectados en NaCl, lo que indica que el régimen de dosificación es bien tolerado y no introduce toxicidad inespecífica. Las microinyecciones en sí reducen ligeramente la viabilidad en comparación con las hermanas no inyectadas, lo que indica un impacto moderado relacionado con el manejo independiente de la exposición a IL-6. Esto confirma que el protocolo es adecuado para análisis conductuales posteriores.

Para validar que el paradigma de microinyección de IL-6 induce una respuesta inflamatoria medible a 5 dpf, cuantificamos la prostaglandina E2 (PGE2), un mediador posterior de la señalización inflamatoria25 impulsada por citocinas. Los mutantes homocigotos tsc2-/- mostraron niveles basales elevados de PGE2 incluso sin inyección de IL-6, significativamente más altos que sus hermanos tipo salvaje (WT) tsc2+/+ (Figura 4B). Los mutantes heterocigotos tsc2+/- mostraron un aumento modesto y no significativo en la PGE2 basal en comparación con las larvas WT, pero es importante destacar que sus niveles de PGE2 aumentaron considerablemente tras la microinyección de IL-6. Este patrón es coherente con nuestro objetivo de modelar las interacciones entre genes × ambiente: las larvas de WT permanecen en gran medida sin verse afectadas por una exposición leve y transitoria a IL-6, mientras que los mutantes TSC2+/- genéticamente susceptibles presentan una respuesta inflamatoria pronunciada.

En línea con estas diferencias dependientes del genotipo en el tono inflamatorio, examinamos a continuación si la señalización inducida por IL-6 se traducía en cambios de comportamiento medibles en el ensayo de campo abierto. La prueba en campo abierto a 5 dpf (como se describióanteriormente en 22) reveló que las larvas mutantes TSC2 mostraron un comportamiento similar a la ansiedad en comparación con los hermanos WT (Figura 4C); sin embargo, las microinyecciones de IL6 no afectaron este comportamiento. Específicamente, las larvas tsc2+/- y tsc2-/- pasaron significativamente más tiempo en la zona externa de la arena y mostraron una exploración del centro reducida en comparación con tsc2+/+, consistente con fenotipos relacionados con la ansiedad establecidos en larvas de pez cebra.

Las inyecciones de IL-6 aumentaron patrones de natación repetitivos y estereotipados, especialmente en larvas mutantes tsc2+/- (Figura 4D–E), una característica conductual comúnmente utilizada como lectura relevante para el TEA en modelospez cebra 26. La cuantificación detallada del bucle repetitivo, definido como tres o más nados circulares consecutivos, reveló un aumento significativo en la proporción de mutantes tsc2+/- inyectados con IL-6 que presentaban este comportamiento en comparación con los controles inyectados con NaCl. Este aumento selectivo de la natación repetitiva en larvas genéticamente susceptibles apoya aún más una interacción gen × ambiente, en la que una estimulación inflamatoria leve desenmascara o amplifica tendencias conductuales similares al TEA, específicamente en el trasfondo mutante tsc2+/-.

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Figura 1: Esquema del protocolo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 2: Configuración de la estación de trabajo de microinyección. Esquema de la estación de trabajo de microinyección utilizada para las inyecciones larvales de pez cebra. (1) Micropipeta de vidrio montada en el soporte del inyector; (2) placa de Petri recubierta de agarosa con pozos moldeados para la posición larval; (3) aceite mineral para calibración; (4) solución de azul de tripán; (5) tiraba agujas de vidrio; (6) diapositiva de calibración; (7) puntas de pipeta extendidas; (8) Pipeta Pasteur; (9) Molde de silicona. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 3: Inyección en el conducto de Cuvier. (A) Representación esquemática del conducto del sitio de inyección de Cuvier (la veta cardinal común) en larvas de pez cebra y vías locomotoras representativas en campo abierto a 5 dpf. (B) Imágenes representativas del control (sin inyectar), e inyecciones de NaCl e IL-6. Barra de escala: 250 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 4: Resultados representativos de la interacción entre el gen y el entorno utilizando la línea mutante tsc2. (A) Tasas de supervivencia (%) de larvas tsc2 vu242 a lo largo del experimento en grupos control (no inyectado), inyectado con NaCl e inyectado en IL-6. Los datos se presentan como media ± SEM a 5 dpf (n = 4 réplicas experimentales independientes, cada genotipo × combinación de tratamiento conteniendo entre 60 y 70 peces). Se realizó un análisis estadístico utilizando ANOVA seguido de la prueba Tukey post hoc para comparación por pares. Se observaron diferencias significativas entre los grupos control y los inyectados en IL-6 (p = 0,00150) y entre los grupos control e inyectados con NaCl (p = 0,00243). (B) Diagramas de caja que representan los niveles de PGE2 en mutantes y hermanos TSC2, medidos a 5 dpf usando un kit de ensayo inmunoabsorbente enzimático (ELISA) según el protocolo del fabricante (ANOVA bi-way para genotipo: F = 7,4503; P = 0,01234). Cada muestra contiene 20 cabezas (se usaron colas para la genotipado). Los puntos en los diagramas de caja representan réplicas biológicas. (C) Diagramas de caja de los resultados de la prueba de campo abierto para peces mutantes tsc2 que muestran el tiempo relativo junto a las paredes para cada genotipo tras inyecciones con NaCl e IL-6 y para controles no inyectados (ANOVA bi-way para genotipo: F = 7,021; P = 0,00106). La prueba en campo abierto se realizó utilizando una cámara de análisis automatizada (Tabla de Materiales) según el protocolopreviamente reportado 22. (D) Figura ejemplar que muestra comportamientos exploratorios aleatorios tras la inyección de NaCl y repeticiones de bucles tras las inyecciones de IL-6. (E) Diagramas de caja que representan el número de animales que muestran comportamientos normales y repetitivos de bucle para cada genotipo tsc2 tras la inyección con NaCl o IL-6 y para peces control no inyectados (ANOVA bipartita para genotipo: F = 5,7615; P = 0,005849). Se utilizaron tres réplicas experimentales independientes, cada combinación de genotipo × tratamiento que contenía entre 60 y 70 peces. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Solución original 60 x E3
ReactivoConcentración finalCantidad
NaCl297 mM17,4 g
KCl10,7 mM0,8 g
CaCl219,6 mM2,18 g
MgCl 2,6H 2O24 mM4,89 g
UltrapureH 2ON/Allenar hasta 1 L
TotalN/A1 L
Solución de culata tricaine
ReactivoConcentración finalCantidad
Tricaine15,3 mM1 g
1 M Tris-HCl pH 921 mM5,25 mL
UltrapureH 2ON/A244,75 mL
TotalN/A250 mL

Tabla 1: Composición de soluciones de E3 y Tricaína.

Discusión

Como era de esperar, los mutantes homocigotos TSC2 mostraron altos niveles basales de ansiedad similar, consistentes con los fenotipospreviamente reportados 22,27. Dado que estas larvas ya presentan graves anomalías conductuales, la inyección de IL-6 no agravó aún más su fenotipo. En contraste, los heterocigotos tsc2 mostraron cambios claros inducidos por la IL-6. Esta sensibilidad selectiva pone de manifiesto la utilidad de este protocolo para sondear interacciones entre genes × ambiente, donde una señalización inflamatoria leve pero prolongada interactúa con la vulnerabilidad genética subyacente para influir en los resultados neuroconductuales.

La exposición al LPS sigue siendo el paradigma inductor de inflamación más utilizado en el pez cebra y produce de forma fiable una respuesta inmunitaria amplia y robusta, caracterizada por una fuerte inducción de citocinas proinflamatorias, reclutamiento de células inmunitarias innatas y mortalidad dependiente dela dosis 28. Aunque potente, el LPS activa múltiples vías receptoras tipo Tollsimultáneamente 28,29,30, lo que dificulta aislar la contribución de las citocinas individuales a los efectos neurodesarrollativos posteriores. En cambio, el protocolo de microinyección de IL-6 descrito aquí proporciona un enfoque dirigido y controlado al elevar una única citoquina conocida por ser central en la activación inmune materna. Es importante destacar que las inyecciones de IL-6 no aumentan la mortalidad en comparación con los controles inyectados con NaCl, lo que permite examinar fenotipos conductuales y moleculares sin causar toxicidad confundidora. Además, la microinyección de IL-6 produce una señalización inflamatoria específica a continuación, como demuestran los niveles elevados de PGE2, e induce cambios de comportamiento medibles —especialmente un aumento de la natación repetitiva en larvas heterocigotas TSC2— donde la susceptibilidad genética interactúa con la exposición a citocinas. En conjunto, estas distinciones subrayan que, mientras que LPS modela la activación inmune global, la microinyección de IL-6 permite una disección precisa de mecanismos específicos de citocinas relevantes para el riesgo neurodesarrollativo.

Los resultados representativos presentados aquí ilustran los efectos de la IL-6 en un trasfondo mutante tsc2, pero el protocolo en sí es ampliamente aplicable. El método puede implementarse fácilmente en larvas de tipo salvaje u otros modelos genéticos para investigar cómo las señales inflamatorias definidas se intersectan con diversos contextos genéticos durante el neurodesarrollo temprano. Para aplicaciones más allá del modelo tsc2, recomendamos determinar empíricamente la dosis óptima de IL-6, ya que la sensibilidad a las citocinas y los umbrales inflamatorios pueden variar según los genotipos y los objetivos experimentales.

Una consideración técnica clave en este protocolo es la consistencia del volumen de inyección, ya que los efectos biológicos de la IL-6 dependen de una entrega precisa de aproximadamente 1 nL por inyección. La variabilidad en el tamaño de las gotas suele surgir por diferencias en la apertura de la aguja o en la presión de inyección. Si las gotas son demasiado pequeñas, aumentar gradualmente la presión o ensanchar ligeramente la punta de la aguja bajo alta magnificación suele restaurar el flujo adecuado. Por el contrario, las gotas que superan el volumen previsto suelen indicar que la abertura de la aguja es demasiado ancha, en cuyo caso es necesario reducir la presión o preparar una nueva aguja con una punta más estrecha. Mantener volúmenes de inyección precisos es esencial, ya que las desviaciones pueden alterar la carga inflamatoria y comprometer su reproducibilidad. Ocasionalmente, los usuarios pueden encontrarse con situaciones en las que no se expulsa ninguna solución de la aguja. Esto suele deberse a burbujas de aire, restos o obstrucciones en la punta de la aguja. Inspeccionar la aguja bajo un estereomicroscopio y comprobar el sistema de inyección en busca de fugas o conexiones sueltas suele resolver el problema. Asegurar una punta de aguja limpia y sin obstáculos es esencial para una entrega constante y para evitar la acumulación de presión que podría dañar las larvas.

Otro factor importante es la tolerancia fisiológica al volumen inyectado. Las larvas generalmente toleran bien ~1 nL, pero volúmenes mayores pueden aumentar la mortalidad, especialmente cuando se realizan múltiples inyecciones en días consecutivos. Para experimentos que requieren dosificaciones repetidas, es crucial minimizar el estrés mecánico, permitir un tiempo suficiente de recuperación entre inyecciones y ajustar la concentración de IL-6 en lugar de volumen para alcanzar la dosis deseada. Estas consideraciones ayudan a garantizar que los fenotipos observados reflejen la exposición a citocinas en lugar de lesiones relacionadas con la inyección.

Por último, la mortalidad relacionada con la inyección puede variar mucho según la experiencia del usuario. Mientras que los usuarios cualificados suelen alcanzar tasas de mortalidad cercanas al 5%, los usuarios inexpertos pueden observar tasas de hasta el 50%. La mayoría de las pérdidas se deben a daños mecánicos durante el montaje, colocación incorrecta de la aguja o punción accidental del saco vitelino o de los tejidos circundantes. Practicar el procedimiento en larvas de tipo salvaje antes de comenzar las inyecciones experimentales mejora mucho la consistencia y reduce la mortalidad. La colocación adecuada de las larvas para visualizar claramente el conducto de Cuvier, combinada con un manejo suave durante el montaje y recuperación, minimiza aún más el daño procedimental.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Kevin Ess y Lilianna Solnica-Krezel (Universidad de Vanderbilt) por el peztsc2 vu242/+ y al IIMCB ZCF por la ayuda con los peces adultos. Este trabajo fue apoyado por la subvención SONATA BIS nº 2023/50/E/NZ3/00252, una subvención a JZ del Centro Nacional de Ciencias de Polonia.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cápsides de vidrio borosilicato (Diámetro exterior 1.0 mm/ diámetro interior 0.75 mm)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (cloruro de calcio)Chempur118748703
Diapositiva de calibración (1/100 mm)Bresser5916710
Portacapilar (Juego de pinza 4 tamaño 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
Extrusor de micropipetas Flaming/BrownSutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
IL6 humanoThermo Fischer Scientific200-06-20UGConcentración en stock: 10 µg/mL, Concentración de trabajo: 2 pg/nL (diluido en NaCl 0.9%)
Bomba inyectora FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (cloruro de potasio)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (cloruro de magnesio hexahidrato)Chempur116120500
Puntas Microloader Femtotips para Microinyector FemtojetEppendorfEPE 5242956003
Microscopio Leica M165 FC 1983 aumentosLeica Microsysytemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/
Aceite mineralSigma-AldrichM5904
NaCl (cloruro de sodio)Chempur117941206
PronasaSigma-AldrichP5147-1GConcentración en stock: 20 mg/mL (preparada en agua ultrapura), Concentración de trabajo: 0.5 mg/mL (diluida en E3)
TricainaSigma-Aldrich/MerckA-5040
Base de TrisCarl Roth4855.3
Azul de TripánThermo Fischer Scientific15250061
Agarosa UltraPure de bajo punto de fusiónThermo Fischer Scientific16520050
Extensión ZebraBox - Respuesta de foto motor EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebraboxCámara de análisis automatizada

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