Protocolo optimizado de transfección inversa para la entrega de ARNm de telomerasa a fibroblastos humanos en etapa temprana de senescencia

Resumen

Este artículo presenta un protocolo optimizado de transfección inversa para la entrega eficiente de ARNm modificado de nucleósidos de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) (ARNm de hTERT) en fibroblastos humanos senescentes. El pre-recubrimiento de las superficies de cultivo con complejos de ARNm de hTERT y lípidos mejora la captación, permitiendo la activación de la telomerasa, la elongación de los telómeros y una rejuvenecimiento parcial. Las culturas finalmente reingresan a la senescencia o crisis sin llegar a la inmortalización.

Resumen

La senescencia celular está asociada con alteraciones profundas en la fisiología celular, incluida la reducción de la fluidez de la membrana, el tráfico endosomal deteriorado, la capacidad endocítica disminuida y el aumento de la actividad de RNasas extracelulares, todo lo cual dificulta la entrega eficiente de ARNm. Estas barreras han limitado la aplicación de enfoques basados en ARN en células senescentes, particularmente para la entrega de transcritos terapéuticos grandes. Este protocolo describe un método de transfección inversa optimizado para la entrega eficiente de ARN mensajero (ARNm) modificado en fibroblastos humanos senescentes. Aunque se utilizó ARNm de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) como transcrito modelo, el procedimiento es ampliamente aplicable a otros ARNm. A diferencia de los métodos convencionales de transfección, en los que los complejos de ARN y lípidos se añaden al medio de cultivo tras la adhesión celular, la transfección inversa deposita los complejos sobre la superficie de cultivo antes de la siembra celular, lo que permite una interacción directa entre las células en proceso de adhesión y los complejos de transfección. Para maximizar la eficiencia de transfección, el protocolo incorpora ARNm con nucleósidos modificados que contienen pseudouridina y 5-metilcitosina, colas poli(A) extendidas, temporización optimizada de la formación de complejos, inhibición de RNasas, elevación transitoria del pH endosomal con cloroquina, mayor densidad de siembra celular y períodos de incubación prolongados. Mediante este enfoque, se lograron eficiencias de transfección de aproximadamente 50%–80% en fibroblastos senescentes tras la entrega de un transcrito de ARNm hTERT de 5 kb. La actividad máxima de telomerasa se detectó entre 24 y 48 h tras la transfección. Un solo ciclo de transfección produjo alargamiento medible de los telómeros, mientras que tres transfecciones sucesivas dieron lugar a una extensión telomérica sustancial pero finita. Se detectó una reversión parcial de los fenotipos asociados a la senescencia dentro de las 72–96 h, incluida la reducción de la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia, la disminución de la expresión de p16 y p21, la restauración de la morfología celular y la extensión de la longevidad replicativa. El ARNm hTERT entregado se degradó dentro de las 72–96 h, y no se observó inmortalización. Este protocolo proporciona un enfoque práctico para la entrega transitoria de ARNm en células senescentes y podría adaptarse a una amplia variedad de tipos celulares y especies.

Introducción

El enfoque de transfección inversa representa una adaptación metodológica fundamental para las células senescentes, que supera las barreras básicas que estas células presentan frente a los métodos estándar de transfección. A diferencia de la transfección directa, en la que las células se siembran previamente y se les permite adherirse antes de añadir los complejos de transfección, la transfección inversa consiste en añadir células en suspensión directamente sobre complejos preformados de ARNm de hTERT y lípidos. Esta técnica aumenta drásticamente la eficiencia de transfección en células senescentes al maximizar la exposición a los complejos de transfección durante la fase crítica de adhesión, cuando la remodelación de la membrana es más activa.

El cambio conceptual fundamental del protocolo consiste en tratar a las células senescentes como un problema de administración distinto, y no simplemente como versiones difíciles de transfectar de células jóvenes. En la senescencia, los cambios globales en la composición lipídica de la membrana, incluyendo fosfolípidos, esfingolípidos y colesterol, alteran la fluidez de la membrana, la curvatura y las interacciones proteína-lípido, al tiempo que contribuyen al fenotipo secretor asociado a la senescencia^1,2,3. Las células senescentes también presentan una endocitosis mediada por clatrina y caveolas reducida y una ruta endocítica alterada, impulsadas en parte por la regulación negativa de la anfifisina-1 y cambios compensatorios en la expresión de caveolina, lo que atenúa la captación y señalización mediadas por receptores^4,5,6. Paralelamente, el eje de endosomas tardíos-lisosomas regulado por Rab7 y la red más amplia endosomal-autofágica-lisosomal (EAL) se desregulan, siendo Rab7 un regulador maestro de la maduración endolisosomal y de la fusión autofagosoma-lisosoma, procesos que se alteran en el envejecimiento y la neurodegeneración⁷.

Las células senescentes suelen sobreexpresar múltiples componentes del sistema de procesamiento y adaptación lisosomal (LYPAS), incluyendo la biogénesis lisosomal impulsada por TFEB/TFE3 y la autofagia mediada por chaperonas, aumentando así la masa lisosomal. Sin embargo, los lisosomas individuales presentan con frecuencia un pH luminal elevado, daño en la membrana y una capacidad proteolítica alterada, lo que contribuye a la disfunción lisosomal a pesar de su mayor abundancia^8,9,10,11. En conjunto, estos cambios pueden canalizar más eficientemente el material internoizado hacia compartimentos endolisosomales degradativos, aumentando la probabilidad de que el ARN o la proteína entregados sean degradados antes de una liberación citosólica productiva^9,10,11. La transfección inversa dirige directamente el complejo al período más temprano en el que las membranas están remodelándose, durante la adhesión, forzando un contacto sostenido y de alta afinidad entre las células y los complejos de ARNm-lípidos, y al menos en parte evita la endocitosis en estado estacionario alterada en células senescentes completamente adheridas^4,5,6,12.

Desde el punto de vista del diseño del ARN, el protocolo asume que, en un contexto de envejecimiento, una base simple con caperuza y cola es insuficiente: se considera imprescindible la modificación completa de los nucleósidos (por ejemplo, pseudouridina o N1‑metilpseudouridina más 5‑metilcitosina) para desacoplar la traducción de la detección por los receptores tipo Toll endosomales y la inducción del interferón de tipo I. Trabajos fundamentales demostraron que la incorporación de nucleósidos modificados en el ARN suprime la activación de TLR3, TLR7 y TLR8 y reduce notablemente la producción de citocinas por las células dendríticas, proporcionando una base mecanicista para la menor inmunogenicidad innata de las actuales plataformas de ARNm modificado¹³. Revisiones más recientes sobre vacunas ARNm–LNP y medicamentos basados en ARNm destacan la ingeniería coordinada de la caperuza 5′, las regiones no traducidas (UTR), la secuencia codificante y la cola poli(A) para aumentar la estabilidad y la traducción in vivo mientras se minimiza la activación inmune innata¹⁴. En particular, la longitud y la arquitectura de la cola poli(A) han surgido como determinantes clave de la estabilidad y el rendimiento traduccional del ARN mensajero transcrito in vitro, lo que motiva diseños de colas poli(A) alargadas o ingenierizadas en el ARNm terapéutico¹⁵.

Sobre esta base, el protocolo incorpora explícitamente protección contra las RNasas extracelulares y endosomales durante la formación del complejo y su incorporación, junto con una ventana definida de escape endosomal mediante un agente lisosomotrópico transitorio, como la cloroquina^16,17. La cloroquina se ha utilizado desde hace tiempo como sonda funcional para evaluar las barreras endosomales y puede aumentar notablemente la interacción con el blanco y el silenciamiento mediante ARNip o oligonucleótidos antisentido al promover la alteración de la membrana endosomal y el escape de la carga de ácidos nucleicos hacia el citosol¹⁸. Al mismo tiempo, imágenes en células vivas y de superresolución del ARNm entregado mediante nanopartículas lipídicas (LNP) han demostrado que la entrega productiva está fuertemente limitada por eventos de escape poco frecuentes desde los endosomas tempranos o de reciclaje, más que por la incorporación inicial en sí, lo que resalta la importancia de diseñar deliberadamente un paso de escape endosomal para los terapéuticos basados en ARNm¹⁹.

En conjunto, estas alteraciones asociadas a la senescencia en la dinámica de la membrana, el tráfico endocítico, el procesamiento lisosomal y la activación inmune innata crean barreras sustanciales para una entrega eficiente de ARNm. La estrategia de transfección inversa descrita aquí fue desarrollada para abordar estas limitaciones mediante la combinación de una ingeniería optimizada del ARNm, protección frente a ribonucleasas, escape endosomal mejorado y exposición directa de las células en adhesión a complejos preformados de ARNm y lípidos. Aunque se utiliza ARNm de hTERT como carga modelo, el procedimiento es ampliamente aplicable a la entrega de otros transcritos terapéuticos grandes de ARNm a poblaciones celulares senescentes y de difícil transfección^20,21,22.

Protocolo

1. Transcripción in vitro de ARNm de hTERT

1. Transcripción in vitro (IVT) con ARCA y ΨUTP
   1. Prepare una reacción de IVT de 20 µL según la Tabla 1. Ajuste linealmente la reacción si se requiere un mayor rendimiento.
   2. Combine todos los componentes de la reacción excepto la ARN polimerasa T7 en un tubo libre de RNasas. Añada la ARN polimerasa T7 al final, mezcle suavemente y centrifugue brevemente el tubo.
   3. Incube la reacción a 37 °C durante 0,5–4 h.
      NOTA: Ajuste el tiempo de incubación según la longitud de la plantilla. Incube las reacciones con plantillas más cortas (aproximadamente 500 pb) durante aproximadamente 30 min y las reacciones con plantillas más largas (aproximadamente 4 kb) durante 3–4 h.
2. Tratamiento con DNasa
   1. Añada 1 µL de DNasa I libre de RNasas directamente a la mezcla de reacción de IVT.
   2. Incube la reacción a 37 °C durante 15 min.
      NOTA: El tratamiento con DNasa debe realizarse directamente en la reacción de IVT sin purificación previa del ARNm sintetizado.
3. Purificación del ARNm
   1. Añada 115 µL de H₂O libre de nucleasas para diluir la mezcla de reacción.
   2. Purifique el ARNm utilizando un kit de limpieza de ARN según las instrucciones del fabricante.
   3. Eluya el ARNm purificado en 20–30 µL de H₂O libre de nucleasas.
   4. Mida la pureza del ARNm mediante espectrofotometría y verifique la integridad del ARN mediante electroforesis en un gel de agarosa desnaturalizante al 1,0–1,5 % o en un gel de poliacrilamida de baja concentración.
4. Adición de cola poli(A)
   1. Prepare una reacción de adición de cola poli(A) de 50 µL según la Tabla 2. Mezcle suavemente los componentes de la reacción e incube a 37 °C durante 30–60 min.
      NOTA: Ajuste el tiempo de incubación según la cantidad de ARN utilizado.
   2. Detenga la reacción añadiendo 2 µL de EDTA 0,5 M (pH 8,0).
5. Purificación final y control de calidad
   1. Purifique el ARNm con cola poli(A) utilizando un kit de limpieza de ARN según las instrucciones del fabricante.
   2. Eluya el ARNm purificado en 20–30 µL de H₂O libre de nucleasas.
   3. Evalue la calidad del ARNm antes de proceder a la transfección
      1. Mida la concentración del ARNm a 260 nm y determine la pureza utilizando las relaciones A260/A280 y A260/A230. Utilice preparaciones de ARNm con valores de A260/A280 de aproximadamente 2,0 y valores de A260/A230 superiores a 2,0.
      2. Evalue la integridad del ARNm mediante electroforesis en gel o un sistema de análisis de ARN según las instrucciones del fabricante.
      3. Confirme la longitud de la cola poli(A) mediante RT-PCR o análisis en Bioanalyzer. Verifique que la longitud de la cola poli(A) esté entre 120 y 200 nucleótidos.
      4. Aliquote el ARNm purificado y almacene los alícuotas a −80 °C para minimizar los ciclos de congelación-descongelación.

2. Transfección inversa

1. Día −1: Preparación previa a la transfección
   1. Verificar el fenotipo senescente
      1. Realizar la tinción de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) en una muestra representativa de células. Verificar que más del 70 % de las células sean positivas.
      2. Confirmar la expresión de los marcadores de senescencia (p16 y p21) mediante qRT-PCR o inmunofluorescencia.
      3. Determinar la viabilidad celular y verificar que supere el 90 %.
   2. Preparar los reactivos
      1. Calentar previamente el medio de cultivo completo a 37 °C.
      2. Calentar previamente la solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C.
      3. Preparar medio Opti-MEM I fresco.
         NOTA: No añadir inhibidor de RNasas al Opti-MEM I antes de su uso.
2. Día 0: Día de la transfección
   NOTA: Dejar aproximadamente 3 h desde la preparación de los reactivos hasta la incubación de las células transfectadas.
   1. Preparación del ARNm de hTERT
      1. Descongelar el ARNm de hTERT sobre hielo. Medir la concentración de ARNm y utilizar preparaciones con concentraciones entre 0,5 y 1,0 µg/µL.
      2. Diluir la cantidad deseada de ARNm de hTERT en Opti-MEM I según el formato de cultivo utilizado (Tabla 3). Añadir inhibidor de RNasas hasta una concentración final de 0,5–1,0 U/µL y mezclar suavemente.
      3. Mantener el ARNm diluido sobre hielo hasta la formación del complejo.
         NOTA: Añadir el inhibidor de RNasas inmediatamente antes de su uso. No almacenar el ARNm con inhibidor de RNasas, ya que su actividad disminuye tras congelarlo.
   2. Preparación del reactivo de transfección
      1. Mezclar 6,0 µL del reactivo de transfección con 100 µL de Opti-MEM I en un tubo estéril libre de RNasas. Mezclar suavemente mediante pipeteo.
      2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min.
         NOTA: Para constructos grandes de ARNm de hTERT (~5 kb), optimizar las relaciones entre reactivo y ARNm entre 0,4 y 0,6 µL de reactivo por cada 100 ng de ARNm.
   3. Formación del complejo ARNm-lípido
      1. Añadir la solución diluida de ARNm de hTERT (100 µL) a la solución diluida del reactivo de transfección (106 µL). Mezclar suavemente mediante pipeteo 5–6 veces.
      2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15–20 min.
      3. No superar los 30 min de complejación.
      4. Verificar la formación exitosa del complejo por la aparición de una solución ligeramente turbia.
         NOTA: Realizar la preparación de las células durante el período de complejación.
   4. Preparación de las células para la transfección inversa
      1. Aspirar el medio de cultivo de los cultivos celulares senescentes.
      2. Lavar las células una vez con PBS precalentado (2 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos).
      3. Añadir 500 µL de tripsina-EDTA al 0,05 % por pocillo.
      4. Incubar las células a 37 °C durante 3–5 min.
      5. Neutralizar la tripsina con 3 mL de medio completo que contenga suero.
      6. Triturar suavemente las células para obtener una suspensión de células individuales.
      7. Determinar el número de células utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado.
      8. Preparar una suspensión que contenga 2,0–2,5 × 10⁵ células por pocillo en medio completo.
         NOTA: Evitar una tripsinización prolongada porque las células senescentes son altamente susceptibles al estrés mecánico. Mantener las células en suspensión; no sembrarlas previamente antes de la transfección inversa.
   5. Transfección inversa
      1. Preparación de la placa de cultivo
         1. Añadir 500 µL de poli-L-lisina al 0,01 % a cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
         2. Aspirar la solución de recubrimiento inmediatamente antes de su uso.
         3. Añadir 200 µL del complejo ARNm de hTERT-lípido al centro de cada pocillo.
         4. Incubar la placa a 37 °C y 5 % de CO₂ durante 30 min.
            NOTA: Realizar el recubrimiento de la placa en paralelo con la formación del complejo y la preparación de las células.
      2. Preparación de la suspensión celular
         1. Suspender 2,0–2,5 × 10⁵ células en 1800 µL de medio completo sin antibióticos.
         2. Resuspender suavemente las células para obtener una suspensión uniforme de células individuales.
            NOTA: Utilizar medio sin antibióticos durante la transfección.
      3. Siembra celular sobre los complejos
         1. Añadir 1800 µL de la suspensión celular directamente sobre los complejos preformados de ARNm de hTERT-lípido.
         2. Inclinar suavemente la placa 2–3 veces en cada dirección para distribuir las células uniformemente.
            NOTA: No pipetear la suspensión tras añadir las células, ya que podría alterar los complejos ARNm-lípido.
      4. Incubación celular
         1. Incubar las células a 37 °C en un incubador humedecido con 5 % de CO₂ durante 6–8 h.
         2. Monitorear la adhesión celular mediante microscopía de luz 2–3 h después de la transfección.
         3. Verificar que las células estén distribuidas uniformemente y comiencen a adherirse a la superficie del cultivo.
            NOTA: Un número excesivo de células flotantes o restos celulares podría indicar citotoxicidad asociada a la transfección.

3. Mitigación de la citotoxicidad

1. Reduzca el período de exposición a la transfección a 48 h si la pérdida celular supera el 20%.
2. Suplemente los cultivos con 10 µM del inhibidor de ROCK Y-27632 durante el período de transfección para mejorar la supervivencia celular.
3. Después de 6–8 h de transfección, aspire cuidadosamente el medio de transfección minimizando la perturbación de las células parcialmente adheridas. Deje aproximadamente 100 µL de medio residual en cada pocillo.
4. Añada 1 mL de medio de crecimiento completo fresco, previamente calentado y suplementado con 15% de FBS, a cada pocillo.
5. Añada cloroquina hasta una concentración final de 10–20 µM inmediatamente después del reemplazo del medio.
6. Incube los cultivos durante 2 h adicionales a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 5% de CO₂.
7. Reemplace el medio que contiene cloroquina por medio de crecimiento completo fresco.
8. Devuelva los cultivos al incubador para continuar el crecimiento.
   NOTA: Monitoree la morfología celular y la viabilidad durante todo el período de recuperación. Una desprendimiento celular excesivo o la presencia de detritos pueden indicar citotoxicidad asociada a la transfección.

4. Análisis posterior a la transfección

1. Evalúe la expresión de la proteína TERT entre 24 y 48 h después de la transfección.
2. Mida los niveles de la proteína TERT mediante inmunotransferencia (western blotting) o tinción por inmunofluorescencia según procedimientos de laboratorio estándar.
3. Mida la actividad de la telomerasa durante el mismo intervalo utilizando un ensayo adecuado de actividad de telomerasa.
   NOTA: La actividad de la telomerasa generalmente disminuye después de 48 h debido a la degradación del ARNm de hTERT entregado de forma transitoria.
4. Evalúe la longitud de los telómeros entre 48 y 72 h después de la transfección utilizando PCR cuantitativa multiplex monocromática (MMqPCR) o un método equivalente de análisis de longitud de telómeros.
   NOTA: Puede observarse alargamiento detectable de los telómeros tras una entrega exitosa del ARNm de hTERT.
5. Evalue los fenotipos asociados con la senescencia y los asociados con la rejuvenecimiento 7 días después de la transfección
   1. Mida la actividad de la β-galactosidasa asociada con la senescencia (SA-β-gal).
   2. Mida los niveles de expresión de p16 y p21.
   3. Evalúe la expresión de Ki67.
   4. Examine la morfología celular mediante microscopía de luz.
      NOTA: Compare los cultivos tratados con controles senescentes no tratados o transfectados con control ficticio (mock) para evaluar los cambios en los fenotipos asociados con la senescencia y las características proliferativas.

5. Protocolo de dosificación repetida (Opcional)

1. Realice la transfección inicial según se describe en las secciones 2–4.
2. Repita las transfecciones según el siguiente cronograma: Día 0: Primera transfección; Día 5: Segunda transfección; Día 10–12: Tercera transfección.
3. Mantenga las células como cultivos adherentes y no las trypsinice antes de las transfecciones subsiguientes.
4. Prepare complejos frescos de ARNm-hTERT con lípidos según se describe en las secciones 2.2.1–2.2.3.
5. Aspire el medio de cultivo de cada pocillo.
6. Añada directamente 200 µL de complejos de ARNm-hTERT con lípidos a cada pocillo.
7. Añada inmediatamente después 800 µL de medio F-10 completo fresco tras la adición de los complejos.
8. Incube las células durante 4–6 h a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 5% de CO₂.
9. Sustituya el medio de transfección por medio completo fresco.
   NOTA: Limite el tratamiento a un máximo de tres ciclos de transfección para minimizar la citotoxicidad acumulativa asociada a la transfección.

6. Protocolo de transfección directa (2 µg/mL, formato de 6 pocillos)

1. Día −1: Siembra celular
   1. Desprender los fibroblastos senescentes o en pre-senescentes utilizando tripsina-EDTA al 0,05 %.
   2. Neutralizar la tripsina con medio de cultivo completo.
   3. Determinar el número y la viabilidad celular.
   4. Sembrar las células en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,0–2,5 × 10⁵ células por pocillo.
   5. Incubar las células durante la noche a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 5 % de CO₂ hasta que alcancen aproximadamente un 60–80 % de confluencia.
2. Día 0: Preparación de complejos de ARNm hTERT–reactivo
   1. Descongelar una alícuota de ARNm hTERT modificado con nucleósidos sobre hielo.
   2. Diluir el ARNm hTERT en Opti-MEM hasta una concentración final de 2 µg/mL en un tubo estéril libre de RNasas (Tubo A).
   3. Añadir inhibidor de RNasas al Tubo A hasta una concentración final de 0,5–1,0 U/µL y mezclar suavemente.
   4. Diluir el reactivo de transfección en Opti-MEM en un segundo tubo libre de RNasas (Tubo B), utilizando 0,4–0,6 µL de reactivo por cada 100 ng de ARNm.
   5. Añadir el contenido del Tubo B gota a gota al Tubo A mientras se mezcla suavemente.
   6. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15–20 min.
3. Día 0: Transfección directa
   1. Verificar que las células presenten una confluencia del 60–80 % y una morfología saludable.
   2. Aspirar el medio de cultivo.
   3. Lavar las células una vez con 1–2 mL de PBS precalentado.
   4. Añadir 0,5 mL de medio completo o con reducción de suero, previamente calentado, a cada pocillo.
   5. Opcionalmente, añadir cloroquina hasta una concentración final de 10–20 µM.
   6. Añadir 0,5 mL de los complejos de ARNm hTERT–reactivo preparados en el paso 6.2.6 a cada pocillo.
   7. Balancéar suavemente la placa para distribuir los complejos de forma uniforme.
   8. Incubar las células durante 4–6 h a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 5 % de CO₂.
      ​NOTA: Extender el periodo de incubación a 6–8 h para células senescentes si es necesario.
   9. Aspirar el medio de transfección.
   10. Añadir 2,0 mL de medio completo fresco a cada pocillo.
   11. Realizar los análisis posteriores a la transfección según se describe en la Sección 4.
       NOTA: Utilizar el mismo lote de ARNm hTERT, reactivo de transfección y dosis nominal al comparar condiciones de transfección directa e inversa.

Resultados

El ARNm modificado d2EGFP-T2A-hTERT fue diseñado como un marco de lectura abierto híbrido en el que un reportero de EGFP inestable (d2EGFP) se unió a la TERT humana mediante un péptido autoinstituyente T2A. Las secuencias completas de nucleótidos y proteínas de todos los constructos se proporcionan en el Archivo Suplementario 1. La secuencia codificante estuvo flanqueada por una región no traducida (UTR) 5′ sintética y la UTR 3′ de la β-globina humana para aumentar la eficiencia traduccional y la estabilidad del ARNm (Figura 1A). El casete de expresión también contenía una secuencia sintética estabilizadora de enzimas (Es) y una secuencia sintética potenciadora de la transcripción (TEs), diseñadas para mejorar la procesividad de la ARN polimerasa T7 y reducir la terminación prematura de la transcripción. Tras la clonación aguas abajo de un promotor T7, se realizó la transcripción in vitro utilizando un análogo de caperuza antiinversión (ARCA) y nucleótidos modificados (m5CTP y ΨUTP), seguida de la adición enzimática de una cola poli(A) (aproximadamente 120–200 nt) para generar un ARNm modificado d2EGFP-T2A-hTERT con caperuza, poliadenilado y de alta integridad (Figura 1A).

El análisis automatizado electroforético de ARN confirmó la síntesis eficiente del transcrito, revelando una especie de ARN predominante del tamaño esperado con productos mínimos de degradación en múltiples cantidades de entrada, lo que es consistente con la generación exitosa de modARN de longitud completa (Figura 1B). Tras la transfección de fibroblastos LF1 en senescencia temprana con 2 µg/mL de modARN d2EGFP-T2A-hTERT, la proteína hTERT se volvió detectable dentro de las 24 h y se mantuvo elevada durante 48–96 h, lo que indica una traducción sostenida del transcrito sintético (Figura 1C). El análisis del reportero d2EGFP acoplado mostró una fluorescencia robusta tras la transfección inversa, mientras que se observó una fluorescencia considerablemente menor tras la transfección directa (Figura 1D,E). Estos hallazgos indican una mayor entrega y expresión del modARN hTERT mediante el enfoque de transfección inversa en fibroblastos LF1 en senescencia temprana.

La transfección repetida hacia adelante (FT) de fibroblastos LF1 en senescencia temprana con modRNA d2EGFP-T2A-hTERT a intervalos de 5 días produjo un aumento progresivo en la longitud media de los telómeros (rT/S) en comparación con los controles transfectados simuladamente, según se midió mediante PCR cuantitativa multiplex monocromática (MMqPCR) (Figura 2A). La relación rT/S aumentó tras cada ciclo de FT, con una significancia estadística que mejoró de *P < 0,05 a **P < 0,01.

La aplicación del mismo esquema de dosificación utilizando transfección inversa (TI) provocó un aumento más pronunciado en la longitud de los telómeros. La relación rT/S aumentó tras cada ciclo de TI y alcanzó diferencias altamente significativas en comparación con los controles transfectados simuladamente (*P < 0,05 hasta ****P < 0,0001) (Figura 2B). La comparación directa entre FT y TI tras tres ciclos de tratamiento demostró que ambos enfoques aumentaron significativamente los valores de rT/S en relación con los controles transfectados simuladamente; sin embargo, la TI produjo un mayor aumento que FT bajo condiciones idénticas de dosificación y temporización (*P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001) (Figura 2C).

El análisis de crecimiento a largo plazo demostró además que la administración repetida de modARNhTERT extendió la longevidad replicativa (Figura 2D). Las células que recibieron uno, dos o tres ciclos de tratamiento mostraron duplicaciones poblacionales acumulativas progresivamente mayores en comparación con los controles transfectados simuladamente. Los cultivos que recibieron tres rondas de tratamiento con modARNhTERT, particularmente mediante RT, mostraron la mayor divergencia respecto a las curvas de crecimiento del control durante aproximadamente 250 días (hasta ****P < 0,0001). Los cálculos de duplicación poblacional se muestran en el Archivo Suplementario 2.

Los fibroblastos LF1 en senescencia temprana transfectados con ARNm-d2EGFP-T2A-hTERT mostraron una marcada escalera de amplificación TRAP 48 h después de la transfección, mientras que las células tratadas con ARNm de control o con ARNm-eGFP presentaron solo una señal de fondo, lo que indica que la actividad de la telomerasa se originó a partir de la expresión exógena de hTERT (Figura 3A). El pretratamiento con calor abolió el patrón de escalera, confirmando la especificidad del ensayo (Figura 3B).

El análisis de curso temporal demostró que la actividad de la telomerasa alcanzó su punto máximo entre 24 y 48 h después de la transfección y posteriormente disminuyó, volviendo a niveles cercanos a la línea base entre 72 y 96 h (Figura 3C). El aumento de la concentración de modRNA de hTERT de 50 a 3.000 ng/mL produjo un incremento correspondiente en la intensidad de la señal TRAP, lo que demuestra una activación de la telomerasa dependiente de la dosis (Figura 3D).

El análisis funcional mediante el uso de construcciones de hTERT de tipo salvaje, inactiva catalíticamente (IC) y deficiente en la señal de localización nuclear (ΔNLS) demostró que solo el hTERT de tipo salvaje generó una actividad telomerasa robusta. Ambas variantes, IC y ΔNLS, no lograron inducir una actividad comparable a pesar de condiciones de entrega similares (Figura 3E). En concordancia con estos hallazgos, el análisis mediante MMqPCR reveló un aumento notable en la longitud media de los telómeros (rT/S ≈ 1,4) únicamente en las células que recibieron modRNA de hTERT de tipo salvaje. Las células que recibieron hTERT-IC, hTERT-ΔNLS o tratamiento simulado permanecieron cerca de los niveles basales (rT/S ≈ 0,3; ****P < 0,0001) (Figura 3F).

Tres rondas secuenciales de transfección inversa con modARNhTERT a intervalos de 5 días redujeron significativamente la proporción de células positivas para β-galactosidasa asociada a senescencia. El porcentaje de células positivas disminuyó de aproximadamente el 85 % en cultivos tratados con control a aproximadamente el 40 % en cultivos tratados con hTERT a los 15 días después de la transfección final (***P < 0,001) (Figura 4A).

La inmunotinción confocal reveló un aumento en la expresión de Ki67 en las células que recibieron tres rondas de transfección inversa de hTERT en comparación con los controles tratados con placebo, lo que indica una mayor actividad proliferativa (Figura 4B). El análisis mediante RT-qPCR demostró además una reducción en la expresión de los marcadores asociados a la senescencia p16 y p21 tras el tratamiento con hTERT. En comparación con las células senescentes tempranas tratadas con placebo, la expresión de p16 disminuyó de aproximadamente 2,3 veces a 0,7 veces, y la expresión de p21 disminuyó de aproximadamente 11 veces a 6 veces (**P < 0,01; ****P < 0,0001) (Figura 4C,D). La Figura suplementaria 1 demuestra además que el tratamiento con cloroquina (CQ) o Y-27632 por separado no alteró significativamente la expresión de p16 o p21 en células transfectadas con placebo. En contraste, la combinación de CQ y Y-27632 durante tres rondas de transfección inversa de hTERT produjo la mayor reducción tanto en la expresión de p16 como de p21 en comparación con la transfección inversa de hTERT sola o con cada agente individualmente, mientras que el tratamiento con un solo agente produjo efectos intermedios. Estos hallazgos indican que el uso combinado de CQ y Y-27632 potenció la reducción de la expresión de marcadores asociados a la senescencia tras la transfección inversa de ARNm de hTERT. En conjunto, estos resultados demuestran que la transfección inversa repetida de ARNm de hTERT promueve la alargamiento de los telómeros, reduce los marcadores asociados a la senescencia y mejora las características proliferativas en fibroblastos LF1 senescentes tempranos.

Figura 1: Diseño, síntesis y validación funcional del ARNm d2EGFP‑T2A‑hTERT en fibroblastos LF1 en senescencia temprana. (A) Diseño esquemático del constructo híbrido de ARNm hTERT que contiene el casete d2EGFP unido mediante el péptido T2A para la expresión simultánea de hTERT y EGFP inestable. El marco de lectura abierto (ORF) d2EGFP-T2A-hTERT está flanqueado por la región UTR 3’ del gen de la β-globina humana (HBB) y por la UTR 5’ sintética. El ARNm se sintetizó utilizando nucleótidos modificados, y finalmente se añadió una cola poli(A). (B) Síntesis eficaz de ARNm d2EGFP-T2A-hTERT de alta integridad mediante transcripción in vitro, analizada mediante electroforesis automatizada de ARN. (C) Análisis temporal de la expresión de la proteína hTERT mediante un inmunoensayo automatizado basado en capilares tras la transfección de 2 µg/mL de ARNm d2EGFP-T2A-hTERT. (D) Se examinó la eficacia y expresión tras la transfección de ARNm d2EGFP-T2A-hTERT, evaluada mediante la expresión de EGFP entre transfección directa (FT) y transfección inversa (RT), en fibroblastos diploides primarios en senescencia temprana (LF1). Barra de escala = 10 µm. (E) Cuantificación de la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la señal eGFP tras transfección directa o inversa. Se analizaron un total de 20 imágenes individuales para cada condición, que incluyeron 4 áreas distintas de 5 réplicas biológicas. Los datos representan medias ± DE. **P < 0,01; evaluado mediante la prueba t no pareada con corrección de Welch. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Dinámica de la longitud de los telómeros y longevidad proliferativa tras transfecciones repetidas hacia adelante frente a inversas de ARNm hTERT en fibroblastos LF1 en senescencia temprana. (A) Las longitudes medias de los telómeros (rT/S) se determinaron mediante la técnica Telomere MMqPCR. Los fibroblastos en senescencia temprana fueron transfectados hacia adelante (FT) con ARNm d2EGFP-T2A-hTERT tres veces consecutivas a intervalos de 5 días, comenzando en el Doblamiento Poblacional (PD) #76. La barra de error indica el error estándar de la media (SEM); n = 5 réplicas biológicas; *P < 0,05, **P < 0,01 comparado con células tratadas únicamente con control simulado (mock). (B) De forma similar a (A), se evaluó rT/S cuando células en senescencia temprana fueron transfectadas repetidamente (RT) con ARNm d2EGFP-T2A-hTERT tres veces consecutivas a intervalos de 5 días, comenzando en el Doblamiento Poblacional (PD) #76. La barra de error representa el SEM; n = 7 réplicas biológicas; *P < 0,05, ****P < 0,0001 comparado con células tratadas únicamente con control simulado. (C) Comparación de la longitud media de los telómeros (rT/S) tras 3 transfecciones hacia adelante y hacia atrás sucesivas a intervalos de 5 días, o solo control simulado. La barra de error representa el SEM; n = 10 réplicas biológicas; *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. (D) Curvas de crecimiento de fibroblastos LF1 transfectados con 2 µg/ml de ARNm d2EGFP-T2A-hTERT o solo control simulado, una, dos o tres veces consecutivas a intervalos de 5 días, comenzando en PD# 76. Las flechas negras indican los momentos del tratamiento. Las curvas de crecimiento se replicaron tres veces, cultivándose cada población por triplicado. Tres réplicas técnicas por muestra biológica; los datos representan medias ± DE. *P < 0,05, **P < 0,01; ****P < 0,0001, según se evaluó mediante la prueba ANOVA de Brown-Forsythe y Welch Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El ARNm de hTERT catalíticamente activo y localizado en el núcleo induce un aumento transitorio y dependiente de la dosis en la actividad de la telomerasa, que por sí solo es suficiente para promover una extensión medible de los telómeros en fibroblastos LF1 en senescencia temprana. (A) Células en senescencia temprana fueron transfectadas con ARNm de control (mock), eGFP o d2EGFP-T2A-hTERT. 48 h después de la transfección, se preparó un extracto celular a partir de 20.000 células y se sometió al ensayo TRAP. Los productos de reacción se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida nativa y se tiñeron con SYBR Green. (B) Inactivación de la telomerasa inducida por calor, medida mediante el ensayo TRAP. (C) El análisis de la actividad de la telomerasa a lo largo del tiempo en células LF1 en senescencia temprana tras la transfección con ARNm de hTERT mostró que la actividad regresó a los niveles basales dentro de las 72 h, lo que indica una activación enzimática transitoria. (D) Células LF1 en senescencia temprana recibieron cantidades variables de ARNm d2EGFP-T2A-hTERT (0–3.000 ng/mL), lo que mostró un aumento en la actividad de la telomerasa proporcional a la dosis. (E) La administración de 2 µg/ml de TERT incrementó la actividad de la telomerasa en células LF1 en senescencia temprana. La forma ΔNLS aumentó parcialmente la actividad de la telomerasa sin inducir alargamiento de los telómeros, ya que actúa en el citoplasma y no transloca al núcleo, mientras que el ARNm de TERT catalíticamente inactivo (CI) no produjo este efecto, lo que indica resultados funcionales distintos. (F) Efecto de la transfección inversa con TERT funcional, TERT deficiente en la señal de localización nuclear (ΔNLS) y TERT catalíticamente inactivo (CI) sobre las longitudes medias de los telómeros (rT/S) en células LF1 en senescencia temprana, lo que indica la importancia del TERT catalíticamente activo y localizado en el núcleo para la extensión de los telómeros. Las barras de error representan la desviación estándar (SD); n = 7 réplicas biológicas; ****P < 0,0001 en comparación con células tratadas solo con controles mock, evaluado mediante ANOVA unidireccional con corrección de Welch. El porcentaje de actividad relativa de telomerasa (RTA %) se indica en la parte inferior de cada carril. La relación entre los niveles de intensidad de las escalas de ARN TRAP y la banda ITAS (control interno - IC) se calculó mediante la siguiente fórmula para cada carril: Actividad _normalizada = Intensidad de la escala / Intensidad de IC, y cada muestra se normalizó respecto al control positivo como porcentaje (control positivo; H1299, 2.500 células) utilizando la siguiente fórmula: Actividad relativa (%) = Actividad _normalizada (muestra) / Actividad _normalizada (referencia). Se aplicó sustracción de fondo en cada paso. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: La transfección inversa optimizada con ARNm de hTERT revierte parcialmente los fenotipos asociados a la senescencia y restaura los marcadores proliferativos en fibroblastos LF1 en fase temprana de senescencia. (A) Imágenes representativas de β-células LF1 senescentes tempranas que expresan gal tras la transfección modificada de ARNm de hTERT tres veces consecutivas a intervalos de 5 días. Barra de escala = 100 µm. βLa expresión de gal se analizó 15 días después de la última transfección. Los experimentos se realizaron tres veces con >100 células por muestra puntuadas manualmente.B) Imágenes confocales representativas (aumento de 20x) de células LF1 senescentes tempranas, teñidas con el marcador de proliferación Ki67. Barra de escala = 100 µm. Aumento significativo de la expresión de Ki-67 tras 3 rondas de transfección inversa con hTERT. El porcentaje de núcleos positivos para Ki-67 aumenta significativamente tras 3× hTERT (TR). El gráfico representa la media ± Desviación estándar del recuento nuclear positivo para Ki67, normalizado a la condición transfectada con Mock. Para cada condición, se examinaron un total de 18 imágenes, seleccionándose 6 campos distintos de cada réplica biológica, para un total de n = 3 réplicas biológicas. ****P < 0.0001. (C) Expresión del marcador de senescencia tras 3× Rejuvenecimiento parcial mediado por hTERT evaluado mediante RT-qPCR (n = 6). Todos los datos representan medias ± SD. **P < 0.01; ****P < 0,0001, según se evaluó mediante la prueba t no pareada con corrección de Welch. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Componente	Volumen/Concentración final
ADN molde para PCR	200 –1000 ng
Tampón 10× IVT	2 μL
ATP (100 mM)	2 μL (10 mM final)
GTP (100 mM)	1,5 μL (7,5 mM final)
CTP (100 mM)	2 μL (10 mM final)
m1Ψ-5′-TP (100 mM)	2 μL (10 mM final) (Puede aumentar la incorporación de pseudo-UTP incorporando UTP normal en una proporción de 1:4 a 2:2 (m1Ψ-5′-TP:UTP).)
ARCA (10 mM)	4 μL (2 mM final)
Inhibidor de RNasa (40 U/μL)	0,5 μL (20 U)
Polimerasa de ARN T7 (50 U/μL)	2 μL (100 U)
H₂O libre de nucleasas	20 μL

Tabla 1: Composición de la reacción de transcripción in vitro (IVT) para la síntesis de ARNm modificado de hTERT. Se enumeran los componentes y las cantidades finales utilizados para la síntesis IVT con caperuza ARCA.

Componente	Volumen/Concentración final
ARNm purificado hasta 5 μg	≤20 μL
Buffer 10× para poliadenilación	5 μL
ATP (10 mM)	5 μL (1 mM final) (Aunque ya está en el buffer, la adición adicional ayuda a la estabilización de la cola poli A.)
Poli(A) polimerasa (5 U/μL)	1 μL (5 U)
H₂O libre de nucleasas	Hasta un volumen total de 50 μL

Tabla 2: Composición de la reacción de adición de cola poli(A) utilizada para la modificación postranscripcional del ARNm de hTERT. Se muestran los volúmenes de reactivos y las condiciones de la reacción para la generación de una cola poli(A) de 120–200 nucleótidos.

Parámetro	Formato de 12 pocillos	Formato de 6 pocillos
Área de superficie de crecimiento	~3.8 cm²	~9.5 cm²
Medio por pocillo	1.0 mL	2.0 mL
Número de siembra celular	5× 104–6.5× 104 células/ml	2.0–2.5 × 10⁵
Número promedio de células (a confluencia del 100 %)	5.7× 104–7.2× 104 células/ml	2.9–3 × 10⁵
Cantidad de transfección de ARNm	750 –1000 ng	2000–3500 ng
Agente de transfección de ARNm	1.5 – 3.0 µL	4.75 – 7 µL
Volumen final de ARNm + agente de transfección en Opti-MEM	50 µL	200 µL

Tabla 3: Parámetros recomendados de transfección para la entrega de ARNm de hTERT en formatos de cultivo de 6 y 12 pocillos. Se resumen las densidades de siembra celular, las cantidades de ARNm, los volúmenes de reactivo de transfección y los volúmenes de formación de complejos utilizados en experimentos de transfección directa e inversa.

Figura suplementaria 1: Efecto de la cloroquina y el Y-27632 sobre la expresión de p16 y p21 asociadas a la senescencia tras la transfección inversa repetida de ARNm de hTERT. (A) Análisis cuantitativo por RT-PCR de la expresión de ARNm de p16 en muestras tratadas con control negativo y 3× Fibroblastos LF1 con hTERT retrotransfectados (RT) tras el tratamiento con cloroquina (CQ), Y-27632, o su combinación, según se indica.B) Análisis cuantitativo por RT-PCR de la expresión de ARNm de p21 bajo las mismas condiciones experimentales. Los niveles de transcritos se normalizaron respecto a RpL13a y se expresaron en relación con las células control jóvenes (PD#12). Cada punto de datos representa réplicas biológicas. Los datos representan las medias ± Desviación estándar (DE) de n = 2 réplicas biológicas, con 5 réplicas técnicas por réplica biológica. La significancia estadística se indica en la figura; ns, no significativo. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0,0001, según se determinó mediante ANOVA de Brown-Forsythe y Welch. Abreviaturas: CQ, cloroquina; RT, transfección inversa; Y-27632, inhibidor de la quinasa asociada a Rho (ROCK).Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Secuencias de ADN y proteínas de los constructos de expresión de hTERT.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Cálculo del duplicado poblacional (PD). Los duplicados poblacionales (PD) se calcularon utilizando la fórmula PD = log₂ (Nf/N₀), donde N₀ es el número de células sembradas y Nf es el número de células viables recolectadas. El PD acumulado se determinó sumando los valores de PD a través de los pases.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Este estudio replantea la senescencia celular como un problema de entrega específico, y no como una variación menor de la fisiología proliferativa, y desarrolla una estrategia de transfección de ARNm de telomerasa adaptada a las restricciones biofísicas e inmunológicas del estado senescente. Las células senescentes presentan membranas rigidificadas y enriquecidas en colesterol, así como una actividad endocítica reducida, lo que crea una barrera considerable para la entrega eficiente de ácidos nucleicos. Al adoptar un enfoque de transfección inversa, este protocolo aprovecha el período transitorio de adhesión durante el cual las células senescentes experimentan remodelación de la membrana y muestran una mayor plasticidad membranal, sincronizando así el contacto entre la célula y el complejo con un período de mayor potencial de absorción^3,4. Los resultados representativos demuestran que esta estrategia mejora la entrega y expresión del ARNm modificado de hTERT en comparación con la transfección directa convencional, lo que conduce a una mayor elongación de los telómeros y a fenotipos más pronunciados asociados con la rejuvenecimiento.

Una característica central del método es una estrategia de ingeniería de ARNm multinivel diseñada para abordar tres barreras principales en las células senescentes: una señalización inmune innata elevada, una degradación aumentada del ARN y una capacidad traduccional reducida^23,24,25. La incorporación de pseudouridina y 5-metilcitosina reduce la activación de las vías de señalización TLR3, TLR7/8 y RIG-I, al mismo tiempo que mejora la estabilidad del transcrito y la eficiencia traduccional^13,26. La caperuza ARCA y la optimización de la cola poli(A) mejoran aún más la estabilidad del transcrito y el rendimiento traduccional, permitiendo una expresión transitoria pero robusta de hTERT. En consonancia con estudios previos, estas modificaciones favorecen una expresión eficiente de la telomerasa mientras minimizan la activación del sistema inmune innato asociada a la administración de ARN exógeno.

El protocolo también aborda el entorno extracelular rico en RNasas, característico de los cultivos senescentes²⁷. La protección del ARN se mejora mediante la modificación de nucleósidos, la formación de complejos lipídicos y la adición inmediata previa a la transfección de un inhibidor de RNasas. Además, el momento de la transfección inversa se ajusta a la cinética más lenta de adhesión de las células senescentes, permitiendo una interacción prolongada entre las células y los complejos de ARNm-lípidos durante la adhesión celular. Estas modificaciones mejoran colectivamente la probabilidad de una captación exitosa del material genético en una población celular que de otro modo sería difícil de transfectar.

El escape endosomal representa un segundo cuello de botella crítico para la entrega de ARNm en células senescentes. Las células senescentes presentan un contenido lisosomal aumentado y un tráfico potenciado del material endocitado hacia compartimentos de degradación^17,28. La exposición transitoria a cloroquina durante el período temprano posterior a la transfección mejora la entrega funcional al promover el escape endosomal y reducir la degradación lisosomal del ARNm internalizado. Aunque la dosis óptima y la duración de la exposición pueden variar entre tipos celulares, los resultados presentados aquí indican que potenciar el escape endosomal mejora sustancialmente la eficiencia de entrega en fibroblastos senescentes.

A nivel funcional, la administración repetida de modARNm de hTERT produjo aumentos acumulativos en la longitud relativa de los telómeros, extendió la longevidad replicativa y redujo múltiples fenotipos asociados a la senescencia. Las células que recibieron tratamiento repetido con hTERT mostraron una actividad reducida de SA-β-gal, una disminución en la expresión de p16 y p21, un aumento en la expresión de Ki67 y una mayor capacidad proliferativa en comparación con los controles transfectados con placebo. Es importante destacar que la actividad de la telomerasa permaneció transitoria, regresando a niveles cercanos a la línea base en varios días tras la transfección. Este perfil de expresión transitoria evita la modificación genética permanente y, al mismo tiempo, proporciona una actividad de telomerasa suficiente para inducir efectos biológicos medibles. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las mediciones de longitud relativa de los telómeros obtenidas mediante MMqPCR no cuantifican directamente la extensión absoluta de los telómeros. Estudios futuros que incorporen análisis de fragmentos de restricción terminales, hibridación in situ fluorescente cuantitativa, Flow-FISH o metodologías TeSLA proporcionarán una evaluación más precisa de la dinámica de la longitud de los telómeros tras la administración de ARNm de hTERT.

Varias limitaciones merecen consideración. Las poblaciones de células senescentes son inherentemente heterogéneas y pueden variar en su respuesta a la entrega de ARNm según el método de inducción de la senescencia, la fuente del donante y la historia del cultivo. En consecuencia, la eficiencia de transfección y los resultados de rejuvenecimiento pueden diferir entre sistemas experimentales. Además, la reactivación de la telomerasa aborda principalmente los aspectos dependientes de los telómeros en el envejecimiento celular y no corrige directamente todos los marcadores de la senescencia. Las alteraciones asociadas al envejecimiento, como la deriva epigenética, la disfunción mitocondrial, la proteostasis alterada y la señalización inflamatoria crónica, pueden persistir a pesar del alargamiento exitoso de los telómeros^29,30. Por lo tanto, este protocolo debe considerarse como una herramienta específica para estudiar y revertir parcialmente la senescencia impulsada por los telómeros, más que como una estrategia integral de rejuvenecimiento.

Los parámetros descritos en este protocolo tienen como finalidad servir de guías prácticas para células humanas senescentes y se desarrollaron mediante una optimización iterativa basada en estudios publicados y en la experiencia experimental. Puede ser necesario ajustar factores como la densidad celular, la relación entre el reactivo de transfección y el ARNm, el tiempo de complejación y las condiciones de escape endosomal, según el tipo celular y el entorno experimental específico. Por lo tanto, los investigadores deben considerar las condiciones descritas como un punto de partida para la optimización, y no como puntos finales universalmente aplicables.

En resumen, este protocolo proporciona un marco reproducible para la entrega de ARNm modificado de hTERT a células humanas senescentes mediante una estrategia de transfección inversa optimizada para las características fisiológicas de la senescencia. Este enfoque permite la reactivación transitoria de la telomerasa, la elongación medible de los telómeros, la extensión de la longevidad replicativa y la reversión parcial de los fenotipos asociados a la senescencia. Estudios futuros deberían evaluar la aplicabilidad de esta estrategia a otros tipos de células senescentes, investigar enfoques combinados con intervenciones complementarias de rejuvenecimiento y explorar su traslación a plataformas de administración in vivo. Como tal, este método proporciona una herramienta valiosa para investigar la biología de los telómeros, el rejuvenecimiento celular y los mecanismos de la senescencia en la investigación del envejecimiento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mezcla de nutrientes Ham's F-10	Thermo Fisher	11550043	Medio de cultivo celular.
Análogo de estructura de caperuza ARN 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G	New England Biolab	S1411L	Para la mayoría de los ARN, la estructura de caperuza aumenta la estabilidad, disminuye la susceptibilidad a la degradación por exonucleasas y promueve la formación de complejos de iniciación del ARNm.
5-Metil-Citidina-5´-trifosfato (5-Metil-CTP)	New England Biolab	N0432S	Los NTP modificados se utilizan comúnmente para reducir la inmunogenicidad del ARN en transcripciones in vitro.
Placa de 6 pocillos	Corning	351146	Para cultivar y tratar volúmenes medianos o grandes de células adherentes o en suspensión en condiciones experimentales independientes.
Anticuerpo anti-Ki67 (SP6)	abcam	ab16667	Ki67 se expresa principalmente en células proliferantes.
Kit de ensayo de senescencia celular (tinción SA-beta-gal)	cellbiolabs	CBA-230	Identificación de células senescentes mediante el ensayo de tinción SA-β-gal
Tubos LoBind de ADN de 0,5 ml	Eppendorf	022431005	Para recuperar eficientemente ADN y ARN sin pérdidas.
Tubos LoBind de ADN de 1,5 ml	Eppendorf	22431021	Para recuperar eficientemente ADN y ARN sin pérdidas.
DNasa I, libre de RNasa (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	La DNasa I, libre de RNasa, es una endonucleasa que digiere ADN de cadena sencilla y doble.
Polimerasa de poli(A) de E. coli	New England Biolab	M0276S	En Escherichia coli, la poli(A) polimerasa I (PAP I) funciona principalmente como catalizador para la adición independiente de plantilla de residuos de adenosina monofosfato (AMP) al extremo 3' de las moléculas de ARN.
Suero bovino fetal	Thermo Fisher	A5256701	Suplemento para cultivo celular
Kit HiScribe T7 ARCA para ARNm	New England Biolab	E2065S	El kit HiScribe T7 ARCA para ARNm (con cola) está diseñado para la producción rápida de ARNm con caperuza ARCA y cola de poli(A) in vitro. Los ARNm con caperuza se sintetizan mediante la incorporación co-transcripcional de un análogo de caperuza inversa (ARCA) utilizando la ARN polimerasa T7.
Kit HiScribe T7 para ARNm con reactivo CleanCap AG	New England Biolab	E2080S	El kit HiScribe T7 para ARNm con reactivo CleanCap AG permite la producción rápida y simplificada de uno o varios transcritos con rendimientos típicos de ≥90 μg por reacción,
Polimerasa LongAmp Hot Start Taq de ADN	New England Biolab	M0534S	La polimerasa LongAmp Hot Start Taq de ADN ofrece un rendimiento excepcional con amplicones largos.
Transcriptasa inversa M-MuLV	New England Biolab	M0253L	La transcriptasa inversa M-MuLV sintetiza una cadena complementaria de ADN a partir de un cebador, utilizando como molde ya sea ARN (síntesis de ADNc) o ADN de cadena sencilla.
Kit Monarch de purificación de ARN por centrifugación (50 μg)	New England Biolab	T2040L	La función principal del kit Monarch® de purificación de ARN por centrifugación (50 μg) es purificar y concentrar hasta 50 μg de ARN de alta calidad procedente de reacciones enzimáticas o mezclas de extracción.
Mezcla maestra NEBuilder HiFi para ensamblaje de ADN	New England Biolab	E2621L	La mezcla maestra NEBuilder HiFi para ensamblaje de ADN permite el ensamblaje sin interrupciones de múltiples fragmentos de ADN, independientemente de la longitud del fragmento o la compatibilidad de los extremos. Es útil para la comunidad de biología sintética, así como para la clonación en un solo paso de múltiples fragmentos debido a su facilidad de uso, flexibilidad y formato sencillo de mezcla maestra.
Opti-MEM, medio con suero reducido	Thermo Fisher	31985070	Para maximizar la eficiencia de transfección celular durante la formación del complejo lípido-carga. Sirve como un entorno optimizado y químicamente definido que mantiene una alta viabilidad de las células de mamífero mientras reduce la necesidad de suplementación estándar con suero.
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher	10010023	El uso funcional principal del tampón salino fosfato (PBS) a pH 7,4 es mantener un pH estable y un equilibrio osmótico para células de mamífero y moléculas biológicas.
Cintas para PCR	Thermo Fisher	AB0776	El uso funcional principal de los tubos en cinta para PCR (generalmente en formato de 8 o 12 tubos) es contener reacciones líquidas de pequeño volumen durante ciclos térmicos de alto rendimiento.
Poli-L-lisina hidrobromuro	Millipore Sigma	P4707-50ML	El uso funcional principal del poli-L-lisina (PLL) hidrobromuro para la adhesión celular es recubrir superficies sólidas con carga negativa (como vidrio o plástico) para crear un sustrato altamente adhesivo con carga positiva.
Pseudouridina-5´-trifosfato (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	La pseudouridina-5´-trifosfato (Pseudo-UTP) se utiliza comúnmente para reducir la inmunogenicidad del ARN en transcripciones in vitro.
Conjunto de soluciones de ribonucleótidos	New England Biolab	N0450L	Cuatro soluciones separadas de ATP, GTP, CTP y UTP
Inhibidor ROCK Y-27632 (dihidrocloruro)	Stem cell technologies	72302	Y-27632 es un inhibidor permeable a la célula, altamente potente y selectivo de la quinasa asociada a Rho que contiene una hélice en espiral (ROCK). Y-27632 inhibe tanto a ROCK1 (Ki = 220 nM) como a ROCK2 (Ki = 300 nM) al competir con el ATP por el sitio catalítico de unión
Agua grado RT-PCR	Thermo Fisher	AM9935	El uso funcional principal del agua grado RT-PCR (a menudo etiquetada como agua libre de nucleasas) es servir como disolvente ultrapuro para ensayos enzimáticos sensibles en los que cualquier contaminación degradaría la muestra o inhibiría la amplificación.
Inhibidor de RNasas SUPERase·In	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In, el inhibidor de RNasas, es un inhibidor de origen no humano basado en proteínas que se une y inhibe de forma no covalente las RNasas más comunes y problemáticas, incluyendo RNasa A, B, C, 1 y T1.
Tinción con SYBR Green I para geles de ácidos nucleicos	Thermo Fisher	S7563	El uso funcional principal de la tinción con SYBR™ Green I para geles de ácidos nucleicos es visualizar y cuantificar el ADN de doble cadena (dsADN) en geles de agarosa o poliacrilamida.
Kit de transfección TransIT-mRNA	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	Un reactivo de transfección de alta eficiencia y baja toxicidad para ARN de gran tamaño
Kit de detección de telomerasa TRAPeze	Millipore Sigma	S7700	El ensayo TRAP (protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas) es un método ampliamente utilizado y sensible basado en PCR para detectar y medir la actividad de la telomerasa en células y muestras de tejidos de mamíferos. Incluye tres pasos principales: extensión de repeticiones teloméricas por telomerasa, amplificación de estos productos mediante PCR y detección posterior.
Tripsina-EDTA (0,05 %), rojo de fenol	Thermo Fisher	25300054	Para desprender células adherentes de mamífero de los recipientes de cultivo durante el paso rutinario (subcultivo) y la recolección.