La sobreexpresión forzada de miR-486-3p suprime la actividad asociada a la proliferación, el crecimiento clonogénico, el cierre de heridas y el tránsito a través de Matrigel en células de adenocarcinoma pulmonar A549 y H358. Estos efectos van acompañados por una reducción en la expresión de WNT5B, DVL1, β-catenina y BCL-2, lo que indica una asociación in vitro con cambios relacionados con la vía Wnt, sin establecer un direccionamiento directo ni una causalidad de la vía.
Artículo de investigación
miR-486-3p suprime fenotipos malignos y se asocia con la reducción de la expresión de WNT5B, DVL1 y β-catenina en células de adenocarcinoma pulmonar
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
El adenocarcinoma pulmonar (LUAD) es el subtipo histológico predominante del cáncer de pulmón de células no pequeñas y continúa asociado con una morbilidad y mortalidad considerables. Estudios previos han identificado funciones supresoras tumorales de miR-486-3p en LUAD, pero su relación con los cambios en la expresión relacionados con WNT5B, DVL1 y β-catenina no se ha definido claramente. Aquí, se examinó la abundancia basal de miR-486-3p en células de LUAD A549 y H358 y se comparó con la de células epiteliales bronquiales Beas-2b mantenidas bajo sus condiciones rutinarias respectivas. Se generaron modelos estables que sobreexpresan miR-486-3p mediante transducción lentiviral. Se evaluó la actividad asociada al crecimiento celular, el crecimiento clonogénico, el cierre de heridas y el tránsito a través de membranas recubiertas con Matrigel utilizando los ensayos de kit de conteo celular-8, formación de colonias, curación de heridas y Transwell. La abundancia de las proteínas WNT5B, DVL1, β-catenina y BCL-2 se evaluó mediante inmunotransferencia, y los niveles de ARNm de WNT5B, DVL1, CTNNB1 y BCL2 se analizaron adicionalmente mediante RT-qPCR. Bajo las condiciones de cultivo utilizadas, la abundancia de miR-486-3p fue menor en las células A549 y H358 que en las células Beas-2b, y la transducción lentiviral produjo una sobreexpresión estable en ambas líneas celulares de LUAD. La sobreexpresión forzada de miR-486-3p redujo la señal del CCK-8, la formación de colonias, el cierre de heridas y el tránsito a través de membranas recubiertas con Matrigel, y se acompañó de una menor abundancia proteica de WNT5B, DVL1, β-catenina total y BCL-2. La RT-qPCR mostró además una menor abundancia de transcritos de WNT5B, DVL1, CTNNB1 y BCL2 en ambas líneas celulares de LUAD tras la sobreexpresión de miR-486-3p. Estos hallazgos respaldan una asociación in vitro entre la expresión forzada de miR-486-3p, la atenuación de varios indicadores de células malignas y alteraciones en la expresión relacionada con la vía Wnt; sin embargo, no establecen un vínculo directo entre el miARN y su diana, la actividad de la vía ni un mecanismo de señalización lineal causal.
Introducción
El adenocarcinoma pulmonar (LUAD) es el subtipo histológico más común del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y contribuye significativamente a la morbilidad y mortalidad relacionadas con el cáncer de pulmón en todo el mundo1,2,3,4,5. La clasificación molecular y las terapias dirigidas han mejorado los resultados en grupos seleccionados de pacientes, pero el LUAD avanzado sigue siendo difícil de tratar y es biológicamente heterogéneo1,2,3,4,5. Por lo tanto, definir los procesos reguladores que contribuyen al comportamiento celular maligno sigue siendo relevante para el desarrollo de hipótesis terapéuticas comprobables.
La señalización Wnt comprende ramas dependientes e independientes de β-catenina que regulan la proliferación, supervivencia, polaridad y motilidad6,7,8,9. WNT5B se asocia más frecuentemente con la señalización no canónica, aunque sus efectos biológicos varían según el receptor y el contexto celular10,11. DVL1 es una proteína citoplasmática de transducción de señales compartida por varias ramas de Wnt y se ha relacionado con comportamientos asociados a β-catenina en el cáncer de pulmón12. Por lo tanto, cambios simultáneos en WNT5B, DVL1 y β-catenina no deberían interpretarse por sí solos como evidencia de una única vía lineal.
Los microARN (miARN) son ARN no codificantes cortos que regulan la expresión génica mediante interacciones dependientes de la secuencia con transcritos diana13,14,15. Dado que un solo miARN puede afectar a múltiples ARN, la abundancia alterada de miARN puede influir en diversos fenotipos asociados a tumores13,14,15,16,17,18. Varios miARN se han relacionado con el crecimiento, la motilidad y la señalización del cáncer de pulmón, y se ha descrito la interacción entre miARN y redes relacionadas con Wnt en múltiples contextos de cáncer16,17,18,19,20.
El locus MIR486 da lugar a las cadenas maduras miR-486-3p y miR-486-5p. Se ha demostrado que miR-486-3p tiene actividad supresora de tumores en el cáncer oral y en el glioblastoma, mientras que se ha informado un efecto promotor de tumores en el carcinoma de células escamosas cutáneo21,22,23,24,25. Se seleccionó miR-486-3p para el presente estudio mediante una estrategia basada en hipótesis, fundamentada en su abundancia reducida en datos públicos de LUAD, en su actividad supresora de tumores previamente reportada en LUAD y en predicciones bioinformáticas que la vinculan con transcritos candidatos relacionados con WNT. Tomioka et al. demostraron efectos supresores de tumores de ambas cadenas de miR-486 en LUAD e identificaron GINS4 mediante un cribado genómico de dianas26. Por lo tanto, el presente estudio no afirma ser la primera demostración de un fenotipo antitumoral. En cambio, evalúa si la expresión forzada de miR-486-3p va acompañada de cambios en la abundancia de WNT5B, DVL1 y β-catenina, así como de cambios fenotípicos reproducibles en dos líneas celulares de LUAD. Estos análisis evalúan asociaciones y no establecen una interacción directa, la actividad de una vía o un mecanismo lineal WNT5B/DVL1/β-catenina.
Protocolo
Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.
Cultivo celular
Se utilizaron las líneas celulares de adenocarcinoma pulmonar humano (LUAD) A549 y H358, y la línea celular epitelial bronquial inmortalizada Beas-2b. Se seleccionaron A549 (KRAS G12S) y H358 (KRAS G12C; deficiente en STK11) como modelos de LUAD comúnmente empleados con antecedentes distintos de mutaciones en KRAS, mientras que Beas-2b se incluyó como comparador epitelial bronquial no maligno. Las células A549 y H358 se mantuvieron en medio RPMI-1640, y las células Beas-2b se mantuvieron en medio DMEM; cada medio contenía 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humedecida que contenía 5% de CO₂. Dado que las líneas celulares del tumor y el comparador epitelial se mantuvieron en medios de rutina diferentes, las comparaciones de expresión basal entre líneas celulares se interpretaron con precaución.
Transducción lentiviral y selección estable de células
Se utilizaron vectores lentivirales que portaban el precursor de hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) o una secuencia de control negativo aleatoria (LV-NC) en un diseño de ganancia de función estable. Las células A549 y H358 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 104 células/pocillo y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, las células se expusieron al lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 en presencia de 8 µg/mL de polibreno. Después de 24 h, el inóculo viral se reemplazó con medio completo fresco. Las células transducidas se seleccionaron con 2 µg/mL de puromicina durante 7 días. Tras la selección, las células sobrevivientes se dejaron recuperar y se ampliaron para los ensayos moleculares y funcionales posteriores. No se incluyó un brazo con inhibidor de miR-486-3p porque el presente estudio fue diseñado específicamente para evaluar los efectos de la sobreexpresión forzada estable.
NOTA: La MOI, el tiempo de exposición a la polibrena y las condiciones de selección con puromicina deben mantenerse idénticos entre los grupos LV-NC y LV-miR-486-3p para minimizar las diferencias relacionadas con el tratamiento en la viabilidad celular.
RT-qPCR
Se realizó RT-qPCR para determinar los niveles de expresión de miR-486-3p y confirmar la eficiencia de la sobreexpresión lentiviral en células A549 y H358. El ARN total se aisló utilizando el reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ARN se evaluaron espectrofotométricamente, considerándose aceptable una relación A260/A280 de 1,8–2,1. Para el análisis de ARNm, 1 µg de ARN total se transcribió inversamente a ADNc utilizando un kit comercial de síntesis de ADNc según el protocolo del fabricante. Para el análisis de microARN, la síntesis de ADNc se realizó utilizando un cebador específico de bucle en tallo para miARN. La PCR cuantitativa se llevó a cabo en un volumen total de reacción de 20 µL que contenía 10 µL de mezcla maestra 2× SYBR Green, 0,4 µM de cada cebador y 2 µL de la plantilla de ADNc. El protocolo de amplificación consistió en una etapa inicial de desnaturalización a 95 °C durante 5 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s y hibridación/extensión a 60 °C durante 30 s. Posteriormente, se realizó un análisis de la curva de disociación para verificar la especificidad de la amplificación. El ARN nuclear pequeño U6 se utilizó como control interno para la cuantificación de miARN, mientras que GAPDH se empleó como gen de referencia para la normalización del ARNm. Los niveles relativos de expresión se determinaron utilizando el método 2−ΔΔCq.
Las secuencias de los cebadores para miARN fueron las siguientes: cebador de retrotranscripción con bucle en tallo, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; cebador directo de miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; cebador inverso universal, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; cebador directo de U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; y cebador inverso de U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Las secuencias de los cebadores para WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 y GAPDH, junto con las longitudes de los amplicones y las eficiencias de amplificación, se proporcionan en Tabla 1. La expresión de ARNm se normalizó respecto a GAPDH, mientras que la expresión de miR-486-3p se normalizó respecto a U6. Cada experimento incluyó tres réplicas biológicas independientes, con tres réplicas técnicas por réplica biológica.
Transferencia Western
Después de completar la selección con puromicina de 7 días y un período de recuperación, las células se lisaron en tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasas. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante un ensayo de proteína BCA. Se separaron cantidades iguales de proteína (20 µg por pocillo) en geles de SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a membranas de PVDF mediante transferencia húmeda a 300 mA durante 120 min. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % preparada en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 al 0,1 % (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-catenina (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) o β-actina (1:5.000). Los fabricantes y números de catálogo de todos los anticuerpos se proporcionan en la Tabla de Materiales. Después de tres lavados de 10 min con TBST, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRP, diluido 1:5.000, durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, las membranas se lavaron tres veces con TBST, y las bandas proteicas se visualizaron utilizando un sustrato quimioluminiscente e imagenes se obtuvieron con un sistema de documentación e imagen de geles. Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando ImageJ. La abundancia de cada proteína diana se normalizó respecto a la señal correspondiente de β-actina del mismo muestra biológica. Solo se utilizaron exposiciones dentro del rango lineal de detección, no saturado, para el análisis densitométrico. Se realizaron tres experimentos biológicos independientes.
Ensayo con el kit de conteo celular-8
Se sembraron células A549 y H358 transducidas establemente con LV-NC o LV-miR-486-3p en placas de 96 pocillos a 1,5 × 104 células/pocillo en 100 µL de medio completo. Tras la adhesión durante la noche, se reemplazó el medio y se midió inmediatamente la absorbancia a las 0 h tras la adición del reactivo del Kit de Conteo de Células-8. A las 0 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h, se añadieron 10 µL de reactivo por pocillo y se incubaron durante 1 h a 37 °C antes de leer la absorbancia a 450 nm. Para el análisis cinético revisado, cada grupo se normalizó respecto a su propio valor a las 0 h antes de la representación gráfica. Se realizaron tres experimentos biológicos independientes, y los pocillos técnicos dentro de cada experimento se promediaron antes del análisis estadístico.
Ensayo de formación de colonias
Las células A549 y H358 seleccionadas de forma estable se prepararon como suspensiones simples de células a 5 × 102 células/mL. Se sembró un mililitro de suspensión celular en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, seguido de 3 mL de medio completo. Las células se cultivaron durante 14 días, con reemplazo del medio cada 5 días. Las colonias se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos, se tiñeron con violeta cristal durante 20 minutos, se lavaron nuevamente y se secaron al aire. Se contaron las colonias que contenían al menos 50 células utilizando ImageJ. Se realizaron tres experimentos biológicos independientes.
NOTA: Se requiere una suspensión uniforme de células individuales y una mínima perturbación de la placa durante el establecimiento de colonias para evitar la agrupación artificial de células.
Ensayo de migración celular
Se sembraron células A549 y H358 transducidas de forma estable en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta la formación de una monocapa confluente. Se realizó un rasguño recto con una punta estéril de pipeta de 10 µL, se eliminaron las células desprendidas y se capturaron imágenes de los mismos campos marcados a las 0 h, 24 h, 48 h y 72 h. El área de la herida se midió mediante ImageJ, y el cierre de la herida se calculó como (área a las 0 h − área en el punto de tiempo indicado) / área a las 0 h × 100 %. Se realizaron tres experimentos biológicos independientes. No se utilizó ningún inhibidor farmacológico de la proliferación; por lo tanto, este ensayo se interpretó como una medida del cierre de la herida y no como una lectura específica de la migración.
NOTA: Los arañazos deben generarse con una anchura y presión constantes, y deben seguirse campos idénticos a lo largo del curso del tiempo.
Ensayo de invasión celular
Los ensayos de invasión en Transwell se realizaron utilizando insertos de membrana de policarbonato de 24 pocillos con un tamaño de poro de 8 µm. La superficie superior de cada inserto se recubrió con 100 µL de matriz de membrana basal Matrigel diluida 1:8 en DMEM sin suero hasta una concentración proteica final aproximada de 1 mg/mL y se incubó a 37 °C durante 4 h. Las células A549 y H358 se resuspendieron en medio RPMI-1640 sin suero a densidades de 8 × 105 células/mL y 4 × 105 células/mL, respectivamente. Se añadió una alícuota de 200 µL de la suspensión celular a la cámara superior, lo que correspondió a 1,6 × 105 células A549 o 8 × 104 células H358 por inserto. La cámara inferior se llenó con 500 µL de medio RPMI-1640 que contenía 20% de suero bovino fetal como quimioatractante. Tras la incubación a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de CO₂ durante 48 h, las células no invasoras que permanecían en la superficie superior de la membrana se eliminaron suavemente con un hisopo de algodón. Las células que habían invadido a través de la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 min y se tiñeron con violeta cristal al 0,1% durante 20 min a temperatura ambiente. Se capturaron imágenes de cinco campos microscópicos seleccionados al azar por cada inserto, y el número de células invadidas se cuantificó utilizando ImageJ. El recuento medio de células de los cinco campos se consideró un único valor por inserto, y el inserto, y no el campo microscópico individual, se trató como la unidad experimental. Se realizaron tres experimentos biológicos independientes.
NOTA: Retire las células no invasoras suave y consistentemente para evitar dañar la membrana o desalojar las células que han migrado a su superficie inferior.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± SD, y n denota experimentos biológicos independientes a menos que se indique lo contrario. Los réplicas técnicas o los múltiples campos microscópicos provenientes de la misma unidad experimental se promediaron antes de las pruebas inferenciales. Para la comparación entre las tres líneas celulares, se utilizó un análisis de varianza de un factor seguido de comparaciones por pares ajustadas según Tukey. Para los cursos temporales de CCK-8 y cierre de herida, se empleó un análisis de varianza de dos vías con medidas repetidas para evaluar los efectos del tratamiento, el tiempo y la interacción tratamiento-por-tiempo, seguido de comparaciones ajustadas según Šídák en puntos temporales individuales. Las comparaciones entre dos grupos se analizaron utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas. pruebas t. Los análisis estadísticos y la visualización de datos se realizaron utilizando software de análisis estadístico y graficación. Exacto p-los valores se indican en los paneles de las figuras o en las tablas de datos originales. La significancia estadística se definió como p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 y ****p < 0.0001.
Resultados
El análisis de TCGA/starBase muestra una abundancia reducida de miR-486-3p en LUAD, y TargetScan identifica sitios de unión candidatos
Los datos de expresión derivados de TCGA y obtenidos a través de starBase v3.0 mostraron que la abundancia de miR-486-3p era significativamente menor en 512 muestras de adenocarcinoma pulmonar (LUAD) que en 20 muestras pulmonares no tumorales (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, p = 3,2 × 10⁻5; Figura 1). TargetScanHuman identificó un sitio candidato 7mer-m8 poco conservado para miR-486-3p en las posiciones 468–474 de la región no traducida 3′ (DVL1 3′ UTR), con una puntuación de contexto++ de −0,23 y un percentil de puntuación de contexto++ del 80. Se identificó un sitio candidato 8mer poco conservado en las posiciones 913–920 de la región 3′ UTR de WNT5B, con una puntuación de contexto++ de −0,46 y un percentil de puntuación de contexto++ del 97 (Figura 2). Estos sitios predichos computacionalmente se utilizaron para generar la hipótesis experimental y no se consideraron evidencia de unión directa entre el miARN y su diana. Las URL de origen se proporcionan en la Tabla 2.
La abundancia de miR-486-3p se reduce en líneas celulares de CAEP y aumenta notablemente tras la transducción lentiviral
Bajo sus respectivas condiciones de cultivo rutinarias, el análisis de RT-qPCR mostró que la abundancia de miR-486-3p era menor en las células A549 y H358 que en las células epiteliales bronquiales Beas-2b. Las comparaciones ajustadas por Tukey tras el análisis de varianza de un factor mostraron diferencias significativas entre las células A549 y Beas-2b (p < 0,01) y entre las células H358 y Beas-2b (p < 0,001; Figura 3A).
La transducción estable con LV-miR-486-3p aumentó notablemente la abundancia de miR-486-3p en comparación con los grupos correspondientes de LV-NC. La expresión aumentó aproximadamente 1.470 veces en células A549 y 220 veces en células H358, con ambas comparaciones alcanzando significancia estadística (p < 0,001; Figura 3B,C). Estos resultados confirmaron el establecimiento exitoso de modelos celulares estables que sobreexpresan miR-486-3p.
La expresión forzada de miR-486-3p se asocia con la reducción de la expresión de WNT5B, DVL1, β-catenina y BCL-2
El inmunotransferencia mostró una menor abundancia proteica de WNT5B, DVL1, β-catenina total y BCL-2 en células transducidas con LV-miR-486-3p en comparación con los controles respectivos LV-NC (Figura 4A–E). En células A549, la expresión forzada de miR-486-3p se asoció con una reducción en la abundancia proteica de β-catenina (p = 0.022), WNT5B (p = 0.0008), DVL1 (p = 0.019) y BCL-2 (p = 0.0017). Reducciones correspondientes también se observaron en células H358 para β-catenina (p = 0.001), WNT5B (p = 0.0002), DVL1 (p = 0.0003) y BCL-2 (p = 0.0018).
Posteriormente, se realizó RT-qPCR para determinar si los cambios a nivel de transcritos acompañaron los hallazgos a nivel proteico (Figura 4F–I). En células A549, la expresión forzada de miR-486-3p redujo el ARNm de CTNNB1 a 0,226 veces respecto al grupo LV-NC (p = 0,004), el ARNm de WNT5B a 0,180 veces (p = 0,004), el ARNm de DVL1 a 0,278 veces (p = 0,006) y el ARNm de BCL2 a 0,259 veces (p = 0,003).
Se detectaron cambios similares a nivel de transcripción en células H358. El ARNm de CTNNB1 se redujo a 0,288 veces en relación con el grupo LV-NC (p = 0,028), el ARNm de WNT5B a 0,250 veces (p = 0,019), el ARNm de DVL1 a 0,271 veces (p = 0,020) y el ARNm de BCL2 a 0,534 veces (p = 0,003). Por lo tanto, la dirección de los cambios a nivel de transcripción fue consistente con los hallazgos correspondientes a nivel proteico en ambas líneas celulares. Estos resultados demuestran cambios coordinados en la expresión, pero no establecen un direccionamiento directo ni la actividad de un mecanismo de señalización lineal WNT5B/DVL1/β-catenina.
La expresión forzada de miR-486-3p reduce la señal de CCK-8 asociada al crecimiento
Las mediciones de CCK-8 se normalizaron respecto al valor correspondiente a las 0 h de cada grupo experimental. La señal de CCK-8 normalizada aumentó con el tiempo tanto en las células transducidas con LV-NC como con LV-miR-486-3p, aunque generalmente se observaron valores más bajos tras la expresión forzada de miR-486-3p (Figura 5).
En células A549, las comparaciones ajustadas mediante el método de Šídák tras el análisis de varianza de dos vías con medidas repetidas mostraron señales de CCK-8 significativamente más bajas en el grupo LV-miR-486-3p a las 24, 48 y 96 h en comparación con el grupo LV-NC (p < 0,05), mientras que la diferencia a las 72 h no fue estadísticamente significativa (Figura 5A). En células H358, la señal de CCK-8 fue significativamente más baja en el grupo LV-miR-486-3p a las 24, 48, 72 y 96 h (p < 0,05; Figura 5B). Estos hallazgos indican que la expresión forzada de miR-486-3p redujo la actividad metabólica asociada al crecimiento, con un efecto más consistente a lo largo del curso temporal en las células H358.
La expresión forzada de miR-486-3p reduce el crecimiento clonogénico
Se realizaron ensayos de formación de colonias para evaluar el crecimiento clonogénico a largo plazo. Las células A549 transducidas con LV-miR-486-3p formaron significativamente menos colonias que las células LV-NC correspondientes (p = 0.013; Figura 6A). También se observó una reducción significativa en el número de colonias en las células H358 (p = 0.006; Figura 6B). La reducción fue más pronunciada en las células H358 que en las células A549, lo que indica que la magnitud del efecto clonogénico difirió entre los dos modelos de CAUP.
La expresión forzada de miR-486-3p reduce el cierre de la herida
El cierre de la herida se cuantificó a las 24 h, 48 h y 72 h posteriores al rayado (Figura 7). En cultivos de A549, el grupo LV-miR-486-3p mostró un cierre de herida significativamente menor que el grupo LV-NC a las 24, 48 y 72 h (p < 0,05 en cada comparación; Figura 7A,C).
De manera similar, el cierre de la herida se redujo en cultivos de H358 transducidos con LV-miR-486-3p a las 24 h y 48 h (p < 0,05) y a las 72 h (p < 0,01; Figura 7B,D). Dado que el ensayo se realizó sin un inhibidor farmacológico de la proliferación, estos resultados se interpretaron como una reducción del cierre de la herida, y no como evidencia de un efecto exclusivamente específico para la migración.
La expresión forzada de miR-486-3p reduce el tránsito a través de membranas recubiertas con Matrigel
Se evaluó la capacidad de las células para atravesar membranas Transwell recubiertas con Matrigel después de 48 h. Se detectaron significativamente menos células teñidas con violeta de cristal en la superficie inferior de la membrana en el grupo A549 LV-miR-486-3p en comparación con el grupo A549 LV-NC (p = 0.0001; Figura 8A). Se observó una reducción similar en las células H358 (p = 0.0007; Figura 8B).
Se promediaron cinco campos microscópicos para cada inserto, y el inserto se trató como la unidad experimental. Estos hallazgos demuestran una reducción en la migración a través de membranas recubiertas con Matrigel tras la expresión forzada de miR-486-3p en las condiciones utilizadas en este ensayo.
DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:
Todos los datos originales que sustentan las figuras se incluyen en el Archivo Suplementario 1, incluidos los archivos fuente de la base de datos, los datos de RT-qPCR, las imágenes completas de las transferencias Western, los valores de densitometría, las imágenes de microscopía, los registros de recuentos, las mediciones de CCK-8 y los archivos de análisis estadístico.
Figura 1: Abundancia de miR-486-3p en muestras de ACPC y pulmón normal de TCGA/starBase. Los datos de expresión derivados de TCGA se recuperaron mediante starBase v3.0 en mayo de 2026 e incluyeron 512 muestras de adenocarcinoma de pulmón (ACPC) y 20 muestras de pulmón normal. Los grupos se compararon utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (p = 3,2 × 10⁻5). ACPC, adenocarcinoma de pulmón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Sitios candidatos de unión de miR-486-3p predichos por TargetScan en las regiones UTR 3′ de DVL1 y WNT5B. TargetScanHuman identificó un sitio candidato 7mer-m8 en las posiciones 468–474 de la región no traducida 3′ (UTR 3′) de DVL1 y un sitio candidato 8mer en las posiciones 913–920 del UTR 3′ de WNT5B. Las URL de origen se proporcionan en la Tabla 2. Estas predicciones computacionales se utilizaron para la generación de hipótesis y no constituyen evidencia experimental de unión directa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Abundancia basal de miR-486-3p y verificación de la sobreexpresión mediante lentivirus. (A) Análisis de RT-qPCR de miR-486-3p abundancia en células A549, H358 y Beas-2b mantenidas en sus respectivos medios de cultivo habituales. (B, C) Verificación mediante RT-qPCR miR-486-3p sobreexpresión en A549 (B) y H358 (C) células transducidas con LV-NC o LV-miR-486-3p. La expresión se normalizó respecto a U6. Los datos se presentan como media ± DE de tres experimentos biológicos independientes. (A) se analizó mediante ANOVA de un factor seguido de comparaciones múltiples ajustadas por Tukey. (B, C) se analizaron utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas t-pruebas. *p < 0.01; **p < 0,001. LV-NC, lentivirus de control negativo; RT-qPCR, PCR cuantitativa de transcripción reversa; DE, desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La expresión forzada de miR-486-3p se asocia con la reducción de la expresión de genes candidatos. (A) Inmunotransferencias representativas que muestran la abundancia de β-catenina, WNT5B, DVL1, BCL-2 y β-actina en células A549 y H358 transducidas con LV-NC o LV-miR-486-3p. Las masas moleculares se indican en kilodaltons. (B–E) Cuantificación densitométrica de β-catenina (B), WNT5B (C), DVL1 (D) y BCL-2 (E), normalizado a β-actina. (F–I) Análisis de RT-qPCR de CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H), y BCL2 (I) abundancia de transcritos, normalizada a GAPDH. Los datos se presentan como media ± DE de tres experimentos biológicos independientes; cada punto representa réplicas biológicas independientes. Los grupos se compararon mediante una prueba t de Student no apareada de dos colas t-pruebas. Exacto p-los valores y los cambios en la expresión se proporcionan en los paneles correspondientes. kDa, kilodalton; LV-NC, lentivirus de control negativo; RT-qPCR, PCR cuantitativa de transcripción inversa; SD, desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La expresión forzada de miR-486-3p reduce las señales asociadas al crecimiento del CCK-8 a lo largo del tiempo. Las células A549 (A) y H358 (B) transducidas con LV-NC o LV-miR-486-3p se analizaron a las 0 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h. Los valores de OD450 se normalizaron respecto al valor correspondiente a las 0 h dentro de cada grupo. Los datos se presentan como media ± DE de tres experimentos biológicos independientes. Los efectos del tratamiento, del tiempo y de la interacción tratamiento-por-tiempo se analizaron mediante un ANOVA de medidas repetidas de dos vías, seguido de comparaciones ajustadas según Šídák entre los grupos en cada punto temporal. *p < 0,05. CCK-8, Kit de recuento celular-8; LV-NC, lentivirus de control negativo; OD450, densidad óptica a 450 nm; DE, desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La expresión forzada de miR-486-3p reduce el crecimiento clonogénico. Imágenes representativas de todo el pocillo y recuentos cuantitativos de colonias se muestran para A549 (A) y H358 (B) células transducidas con LV-NC o LV-miR-486-3p. Las colonias se cuantificaron utilizando ImageJ con configuraciones de análisis idénticas para todos los grupos. Los datos se presentan como media ± DE de tres experimentos biológicos independientes y se analizaron mediante la prueba t de Student no pareada de dos colas t-pruebas. Exacto plos valores se proporcionan en los paneles correspondientes. LV-NC, lentivirus de control negativo; DE, desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: La expresión forzada de miR-486-3p reduce el cierre de la herida. Se muestran imágenes representativas y mediciones cuantitativas del cierre de heridas para células A549 (A,C) y H358 (B,D) a las 0 h, 24 h, 48 h y 72 h después del rayado. El cierre de la herida se calculó de la siguiente manera: (área de la herida a las 0 h − área de la herida en el punto de tiempo indicado) / área de la herida a las 0 h × 100%. Los datos se presentan como media ± DE de tres experimentos biológicos independientes. Los efectos del tratamiento, del tiempo y de la interacción tratamiento-por-tiempo se analizaron mediante ANOVA de medidas repetidas de dos vías, seguido de comparaciones ajustadas por Šídák entre los grupos en cada punto de tiempo. Barras de escala, 200 µm. *p < 0,05; **p < 0,01. LV-NC, lentivirus de control negativo; DE, desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: La expresión forzada de miR-486-3p reduce el tránsito a través de membranas Transwell recubiertas con Matrigel. Campos microscópicos teñidos con violeta de cristal representativos y recuentos cuantitativos de células a nivel del inserto se muestran para A549 (A) y H358 (B) células transducidas con LV-NC o LV-miR-486-3p. Insertos Transwell con un 8-µm se utilizaron tamaños de poro. Se promediaron cinco campos microscópicos para cada inserto, y cada inserto se trató como una unidad experimental. Los datos se presentan como media ± DE de tres experimentos biológicos independientes y se analizaron mediante una prueba t de Student no apareada de dos colas t-pruebas. Barras de escala, 200 µm. Exacto plos valores se proporcionan en los paneles correspondientes. LV-NC, lentivirus de control negativo; DE, desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gen | Secuencias de los cebadores | Longitudes del amplicón | Eficiencias de amplificación | |
| WNT5B | Sentido: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 118 pb | 101% | |
| Antisentido: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | Sentido: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 pb | 95,60% | |
| Antisentido: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | Sentido: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3', | 140 pb | 96,30% | |
| Antisentido: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | Sentido: 5'- GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3', | 139 pb | 97,20% | |
| Antisentido: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | Sentido: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 pb | 98,30% | |
| Antisentido: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
Tabla 1: Secuencias de cebadores utilizadas para RT-qPCR.
| Objetivo | Información de predicción | Fuente | ||
| DVL1 | 7mer-m8, posiciones 468–474 | URL de TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000397196.2&taxid=9606&members=miR-486-3p&showcnc=1& shownc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
| WNT5B | 8mer, posiciones 913–920 | URL de TargetScan (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000378891.5&taxid=9606&members=miR-486-3p&showcnc=1& shownc=1&shownc_nc=1&showncf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
Tabla 2: Base de datos TargetScan y URL correspondiente.
Archivo suplementario 1: Datos que respaldan los hallazgos de este estudio.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
El presente estudio de ganancia de función evaluó los efectos de la expresión estable e inducida de miR-486-3p en células de adenocarcinoma pulmonar (LUAD) A549 y H358. En ambos modelos, la sobreexpresión de miR-486-3p se asoció con señales reducidas del CCK-8 relacionadas con el crecimiento, menor crecimiento clonogénico, disminución del cierre de heridas y menor número de células que atravesaron membranas Transwell recubiertas con Matrigel. Estos cambios fenotípicos se acompañaron de una reducción en la abundancia proteica de WNT5B, DVL1, β-catenina total y BCL-2, junto con niveles más bajos de los transcritos WNT5B, DVL1, CTNNB1 y BCL2. En conjunto, estos hallazgos respaldan una asociación entre la expresión forzada de miR-486-3p, la atenuación de varios fenotipos celulares malignos y cambios coordinados en moléculas seleccionadas relacionadas con la vía Wnt. Sin embargo, no establecen un vínculo directo entre el miARN y su diana, la actividad de la vía ni una secuencia causal de señalización.
El fenotipo supresor general de tumores observado en este estudio es consistente con informes previos y no debe interpretarse como el hallazgo novedoso principal. Tomioka et al. demostraron previamente que tanto miR-486-3p como miR-486-5p suprimen fenotipos malignos en células de LUAD e identificaron GINS4 mediante una estrategia de cribado de objetivos sin sesgo26. La contribución del presente estudio es más específica: la expresión forzada de miR-486-3p se acompañó de reducciones en la abundancia de WNT5B, DVL1 y β-catenina en dos modelos celulares de LUAD. Además, el estudio proporciona un flujo de trabajo experimental integrado que combina transducción lentiviral estable, RT-qPCR, inmunotransferencia (Western blotting), análisis con CCK-8, formación de colonias, cierre de herida y ensayos con Transwell recubierto de Matrigel. Esta distinción es importante porque el presente trabajo amplía las observaciones moleculares asociadas con la sobreexpresión de miR-486-3p sin afirmar ser la primera demostración de su actividad antitumoral en LUAD.
Los hallazgos relacionados con Wnt requieren una interpretación cautelosa. WNT5B generalmente se describe como un ligando Wnt no canónico y puede activar la señalización de polaridad celular planar o la vía Wnt/Ca2⁺ de manera dependiente del receptor y del contexto. En algunos entornos celulares, la señalización Wnt no canónica también puede antagonizar la señalización dependiente de β-catenina10,11. DVL1 es un mediador intracelular común que puede participar tanto en la señalización Wnt canónica como no canónica y se ha asociado con fenotipos relacionados con β-catenina en el cáncer de pulmón de células no pequeñas12. Por lo tanto, la reducción simultánea de WNT5B, DVL1 y β-catenina total no demuestra una vía lineal WNT5B→DVL1→β-catenina. Los datos actuales indican, en cambio, reducciones concomitantes en la expresión de WNT5B y en la abundancia de DVL1 y β-catenina tras la expresión forzada de miR-486-3p.
Los resultados a nivel de transcripción fueron coherentes en dirección con los hallazgos del inmunotransferencia. La expresión forzada de miR-486-3p redujo la abundancia de los transcritos WNT5B, DVL1 y CTNNB1 en células A549 y H358. Esta concordancia sugiere que los cambios observados en las proteínas podrían ir acompañados de una alteración en la abundancia de los transcritos, en lugar de deberse exclusivamente a cambios en la estabilidad proteica. Sin embargo, la reducción en los niveles de transcritos y proteínas no establece un acoplamiento directo de miR-486-3p a las regiones no traducidas 3′ predichas. Serían necesarios ensayos de luciferasa dual utilizando sitios de unión de tipo silvestre y mutantes, junto con experimentos de rescate, para determinar si WNT5B o DVL1 están regulados directamente por miR-486-3p. De manera similar, la reducción en la abundancia de BCL-2 indica una alteración en una proteína asociada a la supervivencia, pero, en ausencia de ensayos validados de muerte celular, no puede interpretarse como evidencia de un aumento en la apoptosis.
Los ensayos funcionales también tienen limitaciones específicas del ensayo. El CCK-8 mide la actividad metabólica celular en lugar de determinar directamente el número de células, y los cambios en la absorbancia pueden reflejar alteraciones en la proliferación, el metabolismo o la viabilidad. La formación de colonias proporciona una medida a largo plazo de la capacidad clonogénica, pero la magnitud del efecto difirió entre las dos líneas celulares, con una reducción moderada en las células A549 y una reducción mayor en las células H358. Esta diferencia sugiere que la respuesta a la expresión forzada de miR-486-3p puede depender del contexto molecular y celular.
Se observó un cierre reducido de la herida en ambas líneas celulares, pero no se utilizó ningún inhibidor de la proliferación durante el ensayo. Dado que la expresión forzada de miR-486-3p también afectó las mediciones asociadas al crecimiento, la proliferación reducida podría haber contribuido al fenotipo de cierre de la herida. Por lo tanto, los hallazgos deben interpretarse como un cierre reducido de la herida y no como un efecto específico de migración. De manera similar, el ensayo de Transwell con recubrimiento de Matrigel de 48 h podría verse influenciado por diferencias en el tránsito a través de la membrana, la proliferación, la supervivencia o la adhesión. La reducción observada en el número de células en la superficie inferior de la membrana apoya, en consecuencia, un tránsito deficiente bajo las condiciones evaluadas, pero no identifica un mecanismo específico de invasión.
Una consideración adicional es la magnitud de la sobreexpresión de miR-486-3p. La transducción lentiviral aumentó la abundancia de miR-486-3p aproximadamente 1.470 veces en células A549 y 220 veces en células H358, en comparación con los grupos de control correspondientes. Dicha expresión supra-fisiológica podría incrementar la represión fuera de blanco dependiente de la región semilla, afectar la disponibilidad de componentes del complejo de silenciamiento inducido por ARN o inducir estrés celular inespecífico. Debido a que no se realizó una serie de respuesta a la dosis, no fue posible definir la relación entre la abundancia de miR-486-3p y los fenotipos observados. Además, la ausencia de un experimento de pérdida de función basado en inhibidores impide llegar a conclusiones sobre el papel fisiológico endógeno de miR-486-3p en células de CAEP. Por lo tanto, los resultados presentes deben interpretarse específicamente como consecuencias de una sobreexpresión forzada y estable.
Se deben considerar varias limitaciones. Solo se examinaron dos líneas celulares de LUAD con mutación en KRAS, y el uso de diferentes medios de cultivo habituales limita la interpretación de las comparaciones con las células Beas-2b. No se realizó la autenticación de las líneas celulares ni pruebas de micoplasma durante el estudio, y se utilizó U6 como única referencia para la cuantificación de miR-486-3p. Además, el estudio careció de ensayos de pérdida de función, respuesta a la dosis, reporter, rescate y funcionales de la vía Wnt. Asimismo, los resultados del cierre de herida y los ensayos Transwell podrían haber sido influenciados por diferencias en la proliferación, viabilidad o adhesión. Por último, no se incluyeron modelos animales, muestras de pacientes ni cohortes de validación clínica. Por lo tanto, los hallazgos se limitan a este sistema in vitro de expresión forzada y no establecen un direccionamiento directo, causalidad de la vía ni utilidad clínica.
En conclusión, la expresión estable forzada de miR-486-3p redujo varias mediciones asociadas al crecimiento y la motilidad en células de adenocarcinoma pulmonar (LUAD) A549 y H358, y se acompañó de una menor expresión de WNT5B, DVL1, β-catenina total y BCL-2. Estos hallazgos proporcionan una base para investigaciones mecanicistas adicionales, pero no establecen a WNT5B ni a DVL1 como dianas directas, una vía lineal WNT5B/DVL1/β-catenina, ni el valor clínico del miR-486-3p.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
El Plan de Ciencia y Tecnología Médica y Sanitaria de la Provincia de Zhejiang (2025KY349) y la Disciplina Clave de Apoyo de la Ciudad de Jiaxing (2023-zc-014) proporcionaron apoyo financiero para este estudio.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tris-HCl 1 M (pH 6,8) | Solarbio | T1020 | Preparación del gel de apilamiento SDS-PAGE |
| Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | Preparación del gel de resolución SDS-PAGE |
| Tampón TBS 20× | Solarbio | 71080 | Tampón stock para lavado en inmunotransferencia y dilución de anticuerpos |
| Solución de acrilamida/bis-acrilamida al 30 % (29:1) | Solarbio | A1010 | Preparación de geles SDS-PAGE |
| Fijador de paraformaldehído al 4 % | Servicebio | G1101 | Fijación para ensayos de formación de colonias y Transwell |
| Tampón de carga de proteínas 5× | Beyotime | P0015 | Preparación de muestras proteicas para SDS-PAGE |
| Persulfato de amonio | Solarbio | 427A038 | Iniciador de polimerización del gel SDS-PAGE |
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Beyotime | P0009-1 | Determinación de la concentración proteica |
| Anticuerpo BCL-2 | Boster Biological Technology | A00040-2 | Anticuerpo policlonal de conejo; inmunotransferencia a 1:5.000 |
| Kit de recuento celular-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Ensayo de actividad metabólica asociada al crecimiento celular; 10 μL por 100 μL de medio de cultivo |
| Sistema de imagen por quimioluminiscencia | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Obtención de imágenes en inmunotransferencia |
| Cloroformo | Servicebio | G3005 | Separação de fases durante la extracción de ARN basada en TRIzol |
| Solución de tinción con violeta de cristal | Servicebio | G1014 | Tinción de colonias y membranas Transwell |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Medio de cultivo rutinario para células Beas-2b |
| Anticuerpo DVL1 | Signalway Antibody | 53180 | Anticuerpo primario de conejo; inmunotransferencia a 1:5.000 |
| Suero bovino fetal (FBS) | Biosharp | BL203B | Suplemento al 10 % (v/v) para cultivo celular rutinario; 20 % (v/v) en la cámara inferior Transwell |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | Preparación de gráficos y análisis estadístico |
| Mezcla maestra Hieff qPCR SYBR Green (sin Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | PCR cuantitativa basada en SYBR Green |
| Hifair III SuperMix para síntesis de ADNc de primera cadena para qPCR (con digeridor de ADN genómico) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Transcripción inversa para RT-qPCR de ARNm |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22.0 | Análisis estadístico |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.53 | Densitometría en inmunotransferencia, medición del área de herida, recuento de colonias y recuento de células Transwell |
| Microscopio invertido | Olympus | CKX53 | Obtención de imágenes en ensayos de cierre de herida y Transwell |
| Isopropanol | Servicebio | G3006 | Precipitación de ARN durante la extracción basada en TRIzol |
| Preparaciones lentivirales LV-miR-486-3p y LV-NC | GenePharma | Síntesis personalizada | Vector estable de sobreexpresión de miR-486-3p y vector de control negativo aleatorio |
| Matriz de membrana basal Matrigel | Corning | 354234 | Diluido 1:8 en DMEM sin suero; concentración proteica final aproximada de 1 mg/mL |
| Metanol | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | Activación de membrana PVDF |
| Lector de microplacas | BioTek | ELx800 | Medición de absorbancia a 450 nm |
| Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen | Allsheng | Nano-600 | Determinación de la concentración de ARN y evaluación de la pureza A260/A280 |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Suplemento al 1 % (v/v) para cultivo celular rutinario |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Servicebio | G0002 | Lavado de células y membranas |
| Cóctel de inhibidores de proteasas | APExBIO | K1007 | Se añade al tampón de lisis RIPA |
| Escalera de proteínas | Biosharp | BL712A | Referencia de peso molecular para inmunotransferencia |
| Membrana PVDF | Millipore | K2MA8350E | Membrana de transferencia proteica para inmunotransferencia |
| Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | Adquisición de datos de RT-qPCR |
| Tampón de lisis RIPA | Beyotime | P0013B | Extracción de proteínas celulares totales |
| Reactivo de extracción de ARN (tipo TRIzol) | Servicebio | G3013 | Extracción de ARN total |
| Medio RPMI 1640 | Servicebio | G4510 | Medio de cultivo rutinario para células A549 y H358 y suspensión celular Transwell sin suero |
| SDS | Solarbio | S8010 | Reactivo SDS-PAGE |
| Leche desnatada en polvo | BD | 2271470 | Solución bloqueante al 5 % para inmunotransferencia |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | Análisis de expresión de miR-486-3p derivado de TCGA |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Predicción de sitios de unión candidatos para miR-486-3p |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Catalizador de polimerización del gel SDS-PAGE |
| Insertos Transwell, 24 pocillos, tamaño de poro 8 μm | Corning | 3428 | Ensayo de migración a través de membrana recubierta con Matrigel |
| Tripsina | Servicebio | G4000 | Desprendimiento celular |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Preparación del tampón de lavado para inmunotransferencia |
| Sistema de electroforesis vertical | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | Separación proteica por SDS-PAGE |
| Reactivo luminol sustrato HRP para inmunotransferencia | Affinity Biosciences | KF001 | Detección quimioluminiscente en inmunotransferencia |
| Sistema de transferencia húmeda | Bio-Rad | 1703930 | Transferencia proteica a membrana PVDF |
| Anticuerpo WNT5B | Signalway Antibody | 56808 | Anticuerpo primario de conejo; inmunotransferencia a 1:5.000 |
| Anticuerpo β-actina | Abcam | ab8227 | Control de carga; inmunotransferencia a 1:5.000 |
| Anticuerpo β-catenina | Signalway Antibody | 21725 | Anticuerpo primario de conejo; inmunotransferencia a 1:5.000 |
Referencias
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