La inmunotransferencia con LC3 es un método ampliamente utilizado para monitorear la autofagia, pero requiere una optimización cuidadosa. Este protocolo describe un enfoque robusto para la detección y cuantificación de LC3-II en células de cáncer pancreático derivadas de KPC, incluyendo consideraciones técnicas clave y un flujo de trabajo estandarizado para el análisis densitométrico mediante Fiji.
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Artículo de método
Análisis por Western Blot de la proteína asociada a microtúbulos cadena ligera 3 para monitorear la dinámica autofagosómica en células de cáncer pancreático derivadas de ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
La autofagia desempeña un papel complejo en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), contribuyendo a la progresión tumoral, la adaptación al estrés y la resistencia a la terapia. Por lo tanto, la evaluación precisa de la dinámica autofagosómica es esencial para los estudios de biología del cáncer. Entre los métodos disponibles, la inmunodetección por transferencia de proteínas (inmunoblot) de la proteína asociada a microtúbulos de cadena ligera 3 (LC3) se utiliza ampliamente para monitorear la dinámica autofagosómica, distinguiendo entre la forma citosólica (LC3-I) y la forma lipidada asociada al autofagosome (LC3-II). Sin embargo, el bajo peso molecular de LC3 y la mínima diferencia en la movilidad electroforética entre estos isoformos presentan desafíos técnicos que requieren una optimización cuidadosa. A continuación se presenta un protocolo reproducible para el análisis semicuantitativo de los niveles de LC3-II mediante inmunoblot tipo Western en células murinas de cáncer pancreático derivadas de KPC. El método incorpora condiciones optimizadas para la lisis celular, electroforesis, transferencia de proteínas y detección basada en anticuerpos, para garantizar una separación y detección confiables de los isoformos de LC3. Además, se proporciona un flujo de trabajo estandarizado para el análisis densitométrico de las bandas de LC3-II utilizando Fiji (ImageJ). La sensibilidad del método se demuestra mediante la detección de niveles aumentados de LC3-II en condiciones de inducción de la autofagia (tratamiento con gemcitabina) y de flujo autofágico alterado (silenciamiento de VMP1). También se examinan parámetros técnicos críticos que influyen en la interpretación de los datos, incluida la composición del tampón de lisis y la especificidad del anticuerpo, junto con errores experimentales comunes. Aunque la inmunodetección de LC3 por sí sola no es suficiente para definir completamente el flujo autofágico, cuando se combina con ensayos complementarios proporciona un enfoque robusto y accesible para monitorear la actividad autofágica. El protocolo puede adaptarse a otros contextos experimentales, facilitando estudios mecanicistas de la autofagia en modelos de cáncer.
Introducción
La macroautofagia (en lo sucesivo denominada autofagia) es una vía de degradación regulada mediante la cual las células degradan material citoplasmático, incluyendo proteínas y orgánulos disfuncionales. Un rasgo distintivo de la autofagia es la formación de una estructura de doble membrana conocida como autofagosoma, que aísla la carga celular y posteriormente la transporta a los lisosomas para su degradación1,2,3. En células normales, la autofagia contribuye al recambio controlado de proteínas y orgánulos, limitando así el estrés oxidativo y reduciendo el riesgo de desarrollo tumoral. En células cancerosas, sin embargo, este proceso puede ser aprovechado para favorecer la supervivencia en condiciones de alta demanda metabólica, privación de nutrientes e hipoxia. Al facilitar la adaptación a un microambiente hostil, la autofagia también contribuye a la resistencia a la quimioterapia, en parte al mitigar el daño celular inducido por el tratamiento4,5.
El cáncer de páncreas ocupa el tercer lugar como causa de mortalidad relacionada con el cáncer en Estados Unidos. Aproximadamente el 90 % de los cánceres de páncreas se clasifican como adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). A diferencia de varias otras malignidades, para las cuales la detección temprana y los avances terapéuticos han mejorado la supervivencia del paciente, el PDAC se diagnostica en una etapa avanzada en más del 80 % de los casos. Esta presentación en estadio tardío, combinada con una biología tumoral agresiva y una marcada resistencia a la terapia, resulta en una tasa de supervivencia general a 5 años de aproximadamente el 11 %6.
El modelo de ratón KPC, basado en la activación específica del páncreas de Kras oncogénico y en la eliminación condicional de Trp53 inducida por recombinasa Cre, es uno de los modelos de adenocarcinoma ductal pancreático genéticamente modificados más utilizados. Estos ratones desarrollan espontáneamente tumores que se asemejan estrechamente a la enfermedad humana, progresando desde neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN) hasta carcinoma invasivo. Es importante destacar que este modelo reproduce características clave del cáncer de páncreas, incluyendo un estroma desmoplásico denso y un microambiente tumoral inmunosupresor. Las células tumorales aisladas de ratones KPC (células derivadas de KPC) proporcionan un sistema complementario in vitro que conserva muchas de las características genéticas y fenotípicas de los tumores originales, permitiendo estudios mecanicistas y la evaluación controlada de las respuestas terapéuticas7,8.
VMP1 es una proteína esencial relacionada con la autofagia que inicia la autofagia mediante su interacción con Beclin-1 y la reclutación del complejo PI3KC39,10. Más allá de la iniciación, VMP1 participa en múltiples etapas de la autofagia, incluyendo la formación del autofagosoma10, el cierre11 y procesos selectivos como la mitofagia12 y la zimofagia13. VMP1 permanece involucrada durante todo el flujo autofágico y podría desempeñar funciones adicionales como una scramblasa de fosfolípidos14. En el páncreas, la expresión de VMP1 es típicamente baja, pero se induce fuertemente bajo condiciones de estrés, incluyendo pancreatitis y transformación oncogénica, donde promueve la autofagia en pasos posteriores a la señalización del KRAS mutante15,16. VMP1 está sobreexpresado en el cáncer de páncreas17, y modelos experimentales en ratón han demostrado que la autofagia dependiente de VMP1 coopera con KRAS para promover la iniciación tumoral y la formación de PanIN18. Además, VMP1 contribuye a la resistencia a la quimioterapia porque su regulación positiva por agentes como la gemcitabina19 estimula la autofagia19 y favorece la supervivencia de las células tumorales17, destacando así su papel protumorigénico15.
Los autofagosomas se caracterizan por la presencia de la proteína relacionada con la autofagia, la proteína ligada a microtúbulos 3 de cadena ligera (LC3)20. En condiciones basales, LC3 se encuentra predominantemente en una forma soluble (LC3-I) distribuida en todo el citoplasma y el núcleo. Tras la activación de la autofagia, LC3 sufre una lipidación mediante la conjugación con fosfatidiletanolamina, generando así la forma asociada a membranas LC3-II1,21. Aunque LC3-II tiene un peso molecular mayor que LC3-I debido a esta modificación, migra más rápidamente durante la electroforesis en SDS-PAGE, probablemente por su mayor hidrofobicidad. En consecuencia, la conversión de LC3-I a LC3-II refleja la lipidación y no un procesamiento proteolítico, siendo LC3-I detectado típicamente en aproximadamente 16 kDa y LC3-II en aproximadamente 14 kDa. Dado que los niveles de LC3-II se correlacionan con la abundancia de autofagosomas, la inmunodetección de LC3 se utiliza ampliamente para monitorear la actividad autofágica22. Por lo tanto, la evaluación precisa de la dinámica de LC3 es esencial para interpretar hallazgos experimentales relacionados con la autofagia.
Este estudio describe la estandarización y la optimización técnica de un protocolo clásico de inmunotransferencia para LC3 en una línea celular de cáncer de páncreas derivada de KPC. La optimización es particularmente importante porque LC3 es una proteína de bajo peso molecular, las formas LC3-I y LC3-II difieren únicamente en ~2 kDa en movilidad electroforética, y LC3-II es una especie lipídica21,22. Por consiguiente, variaciones menores en el procedimiento pueden comprometer la detección de LC3 y conducir a resultados subóptimos. Además, el origen de la especie de las muestras representa un factor importante para lograr una inmunorreactividad óptima. El protocolo optimizado es suficientemente sensible para detectar aumentos en los niveles de LC3-II tras el tratamiento con el agente quimioterapéutico gemcitabina y tras la inhibición de VMP1, condiciones que se sabe estimulan la autofagia y alteran el flujo autofágico, respectivamente. Finalmente, se destacan dos problemas técnicos potenciales para demostrar su impacto en la calidad de los datos y en la interpretación de los resultados. En Figura 1 se ilustra un resumen de este flujo experimental.
Figura 1: Representación esquemática del protocolo de inmunotransferencia de LC3 en células derivadas de KPC. Descripción general esquemática del protocolo utilizado para detectar y cuantificar los niveles de LC3-II mediante inmunotransferencia. Las células de cáncer pancreático derivadas de KPC se cultivan y someten a tratamientos experimentales, seguidos de lisis celular, cuantificación de proteínas, electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), transferencia a membrana, detección por anticuerpos de LC3, adquisición de señal quimioluminiscente y análisis densitométrico de las bandas de LC3-II normalizadas respecto a un control de carga. El flujo de trabajo destaca los pasos procedimentales principales y las etapas críticas necesarias para evaluar de forma confiable la dinámica de LC3. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocolo
Todos los procedimientos que involucraron animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Hospital General de Massachusetts bajo el protocolo #2019N000111. La línea celular de cáncer de páncreas derivada de KPC utilizada en este estudio fue establecida previamente en el laboratorio Mostoslavsky bajo este protocolo aprobado. La lista de reactivos, productos químicos e información de equipo se proporciona en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de células
- Siembre células tumorales pancreáticas derivadas de KrasG12D; Trp53f/+; p48-Cre (en adelante denominadas KPC) en una placa de 6 pocillos utilizando medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) que contenga 10% de suero bovino fetal, 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina. Ajuste la densidad de siembra para obtener una confluencia del 70%–90% el día de la lisis.
NOTA: Una densidad de siembra de 3,5 × 105 células por pocillo dio como resultado una confluencia de aproximadamente el 80% tras 72 h. Dado que el crecimiento puede variar entre laboratorios y modelos KPC, determine empíricamente la densidad de siembra óptima antes de realizar el experimento.
NOTA: Para generar líneas celulares estables con silenciamiento de VMP1, produzca partículas lentivirales mediante la co-transfección de células HEK293T con plásmidos de empaquetamiento y el vector lentiviral respectivo utilizando polietilenimina (PEI). Recoga los sobrenadantes lentivirales 72 h después de la transfección, centrifugue a 300 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar restos celulares y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm. Someta las células KPC a una única ronda de transducción con los sobrenadantes virales recolectados. Seleccione las células transducidas de forma estable mediante tratamiento con 2,5 µg/mL de puromicina (dilución 1:4.000 a partir de una solución madre de 10 mg/mL) durante 72 h. - Cultive las células a 37 °C en un incubador humedecido con 5% de dióxido de carbono (CO₂).
- Reemplace el medio por medio fresco y continúe la incubación en las mismas condiciones.
2. Tratamiento con gemcitabina 20 µM
- Prepare una solución de gemcitabina 10 mM en medio RPMI un día antes de la lisis. Trate cada pocillo con 4 µL de la solución 10 mM para obtener una concentración final de 20 µM.
- Incube las células durante 24 h a 37 °C en un incubador humedecido con 5% de dióxido de carbono (CO₂).
3. Lisados celulares
- Coloque la placa sobre hielo y lávela tres veces con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄ y 2 mM KH₂PO₄).
- Añada 80 µL de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 y 0.1% SDS) suplementado con inhibidores de proteasas.
NOTA: Si se observan diferentes niveles de confluencia entre los pocillos, ajuste el volumen del tampón de lisis para obtener concentraciones de proteína comparables. Como referencia, utilice ~10 µL de tampón de lisis por cada 10% de confluencia (por ejemplo, 70 µL para 70% de confluencia y 90 µL para 90% de confluencia). - Utilizando el extremo ancho (proximal) de la punta de una pipeta P200, raspe completamente toda la superficie de cada pocillo para desprender y recolectar las células en el tampón de lisis.
- Recoja el lisado en un tubo de microcentrífuga y manténgalo en hielo durante 15 min.
- Centrifugue las muestras a 16.900 × g a 4 °C durante 10 min.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio.
- Retire una alícuota para la cuantificación de proteína y manténgala en hielo hasta el análisis.
NOTA: Para la cuantificación de proteína, diluya 2,5 µL de lisado en 7,5 µL de tampón de lisis y mezcle con 200 µL del reactivo de ácido bicinconínico. También pueden utilizarse otros métodos alternativos de cuantificación de proteína. - Añada tampón de muestra 4× de Laemmli (250 mM Tris-HCl, pH 6.8, 8% SDS, 40% glicerol, 0,04% azul de bromofenol y 20% β-mercaptoetanol) a los lisados y mezcle completamente. Para 77,5 µL de lisado, añada 25,8 µL de tampón de muestra de Laemmli.
- Almacene las muestras a −80 °C.
NOTA: El protocolo puede interrumpirse en este paso. Las muestras pueden almacenarse a −80 °C durante hasta dos semanas antes de la SDS-PAGE.
4. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico e inmunotransferencia
- Calentar las muestras a 96 °C durante 5 min.
- Cargar 70 µg de cada muestra en un gel de SDS-PAGE al 15 % (espesor de 1,5 mm) y realizar la electroforesis a 90 V hasta que el frente de colorante entre en el gel de resolución. Utilizar un gel de resolución de poliacrilamida al 15 % preparado en casa que contenga acrilamida/bis-acrilamida al 15 %, Tris-HCl 375 mM (pH 8,8) y 0,1 % de SDS.
- Aumentar el voltaje a 120 V y continuar la electroforesis hasta que el frente de colorante alcance o salga por el fondo del gel. Detener la corrida antes de que el marcador de 10 kDa de la escalera de peso molecular salga del gel.
- Cortar el gel aproximadamente en 25 kDa para separar las porciones superior e inferior.
- Transferir las proteínas a una membrana de PVDF de 0,2 µm previamente activada con metanol en tampón de transferencia (25 mM de Tris base, 192 mM de glicina y 20 % [v/v] de metanol) a 200 mA durante 1 h para la porción inferior del gel (<25 kDa) y 2,5 h para la porción superior del gel (>25 kDa).
- Bloquear la membrana durante 1 h en tampón de bloqueo con agitación suave.
- Preparar una solución de anticuerpo primario anti-LC3 a 1:1.000 en tampón de bloqueo que contenga 0,1 % de Tween-20.
NOTA: El anticuerpo primario anti-LC3 se utilizó en una dilución de 1:1.000, y el anticuerpo de control de carga anti-actina se utilizó en una dilución de 1:4.000. - Incubar la membrana durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario anti-LC3 bajo agitación suave.
- Lavar la membrana cuatro veces durante 5 min con TBS-T (0,1 % de Tween-20 en TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, y 150 mM NaCl).
- Preparar una solución de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante a 1:2.000 en tampón de bloqueo.
- Incubar la membrana con el anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente bajo agitación suave.
- Lavar la membrana cuatro veces durante 5 min con TBS-T.
- Lavar la membrana dos veces con TBS.
5. Detección quimioluminiscente
- Prepare el sustrato quimioluminiscente mejorado de dos componentes mezclando volúmenes iguales del reactivo A (solución de luminol/mejorador) y el reactivo B (solución de peróxido) inmediatamente antes de usarlo.
- Retire suavemente el exceso de líquido de la membrana utilizando una toalla de laboratorio.
- Coloque la membrana dentro de una caja opaca.
- Agregue la solución quimioluminiscente mejorada a la membrana, cierre la caja e incube durante 5 min.
- Deje que escurra el exceso de solución de la membrana y coloque la membrana en el sistema de imagen para la detección de la señal.
- Adquiera las imágenes según las instrucciones del fabricante para el sistema de imagen.
6. Análisis densitométrico utilizando Fiji
- Arrastre y suelte el archivo de imagen en la ventana de Fiji para abrirla.
- Convierta la imagen a escala de grises de 8 bits (Imagen → Tipo → 8 bits).
- Si es necesario, gire la imagen para alinear las bandas horizontalmente (Imagen → Transformar → Girar).
- Habilite la vista previa y configure la cuadrícula con un número adecuado de líneas (por ejemplo, 20).
- Ajuste el ángulo de rotación hasta que las bandas estén correctamente alineadas.
- Utilice la herramienta de selección rectangular para definir una región de interés (ROI) alrededor de la primera banda, incluyendo únicamente la banda correspondiente a LC3-II.
NOTA: La selección no debe tener un ancho superior al doble de su altura. Utilice las mismas dimensiones de ROI para todas las bandas incluidas en el análisis. - Seleccione Analizar → Geles → Seleccionar primera banda.
- Mueva la misma ROI a la siguiente banda y colóquela alrededor de la banda correspondiente.
- Seleccione Analizar → Geles → Seleccionar banda siguiente.
- Repita los pasos 6.6 y 6.7 hasta seleccionar la banda final.
- Genere los perfiles de intensidad (Analizar → Geles → Trazar bandas).
- Utilice la herramienta de línea recta para definir la línea base de cada pico y cuantifique la intensidad de la banda usando la herramienta de varita mágica.
- Normalice los valores respecto a un control de carga.
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Resultados
Este protocolo describe la técnica de inmunotransferencia para monitorear la dinámica de LC3 en una línea celular de cáncer pancreático derivada de KPC bajo diferentes condiciones experimentales. El protocolo genera imágenes quimioluminiscentes de LC3 y de un control de carga. En este estudio, se utilizó actina como control de carga.
Se muestran dos aplicaciones representativas del protocolo. Primero, se compararon células KPC de control con células KPC tratadas con gemcitabina. La gemcitabina...
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Discusión
Este artículo describe la optimización técnica y la estandarización de un protocolo clásico de inmunodetección de LC3 en células de cáncer de páncreas derivadas de KPC. Dado el papel cada vez más reconocido de la autofagia y de las proteínas relacionadas con la autofagia en el desarrollo y progresión del cáncer de páncreas23, este flujo de trabajo estandarizado proporciona un enfoque confiable para monitorear la dinámica de LC3. El protocolo puede aplicarse para evaluar el depósito de autofagosoma...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no existen conflictos de interés.
Agradecimientos
This work was supported by grants from the Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) [PIP 2021–2023 GI-11220200101549CO], the Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, el Desarrollo Tecnológico y la Innovación (Agencia I+D+i) [PICT-2021-I-A-00328], the Universidad de Buenos Aires [UBACyT 2023–2025, 20020220300232BA], and the Fundación Norberto Quirno, Ciudad de Buenos Aires.
The authors gratefully acknowledge The Company of Biologists for financial support through a Traveling Fellowship awarded by Disease Models & Mechanisms. This support contributed to the work arising from the funded visit. Further information about the charity is available at https://www.biologists.com/.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Escáner C-DiGit Blot | LI-COR BioScience | 3600 | Utilizado para la detección quimioluminiscente en el paso 5.6 |
| Solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | Utilizada para preparar PBS 1x estéril para lavar las células antes del paseo en el paso 1.1. |
| 2-Mercaptoetanol (β-mercaptoetanol) | Sigma-Aldrich (Merck) | M3148 | Utilizado para preparar el tampón de muestra Laemmli 4× para la preparación de muestras para SDS-PAGE en el paso 3.8. |
| Agitador 3D | DLAB | SK-D1807-E | Utilizado para incubar las membranas en soluciones de bloqueo, anticuerpos primarios y secundarios, así como durante los pasos de lavado (pasos 4.6, 4.8, 4.9, 4.11, 4.12 y 4.13). |
| Placa de cultivo celular de 6 pocillos | SORFA | SCP-11-006 | Utilizada para sembrar células en el paso 1.1. |
| Acrilamida | Sigma-Aldrich (Merck) | A8887 | Utilizada para preparar el gel de SDS-PAGE al 15 % necesario para los pasos 4.2–4.5. |
| Anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, monoclonal de ratón, clon 6C5 | Merck Millipore | MAB374 | RRID:AB_2107445 Reactividad: humano, felino, cerdo, ratón, conejo, pez, canino, rata. Utilizado como control de carga para evaluar la eficiencia de silenciamiento (Figuras 2C y 2D). |
| Anticuerpo secundario anti-IgG de ratón, conjugado con HRP | Cell Signaling Technology | 7076 | RRID: AB_330924. Utilizado para preparar la solución de anticuerpo secundario en el paso 4.10. |
| Anticuerpo secundario anti-IgG de conejo, conjugado con HRP | Cell Signaling Technology | 7074 | RRID: AB_2099233. Utilizado para preparar la solución de anticuerpo secundario en el paso 4.10. |
| Anticuerpo anti-β-actina (ACTB), monoclonal de ratón, AC-15 | Sigma-Aldrich (Merck) | A1978 | RRID:AB_476744 Reactividad: oveja, carpa, felino, pollo, rata, ratón, Hirudo medicinalis, conejo, canino, cerdo, humano, bovino, cobaya. Utilizado como control de carga en las Figuras 2A, 2B, 2E, 2F, 2G y 2H. |
| Azul de bromofenol | Sigma-Aldrich (Merck) | B0126 | Utilizado para preparar el tampón de muestra Laemmli 4× para la preparación de muestras para SDS-PAGE en el paso 3.8. |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) | Sigma-Aldrich (Merck) | E9884 | Utilizado para preparar el tampón de lisis con bajo contenido de detergente (Figuras 2G y 2H). |
| Suero bovino fetal | NATOCOR | Lintc-634 | Utilizado para preparar el medio completo para el cultivo celular (pasos 1 y 2). |
| Fiji | Software de código abierto | N/A | Software para análisis de imágenes |
| Glicerol | Sigma-Aldrich (Merck) | G5516 | Utilizado para preparar el tampón de muestra Laemmli 4× para la preparación de muestras para SDS-PAGE en el paso 3.8. |
| Glicina | Sigma-Aldrich (Merck) | G7126 | Utilizada para preparar el tampón de transferencia en el paso 4.5. |
| Membrana PVDF Immun-Blot, rollo, 0,2 µm, 26 cm x 3,3 m | Bio-Rad | 1620177 | Utilizada para la transferencia en el paso 4.5. |
| Tampón de bloqueo Intercept (TBS) | LI-COR BioScience | 927-60001 | Utilizado para el bloqueo en el paso 4.6, y para preparar las soluciones de anticuerpos primarios y secundarios en los pasos 4.7 y 4.10. |
| Anticuerpo monoclonal de conejo LC3 A/B (D3U4C) | Cell Signaling Technology | 12741 | RRID: AB_2617131 Reactividad: humano, ratón, conejo. Utilizado para preparar la solución de anticuerpo primario en el paso 4.7. |
| Anticuerpo monoclonal de conejo LC3B (D11) | Cell Signaling Technology | 3868S | RRID: AB_2137707 Reactividad: Humano. Utilizado como anticuerpo primario LC3 en la Figura 2H. |
| Metanol | Anedra | 6197 | Utilizado para activar la membrana PVDF y preparar el tampón de transferencia en el paso 4.5. |
| Unidad de filtro de jeringa Millex-HV, PVDF 0,45 μm | Merck Millipore | SLHV033RS | Utilizada para filtrar el medio que contiene lentivirus (paso 1.1). |
| Baño seco digital mini | Labnet International, Inc. | D 5060075 | Utilizado para calentar las muestras en el paso 4.1. |
| Sistema de electroforesis Mini-PROTEAN Tetra | Bio-Rad | 1658025FC | Utilizado para SDS-PAGE y transferencia en los pasos 4.2, 4.3 y 4.5. |
| MISSION shRNA dirigida contra Vmp1 de ratón (TRCN0000279038) | Sigma-Aldrich (Merck) | SHCLND-NM_029478 | Utilizada para generar líneas celulares estables con silenciamiento de VMP1 (paso 1.1). |
| N,N'-Metilenbisacrilamida (Bis-acrilamida) | Sigma-Aldrich (Merck) | M7279 | Utilizada para preparar el gel de SDS-PAGE al 15 % necesario para los pasos 4.2–4.5. |
| Nabigem 1g Gemcitabina | Microsules Argentina | M3060584-3 | Utilizada para el tratamiento con gemcitabina en el paso 2. |
| Solución Pen-Estrepto (Pen-Strep) | Sartorius | 03-031-1B | Utilizada para preparar el medio completo para el cultivo celular (pasos 1 y 2). |
| Kit Pierce para ensayo de proteína BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Utilizado para la cuantificación de proteínas (paso 3.7). |
| Tabletas Pierce de inhibidores de proteasas | Thermo Fisher Scientific | A32953 | Utilizadas para preparar el tampón de lisis en el paso 3.2. |
| Clorhidrato de polietilenimina MAX, lineal (PEI MAX), PM 40.000 | Polysciences | 24765-1 | Utilizado para la transfección con plásmidos lentivirales (paso 1.1). |
| Cloruro de potasio (KCl) | Sigma-Aldrich (Merck) | P9333 | Utilizado para preparar PBS en el paso 3.1. |
| Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) | Sigma-Aldrich (Merck) | P5655 | Utilizado para preparar PBS en el paso 3.1. |
| Fuente de alimentación PowerPac Basic | Bio-Rad | 1645050 | Utilizada para SDS-PAGE y transferencia en los pasos 4.2, 4.3 y 4.5. |
| Escala de proteínas preteñida | Genbiotech | PM201 | Utilizada para SDS-PAGE en los pasos 4.2 - 4.4. |
| Puromicina (solución 10 mg/mL) | InvivoGen | ant-pr-1 | Utilizada para la selección de células transducidas de forma estable (paso 1.1). |
| RPMI 1640 | Genbiotech | MC2012L | Utilizado para preparar el medio completo para el cultivo celular (pasos 1 y 2). |
| Cloruro de sodio (NaCl) | Sigma-Aldrich (Merck) | S9888 | Utilizado para preparar PBS en el paso 3.1, los tampones de lisis en el paso 3.2 y TBS en el paso 4.9. |
| Dodecilsulfato de sodio (SDS) | Sigma-Aldrich (Merck) | L3771 | Utilizado para preparar el tampón de lisis en el paso 3.2 y el gel de SDS-PAGE al 15 % necesario para los pasos 4.2–4.5. |
| Fluoruro de sodio (NaF) | Sigma-Aldrich (Merck) | S7920 | Utilizado para preparar el tampón de lisis con bajo contenido de detergente (Figuras 2G y 2H). |
| Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich (Merck) | S9763 | Utilizado para preparar PBS en el paso 3.1. |
| Centrífuga Sorval ST 16R | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | Utilizada para centrifugar células en el paso 1.1 y lisados en el paso 3.5. |
| Sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico PLUS | Thermo Fisher Scientific | 34577 | Utilizado para la detección quimioluminiscente en el paso 5.1. |
| Cabina de seguridad biológica Thermo Scientific 1300 Series A2, Tipo A2 | Thermo Fisher Scientific | 1386 | Utilizada para el manejo estéril de cultivos celulares en los pasos 1.1, 1.3 y 2.1. |
| Incubadora de CO2 Thermo Scientific BB 150 | Thermo Fisher Scientific | BB150-2TCS-L | Utilizada para el cultivo celular en los pasos 1.2 y 2.2. |
| Anticuerpo monoclonal de conejo TMEM49/VMP1 (D1Y3E) | Cell Signaling Technology | 12929 | RRID: AB_2714018 Reactividad: humano, ratón, rata. Utilizado como anticuerpo primario para verificar la eficiencia de silenciamiento de VMP1 en las Figuras 2C y 2D. |
| Tris base | Sigma-Aldrich (Merck) | T1503 | Utilizado para preparar el tampón de transferencia en el paso 4.5. |
| Clorhidrato de Tris (Tris-HCl) | Sigma-Aldrich (Merck) | T3253 | Utilizado para preparar los tampones de lisis en el paso 3.2, el tampón de muestra Laemmli 4× en el paso 3.8, el gel de SDS-PAGE al 15 % necesario para los pasos 4.2–4.5, y TBS en el paso 4.9. |
| Tritón X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | T8787 | Utilizado para preparar los tampones de lisis en el paso 3.2. |
| Tripsina EDTA | Gibco | 11570626 | Utilizada para el paseo celular en el paso 1.1. |
Referencias
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