Protocolo optimizado de transfección inversa para la entrega de ARNm de telomerasa a fibroblastos humanos en etapa temprana de senescencia

Sukanta Jash; John Sedivy

doi:10.3791/71538

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Artículo de método

Protocolo optimizado de transfección inversa para la entrega de ARNm de telomerasa a fibroblastos humanos en etapa temprana de senescencia

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DOI:

10.3791/71538

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18 de agosto de 2026

Sukanta Jash^*¹ , John Sedivy^*¹

¹Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este artículo presenta un protocolo optimizado de transfección inversa para la entrega eficiente de ARNm modificado de nucleósidos de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) (ARNm de hTERT) en fibroblastos humanos senescentes. El pre-recubrimiento de las superficies de cultivo con complejos de ARNm de hTERT y lípidos mejora la captación, permitiendo la activación de la telomerasa, la elongación de los telómeros y una rejuvenecimiento parcial. Las culturas finalmente reingresan a la senescencia o crisis sin llegar a la inmortalización.

Resumen

La senescencia celular está asociada con alteraciones profundas en la fisiología celular, incluida la reducción de la fluidez de la membrana, el tráfico endosomal deteriorado, la capacidad endocítica disminuida y el aumento de la actividad de RNasas extracelulares, todo lo cual dificulta la entrega eficiente de ARNm. Estas barreras han limitado la aplicación de enfoques basados en ARN en células senescentes, particularmente para la entrega de transcritos terapéuticos grandes. Este protocolo describe un método de transfección inversa optimizado para la entrega eficiente de ARN mensajero (ARNm) modificado en fibroblastos humanos senescentes. Aunque se utilizó ARNm de la transcriptasa inversa de la telomerasa humana (hTERT) como transcrito modelo, el procedimiento es ampliamente aplicable a otros ARNm. A diferencia de los métodos convencionales de transfección, en los que los complejos de ARN y lípidos se añaden al medio de cultivo tras la adhesión celular, la transfección inversa deposita los complejos sobre la superficie de cultivo antes de la siembra celular, lo que permite una interacción directa entre las células en proceso de adhesión y los complejos de transfección. Para maximizar la eficiencia de transfección, el protocolo incorpora ARNm con nucleósidos modificados que contienen pseudouridina y 5-metilcitosina, colas poli(A) extendidas, temporización optimizada de la formación de complejos, inhibición de RNasas, elevación transitoria del pH endosomal con cloroquina, mayor densidad de siembra celular y períodos de incubación prolongados. Mediante este enfoque, se lograron eficiencias de transfección de aproximadamente 50%–80% en fibroblastos senescentes tras la entrega de un transcrito de ARNm hTERT de 5 kb. La actividad máxima de telomerasa se detectó entre 24 y 48 h tras la transfección. Un solo ciclo de transfección produjo alargamiento medible de los telómeros, mientras que tres transfecciones sucesivas dieron lugar a una extensión telomérica sustancial pero finita. Se detectó una reversión parcial de los fenotipos asociados a la senescencia dentro de las 72–96 h, incluida la reducción de la actividad de β-galactosidasa asociada a la senescencia, la disminución de la expresión de p16 y p21, la restauración de la morfología celular y la extensión de la longevidad replicativa. El ARNm hTERT entregado se degradó dentro de las 72–96 h, y no se observó inmortalización. Este protocolo proporciona un enfoque práctico para la entrega transitoria de ARNm en células senescentes y podría adaptarse a una amplia variedad de tipos celulares y especies.

Introducción

El enfoque de transfección inversa representa una adaptación metodológica fundamental para las células senescentes, que supera las barreras básicas que estas células presentan frente a los métodos estándar de transfección. A diferencia de la transfección directa, en la que las células se siembran previamente y se les permite adherirse antes de añadir los complejos de transfección, la transfección inversa consiste en añadir células en suspensión directamente sobre complejos preformados de ARNm de hTERT y lípidos. Esta técnica aumenta drásticamente la eficiencia de transfección en células senescentes al maximizar la exposición a los complejos de transfección durante la fase crítica de adhesión, cuando la remodelación de la membrana es más activa.

El cambio conceptual fundamental del protocolo consiste en tratar a las células senescentes como un problema de administración distinto, y no simplemente como versiones difíciles de transfectar de células jóvenes. En la senescencia, los cambios globales en la composición lipídica de la membrana, incluyendo fosfolípidos, esfingolípidos y colesterol, alteran la fluidez de la membrana, la curvatura y las interacciones proteína-lípido, al tiempo que contribuyen al fenotipo secretor asociado a la senescencia¹^,²^,³. Las células senescentes también presentan una endocitosis mediada por clatrina y caveolas reducida y una ruta endocítica alterada, impulsadas en parte por la regulación negativa de la anfifisina-1 y cambios compensatorios en la expresión de caveolina, lo que atenúa la captación y señalización mediadas por receptores⁴^,⁵^,⁶. Paralelamente, el eje de endosomas tardíos-lisosomas regulado por Rab7 y la red más amplia endosomal-autofágica-lisosomal (EAL) se desregulan, siendo Rab7 un regulador maestro de la maduración endolisosomal y de la fusión autofagosoma-lisosoma, procesos que se alteran en el envejecimiento y la neurodegeneración⁷.

Las células senescentes suelen sobreexpresar múltiples componentes del sistema de procesamiento y adaptación lisosomal (LYPAS), incluyendo la biogénesis lisosomal impulsada por TFEB/TFE3 y la autofagia mediada por chaperonas, aumentando así la masa lisosomal. Sin embargo, los lisosomas individuales presentan con frecuencia un pH luminal elevado, daño en la membrana y una capacidad proteolítica alterada, lo que contribuye a la disfunción lisosomal a pesar de su mayor abundancia⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. En conjunto, estos cambios pueden canalizar más eficientemente el material internoizado hacia compartimentos endolisosomales degradativos, aumentando la probabilidad de que el ARN o la proteína entregados sean degradados antes de una liberación citosólica productiva⁹^,¹⁰^,¹¹. La transfección inversa dirige directamente el complejo al período más temprano en el que las membranas están remodelándose, durante la adhesión, forzando un contacto sostenido y de alta afinidad entre las células y los complejos de ARNm-lípidos, y al menos en parte evita la endocitosis en estado estacionario alterada en células senescentes completamente adheridas⁴^,⁵^,⁶^,¹².

Desde el punto de vista del diseño del ARN, el protocolo asume que, en un contexto de envejecimiento, una base simple con caperuza y cola es insuficiente: se considera imprescindible la modificación completa de los nucleósidos (por ejemplo, pseudouridina o N1‑metilpseudouridina más 5‑metilcitosina) para desacoplar la traducción de la detección por los receptores tipo Toll endosomales y la inducción del interferón de tipo I. Trabajos fundamentales demostraron que la incorporación de nucleósidos modificados en el ARN suprime la activación de TLR3, TLR7 y TLR8 y reduce notablemente la producción de citocinas por las células dendríticas, proporcionando una base mecanicista para la menor inmunogenicidad innata de las actuales plataformas de ARNm modificado¹³. Revisiones más recientes sobre vacunas ARNm–LNP y medicamentos basados en ARNm destacan la ingeniería coordinada de la caperuza 5′, las regiones no traducidas (UTR), la secuencia codificante y la cola poli(A) para aumentar la estabilidad y la traducción in vivo mientras se minimiza la activación inmune innata¹⁴. En particular, la longitud y la arquitectura de la cola poli(A) han surgido como determinantes clave de la estabilidad y el rendimiento traduccional del ARN mensajero transcrito in vitro, lo que motiva diseños de colas poli(A) alargadas o ingenierizadas en el ARNm terapéutico¹⁵.

Sobre esta base, el protocolo incorpora explícitamente protección contra las RNasas extracelulares y endosomales durante la formación del complejo y su incorporación, junto con una ventana definida de escape endosomal mediante un agente lisosomotrópico transitorio, como la cloroquina¹⁶^,¹⁷. La cloroquina se ha utilizado desde hace tiempo como sonda funcional para evaluar las barreras endosomales y puede aumentar notablemente la interacción con el blanco y el silenciamiento mediante ARNip o oligonucleótidos antisentido al promover la alteración de la membrana endosomal y el escape de la carga de ácidos nucleicos hacia el citosol¹⁸. Al mismo tiempo, imágenes en células vivas y de superresolución del ARNm entregado mediante nanopartículas lipídicas (LNP) han demostrado que la entrega productiva está fuertemente limitada por eventos de escape poco frecuentes desde los endosomas tempranos o de reciclaje, más que por la incorporación inicial en sí, lo que resalta la importancia de diseñar deliberadamente un paso de escape endosomal para los terapéuticos basados en ARNm¹⁹.

En conjunto, estas alteraciones asociadas a la senescencia en la dinámica de la membrana, el tráfico endocítico, el procesamiento lisosomal y la activación inmune innata crean barreras sustanciales para una entrega eficiente de ARNm. La estrategia de transfección inversa descrita aquí fue desarrollada para abordar estas limitaciones mediante la combinación de una ingeniería optimizada del ARNm, protección frente a ribonucleasas, escape endosomal mejorado y exposición directa de las células en adhesión a complejos preformados de ARNm y lípidos. Aunque se utiliza ARNm de hTERT como carga modelo, el procedimiento es ampliamente aplicable a la entrega de otros transcritos terapéuticos grandes de ARNm a poblaciones celulares senescentes y de difícil transfección²⁰^,²¹^,²².

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Protocolo

1. Transcripción in vitro de ARNm de hTERT

Transcripción in vitro (IVT) con ARCA y ΨUTP
1. Prepare una reacción de IVT de 20 µL según la Tabla 1. Ajuste linealmente la reacción si se requiere un mayor rendimiento.
2. Combine todos los componentes de la reacción excepto la ARN polimerasa T7 en un tubo libre de RNasas. Añada la ARN polimerasa T7 al final, mezcle suavemente y centrifugue brevemente el tubo.
3. Incube la reacción a 37 °C durante 0,5–4 h.
  NOTA: Ajuste el tiempo de incubación según la longitud de la plantilla. Incube las reacciones con plantillas más cortas (aproximadamente 500 pb) durante aproximadamente 30 min y las reacciones con plantillas más largas (aproximadamente 4 kb) durante 3–4 h.
Tratamiento con DNasa
1. Añada 1 µL de DNasa I libre de RNasas directamente a la mezcla de reacción de IVT.
2. Incube la reacción a 37 °C durante 15 min.
  NOTA: El tratamiento con DNasa debe realizarse directamente en la reacción de IVT sin purificación previa del ARNm sintetizado.
Purificación del ARNm
1. Añada 115 µL de H₂O libre de nucleasas para diluir la mezcla de reacción.
2. Purifique el ARNm utilizando un kit de limpieza de ARN según las instrucciones del fabricante.
3. Eluya el ARNm purificado en 20–30 µL de H₂O libre de nucleasas.
4. Mida la pureza del ARNm mediante espectrofotometría y verifique la integridad del ARN mediante electroforesis en un gel de agarosa desnaturalizante al 1,0–1,5 % o en un gel de poliacrilamida de baja concentración.
Adición de cola poli(A)
1. Prepare una reacción de adición de cola poli(A) de 50 µL según la Tabla 2. Mezcle suavemente los componentes de la reacción e incube a 37 °C durante 30–60 min.
  NOTA: Ajuste el tiempo de incubación según la cantidad de ARN utilizado.
2. Detenga la reacción añadiendo 2 µL de EDTA 0,5 M (pH 8,0).
Purificación final y control de calidad
1. Purifique el ARNm con cola poli(A) utilizando un kit de limpieza de ARN según las instrucciones del fabricante.
2. Eluya el ARNm purificado en 20–30 µL de H₂O libre de nucleasas.
3. Evalue la calidad del ARNm antes de proceder a la transfección
  1. Mida la concentración del ARNm a 260 nm y determine la pureza utilizando las relaciones A260/A280 y A260/A230. Utilice preparaciones de ARNm con valores de A260/A280 de aproximadamente 2,0 y valores de A260/A230 superiores a 2,0.
  2. Evalue la integridad del ARNm mediante electroforesis en gel o un sistema de análisis de ARN según las instrucciones del fabricante.
  3. Confirme la longitud de la cola poli(A) mediante RT-PCR o análisis en Bioanalyzer. Verifique que la longitud de la cola poli(A) esté entre 120 y 200 nucleótidos.
  4. Aliquote el ARNm purificado y almacene los alícuotas a −80 °C para minimizar los ciclos de congelación-descongelación.

2. Transfección inversa

Día −1: Preparación previa a la transfección
1. Verificar el fenotipo senescente
  1. Realizar la tinción de β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) en una muestra representativa de células. Verificar que más del 70 % de las células sean positivas.
  2. Confirmar la expresión de los marcadores de senescencia (p16 y p21) mediante qRT-PCR o inmunofluorescencia.
  3. Determinar la viabilidad celular y verificar que supere el 90 %.
2. Preparar los reactivos
  1. Calentar previamente el medio de cultivo completo a 37 °C.
  2. Calentar previamente la solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C.
  3. Preparar medio Opti-MEM I fresco.
    NOTA: No añadir inhibidor de RNasas al Opti-MEM I antes de su uso.
Día 0: Día de la transfección
NOTA: Dejar aproximadamente 3 h desde la preparación de los reactivos hasta la incubación de las células transfectadas.
1. Preparación del ARNm de hTERT
  1. Descongelar el ARNm de hTERT sobre hielo. Medir la concentración de ARNm y utilizar preparaciones con concentraciones entre 0,5 y 1,0 µg/µL.
  2. Diluir la cantidad deseada de ARNm de hTERT en Opti-MEM I según el formato de cultivo utilizado (Tabla 3). Añadir inhibidor de RNasas hasta una concentración final de 0,5–1,0 U/µL y mezclar suavemente.
  3. Mantener el ARNm diluido sobre hielo hasta la formación del complejo.
    NOTA: Añadir el inhibidor de RNasas inmediatamente antes de su uso. No almacenar el ARNm con inhibidor de RNasas, ya que su actividad disminuye tras congelarlo.
2. Preparación del reactivo de transfección
  1. Mezclar 6,0 µL del reactivo de transfección con 100 µL de Opti-MEM I en un tubo estéril libre de RNasas. Mezclar suavemente mediante pipeteo.
  2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min.
    NOTA: Para constructos grandes de ARNm de hTERT (~5 kb), optimizar las relaciones entre reactivo y ARNm entre 0,4 y 0,6 µL de reactivo por cada 100 ng de ARNm.
3. Formación del complejo ARNm-lípido
  1. Añadir la solución diluida de ARNm de hTERT (100 µL) a la solución diluida del reactivo de transfección (106 µL). Mezclar suavemente mediante pipeteo 5–6 veces.
  2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15–20 min.
  3. No superar los 30 min de complejación.
  4. Verificar la formación exitosa del complejo por la aparición de una solución ligeramente turbia.
    NOTA: Realizar la preparación de las células durante el período de complejación.
4. Preparación de las células para la transfección inversa
  1. Aspirar el medio de cultivo de los cultivos celulares senescentes.
  2. Lavar las células una vez con PBS precalentado (2 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos).
  3. Añadir 500 µL de tripsina-EDTA al 0,05 % por pocillo.
  4. Incubar las células a 37 °C durante 3–5 min.
  5. Neutralizar la tripsina con 3 mL de medio completo que contenga suero.
  6. Triturar suavemente las células para obtener una suspensión de células individuales.
  7. Determinar el número de células utilizando un hemocitómetro o un contador celular automatizado.
  8. Preparar una suspensión que contenga 2,0–2,5 × 10⁵ células por pocillo en medio completo.
    NOTA: Evitar una tripsinización prolongada porque las células senescentes son altamente susceptibles al estrés mecánico. Mantener las células en suspensión; no sembrarlas previamente antes de la transfección inversa.
5. Transfección inversa
  1. Preparación de la placa de cultivo
    1. Añadir 500 µL de poli-L-lisina al 0,01 % a cada pocillo de una placa de 6 pocillos e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
    2. Aspirar la solución de recubrimiento inmediatamente antes de su uso.
    3. Añadir 200 µL del complejo ARNm de hTERT-lípido al centro de cada pocillo.
    4. Incubar la placa a 37 °C y 5 % de CO₂ durante 30 min.
      NOTA: Realizar el recubrimiento de la placa en paralelo con la formación del complejo y la preparación de las células.
  2. Preparación de la suspensión celular
    1. Suspender 2,0–2,5 × 10⁵ células en 1800 µL de medio completo sin antibióticos.
    2. Resuspender suavemente las células para obtener una suspensión uniforme de células individuales.
      NOTA: Utilizar medio sin antibióticos durante la transfección.
  3. Siembra celular sobre los complejos
    1. Añadir 1800 µL de la suspensión celular directamente sobre los complejos preformados de ARNm de hTERT-lípido.
    2. Inclinar suavemente la placa 2–3 veces en cada dirección para distribuir las células uniformemente.
      NOTA: No pipetear la suspensión tras añadir las células, ya que podría alterar los complejos ARNm-lípido.
  4. Incubación celular
    1. Incubar las células a 37 °C en un incubador humedecido con 5 % de CO₂ durante 6–8 h.
    2. Monitorear la adhesión celular mediante microscopía de luz 2–3 h después de la transfección.
    3. Verificar que las células estén distribuidas uniformemente y comiencen a adherirse a la superficie del cultivo.
      NOTA: Un número excesivo de células flotantes o restos celulares podría indicar citotoxicidad asociada a la transfección.

3. Mitigación de la citotoxicidad

Reduzca el período de exposición a la transfección a 48 h si la pérdida celular supera el 20%.
Suplemente los cultivos con 10 µM del inhibidor de ROCK Y-27632 durante el período de transfección para mejorar la supervivencia celular.
Después de 6–8 h de transfección, aspire cuidadosamente el medio de transfección minimizando la perturbación de las células parcialmente adheridas. Deje aproximadamente 100 µL de medio residual en cada pocillo.
Añada 1 mL de medio de crecimiento completo fresco, previamente calentado y suplementado con 15% de FBS, a cada pocillo.
Añada cloroquina hasta una concentración final de 10–20 µM inmediatamente después del reemplazo del medio.
Incube los cultivos durante 2 h adicionales a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 5% de CO₂.
Reemplace el medio que contiene cloroquina por medio de crecimiento completo fresco.
Devuelva los cultivos al incubador para continuar el crecimiento.
NOTA: Monitoree la morfología celular y la viabilidad durante todo el período de recuperación. Una desprendimiento celular excesivo o la presencia de detritos pueden indicar citotoxicidad asociada a la transfección.

4. Análisis posterior a la transfección

Evalúe la expresión de la proteína TERT entre 24 y 48 h después de la transfección.
Mida los niveles de la proteína TERT mediante inmunotransferencia (western blotting) o tinción por inmunofluorescencia según procedimientos de laboratorio estándar.
Mida la actividad de la telomerasa durante el mismo intervalo utilizando un ensayo adecuado de actividad de telomerasa.
NOTA: La actividad de la telomerasa generalmente disminuye después de 48 h debido a la degradación del ARNm de hTERT entregado de forma transitoria.
Evalúe la longitud de los telómeros entre 48 y 72 h después de la transfección utilizando PCR cuantitativa multiplex monocromática (MMqPCR) o un método equivalente de análisis de longitud de telómeros.
NOTA: Puede observarse alargamiento detectable de los telómeros tras una entrega exitosa del ARNm de hTERT.
Evalue los fenotipos asociados con la senescencia y los asociados con la rejuvenecimiento 7 días después de la transfección
1. Mida la actividad de la β-galactosidasa asociada con la senescencia (SA-β-gal).
2. Mida los niveles de expresión de p16 y p21.
3. Evalúe la expresión de Ki67.
4. Examine la morfología celular mediante microscopía de luz.
  NOTA: Compare los cultivos tratados con controles senescentes no tratados o transfectados con control ficticio (mock) para evaluar los cambios en los fenotipos asociados con la senescencia y las características proliferativas.

5. Protocolo de dosificación repetida (Opcional)

Realice la transfección inicial según se describe en las secciones 2–4.
Repita las transfecciones según el siguiente cronograma: Día 0: Primera transfección; Día 5: Segunda transfección; Día 10–12: Tercera transfección.
Mantenga las células como cultivos adherentes y no las trypsinice antes de las transfecciones subsiguientes.
Prepare complejos frescos de ARNm-hTERT con lípidos según se describe en las secciones 2.2.1–2.2.3.
Aspire el medio de cultivo de cada pocillo.
Añada directamente 200 µL de complejos de ARNm-hTERT con lípidos a cada pocillo.
Añada inmediatamente después 800 µL de medio F-10 completo fresco tras la adición de los complejos.
Incube las células durante 4–6 h a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 5% de CO₂.
Sustituya el medio de transfección por medio completo fresco.
NOTA: Limite el tratamiento a un máximo de tres ciclos de transfección para minimizar la citotoxicidad acumulativa asociada a la transfección.

6. Protocolo de transfección directa (2 µg/mL, formato de 6 pocillos)

Día −1: Siembra celular
1. Desprender los fibroblastos senescentes o en pre-senescentes utilizando tripsina-EDTA al 0,05 %.
2. Neutralizar la tripsina con medio de cultivo completo.
3. Determinar el número y la viabilidad celular.
4. Sembrar las células en placas de 6 pocillos a una densidad de 2,0–2,5 × 10⁵ células por pocillo.
5. Incubar las células durante la noche a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 5 % de CO₂ hasta que alcancen aproximadamente un 60–80 % de confluencia.
Día 0: Preparación de complejos de ARNm hTERT–reactivo
1. Descongelar una alícuota de ARNm hTERT modificado con nucleósidos sobre hielo.
2. Diluir el ARNm hTERT en Opti-MEM hasta una concentración final de 2 µg/mL en un tubo estéril libre de RNasas (Tubo A).
3. Añadir inhibidor de RNasas al Tubo A hasta una concentración final de 0,5–1,0 U/µL y mezclar suavemente.
4. Diluir el reactivo de transfección en Opti-MEM en un segundo tubo libre de RNasas (Tubo B), utilizando 0,4–0,6 µL de reactivo por cada 100 ng de ARNm.
5. Añadir el contenido del Tubo B gota a gota al Tubo A mientras se mezcla suavemente.
6. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 15–20 min.
Día 0: Transfección directa
1. Verificar que las células presenten una confluencia del 60–80 % y una morfología saludable.
2. Aspirar el medio de cultivo.
3. Lavar las células una vez con 1–2 mL de PBS precalentado.
4. Añadir 0,5 mL de medio completo o con reducción de suero, previamente calentado, a cada pocillo.
5. Opcionalmente, añadir cloroquina hasta una concentración final de 10–20 µM.
6. Añadir 0,5 mL de los complejos de ARNm hTERT–reactivo preparados en el paso 6.2.6 a cada pocillo.
7. Balancéar suavemente la placa para distribuir los complejos de forma uniforme.
8. Incubar las células durante 4–6 h a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 5 % de CO₂.
  NOTA: Extender el periodo de incubación a 6–8 h para células senescentes si es necesario.
9. Aspirar el medio de transfección.
10. Añadir 2,0 mL de medio completo fresco a cada pocillo.
11. Realizar los análisis posteriores a la transfección según se describe en la Sección 4.
  NOTA: Utilizar el mismo lote de ARNm hTERT, reactivo de transfección y dosis nominal al comparar condiciones de transfección directa e inversa.

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Resultados

El ARNm modificado d2EGFP-T2A-hTERT fue diseñado como un marco de lectura abierto híbrido en el que un reportero de EGFP inestable (d2EGFP) se unió a la TERT humana mediante un péptido T2A de autoescisión. Las secuencias completas de nucleótidos y proteínas de todos los constructos se proporcionan en el Archivo Suplementario 1. La secuencia codificante estuvo flanqueada por una región no traducida (UTR) 5′ sintética y la UTR 3′ de la β-globina humana para aumentar la eficiencia traduccional y la estabili...

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Discusión

Este estudio replantea la senescencia celular como un problema de entrega específico, y no como una variación menor de la fisiología proliferativa, y desarrolla una estrategia de transfección de ARNm de telomerasa adaptada a las restricciones biofísicas e inmunológicas del estado senescente. Las células senescentes presentan membranas rigidificadas y enriquecidas en colesterol, así como una actividad endocítica reducida, lo que crea una barrera considerable para la entrega eficiente de ácidos nucleicos. Al adoptar un enf...

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Divulgaciones

J.M.S. es cofundador y presidente del comité asesor científico de Transposon Therapeutics.

Agradecimientos

Este trabajo fue respaldado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) P01 AG051449, R01 AG016694 y R01 AG078925 otorgadas a JS.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mezcla de nutrientes Ham's F-10	Thermo Fisher	11550043	Medio de cultivo celular.
Análogo de estructura de caperuza ARN 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G	New England Biolab	S1411L	Para la mayoría de los ARN, la estructura de caperuza aumenta la estabilidad, disminuye la susceptibilidad a la degradación por exonucleasas y promueve la formación de complejos de iniciación del ARNm.
5-Metil-Citidina-5´-trifosfato (5-Metil-CTP)	New England Biolab	N0432S	Los NTP modificados se utilizan comúnmente para reducir la inmunogenicidad del ARN en transcripciones in vitro.
Placa de 6 pocillos	Corning	351146	Para cultivar y tratar volúmenes medianos o grandes de células adherentes o en suspensión en condiciones experimentales independientes.
Anticuerpo anti-Ki67 (SP6)	abcam	ab16667	Ki67 se expresa principalmente en células proliferantes.
Kit de ensayo de senescencia celular (tinción SA-beta-gal)	cellbiolabs	CBA-230	Identificación de células senescentes mediante el ensayo de tinción SA-β-gal
Tubos LoBind de ADN de 0,5 ml	Eppendorf	022431005	Para recuperar eficientemente ADN y ARN sin pérdidas.
Tubos LoBind de ADN de 1,5 ml	Eppendorf	22431021	Para recuperar eficientemente ADN y ARN sin pérdidas.
DNasa I, libre de RNasa (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	La DNasa I, libre de RNasa, es una endonucleasa que digiere ADN de cadena sencilla y doble.
Polimerasa de poli(A) de E. coli	New England Biolab	M0276S	En Escherichia coli, la poli(A) polimerasa I (PAP I) funciona principalmente como catalizador para la adición independiente de plantilla de residuos de adenosina monofosfato (AMP) al extremo 3' de las moléculas de ARN.
Suero bovino fetal	Thermo Fisher	A5256701	Suplemento para cultivo celular
Kit HiScribe T7 ARCA para ARNm	New England Biolab	E2065S	El kit HiScribe T7 ARCA para ARNm (con cola) está diseñado para la producción rápida de ARNm con caperuza ARCA y cola de poli(A) in vitro. Los ARNm con caperuza se sintetizan mediante la incorporación co-transcripcional de un análogo de caperuza inversa (ARCA) utilizando la ARN polimerasa T7.
Kit HiScribe T7 para ARNm con reactivo CleanCap AG	New England Biolab	E2080S	El kit HiScribe T7 para ARNm con reactivo CleanCap AG permite la producción rápida y simplificada de uno o varios transcritos con rendimientos típicos de ≥90 μg por reacción,
Polimerasa LongAmp Hot Start Taq de ADN	New England Biolab	M0534S	La polimerasa LongAmp Hot Start Taq de ADN ofrece un rendimiento excepcional con amplicones largos.
Transcriptasa inversa M-MuLV	New England Biolab	M0253L	La transcriptasa inversa M-MuLV sintetiza una cadena complementaria de ADN a partir de un cebador, utilizando como molde ya sea ARN (síntesis de ADNc) o ADN de cadena sencilla.
Kit Monarch de purificación de ARN por centrifugación (50 μg)	New England Biolab	T2040L	La función principal del kit Monarch® de purificación de ARN por centrifugación (50 μg) es purificar y concentrar hasta 50 μg de ARN de alta calidad procedente de reacciones enzimáticas o mezclas de extracción.
Mezcla maestra NEBuilder HiFi para ensamblaje de ADN	New England Biolab	E2621L	La mezcla maestra NEBuilder HiFi para ensamblaje de ADN permite el ensamblaje sin interrupciones de múltiples fragmentos de ADN, independientemente de la longitud del fragmento o la compatibilidad de los extremos. Es útil para la comunidad de biología sintética, así como para la clonación en un solo paso de múltiples fragmentos debido a su facilidad de uso, flexibilidad y formato sencillo de mezcla maestra.
Opti-MEM, medio con suero reducido	Thermo Fisher	31985070	Para maximizar la eficiencia de transfección celular durante la formación del complejo lípido-carga. Sirve como un entorno optimizado y químicamente definido que mantiene una alta viabilidad de las células de mamífero mientras reduce la necesidad de suplementación estándar con suero.
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher	10010023	El uso funcional principal del tampón salino fosfato (PBS) a pH 7,4 es mantener un pH estable y un equilibrio osmótico para células de mamífero y moléculas biológicas.
Cintas para PCR	Thermo Fisher	AB0776	El uso funcional principal de los tubos en cinta para PCR (generalmente en formato de 8 o 12 tubos) es contener reacciones líquidas de pequeño volumen durante ciclos térmicos de alto rendimiento.
Poli-L-lisina hidrobromuro	Millipore Sigma	P4707-50ML	El uso funcional principal del poli-L-lisina (PLL) hidrobromuro para la adhesión celular es recubrir superficies sólidas con carga negativa (como vidrio o plástico) para crear un sustrato altamente adhesivo con carga positiva.
Pseudouridina-5´-trifosfato (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	La pseudouridina-5´-trifosfato (Pseudo-UTP) se utiliza comúnmente para reducir la inmunogenicidad del ARN en transcripciones in vitro.
Conjunto de soluciones de ribonucleótidos	New England Biolab	N0450L	Cuatro soluciones separadas de ATP, GTP, CTP y UTP
Inhibidor ROCK Y-27632 (dihidrocloruro)	Stem cell technologies	72302	Y-27632 es un inhibidor permeable a la célula, altamente potente y selectivo de la quinasa asociada a Rho que contiene una hélice en espiral (ROCK). Y-27632 inhibe tanto a ROCK1 (Ki = 220 nM) como a ROCK2 (Ki = 300 nM) al competir con el ATP por el sitio catalítico de unión
Agua grado RT-PCR	Thermo Fisher	AM9935	El uso funcional principal del agua grado RT-PCR (a menudo etiquetada como agua libre de nucleasas) es servir como disolvente ultrapuro para ensayos enzimáticos sensibles en los que cualquier contaminación degradaría la muestra o inhibiría la amplificación.
Inhibidor de RNasas SUPERase·In	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In, el inhibidor de RNasas, es un inhibidor de origen no humano basado en proteínas que se une y inhibe de forma no covalente las RNasas más comunes y problemáticas, incluyendo RNasa A, B, C, 1 y T1.
Tinción con SYBR Green I para geles de ácidos nucleicos	Thermo Fisher	S7563	El uso funcional principal de la tinción con SYBR™ Green I para geles de ácidos nucleicos es visualizar y cuantificar el ADN de doble cadena (dsADN) en geles de agarosa o poliacrilamida.
Kit de transfección TransIT-mRNA	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	Un reactivo de transfección de alta eficiencia y baja toxicidad para ARN de gran tamaño
Kit de detección de telomerasa TRAPeze	Millipore Sigma	S7700	El ensayo TRAP (protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas) es un método ampliamente utilizado y sensible basado en PCR para detectar y medir la actividad de la telomerasa en células y muestras de tejidos de mamíferos. Incluye tres pasos principales: extensión de repeticiones teloméricas por telomerasa, amplificación de estos productos mediante PCR y detección posterior.
Tripsina-EDTA (0,05 %), rojo de fenol	Thermo Fisher	25300054	Para desprender células adherentes de mamífero de los recipientes de cultivo durante el paso rutinario (subcultivo) y la recolección.

Referencias

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Fibroblastos senescentes ARNm de hTERT ARNm modificado con nucleósidos inhibición de la RNasa modulación del pH endosomal elongación de los telómeros vida útil replicativa