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Artículo de método

Un modelo ratón ex vivo para inflamación del tejido adiposo con una dieta alta en grasas

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DOI:

10.3791/71651

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14 de julio de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Anatomy, Leipzig University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Utilizando un modelo explantado ex vivo , se cultivan pequeños fragmentos de la porción rostral del tejido adiposo visceral blanco de ratones magros durante 7–10 días, lo que permite inducir y estudiar la inflamación del tejido adiposo a medida que ocurre durante la alimentación rica en grasas.

Resumen

Este protocolo describe un modelo ratón ex vivo que recapitula características celulares e inflamatorias seleccionadas observadas en el tejido visceral adiposo (VAT) tras la alimentación con dietas ricas en grasas (HFD), sin intervención dietética in vivo. Pequeños explantaciones de IVA de ratones magros se cultivan durante 7–10 días, durante los cuales desarrollan espontáneamente un fenotipo inflamatorio que se asemeja mucho al del IVA de animales alimentados con ICD. Es importante destacar que el modelo preserva la arquitectura del tejido adiposo (AT), permitiendo la investigación de procesos inflamatorios en un contexto fisiológicamente relevante. Durante el cultivo, emergen signos clave de inflamación relacionada con la obesidad, incluyendo la formación de estructuras en forma de corona (CLS), la acumulación de macrófagos (MMes) metabólicamente activados y el aumento de la producción de citoquinas inflamatorias. A pesar de la muerte de los adipocitos, otros factores que impulsan la inflamación relacionada con la obesidad, incluyendo factores metabólicos estresantes como ácidos grasos saturados, alteración del manejo de los lípidos, exceso de glucosa, estrés oxidativo, hipoxia, desequilibrio de adipoquinas y señalización paracrina adipocito-célula inmunitaria, pueden representarse parcialmente en el modelo. El sistema soporta una amplia gama de aplicaciones posteriores, incluyendo imágenes en vivo, citometría de flujo, PCR cuantitativa, ELISA, inmunotinción y secuenciación de ARN a granel o unicelular. Además, se pueden aplicar tratamientos farmacológicos y basados en citocinas para investigar las vías de señalización y las respuestas específicas de tipo celular. Este modelo fácilmente personalizable se alinea con los principios de las 3R al reducir el uso de animales en estudios dietéticos in vivo . El modelo es reproducible, rentable y sencillo de implementar, proporcionando una plataforma versátil para estudiar la muerte de adipocitos, la dinámica de las células inmunitarias y las estrategias terapéuticas en la inflamación de AT.

Introducción

El tejido adiposo (AT) es un órgano metabólicamente activo compuesto aproximadamente por un 20% de adipocitos y una mezcla heterogénea de células inmunitarias, fibroblastos, células progenitoras y células vasculares enhumanos 1. La AT se clasifica en tejido adiposo blanco unilocular (WAT), tejido adiposo marrón multilocular (BAT) y tejido adiposo beige intermedio, reflejando heterogeneidad en composición, función y ubicación anatómica. La WAT se distribuye entre depósitos subcutáneos (SCAT), viscerales (VAT), perivasculares y de médula adiposa, que difieren en origen del desarrollo, perfiles de expresión génica y función metabólica. Más allá de su papel en el almacenamiento de lípidos, la AT funciona como órgano endocrino al secretar citocinas, hormonas yadipoquinas 2. En comparación con SCAT, el IVA es más metabólicamente activo y enriquecido en células inflamatorias, lo que lo hace especialmente relevante para estudios sobre la inflamación de la AT y enfermedades metabólicas como la diabetestipo 2 3,4,5.

La AT es un regulador clave de la salud metabólica y desempeña un papel central en la obesidad, que está asociada a numerosas comorbilidades. La obesidad favorece la hipertrofia de los adipocitos, la hiperplasia y laproliferación 6, mientras que la expansión e inflamación de la AT se correlacionan fuertemente con la hiperglucemia, la hiperinsulinemia, la hipertrigliceridemia y la tolerancia a laglucosa deteriorada 3. Se presume que la expansión de la AT va acompañada de un aumento de la muerte de los adipocitos, con aproximadamente un 10% de renovación celular anual7, lo que desencadena el reclutamiento de macrófagos esencial para la limpieza y remodelacióntisular 8. Dado que los adipocitos son sustancialmente más grandes (100–200 μm) que los macrófagos, la fagocitosis eficiente por estas células, aproximadamente cinco veces más pequeñas, es un reto, lo que afecta la homeostasis tisular y promueve una inflamación crónica de laAT 9. Los macrófagos del tejido adiposo (ATMs) median la eliminación de adipocitos moribundos de gran tamaño, ya sea fusionándose en células gigantes multinucleadas (MGCs) o formando estructuras en forma de corona (CLS) alrededor de los adipocitos muertos y degradándolos mediante exocitosislisosomal 10,11,12. La abundancia de CLS se correlaciona con la inflamación asociada ala obesidad 11,13.

En la AT saludable, los cajeros automáticos son predominantemente macrófagos antiinflamatorios similares a la M2, mientras que la obesidad favorece un cambio hacia un fenotipo proinflamatorio similar alM1 14,15. Surgen subconjuntos de macrófagos mecánicamente distintos adicionales, incluyendo macrófagos metabólicamente activados (MMes) y macrófagos asociados a lípidos (LAMs), que desempeñan papeles importantes en la eliminación de adipocitos muertos mediante exocitosislisosomal 16,17,18.

Para investigar la inflamación de la AT en un entorno multicelular fisiológicamente relevante, el protocolo estableció un modelo ratón ex vivo basado en cultivos organotípicos explantados de IVA derivados de ratones magros. Los explantaciones de IVA cultivadas durante 7–10 días desarrollan un fenotipo inflamatorio comparable al observado tras al menos 12 semanas de alimentación con alta contenido en grasas (HFD) en relación con la formación de CLS, el fenotipo de macrófagos y la producción de citoquinasinflamatorias 9,19. Es importante destacar que este enfoque reduce el uso de animales, elimina la necesidad de aprobaciones de intervenciones dietéticas y contribuye a los principios de las 3R al reducir la dependencia de estudios de intervención dietética a largo plazo. En comparación con los sistemas convencionales de cultivo celular bidimensional (2D), como los modelos de cultivo unicelular (por ejemplo, células 3T3-L1 o cultivos primarios de adipocitos), este método preserva la complejidad tisular y la diversidad celular, permitiendo así investigar las interacciones fisiológicas célula-célula, incluidas las entre células inmunitarias y adipocitos.

Los explantaciones de AT cultivadas son compatibles con una amplia gama de enfoques analíticos. La imagen confocal en vivo permite monitorizar la acumulación de ATM, la formación de CLS y la formación deMGC 9,19. La digestión con colagenasa permite aislar la fracción vascular estromal (SVF) para análisis citométricos de flujo, incluyendo ensayos de proliferación y la determinación de losfenotipos 12 tipo M1, M2 o MMe. Los análisis de expresión génica, incluyendo PCR cuantitativa (qPCR) y secuenciación de ARN, pueden realizarse en explantas completas, células SVF o macrófagosclasificados 9. La expresión de proteínas y la actividad enzimática pueden evaluarse mediante Western blot o ELISA12,20,21, mientras que la arquitectura tisular y la expresión de marcadores pueden visualizarse mediante tinción de montaje completo e inmunofluorescencia 9,22. Además, las intervenciones farmacológicas y genéticas, incluyendo el agotamiento de ATM y el tratamiento con citocinas, son fácilmente factibles 21,23,24.

En resumen, este modelo ratón ex vivo de inflamación AT similar a la AT permite investigar la muerte de adipocitos, la observación directa in situ del comportamiento celular y manipulaciones farmacológicas o genéticas relevantes para la inmunología de la AT (Figura 1).

figure-introduction-1
Figura 1: Resumen gráfico del flujo de trabajo. El tejido adiposo visceral (AT) se aísla de ratones, se corta en pequeños explantes y se cultiva durante 7–10 días. Durante el periodo de cultivo, los explantes desarrollan un fenotipo inflamatorio, lo que permite el estudio de la inflamación del tejido adiposo bajo condiciones controladas ex vivo . Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Protocolo

Los experimentos con animales se realizaron conforme a las directrices institucionales y nacionales y fueron aprobados por las autoridades reguladoras correspondientes. Csf1r-eGFP-Adipoq-ERT2-Cre-CAG-tdRatones de tomate ("MacFat", RRID: Csf1r-eGFP: RRID:IMSR_JAX:018549, Adipoq-iCreERT2: RRID:IMSR_JAX:025124, CAG-tdTomato: RRID:IMSR_JAX:007914)27,28 se utilizaron para experimentos de microscopía representativa. Esta línea reportera permite la visualización de macrófagos por expresión de GFP y adipocitos por expresión de tdTomatoes. Debido a que la expresión de tdTomato se pierde tras la muerte de los adipocitos, la viabilidad de los adipocitos puede monitorizarse durante el cultivo. Se utilizaron ratones reporteros Csf1r-eGFP ("MacGreen", RRID:IMSR_JAX:018549)28 para la visualización de macrófagos y análisis de citometría de flujo. Se utilizaron ratones C57BL/6J (RRID:IMSR_JAX:000664) para experimentos no de imagen, incluyendo análisis de scRNA-seq y qPCR. Todas las líneas transgénicas se mantuvieron como ratones heterocigotos sobre un fondo C57BL/6J.

Los experimentos con animales seguían los 'Principios del cuidado de animales de laboratorio' (publicación NIH nº 85e23, revisada en 1985) y leyes nacionales específicas, y fueron aprobados por las autoridades locales del estado de Sajonia: Landesdirektion en Leipzig, Alemania (aplicación experimental con animales: TV11-21-MEZ). Según las autoridades locales, los experimentos descritos no constituyen pruebas en animales (experimentación), ya que establece que "si un vertebrado es sacrificado únicamente con el propósito de usar sus órganos o tejidos con fines científicos, esto no se considera experimentación animal según el § 7(2) de la Ley de Bienestar Animal (TierSchG), sino más bien matar bajo el § 4(3) de la Ley de Bienestar Animal (TierSchG)." La muerte de los animales debe informarse en un 'informe animal'. Este informe está incluido en la solicitud de experimentación animal. El comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Leipzig también ha aprobado los proyectos de investigación. De acuerdo con las directrices de la aplicación experimental animal TV11-21-MEZ, los ratones son sacrificados por sobredosis del anestésico inhalado isoflurano. Una concentración efectiva de gas (5% en gas portador O₂) se administra mediante un vaporizador de isoflurano. El procedimiento de eutanasia se completa cuando se confirma la parada circulatoria definitiva (ausencia de respiración [prueba de pluma] y latido cardíaco [palpación]).

Los ratones fueron alojados en una instalación controlada de temperatura (22 ± 2 °C), libre de patógenos específicos, en la Universidad de Leipzig, en grupos hermanos de 3–5 animales bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas. Los animales tenían acceso improvisado al agua y a una dieta estándar de comida (9% kcal de grasa; Sniff GmbH, Alemania). Se realizaron experimentos representativos utilizando ratones machos y hembras. Los reactivos, productos químicos y kits utilizados en el protocolo están listados en la Tabla de Materiales.

1. Preparativos

  1. Prepara reactivos y equipos
    1. Preparar el medio de cultivo en condiciones estériles suplementando RPMI-1640 con suero fetal bovino (FBS) al 10% y solución antibiótica al 1%.
    2. Calienta el medio de cultivo y el PBS estéril a 37 °C.
    3. Limpia todo el equipo y el área de trabajo dentro de la campana de cultivo de tejidos con etanol al 70%.
  2. Preparar animales
    1. Sacrifica ratones según las directrices de la institución. Opcionalmente, pesa a los animales.
    2. Coloca a los animales en un vaso de cristal que contiene un 70% de etanol.
    3. Limpia el exterior del vaso de cristal con etanol y transfiere a la campana de cultivo de tejidos.

2. Aislamiento del tejido adiposo (Figura 2)

  1. Prepara al ratón
    1. Coloca al ratón en posición supina en un recipiente de cristal usando pinzas romas, o sujeta a una tabla de disección.
    2. Añade una capa fina de PBS precalentado a una placa de Petri.
    3. Cámbiate por un par de guantes nuevos.
    4. Levanta la piel abdominal inferior con pinzas y haz una pequeña incisión horizontal con tijeras para abrir la cavidad abdominal.
    5. Realiza una incisión vertical (~2 cm de caudal a rostral) que se extiende desde el corte inicial para exponer los órganos internos.
  2. Aísla la almohadilla grasa
    1. Con tijeras pequeñas afiladas y pinzas puntiagudas, localiza y extirpa el tejido adiposo blanco. Utiliza un conjunto de instrumentos separado para evitar la contaminación.
    2. Ratones machos: La grasa gonadal está unida únicamente al epidídimo y al testículo. Levanta con cuidado la almohadilla grasa y corta por encima del epidídimo, o extirpa el epidídimo y los testículos junto con la grasa gonadal, y retíralos después.
    3. Hembras de ratón: La grasa gonadal está unida al cuerno uterino y a los ovarios y es más prominente que en los machos. Levanta con cuidado la almohadilla grasa y extiende el cuerno uterino y los ovarios.
    4. Coloca las almohadillas grasas aisladas en la placa de Petri rellena de PBS.
    5. Elimina el epidídimo, testículos, ovarios o vasos sanguíneos residuales usando una cuchilla de afeitar.
    6. Transfiere la almohadilla grasa limpia a una segunda placa de Petri que contenga PBS precalentado. Opcionalmente, pesa las almohadillas de grasa.
      NOTA: Pesar las almohadillas grasas antes del cultivo permite normalizar la masa tisular entre condiciones experimentales.

figure-protocol-1
Figura 2: Aislamiento y cultivo de explantaciones viscerales de tejido adiposo. (A,B) Apertura de la cavidad abdominal y exposición del tejido adiposo visceral. (C, D) Aislamiento del tejido adiposo epidídimo de ratones machos, la grasa se adhiere al epidídimo (círculos rojos) y al testículo (círculos azules). (Mi, Fa) Aislamiento del tejido adiposo gonadal de ratones femeninos, la grasa se adhiere al cuerno uterino (círculos verdes) y a los ovarios. (G, H) Preparación y recorte de explantes de tejido adiposo. (I, J) Transferencia de explantes a pozos de cultivo y colocación de insertos de cultivo celular. (K, L) Imágenes representativas de explantaciones durante el cultivo en placas de 6 pozos. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Preparación y cultivo de explantaciones

  1. Preparar explantaciones
    PRECAUCIÓN: Las cuchillas de afeitar son afiladas y pueden causar lesiones. Manipular con cuidado y desechar las cuchillas conforme a los procedimientos de seguridad institucionales.
    1. Corta la almohadilla grasa en tiras y luego en cubos de aproximadamente 10mm 3 (~10 mg por explantación) usando una cuchilla de afeitar.
  2. Establecer cultivos explantados
    1. Añadir entre 1 y 1,5 mL de medio de cultivo a cada pozo de una placa de 6 pozos.
      NOTA: Para la normalización, utiliza aproximadamente 50 mg de tejido adiposo por cada 1 mL de medio de cultivo.
    2. Transfiere cinco explantaciones a cada pozo usando una cuchara o espátula estéril.
    3. Coloca los explantios de forma uniforme en un patrón circular.
    4. Cubre los explanteamientos con un inserto de cultivo celular usando pinzas estériles.
      NOTA: Evita introducir burbujas de aire al colocar los insertos y asegúrate de que los explantes estén centrados dentro de ellos.
    5. Incubar los explantes a 37 °C, 5% de CO₂ y 21% de O₂ durante 7–10 días.
      NOTA: Utiliza PBS precalentado y medio de cultivo para mejorar la viabilidad del tejido. Trabaja rápido para minimizar el tiempo que las almohadillas grasas permanecen fuera de la incubadora. Evita la contaminación con pelo del ratón. Si el pelo se adhiere al tejido, quítalo y enjuágalo con PBS tibio.

4. Análisis aguas abajo

  1. Tras el periodo de cultivo de 7–10 días, se recogen explantes, células de fracción vascular estromal o cultivo de sobrenadantes para análisis posteriores, incluyendo microscopía, citometría de flujo, qPCR, ELISA o secuenciación de ARN, según sea necesario para el punto final experimental.

5. Análisis estadístico

  1. Realiza análisis estadísticos usando GraphPad Prism 10.2. Examinar conjuntos de datos para valores atípicos usando la prueba ROUT (Q = 1%) y evaluar la normalidad usando la prueba de Shapiro–Wilk (α = 0,05).
  2. Comparar dos grupos utilizando pruebas t de Student emparejadas o pruebas de pareadas de Wilcoxon, según corresponda. Compara varios grupos usando ANOVA unidireccional seguida de la prueba post hoc de Dunnett. Consideremos diferencias estadísticamente significativas en p < 0,05.
  3. Presenta los datos como media ± SEM. Salvo que se indique lo contrario, define n como el número de réplicas biológicas (ratones individuales).

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Resultados

La viabilidad general del tejido se mantuvo durante todo el periodo de cultivo y se monitorizó utilizando varios enfoques complementarios. La viabilidad tisular puede evaluarse mediante microscopía confocal utilizando colorantes de viabilidad comoCalcein 25, tinción por anticuerpos contra Perilipina para evaluar la integridad de la membranade adipocitos 17,26, o expresión de proteínas reporteras transgénic...

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Discusión

Dada la creciente prevalencia global de enfermedades metabólicas y diabetes, comprender los mecanismos subyacentes a la inflamación del tejido adiposo (AT) sigue siendo un objetivo importante de investigación. Para responder a esta necesidad, se desarrolló un sistema de cultivo ex vivo con explantes que permite inducir y analizar la inflamación de AT bajo condiciones experimentales controladas.

Un requisito crítico de este método es la preservación de...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Constance Hobusch y Florian Kirmse su excelente asistencia técnica. Los análisis de citometría de flujo se realizaron en la Unidad Central de Tecnologías de Fluorescencia de la Universidad de Leipzig, con el apoyo técnico de Kathrin Jäger y Pia Glöckner. Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana para la Investigación), Proyecto Número 209933838 – SFB 1052 (Proyecto B09).

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Materiales

```html
Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BD OptEIA Mouse TNF ELISA KitBD Biosciences560478
Bodipy 558/568 C12Flow cytometry: 1:10000; Staining: 1:2000InvitrogenD3835
Bovine Serum Albumin3%SigmaA9647
CD107a (LAMP1) – AF647Staining: 1:100; Flow cytometry: 1:200BioLegend121610
CD11c – BV605Flow cytometry: 1:100BioLegend117334
CD16/32Flow cytometry: 1:100Invitrogen14-0161-82
CD301 – AF647Flow cytometry: 1:50Bio-RadMCA2392A647
CD36 – PEFlow cytometry: 1:400BioLegend102606
CD45 – PEFlow cytometry: 1:100BD Pharmingen555483
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 350 Flow Cytometry Assay KitEdU: 5 µMInvitrogenC10632
Clodronate Liposomes500 µg/ml clodronateLiposoma
Collagenase Type 21 mg/ml, 315 U/mgWorthingtonLS004176
CyQUANT LDH Cytotoxicity Assay KitInvitrogenC20301
DAPIFlow cytometry: 0.2 µg/mlThermo Fisher62248
Ethanol70%Carl RothT913.1
F4/80 – AF647Flow cytometry: 1:100InvitrogenMF48021
F4/80 – PE-Cy7Flow cytometry: 1:200Invitrogen25-4801-82
Fetal Calf Serum1.10Gibco10270106
Fetal Calf Serum1.20Gibco10270106
HBSS (-Mg, -Ca)Gibco14170138
HEPES13 mMRothHN77.2
Hoechst 333421:10,000Life TechnologiesH3570
LysoTracker – AF647Flow cytometry: 1:20000; Staining: 1:10000InvitrogenH34477
MAC-2Staining: 1:1000CedarlaneCL8942AP
Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µmMerck MilliporePICM0RG50
PBS (-Mg, -Ca)Gibco14190169
PBS (-Mg, -Ca)Gibco14190169
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/ml)0.111111111Gibco11548876
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/ml)0.111111111Gibco11548876
Perilipin2 µg/mlAbcamab3526
Plexxicon 562240 µMPlexxicon Inc.HY-114153
RPMI-Media 1640with 11 mM glucoseSigma AldrichR8758
RPMI-Media 1640SigmaR8758
TC-Insert for 6-well platesSarstedt83.3930.040
TPP tissue culture test plate 6TPP92006
Triton X-1001%Carl Roth3051.2
Zinc chloride0.8 mMSigmaZ0152
Zinc formalinePolyscience21516-3.75
```

Referencias

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