Cuantificación de la tasa de letalidad embrionaria en Caenorhabditis elegans

Resumen

Este protocolo proporciona un procedimiento sencillo y de bajo coste para cuantificar la tasa de letalidad embrionaria en Caenorhabditis elegans. Permite la detección sencilla de anomalías embrionarias en poblaciones sin equipos especializados ni experiencia en recogida de lombrices. El protocolo puede utilizarse para cuantificar los efectos de mutaciones genéticas, caídas genéticas mediadas por interferencia de ARN y dieta.

Resumen

La letalidad embrionaria es un fenotipo fundamental utilizado en la investigación de Caenorhabditis elegans para caracterizar defectos del desarrollo derivados de factores como exposiciones tóxicas y mutaciones genéticas. Por lo tanto, cuantificar con precisión la penetrancia de la letalidad embrionaria es fundamental para comprender los mecanismos e impacto de estas perturbaciones en el desarrollo animal. Aunque existen plataformas de puntuación automatizadas, estos enfoques suelen requerir una inversión financiera considerable y hardware o software especializado. Este artículo describe un ensayo de baja tecnología y bajo coste que cuantifica la letalidad embrionaria midiendo el porcentaje de embriones que no logran eclosionar con éxito. Cabe destacar que esta versión del ensayo elimina la necesidad de un punzón de gusano, lo que lo hace especialmente adecuado para principiantes. Una ventaja adicional de este enfoque es que cada ensayo técnico replica progenies de varios animales, evitando los posibles sesgos de los ensayos de un solo gusano. Este protocolo incluye una discusión de parámetros críticos, como el número mínimo de descendientes necesarios para capturar con precisión la penetrancia fenotípica y la lógica de la metodología. Por último, ofrecemos orientación sobre cómo adaptar el ensayo para evaluar los efectos de la reducción génica mediante interferencia de ARN, tratamientos farmacológicos o suplementación nutricional, añadiendo una herramienta versátil y accesible al conjunto de herramientas de los investigadores de C. elegans .

Introducción

La letalidad embrionaria es un fenotipo crítico para evaluar el papel de los genes y los factores ambientales en el desarrollo temprano. C. elegans es un modelo potente para estudiar procesos de desarrollo debido a su linaje celular invariante, cuerpo transparente y rápido ciclo^{de vida 1}. La letalidad embrionaria de C. elegans puede utilizarse para evaluar la integridad del desarrollo bajo perturbaciones químicas, farmacológicas, nutricionales y^genéticas 2,3,4,5. Por lo tanto, métodos accesibles y versátiles para cuantificar con precisión la tasa de letalidad embrionaria beneficiarían a la comunidad investigadora.

Métodos avanzados de alto rendimiento y alto contenido que estudian la embriogénesis dependen de sistemas de imagen especializados y software, a menudo requiriendo una inversión financiera^{considerable 4,6,7}, mientras que los enfoques más simples de alto rendimiento proporcionan principalmente lecturas^{cualitativas 8,9}. Los métodos clásicos, en cambio, utilizan un enfoque manual y de bajo coste que normalmente implica transferencias repetidas de hermafroditas individuales con un punzón para evaluar la letalidad embrionaria de toda la prole ^2,10. Sin embargo, este método puede ser técnicamente desafiante para principiantes y tiene una escalabilidad limitada. Además, los ensayos clásicos basados en el tamaño de la cría cuantifican la viabilidad embrionaria en la descendencia de una sola madre, lo que puede introducir sesgos no intencionados.

El objetivo general de este método es ofrecer un enfoque alternativo, sencillo, rentable y versátil para cuantificar la viabilidad embrionaria a un rendimiento medio. Este método mide las tasas de letalidad embrionaria en la descendencia de varios animales por réplica, no requiere el uso de un punzón de gusano y evita cualquier equipo especializado o costoso. El estudio también muestra cómo el método puede aplicarse a perturbaciones comunes, como la interferencia del ARN y las pruebas de fármacos o nutrientes.

Protocolo

1. Mantenimiento de C. elegans

NOTA: Guías detalladas sobre el manejo de C. elegans pueden encontrarse en WormBook¹¹.

1. Preparar las placas de Medio de Crecimiento Nematodo (NGM) de mantenimiento.
   1. Para obtener 1 L de NGM, combina 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona bacteriológica y 17 g de agar en una botella de 2 L. Añade 975 mL de agua destilada y una barra de agitación, luego autoclave durante 20 minutos a 121 °C.
   2. Deja que el medio se enfríe hasta 55 °C en un baño marea. Coloca el frasco sobre una placa de agitación y, usando técnica aséptica, añade 25 mL de 1 tampón de fosfato potásico M y 1 mL de cada uno de los siguientes: 1 M_{MgSO 4}, 1 M_{CaCl 2} y 5 mg/mL de colesterol. Vierte aproximadamente 25 mL en cada plato de 100 mm.
2. Prepara cultivos OP50 de E. coli durante la noche.
   1. Utilizando la técnica aséptica, se llena un matraz de Erlenmeyer de 1 L hasta una quinta parte de su volumen (200 mL) con medio LB. Inocúla el medio con una sola colonia de E. coli OP50 usando un lazo inoculante estéril. Incubar durante la noche a 37 °C sobre un agitador orbital a 200 rpm.
3. Semillas de placas de mantenimiento NGM con E. coli OP50 (Figura 1A).
   1. Transfiere el cultivo OP50 de E. coli a botellas de centrifugadora autoclave y centrifuga durante 30 minutos a 3.500 x g a temperatura ambiente. Resuspende el pellet bacteriano en una vigésima parte del volumen original. Utilice entre 1 y 1,5 mL de cultivo concentrado para sembrar cada placa de 100 mm de NGM.
   2. Incuba las placas durante la noche a temperatura ambiente para permitir que las bacterias crezcan.
      NOTA: Estas placas de mantenimiento tienen una alta densidad de bacterias para soportar hasta 4.000 gusanos por placa, lo cual es deseable al realizar un gran número de ensayos o trabajar con una cepa de C . elegans de crecimiento lento. Los platos de mantenimiento con semillas pueden almacenarse en la nevera a 4 °C durante hasta 1 mes.
4. Establecer una cultura primaria de C. elegans (Figura 1A).
   1. Utiliza una punta de pipeta estéril para cortar un pequeño trozo de agar que contiene ~1.000 gusanos de una placa de mantenimiento hambrienta. Coloca el trozo de agar sobre una placa de NGM con semillas.
   2. Coloca el plato nuevo en un recipiente de plástico e incuba a 20 °C durante 3 días, hasta que los gusanos estén grávidos y pongan huevos. Asegúrate de que el césped bacteriano sea suficiente y que la población de gusanos no se quede sin alimentación. En este punto, la población de gusanos está lista para el experimento.

2. Preparación de medios experimentales y cultivos bacterianos

NOTA: En este paso, proceda con el Método 1 para probar el efecto de la reducción genética mediada por ARN o el Método 2 para investigar suplementos dietéticos.

1. Método 1: Preparar placas experimentales de NGM para ARNi alimentándose.
   1. Prepara 1 L de NGM como se describe en el paso 1.1 y, usando técnica aséptica, añade 1 mL de 1 M IPTG y 1 mL de ampicilina de 50 mg/mL. Vierte aproximadamente 5 mL en cada placa de 35 mm.
   2. Inocular el número deseado de clones alimentados con ARN de E. coli HT115 portadores de plásmidos de L4440 dirigidos a genes de interés de C. elegans , junto con el control del vector vacío. Elige una sola colonia con un lazo inoculador y transfiere a 1,5 mL de LB que contenga 50 μg/mL de ampicilina. Incubar durante 18 horas a 37 °C sobre un agitador orbital a 200 rpm.
   3. Semilla placas NGM de 35 mm que contienen ampicilina e IPTG con 100 μL de cultivo nocturno de E. coli HT115, preparando dos réplicas técnicas por condición. Incubar las placas durante la noche a temperatura ambiente para permitir el crecimiento bacteriano e inducir la producción de ARN de doble cadena. Guarda un número igual de platos sin sembrar a 4 °C para usarlos después en la transferencia de huevos.
2. Método 2: Preparar placas experimentales de NGM con un suplemento nutricional o medicamentoso.
   1. Prepara 1,5 veces la concentración de NGM siguiendo las instrucciones del paso 1.1, pero añade 642 mL de agua destilada en lugar de 975 mL. Mantén el medio preparado en un baño maria a 55 °C.
   2. Prepara un stock a base de agua del suplemento de interés a 3 veces la concentración objetivo (por ejemplo, para preparar placas que contengan 40 mM de formiato sódico, haz un stock de 120 mM). Calcular el volumen de stock requerido multiplicando el número de placas experimentales por 1,666 mL (un tercio del volumen de placas). Utiliza un filtro de jeringuilla para esterilizar el fondo y luego caliéntalo a 55 °C en baño maria.
   3. En un tubo cónico de 50 mL, mezcla 2 partes de 1,5x NGM con 1 pieza de material suplementario. Para no controlar suplementos, mezcla 2 partes de 1,5x NGM con 1 parte de agua caliente estéril. Mezcla suavemente invirtiendo el tubo 10 veces y, usando técnica aséptica, vierte rápidamente aproximadamente 5 mL de medio en cada placa de 35 mm.
      NOTA: Se utiliza 1,5x NGM para compensar la dilución media cuando se añaden grandes cantidades de suplemento. Sin embargo, si el fármaco o el stock de metabolitos se concentra hasta el 100× o más de la concentración final, se puede usar NGM regular en lugar de 1,5× NGM. Al suplementar con un ácido orgánico, usar su forma de sal sodiona ayudará a evitar una caída del pH medio.
   4. Utilizando técnica aséptica, llena un matraz de Erlenmeyer de 50 mL hasta una quinta parte de su volumen (10 mL) con medio LB. Inocular con una colonia de E. coli OP50 e incubar durante la noche a 37 °C en un agitador orbital a 200 rpm.
   5. Sembra placas NGM de 35 mm con 100 μL de cultivo OP50 de E. coli durante la noche, preparando dos réplicas técnicas por condición. Incuba las placas durante la noche a temperatura ambiente. Guarda un número igual de platos sin sembrar a 4 °C para usarlos después en la transferencia de huevos.

3. Obtención de una población sincronizada de larvas de L1

1. Preparar una solución alcalina de lejía combinando 7 mL de agua estéril, 2 mL de solución de hipoclorito de sodio al 5% y 1 mL de NaOH de 5 N.
2. Prepara el tampón M9 disolviendo 3 g de_{KH 2}PO₄, 6 g de Na₂HPO₄ y 5 g de NaCl en 1 L de agua destilada, luego ajusta el pH a 6,5. Autoclave durante 20 minutos a 121 °C, deja que la solución se enfríe y luego añade asépticamente 1 mL de 1 M MgSO4.
3. Lava los gusanos adultos grávidos (paso 1.4.2) de la placa con buffer M9 y transfiere a un tubo cónico de 15 mL. Centrifuga a 350 x g durante 2 minutos, aspira el sobrenadante y llena el tubo con un nuevo tampón M9. Repite el lavado dos veces.
4. Añade 2 mL de tampón M9 y 2 mL de solución de lejía alcalina al pellet de gusano. Vórtice y agita vigorosamente, revisando periódicamente bajo el microscopio hasta que casi todos los gusanos están disueltos.
5. Llena el tubo con buffer M9 y centrifuga a 350 x g durante 2 minutos. Retira el sobrenadante invirtiendo el tubo y luego lava cuatro veces con el buffer M9. Asegúrate de que el primer lavado se realice inmediatamente después de que las lombrices se lisen para evitar un decoloramiento excesivo. Tras el último lavado, llena el tubo con 8 mL de tampón M9 e incuba en un balancín durante 18–20 horas, hasta que los huevos eclosionen.

4. Cultivar poblaciones maternas

1. Coloque cinco gotas de 3 μL de suspensión de gusanos sobre una lámina de vidrio y cuente el número de larvas L1 eclosionadas bajo un microscopio. Divide el recuento total entre 15 para obtener la concentración por microlitro.
2. Placar 30 larvas L1 sobre cada placa sembrada de 35 mm e incubar a 20 °C durante 72 horas. Si las condiciones experimentales inducen retraso en el desarrollo, extiende el tiempo de incubación hasta que los gusanos se vuelvan grávidos y comiencen a poner huevos (Figura 1B).

5. Transferencia de embriones a placas de eclosión

1. Saca las placas sin sembrar de 35 mm de la nevera y déjalas alcanzar la temperatura ambiente.
2. Examina las placas de gusano al microscopio y confirma que contienen más de 100 embriones, sin larvas de L1 eclosionadas.
3. Llena cuidadosamente el plato con buffer M9. Utiliza una línea de vacío para aspirar el líquido y eliminar la población materna. Asegúrate de que no queden gusanos adultos en el plato.
4. Rellena la punta de una micropipeta con 200 μL de tampón M9 y haz una pipeta con fuerza arriba y abajo para desprender embriones del césped bacteriano. Mientras observas con el microscopio, guía la punta de la pipeta hacia las zonas densas en embriones.
5. Toma una placa sin sembrar y pipotea una gota de suspensión embrionaria en el centro. Examina la gota bajo el microscopio. Si no contiene entre 100 y 300 embriones, añadir más suspensión embrionaria hasta alcanzar este rango. Asegúrate de que no se transfieran gusanos de la población parental con los embriones.
6. Deja que el líquido se seque y luego incuba las placas de transferencia a 20 °C durante al menos 24 horas.
   NOTA: Si ya hay larvas de L1 presentes en la placa experimental, utilice una línea de vacío en lugar de un lavado M9 para eliminar toda la población materna una por una. Esto evita que las crías de L1 se arrastren, que no se adhieren al césped bacteriano como los embriones. Proceder con la transferencia de descendencia, que ahora incluirá tanto embriones como larvas de L1. Asegúrate de que el mismo enfoque se aplique a todas las condiciones.

Figura 1: Cronología experimental y esquema de los pasos clave en el ensayo de letalidad embrionaria. (A) Cronología del diagrama de flujo que representa la duración completa del protocolo experimental, desde la preparación del medio de mantenimiento hasta la puntuación de las placas de tramado. Se indican procedimientos clave para los días correspondientes del experimento. (B) Esquema del ensayo de letalidad embrionaria (pasos 4–6). En el día 4, se añaden larvas sincronizadas de L1 a las placas experimentales de ARN o suplemento para establecer una población materna. Tras 72 horas, en el día 7, una vez que los gusanos han puesto huevos, la población materna se elimina mientras los embriones permanecen adheridos al césped bacteriano. Los embriones se lavan del césped con una pipeta y se transfieren a una placa de incubación, con al menos 100 embriones por placa. Tras 24 horas de incubación, se cuentan las larvas eclosionadas y los embriones no eclosionados. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

6. Placas de puntuación

1. Usa un rotulador permanente para dibujar una cuadrícula de aproximadamente 4 mm × 4 mm sobre la tapa de una placa de Petri de 35 mm, y luego coloca la tapa debajo de la placa. Utiliza la cuadrícula como guía y, bajo un microscopio, cuenta el número de larvas L1 y embriones no eclosionados con un contador de clics de mano.
2. Combine cuenta a partir de réplicas técnicas para asegurar un peso adecuado de cada réplica en función de su recuento de descendencia. Específicamente, suma el número de embriones no eclosionados y larvas eclosionadas entre réplicas técnicas.
3. Calcula una tasa de letalidad embrionaria por réplica biológica dividiendo el número de embriones (gusanos no eclosionados) por el número total de gusanos y embriones, y luego multiplica por 100 para expresar el valor como porcentaje.
   NOTA: Si una placa contiene solo larvas eclosionadas o solo embriones, este paso de conteo puede saltarse, ya que la tasa de letalidad embrionaria es 0 (0%) o 1 (100%), respectivamente.

7. Análisis estadístico

1. Repite todo el experimento al menos tres veces para obtener réplicas biológicas independientes. Para cada réplica biológica, se utilizan dos placas de réplica técnica por condición, con un mínimo de 100 embriones por réplica técnica.
2. Determinar si las tasas de letalidad embrionaria difieren significativamente entre condiciones utilizando ANOVA unidireccional, seguido de pruebas t de Student a pares post hoc con corrección de pruebas múltiples, como el método de Benjamini-Hochberg.
   NOTA: Combinar dos réplicas técnicas produce un mínimo de 200 embriones por réplica biológica. Esto satisface el requisito de tamaño de muestra (~184 embriones/condición) estimado por la función base R power.prop.test para detectar una diferencia del 15 por ciento en letalidad (por ejemplo, 20% frente a 35%) con un 90% de potencia y un nivel de significación de α = 0,05.

Resultados

El ensayo de letalidad embrionaria se realizó en dos cepas: tipo salvaje N2 y la cepa hipersensible al ARN rrf-3(pk1426). Utilizando ARNi mediante alimentación, eliminamos genes previamente reportados como causantes de letalidad embrionaria en cribados de alto rendimiento ^9,12. La Figura 2 ofrece una demostración representativa del rendimiento del ensayo. El knockdown T04G9.4 produjo letalidad embrionaria casi totalmente pen...

Discusión

Varios pasos son fundamentales para la reproducibilidad y precisión del ensayo. Primero, el paso de blanqueo debe sincronizarse cuidadosamente para disolver los gusanos adultos sin dañar los embriones. Otro punto importante es transferir un número suficiente de embriones para contar: unos pocos reducirán la precisión, mientras que demasiados harán que contar sea innecesariamente tedioso. A continuación, debe realizarse la transferencia de embriones antes de que los embriones comiencen a ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Bacteriological peptone	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	tipo salvaje
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. Hipersensible a RNAi
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	746495
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045
Conical tubes, 15 mL	VWR	60818-725
Culture tubes, 14 mL	VWR	470150-966
Diaphragm vacuum pump	Amazon	TC-100
Dissecting microscope	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III-deficient, used for RNAi by feeding experiments
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Granulated agar	Fischer Scientific	BP97445
Handheld tally counter	LabDepot	HTCP01
IPTG, dioxane free (Isopropyl-b-D-thiogalactoside)	US Biological	I8500
LB Broth (Miller)	US Biological	L1520	Para hacer medio LB disuelva 25 g de polvo LB en 1 L de agua destilada. Autoclave durante 20 min a 121,1 °C.
Luer Lok disposable syringe	BH Supplies	BH20LL
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Microscopy slides	Sail Brand	7101
Petri dishes, 100 mm	Tritech Research	T3371
Petri dishes, 35 mm	Tritech Research	T3501
Potassium Phosphate Buffer (PPB)			Para hacer buffer de fosfato de potasio (1 M), disuelva 98 g de fosfato de potasio monobásico y 48 g de fosfato de potasio dibásico en 1 L de agua destilada. Ajuste el pH a 6. Autoclave durante 20 min a 121 °C.
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	529568
Rocker (nutating mixer)	Corning LSE	6720
Serological pipettes, 25 mL	Corning	4489
Serological pipettes, 5 mL	Celltreat	229235
Shaking incubator Infors Multitron	INFORS HT	NA
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium hydroxide solution, 5 N	Fisher Scientific	SS256-500
Sodium hypochlorite, 5%	LabDepot	LC246302
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	75016030
Stir plate	ONilab	ONi28-S
Syringe filters	Semmerfeld	JQP033022QE1
Water bath	FOUR E's Scientific	WB401