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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
La sobreexpresión forzada de miR-486-3p suprime la actividad asociada a la proliferación, el crecimiento clonogénico, el cierre de heridas y el tránsito a través de Matrigel en células de adenocarcinoma pulmonar A549 y H358. Estos efectos van acompañados por una reducción en la expresión de WNT5B, DVL1, β-catenina y BCL-2, lo que indica una asociación in vitro con cambios relacionados con la vía Wnt, sin establecer un direccionamiento directo ni una causalidad de la vía.
El adenocarcinoma pulmonar (LUAD) es el subtipo histológico predominante del cáncer de pulmón de células no pequeñas y continúa asociado con una morbilidad y mortalidad considerables. Estudios previos han identificado funciones supresoras tumorales de miR-486-3p en LUAD, pero su relación con los cambios en la expresión relacionados con WNT5B, DVL1 y β-catenina no se ha definido claramente. Aquí, se examinó la abundancia basal de miR-486-3p en células de LUAD A549 y H358 y se comparó con la de células epiteliales bronquiales Beas-2b mantenidas bajo sus condiciones rutinarias respectivas. Se generaron modelos estables que sobreexpresan miR-486-3p mediante transducción lentiviral. Se evaluó la actividad asociada al crecimiento celular, el crecimiento clonogénico, el cierre de heridas y el tránsito a través de membranas recubiertas con Matrigel utilizando los ensayos de kit de conteo celular-8, formación de colonias, curación de heridas y Transwell. La abundancia de las proteínas WNT5B, DVL1, β-catenina y BCL-2 se evaluó mediante inmunotransferencia, y los niveles de ARNm de WNT5B, DVL1, CTNNB1 y BCL2 se analizaron adicionalmente mediante RT-qPCR. Bajo las condiciones de cultivo utilizadas, la abundancia de miR-486-3p fue menor en las células A549 y H358 que en las células Beas-2b, y la transducción lentiviral produjo una sobreexpresión estable en ambas líneas celulares de LUAD. La sobreexpresión forzada de miR-486-3p redujo la señal del CCK-8, la formación de colonias, el cierre de heridas y el tránsito a través de membranas recubiertas con Matrigel, y se acompañó de una menor abundancia proteica de WNT5B, DVL1, β-catenina total y BCL-2. La RT-qPCR mostró además una menor abundancia de transcritos de WNT5B, DVL1, CTNNB1 y BCL2 en ambas líneas celulares de LUAD tras la sobreexpresión de miR-486-3p. Estos hallazgos respaldan una asociación in vitro entre la expresión forzada de miR-486-3p, la atenuación de varios indicadores de células malignas y alteraciones en la expresión relacionada con la vía Wnt; sin embargo, no establecen un vínculo directo entre el miARN y su diana, la actividad de la vía ni un mecanismo de señalización lineal causal.
El adenocarcinoma pulmonar (LUAD) es el subtipo histológico más común del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y contribuye significativamente a la morbilidad y mortalidad relacionadas con el cáncer de pulmón en todo el mundo1,2,3,4,5. La clasificación molecular y las terapias dirigidas han mejorado los resultados en grupos seleccionados de pacientes, pero el LUAD avanzado sigue siendo difícil de tratar y es biológicamente heterogéneo1,2,3,4,5. Por lo tanto, definir los procesos reguladores que contribuyen al comportamiento celular maligno sigue siendo relevante para el desarrollo de hipótesis terapéuticas comprobables.
La señalización Wnt comprende ramas dependientes e independientes de β-catenina que regulan la proliferación, supervivencia, polaridad y motilidad6,7,8,9. WNT5B se asocia más frecuentemente con la señalización no canónica, aunque sus efectos biológicos varían según el receptor y el contexto celular10,11. DVL1 es una proteína citoplasmática de transducción de señales compartida por varias ramas de Wnt y se ha relacionado con comportamientos asociados a β-catenina en el cáncer de pulmón12. Por lo tanto, cambios simultáneos en WNT5B, DVL1 y β-catenina no deberían interpretarse por sí solos como evidencia de una única vía lineal.
Los microARN (miARN) son ARN no codificantes cortos que regulan la expresión génica mediante interacciones dependientes de la secuencia con transcritos diana13,14,15. Dado que un solo miARN puede afectar a múltiples ARN, la abundancia alterada de miARN puede influir en diversos fenotipos asociados a tumores13,14,15,16,17,18. Varios miARN se han relacionado con el crecimiento, la motilidad y la señalización del cáncer de pulmón, y se ha descrito la interacción entre miARN y redes relacionadas con Wnt en múltiples contextos de cáncer16,17,18,19,20.
El locus MIR486 da lugar a las cadenas maduras miR-486-3p y miR-486-5p. Se ha demostrado que miR-486-3p tiene actividad supresora de tumores en el cáncer oral y en el glioblastoma, mientras que se ha informado un efecto promotor de tumores en el carcinoma de células escamosas cutáneo21,22,23,24,25. Se seleccionó miR-486-3p para el presente estudio mediante una estrategia basada en hipótesis, fundamentada en su abundancia reducida en datos públicos de LUAD, en su actividad supresora de tumores previamente reportada en LUAD y en predicciones bioinformáticas que la vinculan con transcritos candidatos relacionados con WNT. Tomioka et al. demostraron efectos supresores de tumores de ambas cadenas de miR-486 en LUAD e identificaron GINS4 mediante un cribado genómico de dianas26. Por lo tanto, el presente estudio no afirma ser la primera demostración de un fenotipo antitumoral. En cambio, evalúa si la expresión forzada de miR-486-3p va acompañada de cambios en la abundancia de WNT5B, DVL1 y β-catenina, así como de cambios fenotípicos reproducibles en dos líneas celulares de LUAD. Estos análisis evalúan asociaciones y no establecen una interacción directa, la actividad de una vía o un mecanismo lineal WNT5B/DVL1/β-catenina.
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Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de materiales.
Cultivo celular
Se utilizaron las líneas celulares de adenocarcinoma pulmonar humano (LUAD) A549 y H358, y la línea celular epitelial bronquial inmortalizada Beas-2b. Se seleccionaron A549 (KRAS G12S) y H358 (KRAS G12C; deficiente en STK11) como modelos de LUAD comúnmente empleados con antecedentes distintos de mutaciones en KRAS, mientras que Beas-2b se incluyó como comparador epitelial bronquial no maligno. Las células A549 y H358 se mantuvieron en medio RPMI-1640, y las células Beas-2b se mantuvieron en medio DMEM; cada medio contenía 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina. Las células se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humedecida que contenía 5% de CO₂. Dado que las líneas celulares del tumor y el comparador epitelial se mantuvieron en medios de rutina diferentes, las comparaciones de expresión basal entre líneas celulares se interpretaron con precaución.
Transducción lentiviral y selección estable de células
Se utilizaron vectores lentivirales que portaban el precursor de hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) o una secuencia de control negativo aleatoria (LV-NC) en un diseño de ganancia de función estable. Las células A549 y H358 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 104 células/pocillo y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, las células se expusieron al lentivirus a una multiplicidad de infección (MOI) de 10 en presencia de 8 µg/mL de polibreno. Después de 24 h, el inóculo viral se reemplazó con medio completo fresco. Las células transducidas se seleccionaron con 2 µg/mL de puromicina durante 7 días. Tras la selección, las células sobrevivientes se dejaron recuperar y se ampliaron para los ensayos moleculares y funcionales posteriores. No se incluyó un brazo con inhibidor de miR-486-3p porque el presente estudio fue diseñado específicamente para evaluar los efectos de la sobreexpresión forzada estable.
NOTA: La MOI, el tiempo de exposición a la polibrena y las condiciones de selección con puromicina deben mantenerse idénticos entre los grupos LV-NC y LV-miR-486-3p para minimizar las diferencias relacionadas con el tratamiento en la viabilidad celular.
RT-qPCR
Se realizó RT-qPCR para determinar los niveles de expresión de miR-486-3p y confirmar la eficiencia de la sobreexpresión lentiviral en células A549 y H358. El ARN total se aisló utilizando el reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ARN se evaluaron espectrofotométricamente, considerándose aceptable una relación A260/A280 de 1,8–2,1. Para el análisis de ARNm, 1 µg de ARN total se transcribió inversamente a ADNc utilizando un kit comercial de síntesis de ADNc según el protocolo del fabricante. Para el análisis de microARN, la síntesis de ADNc se realizó utilizando un cebador específico de bucle en tallo para miARN. La PCR cuantitativa se llevó a cabo en un volumen total de reacción de 20 µL que contenía 10 µL de mezcla maestra 2× SYBR Green, 0,4 µM de cada cebador y 2 µL de la plantilla de ADNc. El protocolo de amplificación consistió en una etapa inicial de desnaturalización a 95 °C durante 5 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 10 s y hibridación/extensión a 60 °C durante 30 s. Posteriormente, se realizó un análisis de la curva de disociación para verificar la especificidad de la amplificación. El ARN nuclear pequeño U6 se utilizó como control interno para la cuantificación de miARN, mientras que GAPDH se empleó como gen de referencia para la normalización del ARNm. Los niveles relativos de expresión se determinaron utilizando el método 2−ΔΔCq.
Las secuencias de los cebadores para miARN fueron las siguientes: cebador de retrotranscripción con bucle en tallo, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; cebador directo de miR-486-3p, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; cebador inverso universal, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; cebador directo de U6, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; y cebador inverso de U6, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Las secuencias de los cebadores para WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 y GAPDH, junto con las longitudes de los amplicones y las eficiencias de amplificación, se proporcionan en Tabla 1. La expresión de ARNm se normalizó respecto a GAPDH, mientras que la expresión de miR-486-3p se normalizó respecto a U6. Cada experimento incluyó tres réplicas biológicas independientes, con tres réplicas técnicas por réplica biológica.
Transferencia Western
Después de completar la selección con puromicina de 7 días y un período de recuperación, las células se lisaron en tampón RIPA que contenía inhibidores de proteasas. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante un ensayo de proteína BCA. Se separaron cantidades iguales de proteína (20 µg por pocillo) en geles de SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a membranas de PVDF mediante transferencia húmeda a 300 mA durante 120 min. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 % preparada en solución salina tamponada con Tris que contenía Tween-20 al 0,1 % (TBST) durante 1 h a temperatura ambiente. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-catenina (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) o β-actina (1:5.000). Los fabricantes y números de catálogo de todos los anticuerpos se proporcionan en la Tabla de Materiales. Después de tres lavados de 10 min con TBST, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo conjugado con HRP, diluido 1:5.000, durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, las membranas se lavaron tres veces con TBST, y las bandas proteicas se visualizaron utilizando un sustrato quimioluminiscente e imagenes se obtuvieron con un sistema de documentación e imagen de geles. Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando ImageJ. La abundancia de cada proteína diana se normalizó respecto a la señal correspondiente de β-actina del mismo muestra biológica. Solo se utilizaron exposiciones dentro del rango lineal de detección, no saturado, para el análisis densitométrico. Se realizaron tres experimentos biológicos independientes.
Ensayo con el kit de conteo celular-8
Se sembraron células A549 y H358 transducidas establemente con LV-NC o LV-miR-486-3p en placas de 96 pocillos a 1,5 × 104 células/pocillo en 100 µL de medio completo. Tras la adhesión durante la noche, se reemplazó el medio y se midió inmediatamente la absorbancia a las 0 h tras la adición del reactivo del Kit de Conteo de Células-8. A las 0 h, 24 h, 48 h, 72 h y 96 h, se añadieron 10 µL de reactivo por pocillo y se incubaron durante 1 h a 37 °C antes de leer la absorbancia a 450 nm. Para el análisis cinético revisado, cada grupo se normalizó respecto a su propio valor a las 0 h antes de la representación gráfica. Se realizaron tres experimentos biológicos independientes, y los pocillos técnicos dentro de cada experimento se promediaron antes del análisis estadístico.
Ensayo de formación de colonias
Las células A549 y H358 seleccionadas de forma estable se prepararon como suspensiones simples de células a 5 × 102 células/mL. Se sembró un mililitro de suspensión celular en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, seguido de 3 mL de medio completo. Las células se cultivaron durante 14 días, con reemplazo del medio cada 5 días. Las colonias se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos, se tiñeron con violeta cristal durante 20 minutos, se lavaron nuevamente y se secaron al aire. Se contaron las colonias que contenían al menos 50 células utilizando ImageJ. Se realizaron tres experimentos biológicos independientes.
NOTA: Se requiere una suspensión uniforme de células individuales y una mínima perturbación de la placa durante el establecimiento de colonias para evitar la agrupación artificial de células.
Ensayo de migración celular
Se sembraron células A549 y H358 transducidas de forma estable en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta la formación de una monocapa confluente. Se realizó un rasguño recto con una punta estéril de pipeta de 10 µL, se eliminaron las células desprendidas y se capturaron imágenes de los mismos campos marcados a las 0 h, 24 h, 48 h y 72 h. El área de la herida se midió mediante ImageJ, y el cierre de la herida se calculó como (área a las 0 h − área en el punto de tiempo indicado) / área a las 0 h × 100 %. Se realizaron tres experimentos biológicos independientes. No se utilizó ningún inhibidor farmacológico de la proliferación; por lo tanto, este ensayo se interpretó como una medida del cierre de la herida y no como una lectura específica de la migración.
NOTA: Los arañazos deben generarse con una anchura y presión constantes, y deben seguirse campos idénticos a lo largo del curso del tiempo.
Ensayo de invasión celular
Los ensayos de invasión en Transwell se realizaron utilizando insertos de membrana de policarbonato de 24 pocillos con un tamaño de poro de 8 µm. La superficie superior de cada inserto se recubrió con 100 µL de matriz de membrana basal Matrigel diluida 1:8 en DMEM sin suero hasta una concentración proteica final aproximada de 1 mg/mL y se incubó a 37 °C durante 4 h. Las células A549 y H358 se resuspendieron en medio RPMI-1640 sin suero a densidades de 8 × 105 células/mL y 4 × 105 células/mL, respectivamente. Se añadió una alícuota de 200 µL de la suspensión celular a la cámara superior, lo que correspondió a 1,6 × 105 células A549 o 8 × 104 células H358 por inserto. La cámara inferior se llenó con 500 µL de medio RPMI-1640 que contenía 20% de suero bovino fetal como quimioatractante. Tras la incubación a 37 °C en una atmósfera húmeda con 5% de CO₂ durante 48 h, las células no invasoras que permanecían en la superficie superior de la membrana se eliminaron suavemente con un hisopo de algodón. Las células que habían invadido a través de la membrana se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 20 min y se tiñeron con violeta cristal al 0,1% durante 20 min a temperatura ambiente. Se capturaron imágenes de cinco campos microscópicos seleccionados al azar por cada inserto, y el número de células invadidas se cuantificó utilizando ImageJ. El recuento medio de células de los cinco campos se consideró un único valor por inserto, y el inserto, y no el campo microscópico individual, se trató como la unidad experimental. Se realizaron tres experimentos biológicos independientes.
NOTA: Retire las células no invasoras suave y consistentemente para evitar dañar la membrana o desalojar las células que han migrado a su superficie inferior.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± SD, y n denota experimentos biológicos independientes a menos que se indique lo contrario. Los réplicas técnicas o los múltiples campos microscópicos provenientes de la misma unidad experimental se promediaron antes de las pruebas inferenciales. Para la comparación entre las tres líneas celulares, se utilizó un análisis de varianza de un factor seguido de comparaciones por pares ajustadas según Tukey. Para los cursos temporales de CCK-8 y cierre de herida, se empleó un análisis de varianza de dos vías con medidas repetidas para evaluar los efectos del tratamiento, el tiempo y la interacción tratamiento-por-tiempo, seguido de comparaciones ajustadas según Šídák en puntos temporales individuales. Las comparaciones entre dos grupos se analizaron utilizando una prueba t de Student no pareada de dos colas. pruebas t. Los análisis estadísticos y la visualización de datos se realizaron utilizando software de análisis estadístico y graficación. Exacto p-los valores se indican en los paneles de las figuras o en las tablas de datos originales. La significancia estadística se definió como p < 0.05; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001 y ****p < 0.0001.
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El análisis de TCGA/starBase muestra una abundancia reducida de miR-486-3p en LUAD, y TargetScan identifica sitios de unión candidatos
Los datos de expresión derivados de TCGA y obtenidos a través de starBase v3.0 mostraron que la abundancia de miR-486-3p era significativamente menor en 512 muestras de adenocarcinoma pulmonar (LUAD) que en 20 muestras pulmonares no tumorales (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, p = 3,2 × 10⁻5;
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El presente estudio de ganancia de función evaluó los efectos de la expresión estable e inducida de miR-486-3p en células de adenocarcinoma pulmonar (LUAD) A549 y H358. En ambos modelos, la sobreexpresión de miR-486-3p se asoció con señales reducidas del CCK-8 relacionadas con el crecimiento, menor crecimiento clonogénico, disminución del cierre de heridas y menor número de células que atravesaron membranas Transwell recubiertas con Matrigel. Estos cambios fenotípicos se acompañaron de una reducción en la abundancia prot...
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
El Plan de Ciencia y Tecnología Médica y Sanitaria de la Provincia de Zhejiang (2025KY349) y la Disciplina Clave de Apoyo de la Ciudad de Jiaxing (2023-zc-014) proporcionaron apoyo financiero para este estudio.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tris-HCl 1 M (pH 6,8) | Solarbio | T1020 | Preparación del gel de apilamiento SDS-PAGE |
| Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | Preparación del gel de resolución SDS-PAGE |
| Tampón TBS 20× | Solarbio | 71080 | Tampón stock para lavado en inmunotransferencia y dilución de anticuerpos |
| Solución de acrilamida/bis-acrilamida al 30 % (29:1) | Solarbio | A1010 | Preparación de geles SDS-PAGE |
| Fijador de paraformaldehído al 4 % | Servicebio | G1101 | Fijación para ensayos de formación de colonias y Transwell |
| Tampón de carga de proteínas 5× | Beyotime | P0015 | Preparación de muestras proteicas para SDS-PAGE |
| Persulfato de amonio | Solarbio | 427A038 | Iniciador de polimerización del gel SDS-PAGE |
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Beyotime | P0009-1 | Determinación de la concentración proteica |
| Anticuerpo BCL-2 | Boster Biological Technology | A00040-2 | Anticuerpo policlonal de conejo; inmunotransferencia a 1:5.000 |
| Kit de recuento celular-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Ensayo de actividad metabólica asociada al crecimiento celular; 10 μL por 100 μL de medio de cultivo |
| Sistema de imagen por quimioluminiscencia | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Obtención de imágenes en inmunotransferencia |
| Cloroformo | Servicebio | G3005 | Separação de fases durante la extracción de ARN basada en TRIzol |
| Solución de tinción con violeta de cristal | Servicebio | G1014 | Tinción de colonias y membranas Transwell |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Medio de cultivo rutinario para células Beas-2b |
| Anticuerpo DVL1 | Signalway Antibody | 53180 | Anticuerpo primario de conejo; inmunotransferencia a 1:5.000 |
| Suero bovino fetal (FBS) | Biosharp | BL203B | Suplemento al 10 % (v/v) para cultivo celular rutinario; 20 % (v/v) en la cámara inferior Transwell |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | Preparación de gráficos y análisis estadístico |
| Mezcla maestra Hieff qPCR SYBR Green (sin Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | PCR cuantitativa basada en SYBR Green |
| Hifair III SuperMix para síntesis de ADNc de primera cadena para qPCR (con digeridor de ADN genómico) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Transcripción inversa para RT-qPCR de ARNm |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22.0 | Análisis estadístico |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.53 | Densitometría en inmunotransferencia, medición del área de herida, recuento de colonias y recuento de células Transwell |
| Microscopio invertido | Olympus | CKX53 | Obtención de imágenes en ensayos de cierre de herida y Transwell |
| Isopropanol | Servicebio | G3006 | Precipitación de ARN durante la extracción basada en TRIzol |
| Preparaciones lentivirales LV-miR-486-3p y LV-NC | GenePharma | Síntesis personalizada | Vector estable de sobreexpresión de miR-486-3p y vector de control negativo aleatorio |
| Matriz de membrana basal Matrigel | Corning | 354234 | Diluido 1:8 en DMEM sin suero; concentración proteica final aproximada de 1 mg/mL |
| Metanol | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | Activación de membrana PVDF |
| Lector de microplacas | BioTek | ELx800 | Medición de absorbancia a 450 nm |
| Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen | Allsheng | Nano-600 | Determinación de la concentración de ARN y evaluación de la pureza A260/A280 |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Suplemento al 1 % (v/v) para cultivo celular rutinario |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Servicebio | G0002 | Lavado de células y membranas |
| Cóctel de inhibidores de proteasas | APExBIO | K1007 | Se añade al tampón de lisis RIPA |
| Escalera de proteínas | Biosharp | BL712A | Referencia de peso molecular para inmunotransferencia |
| Membrana PVDF | Millipore | K2MA8350E | Membrana de transferencia proteica para inmunotransferencia |
| Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 5 | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | Adquisición de datos de RT-qPCR |
| Tampón de lisis RIPA | Beyotime | P0013B | Extracción de proteínas celulares totales |
| Reactivo de extracción de ARN (tipo TRIzol) | Servicebio | G3013 | Extracción de ARN total |
| Medio RPMI 1640 | Servicebio | G4510 | Medio de cultivo rutinario para células A549 y H358 y suspensión celular Transwell sin suero |
| SDS | Solarbio | S8010 | Reactivo SDS-PAGE |
| Leche desnatada en polvo | BD | 2271470 | Solución bloqueante al 5 % para inmunotransferencia |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | Análisis de expresión de miR-486-3p derivado de TCGA |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Predicción de sitios de unión candidatos para miR-486-3p |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Catalizador de polimerización del gel SDS-PAGE |
| Insertos Transwell, 24 pocillos, tamaño de poro 8 μm | Corning | 3428 | Ensayo de migración a través de membrana recubierta con Matrigel |
| Tripsina | Servicebio | G4000 | Desprendimiento celular |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Preparación del tampón de lavado para inmunotransferencia |
| Sistema de electroforesis vertical | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | Separación proteica por SDS-PAGE |
| Reactivo luminol sustrato HRP para inmunotransferencia | Affinity Biosciences | KF001 | Detección quimioluminiscente en inmunotransferencia |
| Sistema de transferencia húmeda | Bio-Rad | 1703930 | Transferencia proteica a membrana PVDF |
| Anticuerpo WNT5B | Signalway Antibody | 56808 | Anticuerpo primario de conejo; inmunotransferencia a 1:5.000 |
| Anticuerpo β-actina | Abcam | ab8227 | Control de carga; inmunotransferencia a 1:5.000 |
| Anticuerpo β-catenina | Signalway Antibody | 21725 | Anticuerpo primario de conejo; inmunotransferencia a 1:5.000 |
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