Este estudio introduce estrategias quimiogenéticas y basadas en luz violeta para permitir un cambio de fase circadiano fiable durante el día.
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Artículo de método
Inducir desplazamientos de fase circadianos diurnos mediante enfoques quimiogenéticos y espectrales
En este artículo
Resumen
Resumen
En los mamíferos, el desplazamiento de fase circadiano durante el día está limitado por la reducción de la respuesta fótica del núcleo supraquiasmático (NSQ), lo que limita la capacidad de manipular experimentalmente el reloj circadiano durante esta fase. Por tanto, los métodos fiables para inducir desplazamientos de fase diurnos son esenciales para investigar los mecanismos de plasticidad circadiana y arrastre fótico. Se describen estrategias genéticas y espectrales complementarias para permitir una manipulación robusta y temporalmente precisa del reloj circadiano durante el día. El primer enfoque, actualmente limitado a ratones, emplea una estrategia quimiogenética que implica la administración intravítrea de Receptores Diseñados Exclusivamente Activados por Fármacos Diseñados (DREADDs) para activar selectivamente las células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs). Este enfoque permite una activación controlada de la vía retinohipotalámica e induce desplazamientos de fase diurnos reproducibles independientemente de las condiciones de iluminación ambiental. El segundo enfoque utiliza estimulación óptica específica de longitud de onda como alternativa no invasiva. La exposición a la luz violeta aprovecha la sensibilidad espectral de los ipRGCs para reducir el bloqueo de despolarización y promover una activación sostenida, permitiendo un reinicio de fase fiable durante el día subjetivo. Este método es aplicable en términos generales a sistemas mamíferos y no requiere manipulación genética ni intervención farmacológica. Se proporcionan protocolos detallados para la preparación experimental, el momento de la estimulación, la validación de desplazamientos de fase mediante actividad locomotrica y la evaluación de la activación neuronal mediante inmunohistoquímica c-Fos. Se detallan consideraciones clave, incluyendo el tiempo circadiano, los parámetros de estímulo y los controles experimentales, para facilitar la reproducibilidad. En conjunto, estos enfoques proporcionan herramientas versátiles y experimentalmente manejables para inducir desplazamientos de fase circadianos diurnos y permiten una investigación directa de los mecanismos subyacentes a la respuesta circadiana diurna.
Introducción
El núcleo supraquiasmático (NSQ), el reloj circadiano maestro del cerebro de los mamíferos, coordina los ritmos diarios esenciales en fisiología y comportamiento, incluyendo los ciclos de sueño-vigilia y los patrones de alimentación. Para mantener la alineación con el entorno externo, el NSQ recibe entrada fótica directa de células ganglionares retinianas intrínsecamente fotosensibles (ipRGCs), que transmiten información de luz retiniana para sincronizar los ritmos circadianos internos con el díasolar 1,2.
Una característica definitoria de los sistemas circadianos en organismos es la respuesta dependiente de fase: el mismo estímulo entregado en diferentes momentos circadianos puede producir efectos marcadamente distintos. En los mamíferos, la luz nocturna induce de forma fiable desplazamientos de fase del reloj SCN, mientras que la exposición durante el día subjetivo produce poco o ningún reinicio 3,4. Esta aparente insensibilidad diurna se ha observado de forma constante tanto en preparaciones in vivo como in vitro, donde los intentos de imitar la entrada fótica no logran provocar cambios de fasesignificativos 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .
La insensibilidad diurna se ha atribuido, al menos en parte, a la insuficiente potencia retiniana para activar los mecanismos de reinicio de fase, junto con los mecanismos de acceso circadiano dentro del NSC. En consonancia con esta idea, los ipRGC no responden uniformemente bajo condiciones fototópicas; Un subconjunto entra en el bloque de despolarización, limitando el potencial de acción sostenida aldisparo 17, 18 y 19. Esta restricción fisiológica puede reducir la efectividad de la estimulación fótica convencional durante el día. Superar esta limitación permitiría interrogar directamente la plasticidad del reloj diurno, una fase tradicionalmente considerada refractaria al reinicio fótico.
Se describen dos metodologías complementarias para permitir un desplazamiento de fase robusto del reloj circadiano durante el día subjetivo. El primer enfoque emplea una estrategia quimiogenética para activar selectivamente los ipRGCs independientemente de las condiciones de iluminación ambiental. Específicamente, los ratonesOpn4 Cre/+ reciben inyecciones intravítreas de un virus adeno-asociado (AAV) que codifica el receptor excitatorio Designer Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADD), hM3Dq, de manera dependiente de Cre. La administración de clozapina-N-óxido (CNO) en el tiempo circadiano 4 (CT4) induce una activación en ráfaga de ipRGCs, proporcionando una activación sostenida de la vía retinohipotalámica19. Los desplazamientos de fase se cuantifican mediante registros de actividad locomotora, y la activación molecular dentro del SCN se evalúa mediante inmunohistoquímica c-Fos.
El segundo enfoque utiliza la estimulación óptica específica de longitud de onda como una estrategia no invasiva para una aplicabilidad más amplia. Los ratones de tipo salvaje se exponen a la luz violeta (385 nm) en el tiempo circadiano 6 (CT6), durante la mitad del día subjetivo. La luz violeta reduce el bloqueo de despolarización y soporta la activación sostenida de ipRGC en comparación con la luz azul oblanca 19. Los desplazamientos de fase se cuantifican como se ha descrito anteriormente.
Ambos enfoques buscan mejorar la señalización impulsada por ipRGC al SCN, superando así la reducción de la respuesta fótica característica del día subjetivo. En conjunto, estas metodologías proporcionan estrategias robustas y experimentalmente manejables para manipular el reloj circadiano durante una fase tradicionalmente resistente al reinicio fótico.
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso Animal del Instituto Nacional de Salud Mental (NIMH) (ASP-SLCR-01). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el dolor y reducir el número de animales utilizados. Las herramientas de investigación utilizadas se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Estrategia quimiogenética
- Inyección intravítrea del virus adeno-asociado en ratones Opn4Cre/+
- Limpia y esterilice la etapa estereotáxica y todos los instrumentos quirúrgicos utilizando los procedimientos de esterilización adecuados. Instala el aparato de inyección y coloca una aguja de inyección capilar de vidrio.
- Anestesiar al ratón con isoflurano. Ajusta el caudal de oxígeno a aproximadamente 1,5 L/min. Ajustar el isoflurano al 3%–5% para la inducción y reducir a 1–3% para el mantenimiento durante todo el procedimiento.
- Verifica la anestesia adecuada usando un pellizco en el dedo del pie. Considera al animal completamente anestesiado cuando no se observa retiro ni reflejo de sobresalto.
- Coloca el ratón sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal durante todo el procedimiento.
- Saca agujas capilares de cristal. Las agujas se marcaban a ~1,5 mm de la punta usando un marcador fino bajo un estereomicroscopio para asegurar una entrega consistente de profundidad de penetración.
- Aplica suavemente presión sobre el párpado inferior con pinzas de punta roma para sobresalir ligeramente el globo ocular y exponer el limbo dorsal. Mediante un enfoque dorsal, insertar la aguja tangencialmente a la superficie del ojo y penetrar la esclerótica 0,5–1 mm posterior al limbo, evitando las regiones vascularizadas del limbo.
- Inserta la aguja en la cámara vítrea a la profundidad predeterminada. Retira ligeramente para aliviar la presión intraocular y evitar que la punta de la aguja se bloquee por el tejido.
- Inyectar un volumen total de 1,5 μL de solución AAV (a 2,4 x 1013 GC/ml), administradas en cinco inyecciones secuenciales de 300 nL cada una (a razón de 50nl/s). Pausa 5 segundos entre inyecciones para permitir la difusión y minimizar el reflujo. Después de la última inyección, espera 30 segundos antes de retirar la aguja lentamente. Repite el mismo procedimiento en el ojo contralateral usando parámetros idénticos, cuidando minimizar el trauma y el reflujo.
- Administrar ketoprofeno (10 mg/kg, subcutáneo) inmediatamente después de la cirugía.
- Permite que los ratones se recuperen durante al menos 2 semanas para asegurar una expresión viral adecuada antes de trasladarlos al centro de conducta.
- Actividad de movimientos de ruedas y administración de CNO (Figura 1A)
- Ratones domésticos individualmente en jaulas equipadas con ruedas de corredor. Registrar la actividad de ejecución de ruedas usando un sistema automatizado de adquisición de datos.
- Ratones entrenados a un ciclo de 12:12 h claro-oscuro durante 4–7 días. Confirma el entrañamiento estable y luego haz la transición de los animales a oscuridad constante (DD).
- Determina el inicio de la actividad utilizando un software de análisis. Define el inicio de la actividad como CT12 en roedores nocturnos. Calcula CT4 en consecuencia.
- En el día 8 en DD, los ratones reciben inyecciones intraperitoneales de CNO (1 mg/kg) o solución salina en CT4 bajo luz roja tenue.
- Devuelve a los animales a sus jaulas y mantenlos bajo la oscuridad constante. Registrar la actividad locomotora de forma continua durante 8 días.
- Determinar el inicio de la actividad y realizar análisis de regresión en los periodos previos y posteriores a la inyección. Calcula los desplazamientos de fase como la diferencia entre el inicio de actividad proyectado y el observado.
- Inmunohistoquímica del SNQ c-Fos tras la activación quimiogenética
- Ratones entrenados a un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 h y liberados en oscuridad constante. El segundo día en DD, administrar el CNO en CT6. Perfundir animales 30 minutos después de la inyección.
Nota: CT4 se utilizó en experimentos conductuales para minimizar la posibilidad de que los efectos del CNO se extendieran a la noche subjetiva, ya que el CNO puede permanecer activo durante varias horas. En cambio, CT6 se utilizó en experimentos de inmunotinción para evaluar los efectos agudos de la CNO en el reloj circadiano, con animales perfundidos 30 minutos después de la inyección. - Diseccionar el cerebro y posfijar con paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 °C. Crioprotección en un 30% de sacarosa hasta que el tejido se hunda. Sección coronal a 40 μm.
- Incubar secciones en solución bloqueante, seguida de incubación primaria de anticuerpos durante la noche a 4 °C. Lavar e incubar con anticuerpos secundarios durante 1 hora. Contrateñe con DAPI y monta secciones.
- Adquiere imágenes usando ajustes de microscopio consistentes. Procesar imágenes usando software de análisis. Identificar regiones infectadas con AAV mediante células mCherry-positivas.
- Ratones entrenados a un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 h y liberados en oscuridad constante. El segundo día en DD, administrar el CNO en CT6. Perfundir animales 30 minutos después de la inyección.
2. Estrategia espectral
- Transfiere ratones salvajes a la instalación de comportamiento y alojarlos individualmente en jaulas equipadas con ruedas de corredor, como se ha descrito anteriormente. Mantener a los animales en oscuridad constante (DD) para monitorizar la actividad circadiana en movimiento libre.
- En el día 8 en DD, en el tiempo circadiano 6 (CT6), retira la jaula del armario hermético y expone al ratón a un pulso de luz de 15 minutos.
- Exponer a los ratones a un pulso de luz azul (λmax = 470 nm; 1,8 × 1014–2,2 × 1014 fotones/cm 2/s) o a un pulso de luz violeta (λmax = 385 nm; 1,45 × 1014–3,3 × 1014 fotones/cm2/s), con intensidad medida en el centro y en las cuatro esquinas de la jaula a nivel de los ojos del animal.
- Para ambas condiciones de longitud de onda, mantén a los ratones en sus jaulas caseras sin la parte superior de la jaula. Coloca las jaulas directamente debajo de una fuente de luz fija de modo que el centro del haz de luz quede alineado con el centro de la jaula para asegurar una iluminación uniforme.
- Devuelve inmediatamente las jaulas a su posición original bajo la oscuridad constante tras la exposición a la luz. Continúe la grabación de actividad de movimiento de ruedas sin interrupciones para el análisis de cambio de fase.
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Resultados
Los ratonesOpn4 Cre/+ que expresaron AAV-DREADD y recibieron solución salina en CT4 no mostraron un cambio de fase significativo en la actividad de movimiento de ruedas (n = 5; Figura 1B). En contraste, la administración del CNO en CT4 produjo un retraso de fase significativo en el inicio de la actividad (media ± SEM: 5,03 ± 0,48 h; n = 5; Figura 1C, D), demostrando que la activación de DREADD en este...
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Discusión
Los resultados demuestran que la activación de ipRGCs durante el día subjetivo puede inducir desplazamientos de fase circadianos en ratones, un momento caracterizado típicamente por una menor sensibilidad a la estimulación fótica. Un enfoque quimiogenético permitió la activación selectiva de ipRGCs independientemente de la luz externa y produjo robustos retrasos de fase en el comportamiento de la roda. Esta activación también indujo la expresión aguda de c-Fos en el NSC, confirmando la a...
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry | Addgene | 44361 | Vector viral dependiente de Cre que codifica el DREADD excitatorio (hM3Dq) fusionado con mCherry para la activación selectiva de ipRGC |
| Anti-c-Fos antibody (rabbit monoclonal) | Cell Signaling Technology | 2250S | Anticuerpo primario utilizado para detectar c-Fos como marcador de activación neuronal |
| Anti-tdTomato antibody (goat) | LSBio | LS-C340696 | Anticuerpo primario utilizado para detectar la expresión del reportero mCherry/tdTomato |
| Blue LED driver | Thorlabs | LEDD1B | Fuente de alimentación para controlar la intensidad y la salida del LED azul |
| Blue LED light source | Thorlabs | M470L5 | Fuente LED que emite luz azul (λmax ≈ 470 nm) para la estimulación fótica |
| ClockLab software | Actimetrics | Versión 6.0.53 | Software para la adquisición y análisis de datos de actividad locomotora circadiana |
| Clozapine-N-oxide (CNO) | Sigma-Aldrich | C0832-5MG | Ligando utilizado para activar los receptores DREADD hM3Dq in vivo |
| DAPI | Invitrogen | 62248 | Tinción nuclear fluorescente para etiquetar los núcleos celulares |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21432 | Anticuerpo secundario fluorescente para la detección de anticuerpos primarios de cabra |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Anticuerpo secundario fluorescente para la detección de anticuerpos primarios de conejo |
| Fluoromount-G | Invitrogen | 00-4958-02 | Medio de montaje utilizado para preservar la fluorescencia en secciones de tejido |
| ImageJ (Fiji) software | NIH | Versión 2.16.0/1.54g | Software de código abierto para procesamiento de imágenes y análisis cuantitativo |
| Opn4cre Mice | The Jackson Laboratry | RRID:IMSR_JAX:035925 | Ratones utilizados para la activación quimiogénetica |
| Violet LED driver | Mightex | SLA-1000-2 | Fuente de alimentación para controlar la salida del LED violeta |
| Violet LED light source | Mightex | BLS-LCS-0385-04-22 | Fuente LED que emite luz violeta (λmax ≈ 385 nm) para la estimulación específica de longitud de onda |
| Wild-type mice | The Jackson Laboratry | Jackson strain #101043 | Ratones utilizados para el experimento de luz violeta |
Referencias
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