Generación transmitocondrial de cíbridos a partir de plaquetas de pacientes con ADNmt: un protocolo eficiente que optimiza la selección de colonias y la validación funcional

Resumen

Describimos un protocolo optimizado de generación de cíbridos transmitocondriales a partir de plaquetas de pacientes con ADNmt, haciendo hincapié en los parámetros de crecimiento y el aislamiento de colonias. Este enfoque permite estudiar variantes del ADN mitocondrial a niveles variables de heteroplasmia en un fondo nuclear común para cuantificar su importancia funcional en la cadena de transporte de electrones, actividades enzimáticas y capacidad respiratoria integrada.

Resumen

La generación de líneas celulares transmitocondriales de cíbridos representa el método estándar de oro para determinar la patogenicidad permitiendo análisis bioquímicos de una variante específica del ADN mitocondrial (ADNmt) de interés en porcentajes altos y bajos (niveles de heteroplasmia) dentro de un fondo de ADNmtm y genoma nuclear idéntico. Históricamente, el proceso de generación de cybridos ha sido tedioso y poco eficiente. Aquí describimos un protocolo altamente eficiente y eficaz para generar líneas celulares de cíbridos transmitocondriales fusionando plaquetas humanas con una línea celular estándar de osteosarcoma 143B para proporcionar un fondo nuclear isogénico agotado de ADNmt (células Rho⁰ ). Los aislados celulares capturan un genoma de ADNmt dado de interés para establecer líneas celulares estables que albergan diferentes grados de heteroplasmia, o para comparar efectos divergentes de haplogrupos mitocondriales distintos. Dado que los cíbridos de pacientes mitocondriales pueden ser más difíciles de establecer con protocolos estándar, esta metodología actual se centra en aislar variantes del ADNmt donde se ve afectada la actividad de la cadena de transporte de electrones. Aquí demostramos que las técnicas de selección de colonias reducen el tiempo y mejoran el rendimiento de la generación de líneas mutantes de cybridos mutantes de heteroplasmia de alto nivel. Se proporciona un estudio de caso sobre la generación de cibridos para una variante de importancia desconocida en MT-ND1, m.3985G>A (p.E227K). Analizamos la eficiencia del proceso de generación de cíbridos utilizando este protocolo y realizamos estudios funcionales realizados mediante respirometría de alta resolución. Los mutantes cíbridos de heteroplasia de alto nivel MT-ND1 m.3985G>A generados por este protocolo muestran una respiración mitocondrial dependiente de I complejo deteriorada en comparación con el control tipo salvaje, lo que demuestra que m.3985G>A es probablemente patógeno.

Introducción

Establecer la patogenicidad de las mutaciones del ADN mitocondrial (mtDNA) es complicado debido a su rareza, heteroplasmia que implica niveles variables de genomas de ADNmt mutado y de tipo salvaje en diferentes tejidos, diversos mecanismos fisiopatológicos y complejas interacciones con antecedentes genómicos^nucleares 1,2,3,4 . Por estas razones, las líneas celulares de cíbridos transmitocondriales siguen siendo el método estándar de oro para establecer la patogenicidad de variantes del ADNmt, donde los "cíbridos" representan la fusión del núcleo de una célula con las mitocondrias^{de otra célula} 5,6,7,8,9,10 (Figura 1 ). Las líneas celulares de los cibridos contienen un fondo nuclear isogénico y mitocondrias con un porcentaje especificado de heteroplasmia para la variante mtDNA bajo el estudio^11,12. De este modo, se pueden realizar ensayos funcionales como la respirometría (por polarografía) o los ensayos de actividad enzimática de transporte electrónico (por espectrofotometría) en líneas cíbridas que varían entre 0% y 100% de heteroplasmia para determinar los posibles efectos patógenos de una variante dada del ADNmt, así como la influencia relativa de los haplogrupos mitocondriales que pueden diferir entre las líneas^{cíbridas 1}. Otros tipos celulares pueden usarse para estudiar la patogenicidad y son mejor para complementar la generación de cibridos y el análisis funcional, ya que cada tipo celular tiene sus propias ventajas y desventajas. Los fibroblastos del paciente se originan directamente en el paciente, pero están limitados en la heteroplasmia heredada y carecen de un control nuclear isogénico que elimine los efectos génicos nucleares. La edición de mtDNA está ganando popularidad, pero sufre de una edición fuera de objetivo y de sitios editables limitados en^{mtDNA 13}. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden diferenciarse para estudiar el efecto de una mutación en diferentes tipos celulares, como neuronas y ganglionares retinianos, pero la inducción de pluripotencia puede provocar la pérdida de la variante de ADNmt de interés o resultar en variantes de novo adicionales¹⁴. El estudio de Cybrid implica la generación de un sistema más artificial basado en un fondo nuclear de línea celular cancerosa (clásicamente osteosarcoma 143B), pero que clásicamente crece bien, lo que lo hace susceptible de ser utilizado en estudios de cribado de alto rendimiento de intervenciones candidatas. Las limitaciones para la generación de cíbridos a niveles de heteroplasia altos incluyen la calidad plaquetaria, la heteroplasma inicial y las desventajas selectivas de las mitocondrias mutantes, que se discuten en profundidad en este protocolo.

Aunque la generación de cibridos es el estándar de oro para la determinación funcional de la patogenicidad de variantes del ADNmt, pocos laboratorios generan cíbridos para el estudio de la enfermedad mitocondrial 9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. Más bien, se generan más cíbridos para estudiar el cáncer y el envejecimiento^28,29. Aquí, utilizamos un caso de caso de paciente sospechoso de enfermedad mitocondrial para demostrar estrategias de optimización desarrolladas para facilitar la generación de cíbridos a partir de plaquetas de pacientes con ADNmt, incluyendo procesos de selección y preparaciones celulares necesarias para establecer líneas celulares de cybridos con niveles altos frente a bajos de heteroplasmia para la variante de ADNmt objetivo. Concretamente, demostramos la metodología para generar líneas celulares de cibridos para una subunidad compleja I (CI) variante MT-ND1 m.3985G>A, en la que realizamos estudios bioquímicos que demuestran la naturaleza patogénica de esta variante. La Figura 2 muestra la línea temporal para la generación de cíbridos, donde los principales pasos metodológicos incluyen métodos de fusión, selección y aislamiento para obtener colonias distintas.

Protocolo

Las plaquetas sanguíneas se obtuvieron según el estudio IRB 08-6177 del Hospital Infantil de Filadelfia (CHOP).

1. Preparación de plaquetas

1. Día 1: Extraer sangre en tubos de citrato y dextrosa al extraer.
   NOTA: Se debe colocar sangre en el rotador inmediatamente. Idealmente, las plaquetas se extraen como máximo 4 horas después de la extracción de sangre.
2. Anota el volumen de la sangre. Se recomienda un volumen de 5–6 mL de sangre.
3. Centrifuga la sangre a 200 × g durante 20 minutos a 12 °C.
   NOTA: La centrifugación a 12 °C preserva la integridad de la muestra y previene la activación de plaquetas.
4. Transfiere el sobrenadante (plasma) a un nuevo tubo centrífuga.
5. Registra el volumen del plasma.
6. Centrifuga el plasma a 1500 × g durante 20 minutos a 12 °C.
7. Registra el volumen estimado de los pellets de plaquetas.
   NOTA: Demasiadas plaquetas pueden ser engorrosas en este protocolo. Tras la fusión, al emplacar las células Rho⁰ y plaquetas, un exceso de plaquetas puede adherirse al fondo del matraz y evitar la adherencia de las células Rho⁰ . Se recomienda utilizar menos de 50 μL del volumen de plaquetas en pellets para la fusión. El exceso de plaquetas puede congelarse dividiéndolas en los siguientes pasos.
8. Quita el sobrenadante.
   NOTA: Si el pellet es grande, la extracción puede realizarse por aspiración. A veces, las plaquetas de los pacientes se reducen drásticamente y no son muy pegajosas. Si es así, usa una pipeta para retirar el plasma poco a poco.
9. Si continúas con plaquetas frescas, resuspende el pellet en 1 mL de modificación spinner del medio esencial mínimo de Eagle (SMEM), y transfiere a un tubo microcentrífuga.
10. Si se congela, resuspende el pellet (plaquetas) en 1,05 mL de SMEM y 450 μL de solución congelante de plaquetas (350 μL de suero fetal bovino [FBS] + 100 μL de dimetilsulfóxido [DMSO]).
    NOTA: Algunas plaquetas del paciente no son estables durante el procedimiento de congelación, y no se puede obtener un cybrido mutante alto tras congelarla. Se recomienda usar la preparación fresca.
11. Si las células Rho⁰ no están listas a tiempo, coloca las plaquetas a 37 °C con suaves agitaciones a 60 rpm.
    NOTA: En última instancia, es mejor sincronizar las plaquetas y las células Rho⁰ para que estén listas al mismo tiempo. No se recomienda esperar más de 2 horas.

2. Preparación de las celdas Rho ⁰

1. Utiliza células de osteosarcoma 143B recién descongeladas Rho⁰ o células Rho⁰ que estaban creciendo cerca de la confluencia.
   NOTA: Se recomienda usar células Rho⁰ que estaban creciendo en la incubadora hasta casi la confluencia. Se pueden usar células Rho⁰ recién descongeladas, y se recomienda usar un vial congelado de células Rho⁰ con alta densidad celular. Deja que las células se unan durante dos o más horas antes de la fusión.
2. Lava el matraz T75 con 5 mL de PBS.
3. Añade 1 mL de tripsina-EDTA 0,25% para cubrir las células Rho⁰ .
4. Incuba durante 5 minutos a 37 °C.
5. Después de balancear el matraz, lava el fondo con 5 mL de SMEM.
6. Recoge las células Rho⁰ en un tubo cónico de 15 mL.
7. Centrifugar a 200 × g durante 5 minutos para concentrarse y medir el recuento celular.
8. Retira el sobrenadante y vuelve a suspender 1 mL de SMEM.
9. Cuenta las células.
   NOTA: Idealmente, debería haber 1,5 millones de células para cada fusión; sin embargo, las fusiones exitosas se han realizado con tan solo 30.000 células.
10. Alicuota 1,5 millones de celdas en 1,5 tubos de microcentrífuga y eleva el volumen a 1 mL.
    NOTA: Asegúrate de tener un tubo extra de "fusión simulada". Este tubo solo contendrá celdas Rho⁰ y se utilizará para ayudar a guiar el proceso de selección.
11. Centrifuga las plaquetas a 1700 × g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Las células Rho⁰ son sensibles a la temperatura fría.
12. Retira el sobrenadante de las plaquetas.
13. Añade 1 mL de células Rho⁰ encima del pellet de plaquetas.
14. Centrifuga las células Rho⁰ y las plaquetas a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.

3. Fusión

1. Retira el sobrenadante de las células Rho⁰ y del pellet de plaquetas.
2. Añade 150 μL de tampón de fusión (50% polietilenoglicol [PEG]/10% DMSO) y tritura durante 90 segundos para resuspender.
   NOTA: Algunos pellets son bastante pegajosos y necesitan ser removidos y desmontados manualmente además de pipetear hacia arriba y hacia abajo. Anota si la cápsula estaba pegajosa.
3. Añade 12 mL de medio Cybrid (DMEM) + 10% FBS + 50 μg/mL uridina a un matraz de T75.
4. Añade 1 mL de plaquetas fusionadas y las células Rho⁰ al frasco.
5. Las células se incuban a 37 °C con un 5% de CO₂ en alta humedad.
   NOTA: Todos los pasos de crecimiento celular se realizan bajo estas condiciones.

4. Crecimiento

1. Día 2: Retirar el medio Cybrid y añadir 12 mL frescos de medio Cybrid + 10% FBS + 50 μg/mL uridina.
   NOTA: Las células Rho⁰ tardan aproximadamente una semana en incorporar el ADNmt.
2. Día 5: Retirar el medio Cybrid y añadir 12 mL frescos de medio Cybrid + 10% FBS + 50 μg/mL de uridina.
   NOTA: Si las células Rho⁰ están en confluencia del 80%, divide las células en dos frascos.

5. Selección

1. Día 8: Retira el medio y lava las células con 5 mL de PBS.
2. Quita PBS y añade 1 mL de tripsina.
3. Cubre el fondo del matraz con tripsina e incuba durante 5 minutos a 37 °C.
4. Añade 5 mL de medio Cybrid + 10% FBS + 50 μg/mL uridina.
5. Cuenta las células.
   NOTA: La selección debe comenzar en una confluencia del 10%, que son 125.000 células en una placa de Petri tratada con T75 o cultivo de tejidos. Se recomienda usar placas de Petri si se prefiere el método de recogida de colonias. Usa un T75 si usas el método de dilución.
6. Añade 125.000 celdas al recipiente correspondiente y el resto del volumen hasta 12 mL con medio de selección (DMEM).
   NOTA: El medio de selección está diseñado para separar células 143B fusionadas con mitocondrias de las células Rho⁰ . Las células Rho⁰ requieren piruvato y uridina para sobrevivir. La FBS dializada no contiene piruvato ni uridina y solo debe usarse para la selección. Utiliza dos medios de selección diferentes si es posible. Uno debería ser 10% diálisis de FBS y el otro menos restrictivo para el crecimiento, como 20% FBS dializado + 50 μg/mL uridina. Se sugiere un medio de selección menos restrictivo en paralelo para mutantes graves.
7. Congelar las células restantes en dos crioviales con 1 mL de solución congelante cada una.
   NOTA: Estas son celdas de preselección, y se pueden probar diferentes selecciones más adelante.
8. Cambia de medio cada dos días durante aproximadamente una semana.
   NOTA: Las células Rho⁰ flotarán cuando mueran y se irán arrastrando tras el cambio del medio. Utiliza las células de fusión "simuladas" para determinar cuándo la selección está completa (no hay más celdas en el matraz). Este matraz quedará completamente vacío porque todas las celdas Rho⁰ habrán sido arrastradas. Es buena idea esperar un día más, incluso cuando el termo simulado esté vacío, porque las células fusionadas pueden proporcionar los nutrientes del medio para ayudar a que otras células Rho⁰ persistan en el matraz. Si las células crecen hasta más del 20% de confluencia, se escárdelas y se replacan. Más crecimiento enmascara la selección.

6. Método de selección de colonias y crecimiento

1. Haz crecer las colonias hasta que sean visibles a simple vista con medio Cybrid + 20% FBS + 50 μg/mL de uridina.
   NOTA: Inclina el plato y sujétalo hacia la luz. Las colonias aparecen como círculos nublados. Bajo el microscopio, no debería haber muchas células de fondo entre las colonias.
2. Rodea colonias independientes que no se solapen con un marcador en la parte inferior del frasco mientras las sostienes hacia la luz.
3. Utiliza un P20 para raspar (perturbar mecánicamente las células unidas al fondo del matraz) y aspirar 20 μL al mismo tiempo dentro del círculo dibujado para colocar las células de la colonia seleccionada en la punta del P20.
   NOTA: El raspado manualmente desprende las celdas y al extraer 20 μL se recogen las celdas de la punta de la pipeta.
4. Coloca cada colonia en su propio pozo en una placa de 96 pozos.
   NOTA: La ventaja de este método es que las células 143B tienden a crecer bien juntas, por lo que no debería haber problemas para crecer y obtener resultados más rápidos. La desventaja es que se podría tener una población mixta.

7. Método de crecimiento por dilución

1. Cuando las células alcanzan el 75% de confluencia en medios Cybrid + 20% FBS + 50 μg/mL de uridina, lava las células con 5 mL de PBS.
2. Quita PBS y añade 1 mL de tripsina.
3. Cubre el fondo del matraz con tripsina e incuba durante 5 minutos a 37 °C.
4. Añade 5 mL de medio Cybrid + 20% FBS + 50 μg/mL uridina.
5. Cuenta las células.
6. Añadir 1 × 10⁵ células en 20 mL de medio Cybrid + 20% FBS + 50 μg/mL uridina a 50 mL de tubo cónico 1.
   NOTA: Esto equivale a 5000 celdas/mL, lo que equivaldrá a 500 celdas en 100 μL cuando se placa en una placa de 96 pozos.
7. Prepara un tubo cónico de 50 mL con una dilución de 100 veces (200 μL del tubo 1 en 20 mL de medio Cybrid + 20% FBS + 50 μg/mL uridina).
   NOTA: Esto equivale a unas 5 celdas por pozo.
8. Prepara un tubo cónico 3 de 50 mL con una dilución 1:1 (10 mL del tubo 2 en 10 mL de medio Cybrid + 20% FBS + 50 μg/mL uridina).
   NOTA: Esto equivale a unas 2,5 celdas por pozo.
9. Preparar un tubo cónico 4 de 50 mL con una dilución 1:1 (10 mL del tubo 3 en 10 mL de medio Cybrid + 20% FBS + 50 μg/mL uridina).
   NOTA: Esto equivale a aproximadamente 1 celda por pozo.
10. Tubos de placas 2, 3 y 4 en placas de 96 pozos con 100 μL cada una.
    NOTA: Asegúrate de mezclar las células antes de emplatar. Es difícil comprobar el mismo día si hay una celda en cada pozo porque las celdas necesitan hundirse en el fondo y unirse. La ventaja de este método es que una sola célula crece hasta convertirse en una colonia, asegurando la ausencia de un fondo mixto. La desventaja es que los mutantes severos pueden no sobrevivir si están aislados.
11. Al día siguiente, tacha pozos que claramente tengan más de una celda por pozo.
12. Después de unos días, revisa los pozos de nuevo.
    NOTA: Ahora debería haber colonias, y es más evidente si hay células individuales cerca de los bordes de los pozos. Si hay más de una colonia, elimina esos pozos. Si no hay celda, quita el pozo.

8. Crecimiento

1. Empieza en la placa de 96 pozos y transfiere las celdas a placas más grandes paso a paso según sea necesario.
   NOTA: Estas células tienden a crecer mejor con alta densidad celular, y no transferir suficientes células podría causar la muerte. Siempre guarda la placa anterior con algunas celdas y marca de dónde vino el pozo para que siempre puedas volver atrás si hace falta. Es importante destacar que las células 143B mueren y se desprenden si se sobreconfluyen, así que revisa estas células todos los días.

9. Confirmación genética

1. Centrifuga las celdas aliquotadas a 450 ×g durante 5 minutos.
2. Elimina los medios.
3. Añadir 5 μL de buffer de extracción de ADN (50 mM NaOH).
   NOTA: Este número puede cambiar si hay muchas células. Los pellets celulares significativos pueden estar en 10 μL de tampón.
4. Incuba a 95 °C durante 30 minutos.
5. Añadir un volumen equivalente de tampón de estabilización de ADN (0,1 M Tris-HCl; pH 8) al tampón de extracción.
6. Realiza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según las directrices de la enzima.
   NOTA: Algunos mutantes puntuales pueden usar enzimas de restricción para distinguir entre células de control y células del paciente. Otras mutaciones puntuales no pueden distinguirse y requieren secuenciación. En este caso, es importante utilizar mezclas PCR sin tintes para obtener resultados de alta calidad. Se pueden utilizar secuenciación Sanger y secuenciación de próxima generación. 2,5 μL de ADN son suficientes para una reacción de 25 μL.
7. Utiliza amplicones de PCR específicos para esta mutación para la secuenciación de Sanger.
   NOTA: Los amplicones PCR se enviaron para la secuenciación de Sanger. Se confirmó el nivel de heteroplasmia de mutación tanto tras la expansión del clon como tras el análisis funcional.

10. Respirometría de alta resolución usando respirometría de alta resolución

1. Realizar la calibración del aire según las directrices del respirómetro (por ejemplo, Oroboros Instruments).
2. Lava los cybridos en un matraz T75 con PBS.
   NOTA: Las células no deben estar sobreconfluentes; Lo ideal es un 70%–80% de confluente.
3. Añade 1 mL de tripsina e incuba durante 4 minutos.
4. Añade 5 mL de medio Cybrid y cuenta las células.
5. Añade 500.000 celdas a un tubo para centrifugar a 450 × g durante 5 minutos.
   NOTA: El número de celdas y volúmenes del respirómetro están en la cámara de 0,5 mL.
6. Lava las pilas resuspendiéndolas con PBS y vuelve a centrifugar.
7. Resuspende las células en 510 μL de tampón MiR05 y añade a una cámara vacía.
8. Tras la estabilización, añadir 0,65 μL de digitonina (50 mg/mL), 0,8 μL de malato (2,5 M) y 2 μL de piruvato (2,5 M).
   NOTA: Antes de añadir la digitonina, aquí es donde se realiza la medición de la respiración basal. Se deben realizar todos los pasos posteriores tras la estabilización.
9. Añadir 12 μL de adenosina difosfato (ADP) (0,25 M).
10. Añade 4 μL de glutamato (2,5 M).
11. Añade 12 μL de succinato (1,25 M).
12. Añade 1 μL de oligomicina (1 mg/mL).
13. Añadir 1 μL de cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona [FCCP] (0,2 mM).
    NOTA: Titula con múltiples añadidos hasta que no se observe más aumento (normalmente 3–5).
14. Añade 1 μL de rotenona (2 mM).
15. Añade 1 μL de antimicina A (1 mg/mL).
16. Añadir 0,5 μL de ascorbato (0,8 M) y 0,5 μL de tetrametilfenilendiamina [TMPD] (0,2 M).
17. Abre la cámara con un separador durante 20 minutos.
18. Cierra la cámara y estabiliza durante 5 minutos.
19. Añadir 22,5 μL de azida (4 M).
20. Recoge células para cuantificación de proteínas utilizando un kit de ensayo de ácido bicincónico (BCA).
21. Realizar cálculos tras estabilizar la tasa de consumo de oxígeno y normalizar por proteína. La respiración basal es la tasa estabilizada de consumo de oxígeno tras la adición de células a la cámara.
    NOTA: Todas las demás mediciones se realizan después del sustrato o inhibidor indicado.
22. Calcular_{el IC} de OXPHOS: (glutamato-antimicina A)/(FCCP-antimicina A).
23. Calcular_{OXPHOS CI+CII}: (Succinato-Antimicina A)/(FCCP-Antimicina A).
24. Calcular ETS_CI+CII: (FCCP-Antimicina A).
25. Calcular ETS_CII: (Rotenona-Antimicina A)/(FCCP-Antimicina A).
26. Calcular_CI+CII de fuga: (Oligomicina-Antimicina A)/(FCCP-Antimicina A).
27. Calcular_{OXPHOS CIV}: (TMPD/ASC-Azida)/(FCCP-Antimicina A).
28. Utiliza al menos 4–6 réplicas biológicas para mediciones de respirometría.

Resultados

Para demostrar diferencias metodológicas y el camino hacia la optimización del protocolo, presentamos los resultados de la generación de cibridos de un paciente con sospecha de enfermedad mitocondrial que alberga una variante de significado desconocido (VUS) en MT-ND1 del complejo I (IC) en la cadena de transporte de electrones. Tras la secuenciación clínica del genoma de nueva generación de ADNMT en múltiples tejidos en dos laboratorios diagnósticos clínicos aprobados por CLIA ...

Discusión

Aquí presentamos un protocolo altamente eficiente para la generación de líneas celulares de cíbridos transmitocondriales a partir de plaquetas de pacientes con ADNmt. Demostramos la aplicabilidad con un estudio de caso de una variante MT-ND1 de importancia incierta, la importancia de considerar cuidadosamente los parámetros de crecimiento y selección. Una vez optimizados estos problemas principales, se seleccionará con éxito los cibridos que albergan variantes del ADNmt que pued...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Ascorbato	Sigma Aldrich	11140-250G
Azide	Sigma Aldrich	S2002-100G
FBS dializado	Fisher Scientific	35071CV
Digitonina	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	Medio Cybrid
DMEM	Corning	10-017-CM	Medio de selección
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Glutamato	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	búfer de fusión
Malato	Sigma Aldrich	M1000-100G
Búfer MiR05	Oroboros Instruments	60101-01
Respirometro O2K	Oroboros Instruments	C-0050
Oligomicina	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Piruvato	Sigma Aldrich	P2256-100G
Rotenona	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Succinato	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Trypsina-EDTA 0.25%	Thermo Scientific	25200056
Uridina	Sigma Aldrich	U3750-25G