La specnuezhenida alivia la nefropatía diabética en ratones db/db, asociada a una mejora de la función renal, la integridad de la barrera intestinal y la reducción de la inflamación y el estrés oxidativo.
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Artículo de investigación
La specnuezhenida alivia la nefropatía diabética en ratones db/db, asociada a una mejora de la función renal, la integridad de la barrera intestinal y la reducción de la inflamación y el estrés oxidativo.
La patogénesis de la nefropatía diabética (DN) es multifactorial, implicando inflamación, estrés oxidativo y el eje intestino-riñón. La specnuezhenida es el principal componente activo de Ligustri Lucidi Fructus y presenta actividades antineoplásicas, antioxidantes y antiinflamatorias. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a sus efectos sobre la DN necesitan ser estudiados más a fondo. Por tanto, este estudio pretende investigar los mecanismos moleculares de Specnuezhenide en la DN. Se estableció un modelo ratón DN usando ratones db/db, y se les administró Specnuezhenide durante 8 semanas. Los efectos de Specnuezhenide en estos ratones se evaluaron mediante evaluaciones de glucosa sérica y función renal. Las alteraciones histopatológicas se evaluaron mediante tinción de hematoxilina y eosina. Se empleó un ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas para cuantificar los niveles de citocinas inflamatorias. Las vías Nrf2 y A20/NF-κB se analizaron mediante western blot (WB), mientras que la expresión de las proteínas de la unión estrecha intestinal se evaluó mediante WB e inmunofluorescencia. Las alteraciones en la microbiota intestinal se examinaron mediante secuenciación de ARNr 16S de alto rendimiento. En comparación con el modelo control, Specnuezhenide mejoró la función renal en ratones db/db, reduciendo la glucosa en sangre (de 37,13 mmol/L a 28,96 mmol/L), el nitrógeno ureico en sangre (de 18,27 mmol/L a 15,15 mmol/L) y la proteína urinaria (de 28,5 mg a 20,41 mg) en el grupo de dosis altas. Mientras tanto, el análisis de la microbiota intestinal mostró un aumento de la abundancia microbiana y una disminución de los niveles de lipopolisacáridos tras la administración de Specnuezhenide. Mientras tanto, Specnuezhenide puede aumentar la expresión de proteínas de la unión estrecha intestinal, mejorando así la integridad de la barrera intestinal. La specnuezhenida puede aumentar la expresión de Nrf2 y A20, y reducir la expresión de NF-κB. Además, Specnuezhenide puede mejorar la lesión funcional renal mientras regula las vías Nrf2 y A20/NF-κB.
La diabetes es una causa principal de enfermedad renal, y con el aumento del número de pacientes con diabetes, su prevalencia está enaumento. Se ha demostrado que los tratamientos tradicionales para la nefropatía diabética (DN) retrasan la progresión de la enfermedad renalcrónica 2. Sin embargo, sigue siendo necesario identificar fármacos más eficaces para la prevención y el tratamiento de la DN. La patogénesis de la DN es multifacética e implica inflamación, estrés oxidativo y el ejeintestino-riñón 1. Con su enfoque multiobjetivo, la Medicina Tradicional China (MTC) ha demostrado una eficacia notable en el tratamiento de enfermedades metabólicas crónicas. Además, la creciente investigación sobre la MTC en la prevención y tratamiento de la DN ha mostrado resultadosprometedores 3.
La diabetes mellitus es un trastorno metabólico complejo, cuyo intestino desempeña un papel central en su fisiopatología a través de las interacciones con órganosmetabólicos. La interacción entre la microbiota del huésped y el intestino es crucial para mantener la homeostasis del huésped. La alteración de la estructura microbiota saludable puede producir toxinas que dañan losriñones 2, mientras que la aclaración renal deteriorada puede alterar el metabolismo y la composiciónmicrobiana 5,6. La barrera intestinal funciona tanto como defensa química como física y se mantiene mediante uniones epiteliales estrechas y una capa mucosa compuesta pormucina 5. La evidencia sugiere una correlación entre la DN y la función intestinalalterada 7, lo que permite la translocación de toxinas y subproductos bacterianos, como los lipopolisacáridos (LPS), al torrente sanguíneo 8,9. La translocación de LPS a través de la barrera comprometida puede desencadenar una desregulación de las respuestas inmunitarias adaptativas e innatas y estimular la producción de citocinasproinflamatorias 7,10, lo que finalmente conduce a un estado inflamatorio crónico característico de DN11,12.
Ligustri Lucidi Fructus se utiliza clínicamente para tratar la nefropatía diabética (DN)13, siendo la Specnuezhenida identificada como un componente activoclave 14. El specnuezhenuro, un glucósido secoiridoideúnico 15, presenta propiedades antiinflamatorias, antioxidantes einmunomoduladoras 16,17,18,19. El ratón db/db es un modelo espontáneo de DN tipo 2 bien establecido que recapitula características clave de la DN humana, incluyendo hiperglucemia persistente, albuminuria y expansión de la matrizmesangial 20. Un estudio previo informó que Specnuezhenide ejercía efectos renoprotectores en ratas DN21; sin embargo, los mecanismos moleculares siguen siendo en gran medida inexplorados. Cabe destacar que Specnuezhenide tiene una baja biodisponibilidad oral (aproximadamente el 1,93%)22, lo que dificulta explicar sus efectos farmacológicos únicamente mediante la absorción directa. La evidencia emergente sugiere que Specnuezhenide puede ser metabolizado rápidamente por la microbiota intestinal, y su actividad farmacológica puede estar mediada a través de vías dependientes de la microbiota intestinal19. Basándose en estas consideraciones, se planteó la hipótesis de que Specnuezhenide alivia la DN modulando la microbiota intestinal y las vías posteriores de estrés inflamatorio y oxidativo. Para probar esta hipótesis, evaluamos los efectos dependientes de la dosis de Specnuezhenide en ratones db/db, seleccionando dosis basándonos en experimentos preliminares y estudios farmacológicos previos.
Por ello, este estudio tuvo como objetivo evaluar el posible impacto y mecanismo de Specnuezhenide en el contexto de la DN, con especial atención a su capacidad para mitigar la inflamación renal y el estrés oxidativo a través del eje intestino-riñón. Este estudio contribuye a esclarecer los mecanismos por los cuales la Specnuezhenida contribuye a la prevención y tratamiento de la DN.
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El Comité de Ética de la Universidad de Medicina China de Shanxi aprobó este estudio (2022DW167). Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
Experimentos con animales
Los ratones machos de db/db, de entre 8 y 9 semanas, se obtuvieron de una fuente comercial. Los ratones fueron alojados en la sala de animales de nivel SPF del Centro de Manejo Experimental de la Universidad de Medicina China de Shanxi y mantuvieron una humedad estable del 55% ± 5% y un ambiente cómodo de 25 °C ± 1 °C, con un ciclo de luz y oscuridad de 12/12 horas y acceso improvisado a alimentos y agua. Antes del experimento, todos los ratones estaban aclimatados durante 7 días. Criterios humanos: Los ratones que mostraron pérdida de >20% de peso corporal, estado moribundo o incapacidad para alcanzar comida o agua fueron sacrificados humanamente antes del punto final programado. Eutanasia: Todos los ratones fueron eutanasiados mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico, seguida de luxación cervical, siguiendo protocolos institucionalmente aprobados.
El ratón db/db es un modelo diabético genético espontáneo (no un modelo inducido). El éxito del modelo se confirmó a las 9 semanas de edad midiendo la glucosa en ayunas (≥16 mmol/L) y la microalbúmina en orina (positiva). Todos los ratones db/db cumplieron los criterios y no se excluyó ningún animal. Una vez establecido con éxito el modelo DN en ratones db/db, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos usando una secuencia aleatoria generada por ordenador. El investigador que realizaba los experimentos estaba ciego ante la asignación de grupos. Cada jaula albergaba solo un grupo de tratamiento para evitar la contaminación cruzada. Los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (n = 10 por grupo): el grupo de control modelo (MC), el grupo irbesartán (Irb), el grupo Specnuezhenide a baja dosis (Spe-L) y el grupo Specnuezhenide a dosis altas (Spe-H), utilizando ratones db/m (n = 10) como grupo control normal (NC). A los grupos NC y MC se les administró agua destilada. En cambio, los grupos Irb, Spe-L y Spe-H recibieron una dosis oral diaria de 43,75 mg/kg de Irbesartán, 57 mg/kg de Specnuezhenido y 114 mg/kg de Specnuezhenida, respectivamente, durante 8 semanas. La dosis de gavage se incrementó en proporción al aumento de peso corporal. Tras 8 semanas de administración, todos los ratones fueron ayunados durante la noche (12 h) con acceso libre al agua antes de la eutanasia y el suero (centrifugado a ~1500 x g durante 15 minutos y se recogió el sobrenadante), la orina (se recogió la orina de 24 horas en la jaula metabólica), las heces y los tejidos intestinales y renales se recogieron inmediatamente después de la eutanasia, congelados de repente en nitrógeno líquido, y almacenado a -80 °C hasta el análisis. Tras la recogida de datos, se rompió el ceguero para realizar análisis estadísticos.
Indicadores de sangre y orina
Los niveles séricos de LPS, SCr y BUN se midieron según las instrucciones del fabricante. La concentración de albúmina en orina a las 24 horas se detectó según las instrucciones del kit. Los niveles de glucosa sérica se midieron mediante un analizador bioquímico automático.
Detección ELISA
Las concentraciones de TNF-α, IL-6 e IL-1β en el suero de ratón se midieron utilizando un lector de microplacas modelo 352 según las instrucciones del fabricante.
Observación patológica de tejidos renales de ratón
Los tejidos intestinales y renales se fijaron en una solución de paraformaldehído al 4% durante 48 horas antes del lavado, deshidratación e incrustación de parafina. Las secciones (de 4 μm de grosor) se obtuvieron utilizando un microtomo de parafina. Tras la deparafinización, las secciones se teñieron con hematoxilina y eosina (HE) y se escanearon utilizando un escáner digital de portaobjetos de patología.
Secuenciación de ARNrn 16S
El ADN genómico bacteriano se extrajo del contenido cecal utilizando un kit de extracción de ADN de suelo basado en perlas magnéticas siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración de ADN se midió con un fluorómetro.
La región hipervariable V3–V4 del gen 16S rRNA se amplificó usando los cebadores 338F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) y 806R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′). La amplificación se realizó con una mezcla PCR Master bajo las siguientes condiciones de ciclo: una desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 minutos; 5 ciclos de 95 °C durante 30 s, 45 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; seguido de 20 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 30 s; y una extensión final a 72 °C durante 5 minutos. Los amplicones de PCR fueron posteriormente purificados mediante purificación de ADN basada en perlas magnéticas y perlas de selección de tamaño.
Las bibliotecas se construyeron usando adaptadores e índices Illumina, y la secuenciación se realizó en una plataforma de secuenciación de nueva generación (NGS) de sobremesa (2 × 250 bp en emparejamiento). Las lecturas en bruto se ensamblaron utilizando software de secuenciación de extremos emparejados, filtrados por calidad y agrupados en unidades taxonómicas operativas (OTUs) con un 97% de similitud mediante software de análisis de secuencias amplicon. Se eliminaron las secuencias quiméricas y las OTUs singleton. La taxonomía fue asignada por BLAST frente a la base de datos RDP (para bacterias) y UNITE (para hongos).
La diversidad alfa se calculó usando Mothur v3.8.31. La diversidad beta se evaluó mediante análisis de coordenadas principales (PCoA) basándose en distancias de Bray-Curtis utilizando el encapsulado vegano R. Se realizó un análisis diferencial de abundancia con STAMP v2.1.3 y LEfSe v1.1.0. La predicción funcional se realizó utilizando PICRUSt v1.1.4.
Tinción por inmunofluorescencia
Tras la decerillada, las muestras se sometieron a una extracción de antígenos utilizando citrato de sodio a altas temperaturas durante 15 minutos, seguida de un bloque de 60 minutos con 5% de BSA. Posteriormente, se aplicaron anticuerpos primarios para la oclulina y la claudina-1 (1:500) en tejidos ileales y colónicos y se incubaron durante la noche. Posteriormente, se realizó una tinción secundaria con anticuerpos durante 60 minutos. Tras una tinción DAPI de 10 minutos, se conservaron las muestras con un reactivo antifluorescencia y se obtuvieron imágenes de inmunofluorescencia mediante un sistema automatizado de imagen por fluorescencia.
Western blot
La proteína total se extrajo utilizando tampón RIPA y se cuantificó con un kit de análisis de proteínas BCA. Las muestras (15 μL/pozo) se cargaron sobre un gel separador del 8%–12% durante aproximadamente 2 horas de electroforesis. Las proteínas se transfirieron luego a una membrana PVDF bajo condiciones de enfriamiento a 100 V durante 2 horas utilizando un sistema de transferencia húmeda. Tras el bloqueo con leche desnatada al 5%, la membrana se incubaba con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C. Tras los lavados, se aplicó un anticuerpo secundario adecuado y la membrana se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, se desarrollaron membranas en un cuarto oscuro usando quimioluminiscencia ECL y analizadas con el software ImageJ. Para la normalización, se estableció como referencia el valor medio del grupo NC. Los datos en bruto de cada muestra individual de todos los grupos experimentales se dividieron entonces por este valor medio, de modo que la media del grupo NC pasó a ser 1, y todos los demás valores se expresaron como cambio de plegamiento respecto a NC.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software SPSS 26.0, y los datos experimentales se presentan como medios ± SD. Las réplicas biológicas (n) representan ratones individuales por grupo (n = 10 para parámetros fisiológicos; n = 3 para Western blot y n = 6 para la secuenciación 16S). No se excluyeron animales ni muestras del análisis. Si la muestra cumplía con las suposiciones de una distribución normal y homogeneidad de la varianza, se utilizaba un análisis unidireccional de la varianza para comparar múltiples grupos. Cuando se confirmó la homogeneidad de la varianza, se aplicó la prueba de diferencia mínima significativa (LSD) para comparaciones por pares; de lo contrario, se utilizó la prueba T3 de Dunnett. Dada la naturaleza exploratoria del estudio, no se aplicó corrección adicional para comparaciones múltiples en diferentes puntos finales. Se indicó una diferencia estadísticamente significativa cuando la P < 0,05.
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La administración de specnuezhenida redujo los niveles de glucosa en sangre, mejoró la función renal y alivió la lesión renal en ratones con DN
Los ratones modelo DN fueron tratados con Specnuezhenide durante 8 semanas tras un modelado exitoso. Los ratones del grupo MC mostraron aumentos notables en los niveles de glucosa sérica, mientras que los del grupo Specnuezhenide mostraron una disminución significativa (Figura 1B
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La DN, una complicación microvascular persistente de la diabetes, se caracteriza por una excreción elevada de albúmina urinaria y función renaldeteriorada 24. La albuminuria es un indicador clínico temprano frecuentemente utilizado de la progresión del DN25. Los pacientes con DN pueden presentar función renal anormal, como lo demuestra un aumento significativo en los niveles de SCr yBUN 26. En este estudio, el grupo ...
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Los autores afirman que no tienen intereses financieros en competencia ni relaciones personales conocidas que pudieran influir en el trabajo reportado en este artículo.
Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º 81973486 y 82173974), los proyectos de investigación de la Administración de Medicina Tradicional China de la provincia de Shanxi (n.º 2024ZYYA021) y el Proyecto Disciplinario de la Universidad de Medicina China de Shanxi (n.º 2026XK24).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Albustix | Guangzhou Huadu Gaoerbo Biotechnology Co., Ltd. | 20211203 | |
| Analytical balance | Beijing Sartorius Instrument System Co., Ltd. | CPA | |
| antibodie A20 | Cell Signalling Technology | 5630s | (1:1000) |
| antibodie Bax | Cell Signalling Technology | 2772s | (1:1000) |
| antibodie Bcl-2 | Cell Signalling Technology | 3498s | (1:1000) |
| antibodie claudin 1 | Abcam | EPR25359-48 | (1:1000) |
| antibodie COX2 | Proteintech Group | 12375-1-AP | (1:2000) |
| antibodie GAPDH | Abcam | EPR16891 | (1:10000) |
| antibodie GCLC | Proteintech Group | 12601-1-AP | (1:10000) |
| antibodie HO-1 | Proteintech Group | 10701-1-AP | (1:10000) |
| antibodie IκBα | Cell Signalling Technology | 4812s | (1:1000) |
| antibodie Myd88 | Abcam | EPR21824 | (1:1000) |
| antibodie NF-κB p65 | Cell Signalling Technology | 8242s | (1:1000) |
| antibodie NLRP3 | Proteintech Group | 68102-1-Ig | (1:5000) |
| antibodie NQO1 | Proteintech Group | 11451-1-AP | (1:5000) |
| antibodie Nrf2 | Proteintech Group | 16396-1-AP | (1:5000) |
| antibodie occludin | Cell Signalling Technology | 91131S | (1:1000) |
| antibodie p-IκBα | Cell Signalling Technology | 2859s | (1:1000) |
| antibodie p-NF-κB p65 | Cell Signalling Technology | 3033s | (1:1000) |
| antibodie TAX1BP1 | Proteintech Group | 14424-1-AP | (1:2000) |
| antibodie TLR4 | GeneTex | GTX75742 | (1:1000) |
| antibodie TRAF6 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8409 | (1:1000) |
| antibodie ZO-1 | Proteintech Group | 21773-1-AP | (1:10000) |
| Automatic biochemical analyzer for blood glucose measurement | Biobase Biodusty (Shandong) Co., Ltd. | BK-280 | |
| blood urea nitrogen | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C03-2-1 | |
| Centrifugal machine | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | HI650 | |
| db/db mice (8-9 week-old male) | Changzhou Kavens Laboratory Animal Co., Ltd. | SCXK (Su) 2021-0013 | |
| IL-1β ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | EM0109 | |
| IL-6 ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | EM1158 | |
| Irbesartan | Zhejiang Huahai Pharmaceutical Co., Ltd. | 0000019353 | |
| LPS | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. | MM-0634M1 | |
| microscope | Olympus Corporation | BX53 | |
| microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM 2016 | |
| Organized pizza slicing machine | Wuhan Junjie Electronic Co., Ltd | JK-6 | |
| Paraffin slicing machine | RWD Life Science Co., Ltd. | S710 | |
| Pathological slide scanner | Ningbo Konfoong Bioinformation Tech Co., Ltd. | KFBIO PRO-005 | |
| serum creatinine | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C011-2-1 | |
| Specnuezhenide | National Institutes for Food and Drug Control | 39011-92-2 | pureza >98% |
| SPSS statistics 26.0 | |||
| Tissue Embedding Center | Wuhan Junjie Electronic Co., Ltd | JB-P5 | |
| Tissue Processor | Wuhan Junjie Electronic Co., Ltd | JT-12J | |
| TNF-α ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | ER1393 | |
| urinary protein | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | EM0632 |
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