Este estudio introduce estrategias quimiogenéticas y basadas en luz violeta para permitir un cambio de fase circadiano fiable durante el día.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Inducir desplazamientos de fase circadianos diurnos mediante enfoques quimiogenéticos y espectrales
En este artículo
Resumen
Resumen
En los mamíferos, el desplazamiento de fase circadiano durante el día está limitado por la reducción de la respuesta fótica del núcleo supraquiasmático (NSQ), lo que limita la capacidad de manipular experimentalmente el reloj circadiano durante esta fase. Por tanto, los métodos fiables para inducir desplazamientos de fase diurnos son esenciales para investigar los mecanismos de plasticidad circadiana y arrastre fótico. Se describen estrategias genéticas y espectrales complementarias para permitir una manipulación robusta y temporalmente precisa del reloj circadiano durante el día. El primer enfoque, actualmente limitado a ratones, emplea una estrategia quimiogenética que implica la administración intravítrea de Receptores Diseñados Exclusivamente Activados por Fármacos Diseñados (DREADDs) para activar selectivamente las células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs). Este enfoque permite una activación controlada de la vía retinohipotalámica e induce desplazamientos de fase diurnos reproducibles independientemente de las condiciones de iluminación ambiental. El segundo enfoque utiliza estimulación óptica específica de longitud de onda como alternativa no invasiva. La exposición a la luz violeta aprovecha la sensibilidad espectral de los ipRGCs para reducir el bloqueo de despolarización y promover una activación sostenida, permitiendo un reinicio de fase fiable durante el día subjetivo. Este método es aplicable en términos generales a sistemas mamíferos y no requiere manipulación genética ni intervención farmacológica. Se proporcionan protocolos detallados para la preparación experimental, el momento de la estimulación, la validación de desplazamientos de fase mediante actividad locomotrica y la evaluación de la activación neuronal mediante inmunohistoquímica c-Fos. Se detallan consideraciones clave, incluyendo el tiempo circadiano, los parámetros de estímulo y los controles experimentales, para facilitar la reproducibilidad. En conjunto, estos enfoques proporcionan herramientas versátiles y experimentalmente manejables para inducir desplazamientos de fase circadianos diurnos y permiten una investigación directa de los mecanismos subyacentes a la respuesta circadiana diurna.
Introducción
El núcleo supraquiasmático (NSQ), el reloj circadiano maestro del cerebro de los mamíferos, coordina los ritmos diarios esenciales en fisiología y comportamiento, incluyendo los ciclos de sueño-vigilia y los patrones de alimentación. Para mantener la alineación con el entorno externo, el NSQ recibe entrada fótica directa de células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs), que transmiten información de luz retiniana para sincronizar los ritmos circadianos internos con el díasolar 1,2.
Una característica definitoria de los siste....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso Animal del Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH) (ASP-SLCR-01). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor y reducir el número de animales utilizados. Las herramientas de investigación utilizadas se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Estrategia quimiogenética
- Inyección intravítrea del virus adeno-asociado en ratones Opn4Cre/+
- Limpia y esterilice la etapa estereotáxica y todos los instrumentos qu....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Los ratonesOpn4 Cre/+ que expresaron AAV-DREADD y recibieron solución salina en CT4 no mostraron un cambio de fase significativo en la actividad de movimiento de ruedas (n = 5; Figura 1B). En contraste, la administración del CNO en CT4 produjo un retraso de fase significativo en el inicio de la actividad (media ± SEM: 5,03 ± 0,48 h; n = 5; Figura 1C, D), demostrando que la activación de DREADD en este.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los resultados demuestran que la activación de ipRGCs durante el día subjetivo puede inducir desplazamientos de fase circadianos en ratones, un momento caracterizado típicamente por una menor sensibilidad a la estimulación fótica. Un enfoque quimiogenético permitió la activación selectiva de ipRGCs independientemente de la luz externa y produjo robustos retrasos de fase en el comportamiento de la roda. Esta activación también indujo la expresión aguda de c-Fos en el NSC, confirmando la a.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Vector viral dependiente de Cre que codifica el DREADD excitatorio (hM3Dq) fusionado con mCherry para la activación selectiva de ipRGC |
| Anti-c-Fos antibody (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 2250S | Anticuerpo primario utilizado para detectar c-Fos como marcador de activación neuronal |
| Anti-tdTomato antibody (goat) | LSBio | LS-C340696 | Anticuerpo primario utilizado para detectar la expresión del reportero mCherry/tdTomato |
| Blue LED driver | Thorlabs | LEDD1B | Fuente de alimentación para controlar la intensidad y la salida del LED azul |
| Blue LED light source | Thorlabs | M470L5 | Fuente LED que emite luz azul (λmax ≈ 470 nm) para la estimulación fótica |
| ClockLab software | Actimetrics | Versión 6.0.53 | Software para la adquisición y análisis de datos de actividad locomotora circadiana |
| Clozapine-N-oxide (CNO) | Sigma-Aldrich | C0832-5MG | Ligando utilizado para activar los receptores DREADD hM3Dq in vivo |
| DAPI | Invitrogen | 62248 | Tinción nuclear fluorescente para etiquetar los núcleos celulares |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21432 | Anticuerpo secundario fluorescente para la detección de anticuerpos primarios de cabra |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Anticuerpo secundario fluorescente para la detección de anticuerpos primarios de conejo |
| Fluoromount-G | Invitrogen | 00-4958-02 | Medio de montaje utilizado para preservar la fluorescencia en secciones de tejido |
| ImageJ (Fiji) software | NIH | Versión 2.16.0/1.54g | Software de código abierto para procesamiento de imágenes y análisis cuantitativo |
| Opn4cre Mice | The Jackson Laboratry | RRID:IMSR_JAX:035925 | Ratones utilizados para la activación quimiogénetica |
| Violet LED driver | Mightex | SLA-1000-2 | Fuente de alimentación para controlar la salida del LED violeta |
| Violet LED light source | Mightex | BLS-LCS-0385-04-22 | Fuente LED que emite luz violeta (λmax ≈ 385 nm) para la estimulación específica de longitud de onda |
| Wild-type mice | The Jackson Laboratry | Jackson strain #101043 | Ratones utilizados para el experimento de luz violeta |
Referencias
- Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 2002;295(5557):1065–70.
- Jones JR, Simon T, Lones L, Herzog ED. SCN VIP neurons are essential for normal light-mediated resetting of the circadian system. J Neurosci. 2018;38(37):7986–95.
- Coursey PJ. Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 1960;131:33–35.
- Kornhauser JM, Ginty DD, Greenberg ME, Mayo KE, Takahashi JS. Light entrainment and activation of signal transduction pathways in the SCN. Prog Brain Res. 1996;111:133–46.
- Ding JM, Weber ET, Faiman....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
