Artículo de método

Preparación de injertos de nervio periférico humano descelularizados mediante el uso de hidróxido de sodio y desoxicolato de sodio

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DOI:

10.3791/71578

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1 de septiembre de 2026

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método estandarizado de descelularización asistida por álcali que combina el tratamiento con hidróxido de sodio con un sistema de intercambio de soluciones impulsado por una bomba peristáltica, para producir injertos de nervio periférico humano descelularizados con una eliminación celular eficaz y la preservación de la arquitectura nativa de la matriz extracelular.

Resumen

Las lesiones de nervios periféricos a menudo requieren materiales de injerto que proporcionen una guía estructural para la regeneración axonal. Aunque el injerto nervioso autólogo sigue siendo el estándar clínico, su uso está limitado por la morbilidad en el sitio donante y la disponibilidad restringida de tejido. Estas limitaciones han impulsado un creciente interés en los injertos de nervio periférico humano descelularizados como biomaterial alternativo para la regeneración nerviosa. Sin embargo, los protocolos de descelularización basados comúnmente en detergentes pueden alterar la arquitectura de la matriz extracelular (ECM) y dejar residuos citotóxicos que podrían comprometer la calidad del injerto. En este artículo se describe un protocolo estandarizado para preparar injertos de nervio periférico humano descelularizados mediante un enfoque de descelularización asistida por alcalino. El procedimiento comienza con un tratamiento con hidróxido de sodio (NaOH) para promover una desintegración celular eficiente, seguido de un paso suave con desoxicolanato de sodio (SDC) que elimina los componentes celulares e inmunogénicos residuales, preservando al mismo tiempo la organización nativa de la ECM. Esta estrategia limita la exposición a detergentes y favorece la conservación de la arquitectura nativa de la ECM. El flujo de trabajo incluye la preparación del nervio donante, un tratamiento controlado con NaOH, un posterior tratamiento suave con SDC y lavados exhaustivos con intercambio continuo de solución mediante un sistema impulsado por bomba peristáltica para facilitar la eliminación de agentes residuales del proceso. Se implementan pasos adicionales posteriores al procesamiento para mantener la integridad estructural y preparar los injertos para su empaque final y esterilización. La eficiencia de la descelularización se evalúa mediante análisis histológico y cuantificación del ADN residual, y la conservación de la estructura de la ECM se examina mediante microscopía electrónica de barrido. La ausencia de residuos de SDC y la biocompatibilidad de los injertos procesados se confirmaron mediante pruebas de citotoxicidad. Este protocolo ofrece un enfoque práctico para producir injertos de nervio periférico humano descelularizados para la investigación sobre regeneración nerviosa periférica y aplicaciones traslacionales.

Introducción

Las lesiones de los nervios periféricos pueden provocar un deterioro funcional grave y siguen siendo un desafío clínico importante en la medicina regenerativa y la cirugía reconstructiva. La regeneración de defectos nerviosos segmentarios requiere materiales de injerto que no solo cierren la brecha de la lesión, sino que también proporcionen orientación estructural y señales bioquímicas para apoyar la regeneración axonal y la reinervación. El injerto nervioso autólogo es ampliamente considerado el estándar clínico de oro porque conserva la arquitectura nativa de la matriz extracelular (ECM) y proporciona un microambiente favorable para la regeneración nerviosa1,2. Sin embargo, su uso clínico está limitado por la disponibilidad restringida de tejido donante, la necesidad de procedimientos quirúrgicos adicionales y la morbilidad en el sitio donante3,4. Estas limitaciones han impulsado el desarrollo de materiales de injerto alternativos, particularmente injertos nerviosos periféricos descelularizados que conservan la arquitectura nativa de la ECM mientras minimizan los componentes celulares inmunogénicos5,6,7,8.

El rendimiento de los injertos nerviosos descelularizados depende en gran medida del proceso de descelularización. Los métodos convencionales suelen basarse en reactivos a base de detergentes, como el Triton X-100 y el desoxicolato sódico (SDC), que eliminan los componentes celulares solubilizando las membranas lipídicas9,10,11. Sin embargo, la exposición prolongada a estos detergentes puede alterar la microestructura de la matriz extracelular (ECM) y dejar sustancias citotóxicas residuales que afectan negativamente la viabilidad celular y los resultados regenerativos12,13. Como consecuencia, se están investigando activamente estrategias alternativas de descelularización que permitan la eliminación eficiente de células mientras se preserva la integridad de la ECM14. La descelularización alcalina mediante hidróxido sódico (NaOH) ha surgido como un enfoque alternativo potencial, ya que las condiciones de pH extremo pueden degradar eficazmente los componentes celulares, los ácidos nucleicos y los lípidos15,16,17. No obstante, la exposición no controlada a condiciones alcalinas fuertes puede comprometer la integridad de la ECM, lo que subraya la importancia de condiciones de procesamiento rigurosamente controladas16,18.

Aquí se presenta un protocolo estandarizado de descelularización asistida por álcali para injertos de nervio periférico humano, que incorpora un sistema continuo de intercambio de solución impulsado por una bomba peristáltica. En comparación con los métodos convencionales de inmersión estática, este proceso dinámico permite un intercambio continuo de la solución, facilitando la eliminación de restos celulares y agentes residuales del proceso. Este artículo ofrece una demostración visual paso a paso del flujo de trabajo completo, incluyendo la preparación del nervio donante, la descelularización controlada asistida por álcali y el intercambio continuo de solución mediante un sistema impulsado por bomba peristáltica. Los injertos resultantes se evaluaron mediante análisis histológico, cuantificación del ADN residual y microscopía electrónica de barrido (SEM) para confirmar una descelularización eficiente y la preservación de la ultraestructura de la matriz extracelular. Al permitir una visualización clara de los pasos técnicos críticos, este artículo proporciona un marco claramente definido para la preparación de injertos nerviosos descelularizados y para la futura ampliación del proceso.

Protocolo

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

  1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
    CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

  1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
  2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
  3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
  4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
    NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

  1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
  2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
  3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
    NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

  1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
  2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
  3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
  4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
    NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
  5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
  6. Drain the solution from the column.
  7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
  8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
  9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
    NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

  1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

  1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

  1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
  2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
  3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
    NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

Resultados

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing is shown in Figure 2A. Trimming and segmenting of the nerve were illustrated in Figure 2B–D. After completion of the process, the peripheral nerve maintained its overall morphology without visible structural disruption (Figure 2E).

Histological evaluation of the decellularization is shown in Figure 3. Hematoxylin and eosin (H&E) staining of the native peripheral nerve revealed abundant nuclei, whereas nuclei were largely absent in the decellularized samples (Figure 3A). Quantification of residual DNA, expressed as ng DNA/mg of dry tissue, demonstrated a substantial reduction in DNA content following decellularization (Figure 3B).

Ultrastructural analysis using scanning electron microscopy (SEM) is presented in Figure 4. The fibrous organization of the extracellular matrix (ECM) remained clearly visible after decellularization, indicating preservation of the native ECM architecture (Figure 4).

Assessment of residual detergent and cytocompatibility is shown in Figure 5. Residual SDC levels were minimal following the washing steps (Figure 5A). Cytotoxicity testing showed no significant cytotoxic response in cultured cells exposed to the decellularized peripheral nerve grafts (Figure 5B).

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Figure 1: Schematic workflow for the preparation of decellularized human peripheral nerve grafts. Donated human peripheral nerve segments are first prepared by trimming and segmenting to remove surrounding connective tissue. The nerve segments then undergo delipidization using IPA-based solution exchange (Day 1). Sequential decellularization is performed using NaOH (Day 2) and SDC (Day 3) under continuous solution exchange in a peristaltic pump-driven system. The processed grafts are subsequently packaged and sterilized (Day 4) to obtain decellularized peripheral nerve grafts. Abbreviations: IPA = isopropanol; NaOH = sodium hydroxide; SDC = sodium deoxycholate. Please click here to view a larger version of this figure.

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Figure 2: Representative images of the peripheral nerve processing workflow. (A) Peristaltic pump-driven solution exchange system used for delipidization, decellularization, and washing. (B) Donated human peripheral nerve before trimming. (C) Peripheral nerve during trimming. (D) Peripheral nerve after trimming and segmenting. (E) Peripheral nerve after completion of the entire decellularization process. Please click here to view a larger version of this figure.

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Figure 3: Evaluation of decellularization efficiency. (A) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained images of native and decellularized human peripheral nerve tissues showing reduced cellular components after decellularization. Scale bars = 100 µm. (B) Quantification of residual DNA content in native and decellularized nerve tissues, expressed as ng DNA/mg of dry tissue. Data are presented as mean ± SD (n = 3). *p < 0.05. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-4
Figure 4: Scanning electron microscopy (SEM) analysis of nerve microarchitecture. Representative SEM images of native (left) and decellularized (right) human peripheral nerve tissues showing preserved extracellular matrix architecture following the decellularization process. Scale bars = 2 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

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Figure 5: Evaluation of residual detergent and cytotoxicity. (A) Chromatograms of the SDC standard (left) and extracts from decellularized nerve grafts (right) used to assess residual detergent. The red box indicates the region corresponding to the SDC retention time (~3.2 min). (B) Cytotoxicity assessment of extracts from decellularized nerve grafts using L929 fibroblasts following ISO 10993-5 guidelines. Representative images after 48 h incubation show the reagent control, extract from decellularized nerve grafts, negative control, and positive control groups. Scale bars = 50 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Nerve segment length (cm)IPA treatment (h)NaOH treatment (h)SDC treatment (h)
2–31.566
>3–4288
>4–52.51010

Table 1: Length-specific processing durations for peripheral nerve segments within the range evaluated in this study.

Discusión

Este estudio presenta un protocolo estandarizado de descelularización asistida por álcali para la fabricación de injertos de nervio periférico humano descelularizados destinados a la regeneración del nervio periférico. El protocolo integra el pretratamiento del nervio donante, la descelularización química controlada y un sistema de intercambio de soluciones impulsado por una bomba peristáltica en un flujo de trabajo claramente definido, lo que permite la eliminación eficiente de los componentes celulares e inmunogénicos mientras se conserva la arquitectura nativa de la matriz extracelular.

Una característica clave de este método es la integración del tratamiento alcalino con una exposición reducida a detergentes. Los protocolos convencionales basados en detergentes, como el de Sondell (3% de Triton X-100 y 4% de SDC) y el método de Hudson (sulfobetaina-10, sulfobetaina-16 y Triton X-200), dependen de tratamientos prolongados y multietapa con detergentes para lograr una descelularización efectiva9,10. Aunque estos enfoques eliminan eficazmente los componentes celulares, la exposición prolongada a detergentes puede comprometer la integridad de la matriz extracelular (ECM) y contribuir a la citotoxicidad residual relacionada con los detergentes19,20,21. En contraste, el presente protocolo incorpora NaOH para mejorar la eliminación celular mientras limita la exposición al SDC, reduciendo así la carga total de detergentes y favoreciendo la preservación de la arquitectura nativa de la ECM.

Otro aspecto crítico de este protocolo es el sistema de intercambio de soluciones impulsado por una bomba peristáltica. A diferencia de los enfoques basados en perfusión, que pueden ejercer presión interna sobre el tejido y conllevan riesgo de alteración estructural21, este sistema permite un intercambio continuo y controlado de soluciones dentro de una columna de cromatografía. La eficacia de este enfoque se respalda mediante múltiples resultados analíticos. El análisis histológico y la cuantificación del ADN residual confirmaron la eliminación eficiente de los componentes celulares, mientras que el análisis mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) demostró la preservación de la arquitectura nativa de la matriz extracelular (ECM). Además, los bajos niveles residuales de SDC y los resultados favorables de citocompatibilidad respaldaron la biocompatibilidad del injerto resultante. En conjunto, estos hallazgos sugieren que el protocolo logra un equilibrio entre una descelularización eficaz y la preservación estructural.

Varios pasos técnicos son fundamentales para minimizar la variabilidad del procedimiento y mantener condiciones controladas de procesamiento. Primero, es esencial manipular cuidadosamente el segmento nervioso durante el recorte, la transferencia y el lavado. El tejido nervioso periférico es mecánicamente frágil, y una compresión, plegado o tensión excesivos pueden alterar su estructura interna y comprometer la preservación de la matriz extracelular (ECM)19,20. Por lo tanto, los tejidos deben mantenerse húmedos y manipularse con delicadeza durante todo el procedimiento. Segundo, el intercambio uniforme de soluciones dentro de la columna es un factor clave para el rendimiento del proceso. Deben minimizarse las burbujas de aire dentro de la columna, y el tejido debe permanecer completamente sumergido y suspendido en la solución, evitando que se adhiera a la pared de la columna o al filtro. La adhesión del tejido puede provocar un intercambio de solución irregular, reduciendo la eficiencia del lavado y generando una exposición inconsistente a los reactivos de procesamiento21,22. Tercero, el sistema impulsado por bomba peristáltica debe funcionar de manera estable durante todo el procedimiento. Se requiere una circulación continua para la delipidificación, la descelularización y el lavado; por lo tanto, todas las conexiones de tubos deben asegurarse firmemente para prevenir desconexiones causadas por la presión o vibración inducida por la bomba. Durante la recuperación de la muestra, debe evitarse el drenaje completo de la columna. Mantener un volumen suficiente de líquido ayuda a prevenir la adhesión del tejido y facilita su manipulación delicada durante la recolección.

Los segmentos nerviosos de 2–3 cm se procesaron con IPA, NaOH y SDC durante 1,5, 6 y 6 h, respectivamente. Los segmentos de >3–4 cm se procesaron durante 2, 8 y 8 h, respectivamente, mientras que los segmentos de >4–5 cm se procesaron durante 2,5, 10 y 10 h, respectivamente. Así, las duraciones del tratamiento variaron entre 1,5 y 2,5 h para la delipidización con IPA y entre 6 y 10 h para cada paso de descelularización. Todos los demás parámetros de procesamiento, incluyendo las concentraciones de reactivos, los volúmenes de solución y los procedimientos de lavado, se mantuvieron constantes en todos los grupos de longitud. Dependiendo de la configuración del tubo, el caudal se estableció dentro del rango especificado y se mantuvo constante durante cada corrida de procesamiento. Las condiciones de procesamiento específicas para cada longitud se resumen en Tabla 1. No se evaluaron sistemáticamente ajustes basados en el diámetro del nervio, el grosor, la estructura fascicular o la composición celular y matricial, y se requiere investigación adicional23,24. Para aplicaciones a mayor escala, un sistema de bomba peristáltica multicanal podría mejorar el rendimiento; sin embargo, se debe verificar cuidadosamente la uniformidad del caudal entre los canales para garantizar un procesamiento homogéneo.

Quedan varias consideraciones para una mayor optimización. Aunque este protocolo reduce sustancialmente la exposición total al detergente, aún se incluye SDC, y futuras mejoras podrían centrarse en minimizar o reemplazar el uso de detergentes, manteniendo la eficiencia de descelularización y la preservación de la MEC25,26. Además, el tejido del nervio periférico es inherentemente difícil de estandarizar debido a la variación en la estructura fascicular, el diámetro, el grosor, y la composición celular y matricial23,24. Durante la fabricación a gran escala, estas diferencias, junto con variaciones en la carga del tejido y las condiciones de flujo, podrían contribuir a la variabilidad entre lotes. Sin embargo, la reproducibilidad entre donantes y entre lotes no se evaluó sistemáticamente en el presente estudio. Por lo tanto, será necesario realizar una validación adicional utilizando tejidos de múltiples donantes y lotes de fabricación independientes para establecer criterios adecuados de aceptación del tejido, estandarizar los procesos y garantizar la reproducibilidad entre lotes.

Una limitación adicional concierne la longitud del injerto. El rendimiento regenerativo disminuye con el aumento de la longitud del injerto, y esta limitación dependiente de la longitud puede ser más pronunciada en los injertos nerviosos alogénicos acelulares que en los autólogos3,27. Dado que los injertos nerviosos alogénicos acelulares carecen de células de Schwann viables residentes, dependen de la migración y proliferación de células de Schwann del huésped para apoyar la regeneración axonal27. Saheb-Al-Zamani et al. informaron que la regeneración limitada en injertos nerviosos alogénicos acelulares largos estuvo asociada con un aumento en la senescencia de las células de Schwann27.

Sin embargo, un estudio previo in vivo mostró que los injertos nerviosos humanos descelularizados con NaOH favorecieron una recuperación funcional y estructural comparable a la de los autoinjertos en un defecto de 15 mm del nervio ciático de conejo28. Contreras et al. también demostraron regeneración axonal y recuperación funcional mediante un aloinjerto nervioso descelularizado en un defecto de 70 mm del nervio peroneo en oveja29. Estos estudios respaldan el potencial regenerativo de los injertos nerviosos descelularizados, aunque se requiere una evaluación adicional de los injertos preparados con el presente protocolo en longitudes clínicamente relevantes. Los autoinjertos también están limitados por la disponibilidad del nervio donante y requieren un procedimiento adicional de extracción, lo que implica un segundo sitio quirúrgico y morbilidad en el sitio donante4. Por lo tanto, los aloinjertos nerviosos acelulares podrían ofrecer una alternativa clínicamente relevante cuando no se dispone de tejido autólogo suficiente o cuando la extracción del nervio donante es poco práctica.

En resumen, este protocolo proporciona un marco práctico y adaptable para la preparación de injertos de nervio periférico descelularizados. Su enfoque en la reducción de la exposición a detergentes, el intercambio controlado de soluciones y la estandarización del proceso respalda tanto aplicaciones de investigación como un posible uso traslacional en la regeneración del nervio periférico. Los estudios futuros deben centrarse en el desarrollo adicional de enfoques libres de detergentes, la escalabilidad del sistema y la evaluación exhaustiva in vivo del rendimiento regenerativo.

Divulgaciones

Los autores declaran que no existen conflictos de interés.

Agradecimientos

This work was supported by the Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korea Government (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech Bilateral Co-funding R&D Projects).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BT100-1L Bomba peristáltica multicanalBomba largaBT100-1LUtilizada para proporcionar circulación continua y cambio de solución durante la delipidificación, descelularización y lavado.
Columna de cromatografía Econo-Column, 2.5 × 10 cmBio-Rad737-2512Utilizada para sostener segmentos de nervio periférico durante el intercambio continuo de solución.
Alcohol isopropílico (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410Utilizado para la delipidificación del tejido nervioso periférico.
Tubo para bomba Masterflex Tygon E-LFLThermo Scientific06440-16Utilizado para conectar la bomba peristáltica, la columna de cromatografía y los depósitos de solución para la circulación continua de solución.
Desoxicolato sódico (SDC)Sigma-Aldrich30970-100GUtilizado como detergente en el segundo paso de descelularización para eliminar componentes celulares residuales.
Hidróxido de sodio, NaOHDuksan1636Para la ruptura celular.

Referencias

  1. Kornfeld T, Vogt PM, Radtke C. Nerve grafting for peripheral nerve injuries with extended defect sizes. Wien Med Wochenschr. 2019;169(9):240-251.
  2. Siemionow M, Brzezicki G. Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int Rev Neurobiol. 2009;87:141-172.
  3. Hoben GM, et al. Increasing nerve autograft length increases senescence and reduces regeneration. Plast Reconstr Surg. 2018;142(4):952-963.
  4. Gaudin R, et al. Approaches to peripheral nerve repair: Generations of biomaterial conduits yielding to replacing autologous nerve grafts in craniomaxillofacial surgery. Biomed Res Int. 2016;2016:3856262.
  5. Lans J, et al. A systematic review and meta-analysis of nerve gap repair: Comparative effectiveness of allografts, autografts, and conduits. Plast Reconstr Surg. 2023;151(5):814e-827e.
  6. Huang H, et al. A comparative study of acellular nerve xenografts and allografts in repairing rat facial nerve defects. Mol Med Rep. 2015;12(4):6330-6336.
  7. Rana D, et al. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(4):942-965.
  8. Zhang Y, et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31(20):5312-5324.
  9. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res. 1998;795(1-2):44-54.
  10. Hudson TW, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration. Tissue Eng. 2004;10(11-12):1641-1651.
  11. Rinker B, et al. Use of processed nerve allografts to repair nerve injuries greater than 25 mm in the hand. Ann Plast Surg. 2017;78(6 Suppl):S292-S295.
  12. Zvarova B, et al. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(5):418-428.
  13. Fox DA, Epstein ML, Bass P. Surfactants selectively ablate enteric neurons of the rat jejunum. J Pharmacol Exp Ther. 1983;227(2):538-544.
  14. Singh G, et al. Impact of various detergent-based immersion and perfusion decellularization strategies on the novel caprine pancreas derived extracellular matrix scaffold. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1253804.
  15. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006;27(19):3675-3683.
  16. Tsuchiya T, et al. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 2014;20(12):1028-1036.
  17. Sengyoku H, et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 2018;14(2):94-106.
  18. Jones EM, Cochrane CA, Percival SL. The effect of pH on the extracellular matrix and biofilms. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(7):431-439.
  19. Nieto-Nicolau N, et al. Effective decellularization of human nerve matrix for regenerative medicine with a novel protocol. Cell Tissue Res. 2021;384(1):167-177.
  20. Philips C, et al. Qualitative and quantitative evaluation of a novel detergent-based method for decellularization of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 2018;46(11):1921-1937.
  21. Wüthrich T, et al. Development of vascularized nerve scaffold using perfusion-decellularization and recellularization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;117:111311.
  22. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243.
  23. Hopf A, et al. Optimized decellularization protocol for large peripheral nerve segments: Towards personalized nerve bioengineering. Bioengineering (Basel). 2022;9(9):412.
  24. Penkert G. Anatomy of the peripheral nerve system. In: Focal Peripheral Neuropathies: Imaging, Neurological, and Neurosurgical Approaches. Springer; 2014:3-9.
  25. Vasudevan S, et al. Detergent-free decellularized nerve grafts for long-gap peripheral nerve reconstruction. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014;2(8):e201.
  26. García-García ÓD, et al. Comprehensive ex vivo and in vivo preclinical evaluation of novel chemoenzymatic decellularized peripheral nerve allografts. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1162684.
  27. Saheb-Al-Zamani M, et al. Limited regeneration in long acellular nerve allografts is associated with increased Schwann cell senescence. Exp Neurol. 2013;247:165-177.
  28. Kim S, et al. Enhancing peripheral nerve regeneration through NaOH-based decellularization of human nerve tissue. Bioeng Transl Med. 2025;10(6):e70072.
  29. Contreras E, et al. Repair of long nerve defects with a new decellularized nerve graft in rats and in sheep. Cells. 2022;11(24):4074.

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