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Artículo de investigación

Identificación de biomarcadores candidatos relacionados con las mitocondrias del Ligustri Lucidi Fructus en nefropatía diabética

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DOI:

10.3791/71592

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15 de septiembre de 2026

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1Institute of Pharmaceutical and Food Engineering, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Shanxi Key Laboratory of Integrative Systemic Regulation for Qi-Blood Homeostasis, 2College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

En este artículo

Resumen

La nefropatía diabética (ND) implica disfunción mitocondrial. Mediante el uso de transcriptómica, farmacología de redes y aprendizaje automático, identificamos CAT, FABP1, MAOA y MAOB como biomarcadores candidatos relacionados con las mitocondrias para Ligustri Lucidi Fructus. En ratones db/db, LLF reguló al alza CAT y MAOA, lo que respalda una mayor investigación mecanicista.

Resumen

La disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo excesivo dentro de las mitocondrias son factores patológicos clave que impulsan la lesión tubular renal en la nefropatía diabética (DN). Aunque el Ligustri Lucidi Fructus (LLF) se utiliza tradicionalmente para tratar la DN, los mecanismos implicados, particularmente aquellos relacionados con genes y vías asociados a las mitocondrias, aún no se comprenden bien. En este estudio se utilizó el análisis de expresión diferencial del conjunto de datos GSE142025 para identificar genes con expresión diferencial (DEG) relacionados con la DN. Los genes característicos se seleccionaron mediante la comparación cruzada de los resultados de cuatro modelos de aprendizaje automático. Los genes que mostraron expresión diferencial significativa y patrones de expresión consistentes en ambos conjuntos de datos se evaluaron posteriormente mediante análisis de la curva ROC (característica de operación del receptor). Aquellos con un área bajo la curva (AUC) > 0,7 en ambos conjuntos de datos se definieron como biomarcadores candidatos. Se realizaron análisis de enriquecimiento funcional, infiltración inmune, construcción de redes y acoplamiento molecular. Se utilizó un modelo de ratón con DN para evaluar la glucosa en sangre, la microalbumina urinaria, la histopatología y la expresión mediante RT-qPCR de los biomarcadores candidatos. CAT y MAOA se reguló significativamente hacia arriba in vivo. Los biomarcadores candidatos se enriquecieron en vías relacionadas con la función del ribosoma, la degradación de valina, leucina e isoleucina, las interacciones entre citocinas y sus receptores, y los peroxisomas. Estos mostraron correlación negativa con células T CD8+ y células mastocíticas activadas, y correlación positiva con células NK activadas y células B naïve. La taxifolina, el beta-sitosterol y la eriodictiol mostraron energías de enlace inferiores a -5 kcal/mol con los biomarcadores candidatos. CAT y MAOA son candidatos prometedores que justifican una investigación mecanicista más profunda.

Introducción

La nefropatía diabética (ND), la causa principal de enfermedad renal en etapa terminal en todo el mundo, es una de las complicaciones más comunes de la diabetes mellitus. Desde el punto de vista patológico, se caracteriza por la acumulación excesiva de matriz extracelular en los compartimentos glomerular y tubular, junto con el engrosamiento y la esclerosis de los vasos sanguíneos intrarrenales2. La ND se asocia comúnmente con proteinuria e hipertensión3. Su desarrollo está estrechamente relacionado con el daño en las células endoteliales vasculares, una respuesta inflamatoria exacerbada y un estrés oxidativo aumentado como consecuencia de la hiperglucemia prolongada4. La incidencia de la ND está en aumento a nivel mundial, especialmente entre personas diabéticas de mediana edad y ancianos. A medida que la enfermedad progresa, puede conducir a insuficiencia renal en etapa terminal e incluso a complicaciones cardiovasculares, afectando significativamente la calidad de vida y el pronóstico de los pacientes5. A pesar de los avances en los enfoques diagnósticos y terapéuticos para la ND, aún no se han identificado biomarcadores candidatos precisos y tempranos para el diagnóstico, y faltan estrategias terapéuticas efectivas para revertir los procesos patológicos. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar fármacos anti-ND novedosos y dirigidos.

Las mitocondrias son fundamentales para la bioenergética celular, la síntesis de precursores metabólicos, la homeostasis del calcio, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la señalización inmunitaria y la apoptosis, todos los cuales son esenciales para mantener la estabilidad celular y del organismo6. Como centrales energéticas de la célula, las mitocondrias desempeñan un papel fundamental en procesos básicos como la glucólisis, el ciclo del ácido tricarboxílico y la fosforilación oxidativa7. La obesidad altera el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria mitocondrial, lo que conduce a disfunción mitocondrial y un aumento en la producción de ROS. Los niveles elevados de ROS en la cadena respiratoria mitocondrial pueden inducir estrés oxidativo, el cual agrava la respuesta inflamatoria asociada con la obesidad y promueve la apoptosis8. Investigaciones recientes han destacado el papel significativo de la disfunción mitocondrial en la patogénesis y progresión de la nefropatía diabética (DN), incluyendo alteraciones en el metabolismo energético, generación excesiva de ROS y señalización apoptótica aumentada9. La disfunción mitocondrial crónica acelera la progresión de la enfermedad renal10. Por lo tanto, mejorar la función mitocondrial podría representar una estrategia protectora crucial contra la DN.

Ligustri Lucidi Fructus (LLF) es un fruto seco y maduro de la familia Luteaceae que es reconocido por sus propiedades nutritivas para el hígado y los riñones, así como por su capacidad para oscurecer el cabello y mejorar la visión. Se ha identificado un heteropolisacárido natural extraído de LLF, que revela su potencial para proteger los riñones contra la fibrosis11. En los últimos años, se ha prestado cada vez más atención al uso de LLF en el tratamiento de la nefropatía diabética (DN), con efectos renoprotectores notables demostrados11,12,13. Además, se ha investigado y validado ampliamente la relación compleja entre LLF y las mitocondrias. En particular, un estudio ha demostrado que LLF ejerce sus efectos beneficiosos mediante la modulación de la función mitocondrial a través de la activación de la vía de señalización AMPK14. Este mecanismo protege eficazmente a las mitocondrias contra el daño causado por el estrés oxidativo. Estos hallazgos subrayan aún más el papel esencial de LLF en el mantenimiento del metabolismo energético celular y en la mejora de la resistencia de las células al estrés oxidativo. Sin embargo, el mecanismo terapéutico exacto, particularmente en relación con la recuperación de la función mitocondrial, sigue siendo poco comprendido.

El objetivo de este estudio fue esclarecer los mecanismos biológicos subyacentes al efecto terapéutico de LLF sobre la función mitocondrial en la DN. Se realizaron búsquedas en bases de datos públicas mediante herramientas de bioinformática para identificar biomarcadores candidatos asociados con los efectos nefroprotectores de LLF, integrando datos transcriptómicos e información sobre ingredientes activos. Análisis adicionales, incluyendo infiltración inmunitaria, asociación con características clínicas, modificación de ARN por m6A, enriquecimiento funcional, construcción de redes reguladoras y acoplamiento molecular, sugirieron que estos biomarcadores candidatos desempeñan un papel fundamental en la regulación de la función mitocondrial durante el tratamiento de la DN. La validación in vivo confirmó además su importancia. Este análisis integral profundiza nuestra comprensión de los mecanismos mediante los cuales LLF trata la DN y proporciona una base sólida para el desarrollo de nuevos objetivos terapéuticos basados en la disfunción mitocondrial.

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Protocolo

Recolección de datos
La matriz de expresión génica y los datos clínicos correspondientes de los conjuntos de datos GSE142025 y GSE96804, relacionados con la DN, se obtuvieron de la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)15. El conjunto de entrenamiento (GSE142025) incluyó muestras de tejido renal de 27 pacientes con DN y nueve controles, secuenciadas mediante la plataforma GPL20301. El conjunto de validación (GSE96804) comprendió datos de secuenciación de 41 pacientes con DN y 20 controles, procesados mediante la plataforma GPL17586. Ambos conjuntos de datos se centran en tejido renal; el conjunto de datos GSE96804 examina específicamente el glomérulo, la unidad principal de filtración del riñón (Figura 1). El conjunto de datos GSE142025 (conjunto de entrenamiento) comprende muestras de tejido renal completo y proporciona una visión amplia del paisaje transcriptómico de la DN. El conjunto de datos GSE96804 (conjunto de validación), por otro lado, se enfoca específicamente en el tejido glomerular, que es el sitio principal de la lesión por filtración glomerular. Dado que estos dos conjuntos de datos no se fusionaron directamente debido a diferencias en la plataforma y el tejido, no se aplicó corrección del efecto de lote. En su lugar, se realizó una validación cruzada entre conjuntos de datos de forma independiente. Se seleccionaron como candidatos robustos aquellos genes con cambios direccionales consistentes y un área bajo la curva (AUC) mayor de 0,7 en ambos conjuntos de datos, lo que respalda su generalización a través de los compartimentos renales.

Se extrajeron un total de 1.136 genes relacionados con las mitocondrias (MRGs) de la base de datos MitoCarta3.0 (https://www.broadinstitute.org/mitocarta). Los ingredientes activos de LLF se predijeron utilizando la base de datos de Farmacología Sistémica de la Medicina Tradicional China (TCMSP) (http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php), basándose en un umbral de biodisponibilidad oral (OB) ≥30 % y un umbral de similitud con fármacos (DL) ≥0,18. Posteriormente, se predijeron los genes diana potenciales para los constituyentes activos mediante la base de datos Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/).

Análisis de expresión diferencial
Se realizó el análisis de expresión diferencial de GSE142025 (DN frente a control) utilizando el paquete limma (v3.54.1), con criterios de significancia establecidos en P.adj < 0,05 y |log2FoldChange| > 0,516. Los gráficos de volcan y mapas de calor se visualizaron utilizando los paquetes ggplot2 (v 3.3.6) y ComplexHeatmap (v 2.14.0)17,18, respectivamente. Se intersectaron los genes con expresión diferencial (DEGs), los genes relacionados con la respuesta mitocondrial (MRGs) y los genes diana potenciales de los ingredientes activos, y los genes superpuestos se definieron como genes candidatos. La red que vincula los ingredientes activos con los genes candidatos se construyó utilizando el software Cytoscape (v 3.9.0)19.

Análisis de enriquecimiento funcional y construcción de la red de interacción proteína-proteína (PPI)
Se realizaron análisis de enriquecimiento de Ontología Genética (GO) y del Banco de Datos Kyoto de Genes y Genomas (KEGG) para los genes candidato utilizando el paquete clusterProfiler (v 4.6.2) con el fin de explorar sus funciones biológicas y las vías de señalización asociadas (P.adjust < 0.05). Posteriormente, los genes candidato se introdujeron en la base de datos STRING (https://cn.string-db.org/) para recuperar las relaciones de interacción proteína-proteína (nivel de confianza ≥ 0.4), seguido de la construcción de una red PPI mediante Cytoscape (v 3.9.0)20.

Aprendizaje automático
Se implementaron cuatro algoritmos de aprendizaje automático, incluyendo bosque aleatorio (RF), vecino más cercano k (KNN), mínimos cuadrados parciales (PLS) y máquina de vectores de soporte con un núcleo de base radial (SVM), utilizando el paquete caret (v6.0-93) basado en el conjunto de datos GSE142025. Los genes candidatos identificados en el análisis previo se utilizaron como variables predictoras, y el estado de la enfermedad (DN o control) se utilizó como resultado. Para el modelo KNN, se implementó una validación cruzada de 10 pliegues utilizando la función trainControl, con tuneLength = 10. El modelo RF se ajustó con 20 árboles (ntree = 20); los modelos PLS y SVM se ajustaron utilizando los parámetros establecidos en el flujo de trabajo original de caret.

Las distribuciones residuales del modelo se evaluaron utilizando el paquete DALEX (v2.4.3). Posteriormente, se realizó una evaluación de variables basada en permutación usando la función variable_importance de DALEX, especificando el error cuadrático medio (RMSE) como función de pérdida. El dropout_loss resultante representa el RMSE obtenido tras la permutación de la variable correspondiente21,22. En el flujo de trabajo analítico original, se conservaron las variables con una dropout loss < 0.281 en todos los modelos, y los genes comunes a los cuatro modelos se definieron como genes característicos de consenso para su validación posterior.

Los cuatro modelos de aprendizaje automático se utilizaron principalmente para la priorización de características en lugar de para la construcción de un clasificador clínico final. Por consiguiente, la discriminación diagnóstica se evaluó posteriormente a nivel de gen individual mediante análisis ROC en ambos conjuntos de datos, el de descubrimiento y el de validación.

Identificación de biomarcadores candidatos
En GSE142025 y GSE96804, se evaluaron las diferencias de expresión en genes característicos entre muestras DN y controles utilizando la prueba de Wilcoxon. Solo se seleccionaron los genes con expresión diferencial significativa (P < 0,05) y tendencias de expresión concordantes en ambos conjuntos de datos para el análisis de la curva característica de operación del receptor (ROC). Se utilizó el paquete pROC (v1.18.0) para generar las curvas ROC y calcular el área bajo la curva (AUC), clasificándose como biomarcadores candidatos aquellos genes que mostraron un AUC > 0,7 en ambos conjuntos de datos23.

Análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA)
Las funciones biológicas y las vías de señalización asociadas con los biomarcadores candidatos se exploraron adicionalmente mediante el análisis de enriquecimiento genético (GSEA) en el conjunto de datos GSE142025. Primero, se realizó un análisis de correlación de Spearman entre los biomarcadores candidatos y todos los demás genes utilizando el paquete psych (v2.2.9).24. Se calcularon y ordenaron los coeficientes de correlación (de mayor a menor). El conjunto de genes de referencia fue c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols.gmt de la Base de Datos de Firmas Moleculares (Molecular Signatures Database, MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/). Luego, se realizó un análisis GSEA para evaluar el enriquecimiento de los genes ordenados en el conjunto de genes de referencia utilizando el paquete clusterProfiler (v4.6.2). Se aplicó corrección por múltiples pruebas. vía el método FDR y ajustado P-valores (denotados como P.ajuste) se consideraron significativos si < 0.05.

Análisis de la modificación m6A
Para investigar las modificaciones de metilación del ARN en biomarcadores candidatos, se utilizó la base de datos SRAMP (http://www.cuilab.cn/sramp/) para predecir m6Sitios de modificación en biomarcadores candidatos, centrándose en posiciones de alta confianza dentro de sus estructuras secundarias. Luego, se utilizó la base de datos ENCORI (https://starbase.sysu.edu.cn/) para identificar proteínas modificadas por m6A que interactúan con los biomarcadores candidatos, utilizando |HepG2 (shRNA)| > 1 parámetro para detectar las proteínas clave. Posteriormente, se utilizó la base de datos RPISeq (http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/) para predecir la probabilidad de interacciones entre las proteínas clave y los biomarcadores candidatos. Las secuencias de ARN de ambos se cargaron en formato de texto plano para generar puntuaciones de predicción mediante los clasificadores RF y SVM. Se consideró significativa una interacción cuando la puntuación superaba 0,5.25Se realizó el análisis con SRAMP utilizando el umbral 'Alto' para la predicción de sitios m6A, en modo 'Transcripto' y con los parámetros predeterminados. El análisis con ENCORI utilizó la función de interacción 'miARN-ARNm' con el parámetro 'HepG2 (shARN)' > 1. El análisis RPISeq utilizó el clasificador RF con parámetros predeterminados; puntuaciones > 0,5 indicó una interacción positiva. Estas son predicciones computacionales, no evidencia experimental de modificación m6A ni de interacciones ARN-proteína en tejido renal. El criterio de shRNA en HepG2 se derivó de conjuntos de datos precalculados de ENCORI y puede no reflejar la regulación específica del riñón.

Análisis de infiltración inmunitaria
Se aplicó el algoritmo CIBERSORT para estimar las proporciones de 22 tipos de células inmunitarias en muestras de control y con DN del conjunto GSE142025, con visualización mediante un mapa de calor generado utilizando el paquete ggplot2 (v3.3.6)26. CIBERSORT se ejecutó utilizando la matriz de firmas LM22, con 1.000 permutaciones y sin normalización por cuantiles (según se recomienda para datos de microarrays). Se conservaron para análisis posteriores las muestras con p de CIBERSORT < 0,05. CIBERSORT estima las fracciones de células inmunitarias a partir de la expresión en tejido renal total, lo cual no permite distinguir la infiltración específica por compartimentos (por ejemplo, glomerular frente a túbulo-intersticial) ni diferenciar los leucocitos infiltrantes de las células inmunitarias residentes. Por lo tanto, las correlaciones informadas corresponden al nivel tisular y deben validarse mediante métodos espaciales. Se realizó un análisis de correlación de Spearman entre las células inmunitarias con abundancia diferencial y los biomarcadores candidatos utilizando el paquete psych.

Construcción de redes y acoplamiento molecular
Se predijeron las microARNs (miARNs) que interactúan con los biomarcadores candidatos utilizando la base de datos miRNet (https://www.mirnet.ca). Posteriormente, se predijeron las ARN largos no codificantes (lncARNs) que dirigen sus dianas a las miARNs identificadas mediante las bases de datos TarBase (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase) y starbase (http://starbase.sysu.edu.cn/). Se seleccionaron los lncARNs comunes a ambas bases de datos para la construcción de la red. Luego, se construyó una red reguladora de lncARN-miARN-mARN utilizando el software Cytoscape. Se seleccionaron ingredientes activos potenciales que dirigen sus dianas a los biomarcadores candidatos para construir una red de ingrediente activo-biomarcador. Además, se incorporaron en Cytoscape los ingredientes activos, los biomarcadores candidatos y las vías identificadas en el análisis GSEA para crear una red de ingrediente activo-biomarcador-vía.

Se realizó un análisis de acoplamiento molecular para evaluar la afinidad de unión entre los ingredientes activos potenciales y los biomarcadores candidatos. Las estructuras tridimensionales de las proteínas biomarcadoras se obtuvieron desde la Base de Datos del Protein Data Bank del Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB PDB, https://www.rscb.org/pdb) en formato de archivo PDB. Las estructuras bidimensionales de los ingredientes activos potenciales se recuperaron en formato SDF desde la base de datos PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). El acoplamiento molecular se llevó a cabo utilizando la plataforma CB-Dock (http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php). Una energía de unión inferior a -5 kcal/mol indicó una afinidad de unión fuerte27.

Preparación y autenticación de Ligustri Lucidi Fructus
Aquí, Ligustri Lucidi Fructus (LLF) se refiere al fruto seco maduro de Ligustrum lucidum W. T. Aiton (Oleaceae). El material botánico fue autenticado de acuerdo con la Farmacopea de China, y un ejemplar depositado con el número 20240506,20240911,20241103 fue archivado en la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanxi.

Para la preparación del decocción, 200 g de rodajas calificadas de LLF se remojaron en 1.000 mL de agua destilada durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla se hirvió vigorosamente y luego se cocinó a fuego lento durante 60 min. Se recogió el filtrado, y los materiales herbáceos residuales se sometieron nuevamente a decocción con otros 1.000 mL de agua destilada durante 60 min. Los dos filtrados se combinaron, filtraron, centrifugaron y concentraron bajo presión reducida para obtener una concentración final de 1 g de droga cruda/mL (volumen total de 100 mL). La decocción preparada se almacenó a 4 °C para uso a corto plazo o a −20 °C para conservación a largo plazo. La calidad del LLF y su decocción se identificó y verificó rigurosamente de acuerdo con las normas de la Farmacopea China para garantizar la confiabilidad y la reproducibilidad del experimento.

Para la identificación cualitativa, se realizó cromatografía en capa fina. Breve­mente, un volumen adecuado de la decocción preparada se centrifugó y el sobrenadante se extrajo con metanol. Después de la filtración, la solución de la muestra y la solución estándar de referencia de specnuezhenida se aplicaron en la misma placa de gel de sílice G. Tras el desarrollo, secado e inspección bajo luz ultravioleta, la mancha de la solución de la muestra mostró color y posición coincidentes con el compuesto de referencia, confirmando la presencia del componente bioactivo característico del LLF.

Para el control de calidad cuantitativo, se realizó la detección mediante cromatografía líquida de alta eficacia. El análisis se llevó a cabo utilizando una columna C18 con metanol–agua como fase móvil. La longitud de onda de detección se estableció a 224 nm. El contenido de especnuezhenida en la decocción se determinó en función de la curva patrón. Los resultados demostraron una composición química estable y uniforme de la decocción preparada, asegurando una calidad constante del fármaco durante todo el experimento de intervención en animales.

Experimentos con animales
Doce ratones machos de grado SPF db/db (8–9 semanas de edad) y seis ratones db/m de edad comparable se mantuvieron en las instalaciones para animales SPF de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanxi. Antes de los experimentos, los animales se aclimataron durante 7 días bajo un ciclo de 12 h de luz/12 h de oscuridad con acceso ad libitum a alimento y agua. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina Tradicional China de Shanxi (Número de aprobación: 2022DW167). Los animales que presentaron una pérdida de peso corporal >20%, un estado moribundo o una incapacidad para acceder al alimento o al agua fueron sacrificados humanamente antes del final previsto del estudio. Al finalizar el estudio, todos los ratones restantes fueron sacrificados mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico seguida de dislocación cervical, de acuerdo con los protocolos institucionales.

Tras el período de aclimatación, se confirmó el establecimiento de un modelo de DN en ratones db/db mediante un nivel de glucosa en sangre de la vena de la cola ≥ 16 mmol/L y microalbuminuria, indicada por una prueba positiva con tira reactiva para microalbumina urinaria. Tras el establecimiento exitoso del modelo de DN, los ratones db/db se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 6 por grupo): el grupo modelo de DN (DN) y el grupo tratado con LLF (Tratamiento). Además, se utilizaron ratones db/m (n = 6) como grupo control (Control). La dosis se seleccionó con base en estudios farmacodinámicos previos de LLF en ratas diabéticas y se convirtió a la dosis equivalente humana utilizando la normalización por área de superficie corporal28. A los grupos Control y DN se les administró agua destilada, mientras que al grupo de tratamiento se le administró 3,5 g/kg de LLF durante 8 semanas. Tras 8 semanas de administración, todos los ratones fueron sacrificados para recolectar suero, orina y tejido renal para pruebas posteriores.

Indicadores sanguíneos y urinarios
Los niveles séricos de glucosa se analizaron utilizando un analizador automático completo de bioquímica sanguínea. La concentración de microalbúmina urinaria se midió según las instrucciones del kit (Archivo complementario 1).

Observación patológica de tejidos renales de ratón
Los tejidos renales se procesaron para examen histopatológico. Después de la fijación en paraformaldehído al 4%, los tejidos se lavaron, deshidrataron, embebieron en parafina y seccionaron. Luego se realizó la tinción con hematoxilina y eosina (HE), y las secciones teñidas se examinaron al microscopio óptico para evaluar los cambios patológicos.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR)
Se utilizó RT-qPCR para determinar la expresión de los biomarcadores candidatos en tejido renal de ratón. El ARN total se extrajo según las instrucciones del fabricante, tras lo cual se evaluó la concentración y calidad del ARN (Tabla 1). Se sintetizó ADN complementario (cDNA) a partir del ARN extraído utilizando el Kit de Síntesis de cDNA. La amplificación se realizó con los pares de cebadores listados en la Tabla 1, utilizando GAPDH como gen de referencia. Los niveles de expresión relativos se calcularon mediante el método 2−ΔΔCt13,26.

Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R (versión 4.2.2) junto con el software necesario para los procedimientos experimentales correspondientes. A menos que se indique lo contrario, todas las pruebas estadísticas fueron bilaterales, y las diferencias se consideraron estadísticamente significativas con un valor de P < 0,05. El análisis de expresión diferencial transcriptómica se realizó utilizando el paquete limma. Se definieron como genes diferencialmente expresados aquellos con un valor de P ajustado < 0,05 y un cambio absoluto en el log2 de la razón mayor a 0,5.

Para las comparaciones de la expresión de genes candidatos entre muestras independientes de DN y controles, se utilizaron pruebas no paramétricas de suma de rangos de Wilcoxon cuando se indicó en el flujo de trabajo analítico original. Las correlaciones entre biomarcadores candidatos y fracciones de células inmunitarias se evaluaron mediante la correlación de rangos de Spearman.

Los datos experimentales se presentan como media ± DE. Las comparaciones entre los tres grupos independientes de animales se realizaron mediante análisis de varianza de un factor cuando se cumplieron los supuestos del análisis paramétrico. Para las comparaciones post hoc, se utilizó la prueba de diferencia mínima significativa cuando las varianzas eran homogéneas, mientras que se empleó la prueba de Dunnett T3 cuando las varianzas eran desiguales. Las mediciones farmacodinámicas de la línea base y de la semana 8 se analizaron y presentaron por separado; no se realizó ninguna inferencia respecto a una interacción grupo por tiempo. Los scripts de R y los datos originales utilizados para los análisis de bioinformática y de aprendizaje automático se proporcionan en Archivo Suplementario 1.

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Resultados

Para investigar sistemáticamente posibles biomarcadores candidatos relacionados con las mitocondrias para LLF en el tratamiento de la DN, diseñamos un flujo de trabajo analítico de cuatro fases (Figura 1). En la Fase I, integramos datos transcriptómicos del conjunto de datos GSE142025 (conjunto de entrenamiento, riñón completo, n=36) y GSE96804 (conjunto de validación, glomérulo, n = 61) con 1.136 genes relacionados con mitocondrias de la base de datos MitoCarta 3.0 y 517 dianas predichas de 9 ingredient...

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Discusión

LLF es una medicina tradicional china comúnmente utilizada, empleada principalmente para nutrir el hígado y los riñones y para tratar la diabetes y sus complicaciones. Actualmente, no existen fármacos ni terapias específicas para la DN, y su manejo depende principalmente de tratamientos hipoglucemiantes, hipolipemiantes y antihipertensivos30,31,32. Sin embargo, estos tratamientos solo pueden ralentizar la progresión del daño ren...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Deseamos expresar nuestro sincero agradecimiento a todas las personas y organizaciones que nos apoyaron y asistieron durante esta investigación. Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81973486 y 82173974), los proyectos de investigación de la Administración de Medicina Tradicional China de la provincia de Shanxi (No.2024ZYYA021), el Proyecto de Disciplina de la Universidad de Medicina China de Shanxi (No.2026XK24) y el Proyecto del Fondo de Investigación Científica de la Universidad de Medicina China de Shandong (No. KYZK2024Q13). Agradecemos a Qinqing Li, Profesor Asociado de la Universidad de Medicina China de Shanxi, quien autentificó el material botánico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución fijadora de tejidos al 4% de paraformaldehídoSaiyin Biotechnology Co., Ltd.71033600
Etileno absolutoSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
GlucómetroSinocare Inc.GA-3
Kit de ensayo de nitrógeno ureico en sangre (BUN)Instituto de Bioingeniería Nanjing JianweiC03-2-1
Ratones C57BLKS/J db/dbChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
Ratones C57BLKS/J db/mChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
CentrífugaHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.HI650
Hidrato de cloralShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.302-17-0
Cytoscape (v3.9.0)https://cytoscape.org
Base de datos para predicción de modificaciones m6Ahttp://www.cuilab.cn/sramp/
Base de datos de ingredientes activos en medicina tradicional chinahttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
ENCORI / Starbasehttps://starbase.sysu.edu.cn/
Gene Expression Omnibus (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Kit de tinción de hematoxilina y eosina (HE)Servicebio C0105S
Centrífuga de alta velocidadLabnet, USAC2500-R-230V
Herramienta de análisis de infiltración inmunehttps://cibersort.stanford.edu/
Fructus Ligustri LucidiSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20240506
Agitador magnéticoFábrica de Instrumentos Jintan Zhongtian, JiangsuT8-1
MicroscopioOlympusBX53
MicrotomoLeica, AlemaniaRM 2016
Espetrofotómetro de microvolumenHangzhou Aosheng Instrument Co., Ltd.Nano-300
miRNethttps://www.mirnet.ca
MitoCarta 3.0https://www.broadinstitute.org/mitocarta
Paquete R para interpretación de modeloshttps://cran.r-project.org/package=DALEX
Plataforma de acoplamiento molecularhttp://clab.labshare.cn/cb-dock/
Kit ELISA para microalbuminuria en ratónFine TestEM0632
Cinta reactiva para microalbuminuria en ratónGuangzhou Huadu Gaoerbao Biotechnology Co., Ltd.20211203
Kit ELISA para creatinina sérica en ratónAbmartAB5990A
MSigDBhttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/
Ciclador térmico PCRRocheRoche LightCycler 480
Software R (v4.2.2) + paquetes Rhttps://www.r-project.org / CRAN/Bioconductor
RCSB PDBhttps://www.rcsb.org
Kit de extracción de ARNBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF-036-01
RPISeqhttp://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/
Kit RT-qPCRBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF949-T
SalidrosideSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20211009
Kit de ensayo de creatinina séricaInstituto de Bioingeniería Nanjing JianweiC011-2-1
Instalación animal SPFUniversidad de Medicina Tradicional China de Shanxi
SRAMPhttp://www.cuilab.cn/sramp/
STRINGhttps://cn.string-db.org/
SwissTargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/
TCMSPhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
Tezhi PiganSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20210602
Baño flotador de tejidosWuhan JunjieJK-6

Referencias

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