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Artículo de método

Preparación de injertos de nervio periférico humano descelularizados mediante el uso de hidróxido de sodio y desoxicolato de sodio

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DOI:

10.3791/71578

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1 de septiembre de 2026

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método estandarizado de descelularización asistida por álcali que combina el tratamiento con hidróxido de sodio con un sistema de intercambio de soluciones impulsado por una bomba peristáltica, para producir injertos de nervio periférico humano descelularizados con una eliminación celular eficaz y la preservación de la arquitectura nativa de la matriz extracelular.

Resumen

Las lesiones de nervios periféricos a menudo requieren materiales de injerto que proporcionen una guía estructural para la regeneración axonal. Aunque el injerto nervioso autólogo sigue siendo el estándar clínico, su uso está limitado por la morbilidad en el sitio donante y la disponibilidad restringida de tejido. Estas limitaciones han impulsado un creciente interés en los injertos de nervio periférico humano descelularizados como biomaterial alternativo para la regeneración nerviosa. Sin embargo, los protocolos de descelularización basados comúnmente en detergentes pueden alterar la arquitectura de la matriz extracelular (ECM) y dejar residuos citotóxicos que podrían comprometer la calidad del injerto. En este artículo se describe un protocolo estandarizado para preparar injertos de nervio periférico humano descelularizados mediante un enfoque de descelularización asistida por alcalino. El procedimiento comienza con un tratamiento con hidróxido de sodio (NaOH) para promover una desintegración celular eficiente, seguido de un paso suave con desoxicolanato de sodio (SDC) que elimina los componentes celulares e inmunogénicos residuales, preservando al mismo tiempo la organización nativa de la ECM. Esta estrategia limita la exposición a detergentes y favorece la conservación de la arquitectura nativa de la ECM. El flujo de trabajo incluye la preparación del nervio donante, un tratamiento controlado con NaOH, un posterior tratamiento suave con SDC y lavados exhaustivos con intercambio continuo de solución mediante un sistema impulsado por bomba peristáltica para facilitar la eliminación de agentes residuales del proceso. Se implementan pasos adicionales posteriores al procesamiento para mantener la integridad estructural y preparar los injertos para su empaque final y esterilización. La eficiencia de la descelularización se evalúa mediante análisis histológico y cuantificación del ADN residual, y la conservación de la estructura de la ECM se examina mediante microscopía electrónica de barrido. La ausencia de residuos de SDC y la biocompatibilidad de los injertos procesados se confirmaron mediante pruebas de citotoxicidad. Este protocolo ofrece un enfoque práctico para producir injertos de nervio periférico humano descelularizados para la investigación sobre regeneración nerviosa periférica y aplicaciones traslacionales.

Introducción

Las lesiones de los nervios periféricos pueden provocar un deterioro funcional grave y siguen siendo un desafío clínico importante en la medicina regenerativa y la cirugía reconstructiva. La regeneración de defectos nerviosos segmentarios requiere materiales de injerto que no solo cierren la brecha de la lesión, sino que también proporcionen orientación estructural y señales bioquímicas para apoyar la regeneración axonal y la reinervación. El injerto nervioso autólogo es ampliamente considerado el estándar clínico de oro porque conserva la arquitectura nativa de la matriz extracelular (ECM) y proporciona un microambiente favorable para la regeneración nerviosa1,2. Sin embargo, su uso clínico está limitado por la disponibilidad restringida de tejido donante, la necesidad de procedimientos quirúrgicos adicionales y la morbilidad en el sitio donante3,4. Estas limitaciones han impulsado el desarrollo de materiales de injerto alternativos, particularmente injertos nerviosos periféricos descelularizados que conservan la arquitectura nativa de la ECM mientras minimizan los componentes celulares inmunogénicos5,6,7,8.

El rendimiento de los injertos nerviosos descelularizados depende en gran medida del proceso de descelularización. Los métodos convencionales suelen basarse en reactivos a base de detergentes, como el Triton X-100 y el desoxicolato sódico (SDC), que eliminan los componentes celulares solubilizando las membranas lipídicas9,10,11. Sin embargo, la exposición prolongada a estos detergentes puede alterar la microestructura de la matriz extracelular (ECM) y dejar sustancias citotóxicas residuales que afectan negativamente la viabilidad celular y los resultados regenerativos12,13. Como consecuencia, se están investigando activamente estrategias alternativas de descelularización que permitan la eliminación eficiente de células mientras se preserva la integridad de la ECM14. La descelularización alcalina mediante hidróxido sódico (NaOH) ha surgido como un enfoque alternativo potencial, ya que las condiciones de pH extremo pueden degradar eficazmente los componentes celulares, los ácidos nucleicos y los lípidos15,16,17. No obstante, la exposición no controlada a condiciones alcalinas fuertes puede comprometer la integridad de la ECM, lo que subraya la importancia de condiciones de procesamiento rigurosamente controladas16,18.

Aquí se presenta un protocolo estandarizado de descelularización asistida por álcali para injertos de nervio periférico humano, que incorpora un sistema continuo de intercambio de solución impulsado por una bomba peristáltica. En comparación con los métodos convencionales de inmersión estática, este proceso dinámico permite un intercambio continuo de la solución, facilitando la eliminación de restos celulares y agentes residuales del proceso. Este artículo ofrece una demostración visual paso a paso del flujo de trabajo completo, incluyendo la preparación del nervio donante, la descelularización controlada asistida por álcali y el intercambio continuo de solución mediante un sistema impulsado por bomba peristáltica. Los injertos resultantes se evaluaron mediante análisis histológico, cuantificación del ADN residual y microscopía electrónica de barrido (SEM) para confirmar una descelularización eficiente y la preservación de la ultraestructura de la matriz extracelular. Al permitir una visualización clara de los pasos técnicos críticos, este artículo proporciona un marco claramente definido para la preparación de injertos nerviosos descelularizados y para la futura ampliación del proceso.

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Protocolo

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

  1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
    CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

  1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
  2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
  3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
  4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
    NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

  1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
  2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
  3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
    NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

  1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
  2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
  3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
  4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
    NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
  5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
  6. Drain the solution from the column.
  7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
  8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
  9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
    NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

  1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

  1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

  1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
  2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
  3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
    NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

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Resultados

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

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Discusión

Este estudio presenta un protocolo estandarizado de descelularización asistida por álcali para la fabricación de injertos de nervio periférico humano descelularizados destinados a la regeneración del nervio periférico. El protocolo integra el pretratamiento del nervio donante, la descelularización química controlada y un sistema de intercambio de soluciones impulsado por una bomba peristáltica en un flujo de trabajo claramente definido, lo que permite la eliminación eficiente de los componentes celulares e inmunogénicos ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no existen conflictos de interés.

Agradecimientos

This work was supported by the Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korea Government (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech Bilateral Co-funding R&D Projects).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BT100-1L Bomba peristáltica multicanalBomba largaBT100-1LUtilizada para proporcionar circulación continua y cambio de solución durante la delipidificación, descelularización y lavado.
Columna de cromatografía Econo-Column, 2.5 × 10 cmBio-Rad737-2512Utilizada para sostener segmentos de nervio periférico durante el intercambio continuo de solución.
Alcohol isopropílico (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410Utilizado para la delipidificación del tejido nervioso periférico.
Tubo para bomba Masterflex Tygon E-LFLThermo Scientific06440-16Utilizado para conectar la bomba peristáltica, la columna de cromatografía y los depósitos de solución para la circulación continua de solución.
Desoxicolato sódico (SDC)Sigma-Aldrich30970-100GUtilizado como detergente en el segundo paso de descelularización para eliminar componentes celulares residuales.
Hidróxido de sodio, NaOHDuksan1636Para la ruptura celular.

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