Software de Mapeo de Parámetros Microgliales (MMPS): Una herramienta de código abierto y fácil de usar para el análisis cuantitativo de la morfología de la microglía

Resumen

El Software de Parámetros Microgliales de Mapeo (MMPS) es una cadena de análisis fácil de usar que no requiere conocimientos de codificación y que semiautomatiza el análisis de morfología microglial de células individuales a partir de imágenes de inmunofluorescencia. Validado en un modelo de neuroinflamación inducido por lipopolisacáridos en roedores, MMPS detecta de forma reproducible los cambios morfológicos asociados a la activación y permite un fenotipado microglial estandarizado y escalable.

Resumen

La microglía son células inmunitarias derivadas de mieloides del sistema nervioso central que median la degradación y remodelación del tejido tras una lesión neurológica y han surgido como objetivos terapéuticos prometedores en varias enfermedades neurodegenerativas. El análisis cuantitativo de la morfología microglial puede revelar diferencias sutiles entre subpoblaciones microgliales, preservando al mismo tiempo información importante in situ . Sin embargo, muchas plataformas de análisis de morfología microglial actualmente disponibles no son accesibles públicamente o requieren conocimientos computacionales especializados, lo que limita su adopción generalizada. Para abordar estas limitaciones, se desarrolló una plataforma de análisis de morfología microglial de código abierto, denominada Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), utilizando Python 3.11. MMPS es compatible con flujos de trabajo basados en inmunofluorescencia y no requiere conocimientos de codificación para su instalación o funcionamiento. El software semiautomatiza el análisis de morfología microglial de célula única mediante una interfaz gráfica accesible e incorpora flujos de trabajo personalizables de procesamiento de imágenes y generación de máscaras. El estudio consiste en validar el MMPS utilizando un modelo de neuroinflamación inducido por lipopolisacáridos de roedores (LPS). El análisis cuantitativo a nivel animal demostró que la microglía de animales tratados con LPS mostró un aumento significativo del área del soma (p < 0,01) y una reducción del perímetro celular (p < 0,05) en comparación con los controles tratados con vehículo, consistente con características morfológicas asociadas a la activación microglial y la neuroinflamación. En general, MMPS proporciona una plataforma estandarizada y reproducible para el análisis cuantitativo de la morfología microglial en laboratorios.

Introducción

La microglía son células inmunitarias innatas del sistema nervioso central (SNC) que inspeccionan continuamente su entorno en busca de patógenos y daños^{tisulares 1}. Al activarse, la microglía retrae sus procesos y pasa de una morfología homeostática ramificada a un fenotipo^{ameboide 2,3}. En enfermedades neurodegenerativas como el ictus isquémico ^4,5 y la enfermedad de Alzheimer ^6,7. La microglía a menudo perpetúa la neuroinflamación mediante la producción sostenida de citocinas, la degradación extensa de los tejidos y la^{fagocitosis 2}. Estos procesos contribuyen a la alteración de la unidad neurovascular, agravando aún más la activación microglial y la lesión del^{SNC 8}, convirtiendo así a la microglía en objetivos terapéuticos^{prometedores 9,10}.

Un enfoque para identificar diferencias sutiles entre subpoblaciones microgliales en enfermedades neurodegenerativas es mediante el análisis morfológico. Esto se realiza comúnmente utilizando animales Cx3CR1-GFP con microscopía in vivo de dos^{fotones 11} o mediante marcaje inmunofluorescencia (IF) de marcadores microgliales establecidos, como la molécula adaptadora ionizada de unión al calcio-1 (Iba1) o el receptor purinoceptor^{P2Y 12}. Aunque la microglía frecuentemente transita entre morfologías homeostática y ameboide tras una lesión, estudios previos han demostrado que la microglía también puede adoptar fenotipos adicionales, incluyendo microglía^{hiperramificada 3,13}, microglía panal ^3,14, microglía^{reactiva 15} y microglía^{bastón 3,16}. Sin embargo, los estudios de morfología microglial a menudo se basan en la categorización manual de fenotipos homeostáticos y ameboides. Estos enfoques requieren canales de análisis especializados que frecuentemente carecen de estandarización entre laboratorios y dificultan la diferenciación entre morfologías similares, como fenotipos homeostáticos frente a fenotipos hiperramificados, incluso para personal^{formado 17}. Además, el análisis basado en FI de alteraciones morfológicas sutiles requiere imágenes de alta resolución, lo que puede presentar desafíos técnicos adicionales.

Para abordar estas limitaciones, se han desarrollado varias plataformas analíticas que detectan microglía de forma semiautomática¹¹ o^{automáticamente 18} y generan múltiples representaciones binarias de las celdas, denominadas "máscaras", en áreas objetivo definidas por el usuario (por ejemplo, 200–800^{μm 2}). Estos enfoques reducen el sesgo del usuario, mejoran la reproducibilidad y aumentan la eficiencia analítica. A pesar de estos avances, muchas plataformas de software actualmente disponibles presentan limitaciones que limitan la adopción generalizada, incluyendo la falta de accesibilidad de código^{abierto 17}, requisitos de conocimientos de programación 11,19,20, dependencia de sistemas de microscopía in vivo de dos fotones^11,19, ausencia de interfaces gráficas intuitivas 11,21,22, lentitud velocidades de procesamiento¹¹, o dependencia de plataformas de software^{comerciales 12, 19, 21}. Aunque estudios recientes han comenzado a abordar varios de estos problemas, muchas plataformas existentes siguen siendo poco adecuadas para flujos de trabajo basados en IF, que siguen siendo ampliamente utilizados para estudiar la morfología microglial.

Aquí se presenta una plataforma orientada al usuario para análisis de morfología microglial denominada Mapping Microglial Parameters Software (MMPS). MMPS no requiere conocimientos de programación, se integra con flujos de trabajo establecidos basados en ImageJ y está diseñado específicamente para su uso con imágenes FI. El software fue desarrollado en Python 3.11 e incorpora conceptos de plataformas morfológicas de código abierto previamente^{publicadas 11}. MMPS cuenta con una interfaz gráfica intuitiva que permite importar y procesar grandes lotes de imágenes IF utilizando múltiples opciones personalizables de procesamiento de imágenes. La plataforma también incorpora selección manual de células para minimizar artefactos de sobremuestreo introducidos durante la imagen FI, así como el contorno manual de soma para evitar la inclusión de procesos celulares en las mediciones de SOMA. Además, MMPS incluye parámetros personalizables para la generación de mascarillas y múltiples funciones de control de calidad para mejorar la precisión de las máscaras. El software calcula varios parámetros morfológicos comúnmente utilizados, incluyendo el perímetro, la distancia media del centroide, el área de la máscara, la excentricidad, la redondez y el área de soma. Para estudios más avanzados, las salidas generadas por MMPS son compatibles con múltiples plugins ImageJ y pueden analizarse más a fondo utilizando plugins acompañantes para análisis fractales, esqueletos y de casco.

La MMPS fue validada utilizando un modelo de neuroinflamación inducido por lipopolisacáridos de roedores (LPS) examinando alteraciones microgliales dentro de la capa cortical IV. El análisis cuantitativo demostró que la administración de LPS aumentó significativamente el área del soma microglial mientras disminuía el perímetro celular en comparación con los controles tratados con vehículo, lo que indica que el MMPS detecta con precisión cambios morfológicos sutiles asociados a la activación microglial.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia Occidental (protocolo #2109047180) y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio apoyada por los Institutos Nacionales de Salud. El equipo, reactivos y software utilizados en este método se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Animales experimentales

1. Adquiere 10 ratas macho de Sprague-Dawley (de 2-3 meses). Una vez que las ratas llegan a la instalación para animales, deben ser alojadas en grupo bajo un ciclo de 12 horas luz/oscuridad con acceso ad libitum a comida y agua. Al llegar, las ratas se aclimatan durante 3 días antes de su uso.
2. Asignar aleatoriamente ratas a grupos tratados con vehículos o LPS (n = 5 ratas/grupo).
   NOTA: Debido al pequeño número de ratas que se van a utilizar, se puede emplear una estrategia sencilla de aleatorización, con números aleatorios generados por ordenador para asignar a las ratas a un grupo de tratamiento.
3. Monitoriza ratas tras el tratamiento para detectar "conductas de enfermedad": pérdida de peso (>15%), secreción de porfirina, anomalías respiratorias o reducción de la actividad.
   NOTA: Los síntomas de conducta de enfermedad suelen aparecer en las primeras 12 horas tras la administración, por lo que inyecta agentes temprano por la mañana (6-8 AM), controla el comportamiento durante el día y devuelve las ratas a la instalación a última hora del día (5-7 PM).

2. Modelo de neuroinflamación

1. Preparar la solución de stock de LPS (O111:B4) (10 mg/mL) disolviendo 50 mg LPS en 5 mL de solución salina tamponada con fosfato.
   NOTA: El LPS es una endotoxina. Los investigadores deben seguir el procedimiento estándar estándar de su institución para su manipulación y eliminación.
2. Pesa ratas y luego inyecta intraperitonealmente LPS (10 mg/kg) o PBS (vehículo).
3. Según el peso de las ratas, se espera un volumen de inyección entre 150 y 300 μL.
4. Eutanasiar ratas 24 horas después de la inyección mediante perfusión cardíaca seguida de decapitación.
5. Anestesiar ratas con isoflurano inhalado (5% en_O2) durante 5–10 minutos. Confirma la anestesia por la ausencia del reflejo de retirada del pedal.
6. Durante la anestesia, crea una incisión torácica media para exponer el diafragma y el esternón. Pinza el proceso xifoides usando hemostatos para revelar la cavidad torácica.
7. Corta el diafragma y la caja torácica hacia las extremidades anteriores para exponer el corazón.
8. Pinza la aorta descendente y la vena cava inferior con hemostatos. Inserta una aguja alada de calibre 25 en el ventrículo izquierdo.
9. Perfundir ratas con PBS bien frío (25 mL a 30 mL/min) usando una bomba peristáltica. Incire la aurícula izquierda en los primeros segundos de iniciar la perfusión para permitir el drenaje perfuso.
10. Perfundir ratas con un 4% de paraformaldehído (25 mL a 30 mL/min).
    PRECAUCIÓN: Manipula el paraformaldehído utilizando el equipo de protección personal adecuado en un entorno bien ventilado. Eliminar los residuos de paraformaldehído conforme a la normativa institucional y local.
11. Decapitar ratas con guillotina tras una perfusión.
    NOTA: Sigue las directrices de tu institución respecto al registro de decapitaciones y el afilado de las hojas.
12. Expone el cráneo retrayendo el cuero cabelludo hacia el pavillón.
13. Rompe el hueso frontal usando hemostats o rongeurs insertados en las cavidades orbitales.
14. Inserta pinzas en el foramen magnum y retira los huesos parietales.
15. Extirpa el cerebro con pinzas finas e incuba durante la noche en paraformaldehído al 4%.
16. Transfiere los cerebros secuencialmente a un 20% de sacarosa y un 30% de sacarosa durante la noche para crioprotección.

3. Inmunofluorescencia

1. Congelar cerebros crioprotegidos en el compuesto Tissue Tek O.C.T. sobre hielo seco.
2. Seccionar cerebros a 30 μm usando un criostato.
3. Recoge secciones en PBS y transfierelas a pozos de red insertados en una placa de 12 pozos.
4. Selecciona al menos dos secciones por rata que contengan el hipocampo dorsal anterior.
5. Lava las secciones en PBS durante 5 minutos dos veces mientras meces.
6. Permeabiliza las secciones en 0,3% Triton X-100/PBS durante 45 minutos mientras meces.
   NOTA: Usa 3 mL de solución por lavado o fase de incubación, salvo que se especifique lo contrario.
7. Lava las secciones en PBS durante 5 minutos dos veces.
8. Diluye la solución de extracción de antígenos a 1x en PBS y añade 2 mL por pozo.
9. Incuba secciones a 80°C durante 20 minutos usando un baño marea.
10. Deja que las secciones se enfríen hasta la temperatura ambiente antes de continuar.
11. Lava las secciones en PBS durante 5 minutos dos veces.
12. Secciones bloqueadas con suero de burro al 10%/0,05% Triton X-100/PBS durante 2 horas a 37°C mientras agitas a 75 rpm.
13. Lava las secciones con suero de burro al 1%/0,05% Triton X-100/PBS durante 5 minutos y tres veces.
14. Transfiere secciones a una nueva placa de 12 pozos sin los pozos netos que contienen 500 μL de solución primaria de anticuerpos anti-Iba1 preparada en suero de burro al 1%/0,05% Triton X-100/PBS.
15. Prepara controles negativos omitiendo el anticuerpo primario de la solución de incubación.
16. Incubar todas las secciones durante la noche a 4°C sobre un balancín orbital
17. Devolver las secciones a los pozos de red.
18. Lava las secciones con suero de burro al 1%/0,05% Triton X-100/PBS durante 10 minutos y tres veces.
19. Incubar secciones con anticuerpo secundario anti-conejo (dilución 1:1000) en suero de burro al 1%/0,05% Triton X-100/PBS durante 1,5 horas a temperatura ambiente.
    NOTA: Minimiza la exposición a la luz durante todos los procedimientos posteriores y envuelve las placas en papel de aluminio para evitar la degradación del fluoróforo.
20. Lava las secciones en PBS durante 5 minutos dos veces.
21. Monta secciones sobre láminas de microscopio.
22. Deslizarse al aire en la oscuridad durante >2 horas.
23. Secciones de cobertura usando compuestos solubles en agua.
24. Prepara las correderas de control negativo usando un medio de montaje.
25. Guarda las láminas en una caja de diapositivas a temperatura ambiente en un entorno oscuro.

4. Imagen

1. Identifica el tamaño de píxel de un sistema de imagen con una ampliación de 40x. Si no se encuentra la escala, añade una barra de escala a cada imagen.
2. Utiliza la tinción DAPI para identificar una banda densa de núcleos corticales a bajo aumento correspondiente a la capa cortical IV.
3. Enfoca la imagen en la región cortical identificada.
4. Cambia a la ampliación de 40x.
5. Ajusta la configuración de exposición del canal para maximizar la separación de la señal DAPI e Iba1 de la fluorescencia de fondo.
6. Adquiere imágenes Z-stack (> 30 pasos) que abarcan toda la profundidad de la microglia.
7. Genera y guarda una imagen compuesta de proyección de intensidad máxima a partir del Z-stack adquirido de ambas tinciones.
   NOTA: Optimiza la exposición y los ajustes de Z-stack para cada imagen para maximizar la separación de señal entre DAPI/Iba1 y la fluorescencia de fondo. Una mala separación de señales reduce la precisión de la generación de máscaras.

5. Software de mapeo de parámetros microgliales (MMPS)

1. Guarda todas las imágenes compuestas en un único directorio de imágenes.
2. Crea un directorio de salida separado para los resultados generados por MMPS.
3. Descarga el paquete independiente de MMPS o MMPS.py script desde el repositorio de GitHub.
4. Instala todas las dependencias listadas en el archivo requirements.txt si lanzas MMPS desde MMPS.py.
5. Abre el paquete MMPS o ejecuta MMPS.py script.
6. Selecciona "Seleccionar la carpeta de imágenes" y elige el directorio de imágenes.
7. Selecciona "Seleccionar carpeta de salida" y elige el directorio de salida.
8. Concede permisos de acceso a carpetas si el sistema operativo lo solicita.
   NOTA: Instrucciones adicionales de instalación, guías para solucionar problemas y ejemplos de uso se proporcionan en la documentación complementaria y en el repositorio de GitHub.
9. Selecciona "Etiquetado de imagen" y asigna identificadores de animales y grupos de tratamiento a cada imagen.
   NOTA: Si se omite el etiquetado de imágenes, MMPS solicita identificadores de grupos de tratamiento y animales antes de exportar los datos.
10. Introduce el tamaño del píxel en la pestaña "Parámetros".
11. Selecciona "Calibrar desde la barra de escala" si el tamaño del píxel es desconocido. Selecciona los puntos de inicio y final de la barra de escala cuando se lo pida. Entra la distancia conocida entre la barra de escala en micrómetros.
12. Selecciona el canal de fluorescencia que contiene la señal microglial.
13. Selecciona las imágenes para procesar marcando la casilla junto a cada nombre de imagen. Procesa las imágenes individualmente cuando la fluorescencia de fondo difiere sustancialmente entre imágenes.
14. Revisa las pestañas "Original", "Vista previa", "Procesado" y "Máscaras" para comparar las etapas de procesamiento de imagen.
15. Selecciona "Previsualizar imagen actual" para evaluar la configuración de procesamiento de imágenes.
16. Ajusta los ajustes de resta, reducción de ruido y enfoque del fondo de la bola rodante según sea necesario.
17. Utiliza valores de bola rodante entre 5 y 150 píxeles para la resta de fondo.
18. Utiliza valores de reducción de ruido entre 3 y 7 píxeles para reducir artefactos de iluminación desigual.
19. Utiliza valores de nitidez entre 1 y 2 para mejorar la definición de los filos.
20. Selecciona "Procesar imágenes seleccionadas" tras optimizar los ajustes de procesamiento de imágenes.
    NOTA: El tiempo de procesamiento de imagen varía según el número de imagen y los parámetros seleccionados.
21. Selecciona "Elige Somas (Todas las imágenes)."
22. Selecciona "Mostrar color (C)" para mostrar imágenes compuestas RGB. Selecciona "Canales..." y desseleccionar canales no utilizados si la coloración de la imagen aparece distorsionada.
23. Selecciona somas microgliales que muestren la colocalización DAPI e Iba1. Evita seleccionar celdas que contacten con los bordes de la imagen. Elimina marcadores soma seleccionados incorrectamente usando la tecla "Retroceso" o "Eliminar".
24. Pulsa "Enter" o "Return" para pasar a la siguiente imagen.
25. Selecciona "Esquema de Somas (Todos)" después de completar la selección de Soma.
26. Describe el perímetro somático de cada célula microglial seleccionada. Excluye los procesos celulares del contorno del soma y utiliza al menos ocho puntos de contorno por soma. Elimina los puntos de contorno mal colocados usando "Deshacer el último punto", "Eliminar" o "Retroceder".
27. Prensa "Enter", "Return", doble clic o clic derecho para finalizar cada esquema de soma.
28. Selecciona "Rehacer el último esquema" para repetir el esquema anterior del SOMA si es necesario.
29. Selecciona "Generar todas las máscaras" tras completar el esquema de Soma.
30. Aplica un valor umbral mínimo para restringir la incorporación de píxeles de fondo de baja intensidad en las máscaras.
    NOTA: Valores más altos mantienen la precisión del soma a costa de la ramificación, mientras que valores más bajos mantienen la precisión de ramificación a costa del soma. Los valores umbral entre el 10 y el 30% suelen proporcionar una supresión equilibrada de fondos y preservación de ramas.
    NOTA: El tiempo de generación de la máscara varía según el número de celdas seleccionadas.
31. Selecciona "QA All Masks" para comenzar el control de calidad de las mascarillas.
32. Revisa las mascarillas presentadas desde la mayor (800 μm²) hasta la más pequeña (200^{μm 2}).
33. Compara cada máscara con la microglía correspondiente usando las pestañas "Procesado" y "Máscara".
34. Acepta máscaras usando el atajo de teclado "A". Rechaza máscaras usando el atajo de teclado "R". Pulsa "B" para deshacer una aceptación o rechazo. Navega entre los tamaños de las máscaras usando las teclas de flecha del teclado.
35. Selecciona la máscara aceptable más grande que capture con precisión la ramificación microglial sin incluir células vecinas, fondos excesivos, bordes de imagen o barras de escala.
    NOTA: Rechaza las máscaras si hay incertidumbre sobre su precisión.
    NOTA: Selecciona "Borrar todas las máscaras" y luego regenera las máscaras con un valor umbral diferente si la mayoría son inexactas.
36. Selecciona "Calcular características simples" una vez completado el control de calidad de la mascarilla para
    Calcula la distancia media del centroide, el área de la mascarilla, el perímetro, la excentricidad, la redondez y el tamaño del Soma utilizando mascarillas aceptadas y contornos del SOMA.
37. Consulte la Tabla 1 para definiciones de parámetros y tendencias microgliales en la neuroinflamación.
38. Descargar "Sholl.py", "FractalAnalysis_ImageJ.py" y "SkeletonAnalysisImageJ.py" para realizar análisis adicionales.
39. Abre "FractalAnalysis_ImageJ.py" como plugin de Fiji para análisis fractales y de casco.
40. Introduce la ubicación del directorio de salida y el tamaño del píxel cuando te lo pidan. Selecciona la opción de "solo máscara más grande" si se desea analizar solo la máscara aceptada más grande.
41. Abre "Sholl.py" como un plugin de Fiji para análisis de Sholl.
42. Introduce la ubicación del directorio de salida y el tamaño del píxel cuando te lo pidan.
43. Introduce el tamaño deseado del paso en el análisis de Sholl. Selecciona "Usar radio soma como radio inicial" para usar radios soma derivados de MMPS como radio inicial para el análisis de Sholl. Introduzca un valor fijo de radio soma si no se utilizan radios soma derivados de MMPS.
44. Abre "SkeletonAnalysisImageJ.py" como un plugin Fiji para análisis de esqueletos.
45. Introduce la ubicación del directorio de salida, el tamaño del píxel y la ubicación de la carpeta de máscaras cuando se lo solicite.
46. Exporta todos los resultados generados por plugins como archivos CSV al directorio de salida cuando termines.

6. Fórmulas utilizadas en MMPS para cálculos de morfología de la microglía

NOTA: Todos los cálculos se realizan automáticamente por MMPS cuando se pulsa "Calcular características simples". A continuación se muestran los cálculos de los parámetros.

1. Perímetro
   1. Calcula el perímetro usando la siguiente ecuación:
      
   2. Definamos como perímetro, como el número de píxeles de los bordes, y como el tamaño de píxel en μm.
2. Distancia media del centroide
   NOTA: La distancia media del centroide también se denomina dispersión celular¹¹.
   1. Identifica cuatro extremos de rama basándose en las coordenadas de la celda:
      Rama superior: coordenada mínima Y,
      Rama inferior: coordenada máxima Y,
      Rama izquierda: coordenada x mínima,
      Rama derecha: coordenada máxima X.
   2. Calcula las coordenadas del centroide usando las siguientes ecuaciones:
      
      
   3. Define c_x y _{c y} como coordenadas del centroide, x_i e _{y i} como coordenadas de píxeles, y como el número total de píxeles.
   4. Calcula la distancia de rama usando la siguiente ecuación:
      
   5. Definamos d como distancia de rama, x_i e _{y i} como coordenadas de extremo de rama, y c_x y y como coordenadas del centroide.
   6. Calcula la distancia media del centroide usando la siguiente ecuación:
      
   7. Defina como la distancia media del centroide, como distancia de rama, d_i y como tamaño de píxel en μm.
3. Área de la máscara
   1. Calcula el área de la máscara usando la siguiente ecuación:
      
   2. Definamos como área de la máscara en μm², como el número de píxeles dentro de la máscara y como tamaño de píxel en μm.
4. Excentricidad
   1. Calcular segundos momentos centrales usando las siguientes ecuaciones:
      
      
      
   2. Definamos μ₂₀, μ₀₂ y μ₁₁ como segundos momentos centrales, x_i e _{y i} como coordenadas de píxeles, c_x y _{c y} como coordenadas del centroide, y N como el número total de píxeles.
   3. Calcula los valores propios de la matriz de covarianza usando la siguiente ecuación:
      
   4. Definamos λ₁ ≥ λ₂.
   5. Calcula las longitudes de los ejes mayor y menor usando las siguientes ecuaciones:
      
   6. Define a como longitud del eje mayor y b como longitud del eje menor.
   7. Calcula la excentricidad usando la siguiente ecuación:
      
   8. Define como excentricidad.
5. Redondez
   1. Calcula la redondez usando la siguiente ecuación:
      
   2. Define como redondez, como longitud del eje mayor y longitud del eje menor.
6. Tamaño Soma
   1. Calcula el área de soma usando la siguiente ecuación:
      
   2. Define Sa como área soma en μm², como el número de píxeles dentro de la máscara soma, y S como tamaño de píxel en μm.

7. Análisis estadístico

1. Realiza todos los análisis estadísticos usando la versión 4.3.2 de R.
2. Filtra conjuntos de datos usando la mayor máscara aceptada para cada célula.
3. Parámetros celulares promedio a nivel animal antes del análisis estadístico.
4. Evalúa la normalidad y la varianza utilizando las pruebas de Shapiro–Wilk y Levene.
5. Realizar pruebas t de Student o ANOVA de medias repetidas con pruebas t pareadas corregidas por Holm post-hoc cuando los conjuntos de datos cumplen suposiciones paramétricas.
6. Realizar pruebas de suma de rangos de Wilcoxon o de Friedman con pruebas de rango con signo de Wilcoxon paradas corregidas por Holm cuando los conjuntos de datos no cumplen las suposiciones paramétricas.
7. Defina la significación estadística como p < 0,05 .

Resultados

Se desarrolló una plataforma de análisis de morfología microglial de código abierto e independiente, denominada Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), para proporcionar un flujo de trabajo accesible y estandarizado para el análisis de morfología microglial basado en IF. La plataforma se basa en metodologías previas de análisis morfológicos, no requiere conocimientos de programación e incorpora una interfaz gráfica accesible. MMPS fue diseñada para mejorar la detección de ramificaciones microgliales sutiles, incorporando múltiples salvaguardas para minimizar la sobreestimación de las mascarillas microgliales.

MMPS fue validado utilizando un modelo de neuroinflamación de roedores inducido por LPS. Tras el procesamiento tisular y la adquisición de imágenes (Figura 1), se confirmó la especificidad del JI utilizando secciones de control negativas sin tinción primaria de anticuerpos (Figura suplementaria 1). El procesamiento MMPS comienza con la importación de imágenes IF en la interfaz de software (Figura 2A). El software ofrece múltiples opciones de procesamiento de imágenes para mejorar la detección de señales microgliales y la separación de fondos. La resta obligatoria de fondos se realiza usando el algoritmo rolling-ball implementado en el paquete Scikit-image, mientras que hay filtros opcionales de reducción de ruido y nitidez disponibles mediante filtrado gaussiano basado en SciPy. Tras el procesamiento de imágenes, los somas microgliales se seleccionan e identifican manualmente mediante marcadores de selección rojos (Figura 2B). Los límites de la soma se delinean posteriormente manualmente para los cálculos morfológicos aguas abajo (Figura 2C).

Figura 1: Visión gráfica del modelo y procesamiento de la neuroinflamación. Se inyectó LPS o PBS a las ratas y se les recogió 24 horas con perfusión cardíaca seguida de decapitación. Se extrajeron cerebros y se cortaron en secciones de 30 μm para luego usarse en FI para el marcador microglial Iba1, que después se procesaron con MMPS. Creado con Biorender. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Visión general del uso de MMPS. (A) Ejemplo de una imagen de microglía cortical (roja, Iba1) con núcleos celulares (azul, DAPI) para referenciarse en MMPS (barra de escala = 75 μm, 40x). Tras el procesamiento de imagen usando MMPS, se reducirá el fondo y se evaluarán morfologías precisas (B). Tras el procesamiento de la imagen en MMPS, los somas se seleccionan manualmente con un círculo rojo para usarse en los pasos posteriores detallados en los métodos (barra de escala = 75 μm, 40x). (C) Dos microglías representativas se delinearon manualmente, y las imágenes guardadas del contorno del soma se muestran a continuación. (D) La generación de máscaras de células seleccionadas traza automáticamente ramas microgliales hasta 800^{μm 2}, pero requiere control manual de calidad. Aquí mostramos la máscara inexacta de 800^{μm 2} seguida de la más precisa máscara de^{700 μm 2} . Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Tras el esquema de SOMA, MMPS genera máscaras iterativamente a lo largo de un rango de tamaño de 200–800^μm2 utilizando umbrales adaptativos restringidos por umbrales de intensidad mínima definidos por el usuario. Las máscaras más pequeñas siguen más de cerca el umbral definido por el usuario, mientras que las más grandes relajan progresivamente las restricciones de umbral para maximizar la incorporación de ramas. Las máscaras generadas pasan por una revisión manual de control de calidad para evitar la inclusión de células vecinas, la incorporación excesiva de fondos o el truncamiento por bordes de imagen o barras de escala. Como se muestra en la Figura 2D, la máscara de 800^{μm 2} para una célula microglial representativa se extendía hacia una célula vecina. El rechazo de la máscara de 800^{μm 2} y la selección de la máscara de 700^{μm 2} corrigieron el error de segmentación mientras se preservaba la delimitación precisa de las microglas del objetivo.

Tras el procesamiento de MMPS, se evaluó la activación microglial utilizando la mayor máscara aceptada para cada célula, ya que estas máscaras capturaron con mayor precisión la ramificación distal minimizando la incorporación de fondo. Los parámetros morfológicos calculados se resumen en la Tabla 1 y se representan en la Figura 3. La administración de LPS redujo significativamente la distancia media del centroide y el perímetro celular en comparación con los controles tratados con vehículos (p < 0,05; Figura 3A,B), consistente con la retracción de los procesos microgliales durante la activación. No se observaron diferencias significativas en el área de la mascarilla, redondez o excentricidad entre los grupos de tratamiento (Figura 3C–E), a pesar de que los informes previos asociaban estos parámetros con fenotipos microgliales^{activados 3,23}. El presente estudio no tuvo estadísticamente potencia para detectar diferencias sutiles en la forma del soma o en el área de la máscara, y las subpoblaciones microgliales pueden adoptar morfologías inflamatorias heterogéneas que no siguen uniformemente estas^{tendencias 3}. En contraste, el área de soma aumentó significativamente en animales tratados con LPS en comparación con los controles de vehículos (p < 0,01; Figura 3F), apoyando además la remodelación morfológica asociada a la^{activación 22}.

Figura 3: Comparación de parámetros morfológicos microgliales. Para todos los paneles se realizaron pruebas de normalidad (Shapiro-Wilk y Levene) con valores no significativos en todos los casos (p>0,05), lo que llevó a emplear pruebas t de Estudiante. Los puntos representan animales individuales (n=5 por tratamiento) (A) La distancia media del centroide fue significativamente mayor en el grupo de vehículos en comparación con el grupo de tratamiento LPS. (B) El perímetro de las células microglólicas fue significativamente mayor en el grupo de vehículos en comparación con el grupo de tratamiento LPS. (C) No hubo diferencias significativas en el área de la mascarilla entre los grupos de tratamiento. (D) No hubo diferencias significativas en la excentricidad de los soma entre grupos. (E) No hay diferencia significativa en la redondez del soma entre los grupos de tratamiento. (F) Hubo un aumento significativo en el área soma en el grupo LPS * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Parámetro	Definición	Relación con la activación microglial
Distancia media del centroide	Distancia media de la rama más alejada en las posiciones superior, derecha, inferior e izquierda	Disminuciones
Perímetro	Medición del perímetro de la celda	Disminuciones
Área de mascarilla	El área real de la célula, no el área de la máscara objetivo	Disminuciones
Excentricidad	Una medición de la elongación aproximada del soma celular (0: circular, 1: muy alargado)	Disminuciones
Redondez	Una medición de la circularidad aproximada del soma celular (0: alargado, 1: circular)	Incrementos
Tamaño Soma	El área de la célula soma	Incrementos

Tabla 1: Parámetros calculados a partir de MMPS y cambios predichos en la respuesta a la activación de la microglía. La tabla resume los parámetros morfológicos calculados por Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), incluyendo perímetro, distancia media del centroide, área de la máscara, excentricidad, redondez y área de soma.

La reproducibilidad entre usuarios se evaluó posteriormente proporcionando el mismo conjunto de imágenes a usuarios ciegos y previamente no entrenados para un análisis independiente (Figura suplementaria 2). No se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre los usuarios, y todos ellos reprodujeron tendencias morfológicas compatibles con la activación microglial en animales tratados con LPS.

MMPS también soporta análisis morfológicos avanzados aguas abajo. El análisis correlativo de parámetros generados a partir de la Figura 3 demostró relaciones entre características morfológicas distintas. Las ratas tratadas con vehículo mostraron solo una correlación débil entre la redondez de la microglía y el perímetro (R² = 0,17), mientras que las tratadas con LPS mostraron una correlación más fuerte (R² = 0,64), lo que sugiere que un aumento de la activación microglial se asoció con reducciones simultáneas de redondez y perímetro (Figura 4A). Además, el área de la máscara mostró fuertes correlaciones positivas con la distancia media del centroide tanto en grupos con vehículo como tratados con LPS (R² = 0,71 y 0,88, respectivamente), consistentes con cambios en la complejidad de ramificación asociados al estado de activación microglial (Figura 4B).

Figura 4: Análisis avanzado de parámetros microgliales. Todos los paneles son líneas a nivel animal de mejor ajuste calculadas mediante el método ordinario de mínimos cuadrados mostrados con su coeficiente de determinación (R²) y sombreados con su intervalo de confianza del 95%. (A) La redondez del soma microglial y la tendencia total de longitud perimetral débil en la microglía forman el grupo del vehículo (R² = 0,17), pero presentan una correlación más fuerte tras la exposición al LPS (R² = 0,64). (B) La distancia media del centroide se correlaciona con el área de la microglía en los grupos del vehículo (R² = 0,71) y LPS (R² = 0,88). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura suplementaria 1: Validación del protocolo de FI mediante control negativo. Un fragmento cerebral de la misma región para cada rata se sometió al protocolo FI sin adición primaria de anticuerpos para confirmar la falta de autofluorescencia (barra de escala = 75 μm) (A) Imagen representativa del tejido teñido con vehículo para DAPI (azul). (B) Imagen representativa del tejido teñido por vehículo para Iba1 (rojo). (C) Imagen representativa del tejido teñido por vehículo para DAPI (azul) e Iba1 (rojo). (D) Imagen representativa del tejido teñido con LPS para DAPI (azul). (E) Imagen representativa del tejido teñido con LPS para Iba1 (rojo). (F) Imagen representativa de tejido teñido con LPS para DAPI (azul) e Iba1 (rojo). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 2: Evaluación de la variación entre usuarios de MMPS. Varios usuarios ciegos utilizaron MMPS en las mismas muestras de la Figura 3 y se compararon los resultados a nivel animal. Para todos, las pruebas de normalidad (Shapiro-Wilk y Levene) no fueron significativas (p>0,05), lo que llevó a la utilización de una ANOVA de medias repetidas con la prueba t pareada corregida por Holm post hoc (p>0,05). (A) No hubo diferencias significativas en cada grupo entre usuarios en cuanto a la distancia media del centroide (p>0,05). (B) No hubo diferencias significativas en cada grupo entre usuarios para el perímetro (p>0,05). (C) No hubo diferencias significativas en cada grupo entre usuarios en cuanto al área de la mascarilla (p>0,05). (D) No hubo diferencias significativas en cada grupo entre usuarios en cuanto a excentricidad (p>0,05). (E) No hubo diferencias significativas en cada grupo entre usuarios en cuanto a redondez (p>0,05). (F) No hubo diferencias significativas en cada grupo entre usuarios del área de soma (p>0,05). Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

El objetivo principal de esta metodología es ampliar el acceso al análisis de la morfología microglial reduciendo barreras técnicas comunes y preservando las fortalezas de los enfoques de evaluación morfológico establecidos. MMPS permite detectar alteraciones morfológicas microgliales sutiles manteniendo la compatibilidad con análisis avanzados, incluyendo análisis fractales, esqueleto, casco y Sholl. En comparación con los enfoques publicados anteriormente, MMPS proporciona una interfaz gráfica de usuario accesible, cálculos integrados para parámetros morfológicos comúnmente usados y eliminación de requisitos de codificación, manteniendo la compatibilidad con análisis posteriores más avanzados.

Varios pasos metodológicos críticos influyen fuertemente en la precisión analítica y la reproducibilidad. La imagen de inmunofluorescencia (FI) de alta calidad es esencial para la generación fiable de mascarillas y cálculos morfológicos. La especificidad de anticuerpos representa un factor determinante importante de la calidad de la imagen, ya que el marcado inespecífico aumenta la fluorescencia de fondo y reduce la separación de señales entre la microglía y el tejido circundante. De manera similar, concentraciones subóptimas de anticuerpos pueden reducir la intensidad de la fluorescencia y disminuir la resolución de la imagen. La adquisición de imágenes Z-stack también es crítica, ya que la omisión de la imagen Z-stack puede alterar artificialmente la aparente complejidad de ramificación microglial y la propagación del proceso, sesgando así los cálculos morfológicos.

Varias consideraciones adicionales son importantes durante el procesamiento de MMPS. Aunque MMPS soporta procesamiento de imágenes por lotes, la optimización individual de imagen suele ser preferible porque las características de fondo y la calidad de tinción pueden variar sustancialmente entre imágenes. La calidad de imagen influye directamente en la precisión de generación de máscaras; Por lo tanto, la optimización durante el preprocesamiento de imágenes mejora sustancialmente la reproducibilidad y robustez de los análisis posteriores. La selección cuidadosa de los somas microgliales también es importante, especialmente evitar que las células entren en contacto con los bordes de la imagen, ya que la selección celular parcial puede reducir artificialmente las mediciones de soma y distorsionar la generación de máscaras. Durante la revisión de control de calidad de las mascarillas, deben rechazarse las mascarillas que incorporen células vecinas, fondos excesivos o bordes de imagen. Por el contrario, las máscaras más pequeñas no deben rechazarse únicamente porque no capturen todos los procesos distales, ya que el algoritmo iterativo de generación de máscaras ajusta intencionadamente los parámetros locales de umbral según el tamaño de la máscara y la intensidad regional de los píxeles.

Esta metodología es altamente adaptable y puede modificarse para cumplir con requisitos experimentales específicos. Dado que MMPS es de código abierto, la plataforma puede ampliarse para analizar tramas individuales de la pila Z o incorporar algoritmos automatizados de detección celular para generar una cadena de análisis morfológico totalmente automatizada. Además, las máscaras generadas y los contornos soma siguen siendo compatibles con los flujos de trabajo basados en ImageJ para análisis fractales, casco, esqueleto y Sholl. Como MMPS se desarrolló en Python 3.11, también se pueden incorporar análisis adicionales directamente en el software utilizando paquetes científicos de Python comúnmente disponibles sin necesidad de plataformas externas.

A pesar de estas ventajas, deben considerarse varias limitaciones. La MMPS fue validada mediante un modelo de neuroinflamación en una región cerebral específica de ratas macho de Sprague-Dawley, y diferentes regiones cerebrales, modelos de enfermedades, especies o sexo biológico pueden influir en los resultados morfológicos. Por tanto, la aplicabilidad de MMPS a paradigmas experimentales alternativos debe validarse mediante estudios piloto o respaldarse mediante comparaciones previas de la literatura. Además, la imagen basada en SI captura incompletamente las estructuras ramificadas tridimensionales porque los procesos que se extienden directamente por encima o por debajo del plano focal pueden no detectarse en imágenes de máxima proyección. Aumentar el número de células analizadas puede ayudar a mitigar esta limitación. MMPS también depende de la calidad de adquisición de imagen y, por tanto, requiere optimización para sistemas de imagen individuales, protocolos de tinción y preparaciones de anticuerpos. Las imágenes de baja resolución pueden inflar artificialmente el tamaño de la máscara debido a los límites difusos que rodean a los somas y las ramas muy compactas. Por esta razón, el protocolo actual incorpora métodos IF flotantes y múltiples opciones de procesamiento de imagen para maximizar la calidad de imagen.

MMPS además conserva cierto potencial de variabilidad dependiente del usuario, ya que los usuarios seleccionan manualmente las celdas y delinean los somas. Sin embargo, el uso de DAPI e Iba1 colocalización reduce sustancialmente la ambigüedad durante la selección celular. Además, el análisis interusuario a ciegas demostró una variabilidad mínima entre usuarios previamente no entrenados, lo que apoya la reproducibilidad del flujo de trabajo analítico.

A diferencia de varias plataformas de morfología microglial publicadas previamente, MMPS no está completamente automatizado. Sin embargo, este diseño fue seleccionado para priorizar la precisión en la segmentación y el aseguramiento de la calidad de las máscaras. Se podrían incorporar flujos de trabajo automatizados mediante la modificación del código fuente de Python para permitir la detección automatizada de colocalización DAPI/Iba1, el contorno de soma basado en contornos y la aceptación o rechazo de máscaras mediante aprendizaje automático. Además, MMPS requiere una capacidad considerable de almacenamiento en disco porque las máscaras generadas y los esquemas de soma se guardan automáticamente como archivos .tiff para análisis posteriores y aseguramiento de calidad. Los requisitos de almacenamiento podrían reducirse modificando el software para generar máscaras secuencialmente célula por celda, seguidas de una evaluación inmediata de la calidad y la extracción de parámetros.

En conclusión, MMPS amplía el acceso al análisis cuantitativo de la morfología microglial al proporcionar una plataforma estandarizada y de código abierto que no requiere conocimientos de codificación ni capacidades de imagen in vivo . La plataforma facilita el análisis reproducible de la morfología microglial basada en FI, manteniendo la compatibilidad con enfoques analíticos avanzados posteriores.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	Plato utilizado para la incubación y lavado de secciones de tejido.
Aluminio	Fisher Scientific	01-213-101	Usado para proteger muestras fluorescentes de la exposición a la luz.
Antigen Retrieval Buffer (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	Usado para mejorar la accesibilidad del antígeno durante la tinción de inmunofluorescencia.
Anti-Iba1 anticuerpo primario	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	Anticuerpo primario utilizado para el etiquetado inmunofluorescente de microglía.
Criostato	Fisher Scientific	95-710-0L	Instrumento utilizado para seccionar tejido cerebral congelado en espesores definidos.
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	Anticuerpo secundario fluorescente utilizado para la visualización de anticuerpos primarios de conejo.
Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-115	Reactivo de bloqueo utilizado para reducir la unión no específica de anticuerpos.
EVOS FL Auto 2 Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Microscopio de fluorescencia utilizado para la adquisición de imágenes.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	Plataforma de procesamiento de imágenes utilizada para análisis morfológicos posteriores y plugins.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	Medio de montaje utilizado para preservar la fluorescencia y asegurar las cubreobjetos.
Isoflurano	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	Anestésico inhalado utilizado durante procedimientos en animales.
Lipopolisacárido	Millipore Sigma	L2630	Usado para inducir neuroinflamación sistémica y activación de microglía en roedores.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		Biblioteca de trazado de Python utilizada para la visualización de datos y generación de figuras.
MMPS (Mapping Microglial Parameters Software) v1.00	Este trabajo	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	Plataforma de software de código abierto desarrollada para el análisis de morfología de microglía.
Net wells	Millipore Sigma	CLS3477	Insertos utilizados para mantener secciones de tejido flotando libremente durante los procedimientos de tinción.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		Biblioteca de Python utilizada para cálculos numéricos dentro de MMPS.
Objective lens (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	Objetivo de baja magnificación utilizado para orientación anatómica e identificación de regiones.
Objective lens (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	Objetivo de alta magnificación utilizado para la imagen de la morfología de microglía.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		Biblioteca de visión computacional utilizada para funciones de procesamiento de imágenes dentro de MMPS.
Paraformaldehído	ThermoFisher Scientific	169650025	Fijador utilizado para la perfusión de tejidos y preservación antes de la sección.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Medio de montaje permanente utilizado para la preservación de portaobjetos.
Phosphate-buffered saline	Fisher Scientific	BP3991	Solución tampón utilizada para el lavado de tejidos y preparación de reactivos.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		Biblioteca de imágenes de Python utilizada para operaciones de procesamiento de imágenes.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		Marco de GUI de Python utilizado para generar la interfaz de usuario gráfica de MMPS.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	Entorno de lenguaje de programación utilizado para desarrollar y ejecutar MMPS.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	Software estadístico utilizado para el análisis de datos y la generación de gráficos.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		Biblioteca de análisis de imágenes de Python utilizada para el procesamiento y segmentación de imágenes.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		Paquete de computación científica de Python utilizado para operaciones de filtrado y procesamiento de imágenes.
Sprague-Dawley Rats	Evingo	002	Animales experimentales utilizados para la validación del modelo de neuroinflamación.
Sacarosa	Fisher Scientific	S5-3	Crioprotector utilizado antes de congelar el tejido cerebral.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		Paquete de Python utilizado para leer y escribir archivos de imagen TIFF.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Medio de inclusión utilizado para la criosección de muestras de tejido congelado.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergente utilizado para la permeabilización de membranas durante la inmunofluorescencia.