Imagen estandarizada por inmunofluorescencia de nanotubos de túnel y transferencia mitocondrial entre astrocitos y neuronas

Resumen

Este protocolo estandariza los métodos de fijación, tinción e imagen confocal para visualizar nanotubos de túnel y transferencia mitocondrial entre astrocitos y neuronas in vitro.

Resumen

Las mitocondrias son orgánulos esenciales que regulan la producción de energía, la señalización celular y la homeostasis metabólica en las células neuronales. Los nanotubos tunelados (TNT) son estructuras membranosas delgadas que median la comunicación intercelular a larga distancia y facilitan la transferencia de componentes celulares, incluidas las mitocondrias, entre células conectadas. La visualización fiable de TNTs y transferencia mitocondrial requiere un manejo cuidadoso de la muestra porque estas estructuras son muy frágiles y sensibles a condiciones de fijación, lavado e imagen. Este protocolo describe procedimientos estandarizados para la fijación, tinción e imagen confocal de TNTs en astrocitos y sistemas de cocultura astrocito-neurona. El flujo de trabajo incluye tinción de membrana y citoesqueleto para la visualización de TNT, marcaje mitocondrial para el seguimiento de la localización mitocondrial y tinción por inmunofluorescencia para el análisis de colocalización con Miro1. Se enfatizan pasos críticos para preservar la morfología del TNT, incluyendo un lavado suave y un manejo protegido de la luz, a lo largo de todo el procedimiento. El protocolo también describe enfoques de imagen para la caracterización de TNTs y mitocondrias en preparaciones de células fijas. Estos métodos proporcionan un marco experimental reproducible para estudiar la formación de TNT y la transferencia mitocondrial entre células neuronales in vitro.

Introducción

Las mitocondrias actúan como las fábricas energéticas de la célula, proporcionando la energía necesaria para las actividades celulares mediante la producción de trifosfato de adenosina, además de desempeñar un papel importante en la transducción de señales celulares y en el equilibrio^{redox 1}. En el sistema nervioso, los metabolitos mitocondriales pueden aumentar la complejidad y excitabilidad de los procesos neuronales, apoyando así el crecimiento y desarrollo^{neuronal 2}. Las mitocondrias no son orgánulos estáticos; alteran continuamente su morfología, ubicación y distribución para adaptarse a diversas tensiones intracelulares y extracelulares y demandas^{metabólicas 3}. La transferencia mitocondrial intercelular contribuye al mantenimiento de la homeostasis tisular y promueve el desarrollo bajo condiciones fisiológicas, mientras que bajo condiciones patológicas participa en la reparación del daño, la regulación inmune y la progresión de^{la enfermedad 4,5}.

La comunicación intercelular de materiales y energía es esencial para diversos procesos biológicos, incluyendo la homeostasis celular, la reparación tisular y la regulación de redes neuronales. Los estudios actuales han revelado múltiples modos de comunicación intercelular, entre los cuales los nanotubos de túnel (TNT) representan uno de los mecanismos más estudiados asociados a la transferencia mitocondrial^{intercelular 6}. Los TNT son estructuras de membrana basadas en F-actina, en forma de puente, con una morfología tubular, que varía entre 50 y 200 nm de diámetro y se extiende hasta varios diámetros celulares en^{longitud 7}. Las investigaciones han demostrado que las TNTs pueden actuar como conexiones físicas entre las células neuronales y están estrechamente asociadas con el inicio y progresión de enfermedades neurodegenerativas, cáncer cerebral y otros trastornos. Por ejemplo, se ha informado que la transferencia mitocondrial de la microglía a las neuronas mediante TNTs rescata células^{neuronales 8,9}.

La investigación actual sobre las TNT suele enfrentarse a varios desafíos, incluyendo la fragilidad estructural de las TNT, que las hace propensas a la rotura y, en consecuencia, pueden afectar los resultados experimentales; dificultad para distinguir TNTs de filopodias u otras protuberancias de membrana; y los desafíos asociados a la cuantificación precisa de TNTs intercelulares. Para mejorar la reproducibilidad y consistencia de los estudios relacionados con TNT, se requieren métodos estandarizados para el lavado, fijación, tinción e imagen de TNTs que permitan una evaluación precisa de su estructura y distribución, minimizando la variabilidad experimental. Factores como la densidad celular antes de la fijación, la protección contra la luz, la intensidad del lavado, la duración de la fijación y las condiciones de tinción posteriores a la fijación pueden influir en la estructura y estabilidad de los TNT. En este estudio, describimos procedimientos para el pretratamiento, tinción e imagen confocal de TNTs y estructuras de TNT asociadas a mitocondrias en sistemas de cultivo de astrocitos y astrocitos-neuronas.

Este protocolo de investigación puede aplicarse generalmente a la mayoría de los entornos de laboratorio. La validación en astrocitos primarios y en una línea celular neuronal hipocampal de ratón confirmó que el protocolo es adecuado tanto para células neuronales primarias como para líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, este protocolo sigue teniendo varias limitaciones. La microscopía confocal proporciona una resolución espacial inferior a los enfoques de imagen de superresolución para la visualización de TNT, y la evaluación basada en MitoTracker de la transferencia mitocondrial puede verse afectada por fugas de colorantes e interferencias de señal no mitocondrial¹⁰.

Protocolo

Este estudio no involucró sujetos humanos ni animales vertebrados vivos; solo se usaron líneas celulares obtenidas o establecidas comercialmente, y no se requirió ninguna aprobación ética.

1. Tinción para TNTs en astrocitos

1. Siembra de células
   1. Semillas aislaron astrocitos primarios de rata en el paso 3 (P3) en recipientes de cultivo de fondo de vidrio de 35 mm con una densidad de 5 × 10⁴ celdas por plato. Añadir 2 mL de medio modificado Eagle/Mezcla de Nutrientes F-12 (DMEM/F-12) de Dulbecco, suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% y mezcla de antibióticos triples al 1% (penicilina G, estreptomicina y anfotericina B). Cultiva las células a 37°C en una incubadora humidificada que contenga un 5% de CO₂.
   2. Incuba las células durante aproximadamente 24 horas hasta que se produzca la inserción.
2. Pretratamiento y fijación
   1. Transfiere los platos de cultivo a un banco limpio bajo condiciones protegidas de la luz después de la unión de la celda.
      NOTA: Minimizar los movimientos y vibraciones innecesarios durante el manejo para preservar la integridad del TNT.
   2. Retira el medio de cultivo suavemente bajo condiciones de poca luz.
      NOTA: Evitar el secado completo de la superficie celular durante la eliminación del medio porque los TNT pueden colapsar y adherirse al sustrato del cultivo.
   3. Lava suavemente las células una vez con 500 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin iones de calcio ni magnesio (pH 7,3–7,5). Añade y retira el PBS lentamente a lo largo de la pared del plato de cultivo para evitar interrumpir los TNTs intercelulares durante el lavado.
   4. Quita el PBS con cuidado.
   5. Fijar las células con una solución fijadora comercial de células tisulares al 4% que contenga paraformaldehído (pH 7,2–7,4) durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT; 20°C–25°C) en condiciones de luz tenue.
      PRECAUCIÓN: Manipular soluciones fijadoras utilizando el equipo de protección individual adecuado y realizar todos los procedimientos conforme a las directrices de seguridad química institucional.
   6. Elimina la solución fijadora.
   7. Lava las células una vez con PBS.
3. Permeabilización celular y tinción fluorescente
   1. Permeabiliza las células con 500 μL de solución de permeabilización Triton X-100 lista para usar durante 20 minutos en RT.
      PRECAUCIÓN: El Triton X-100 puede alterar estructuras frágiles de TNT. Minimizar la agitación excesiva durante la permeabilización.
   2. Elimina la solución de permeabilidad.
   3. Lava las células una vez con PBS.
   4. Prepara la solución de tinte inmediatamente antes de usarla. Diluir el tinte de F-actina en PBS hasta una concentración final de 1 μM y utilizar 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) como tinte nuclear listo para usar. Mezcla bien las dos soluciones de tinción antes de usarlas.
      NOTA: Los reactivos de tinción basados en faloidinas pueden usarse como alternativas para la visualización de F-actina.
   5. Mezclar las soluciones de tinción F-actina y nuclear en una proporción 1:1 (volúmenes iguales) bajo condiciones protegidas de la luz.
   6. Añade la solución de tinción preparada a los platos de cultivo.
   7. Incuba las células durante 30 minutos a 37°C en la oscuridad.
   8. Quita la solución de manchas.
   9. Lava las células tres veces con PBS usando 500 μL por lavado durante 1 minuto en cada lavado.
   10. Añade 1 mL de PBS para evitar que las células se sequen durante la preparación por imagen.
4. Imagen Confocal
   1. Toma imágenes usando un microscopio confocal invertido Nikon equipado con un objetivo ×20. Usa excitación de 405 nm para DAPI y excitación de 488 nm para la tinción de F-actina. Captura imágenes con una resolución de 1024 × 1024 píxeles bajo condiciones protegidas de la luz en RT.
   2. Realizar una evaluación cualitativa y cuantificación manual utilizando al menos cinco campos de visión seleccionados aleatoriamente por muestra. Cuantifique el número de TNTs y el número de celdas TNT positivas que contienen una o más TNTs en cada campo de visión (Figuras 1A y 1B).
      NOTA: Adquiere imágenes inmediatamente después de la tinción para minimizar la pérdida de fluorescencia y la alteración estructural de las TNT.

Figura 1: Tinción por fluorescencia de nanotubos de túnel (TNT) en astrocitos. (A) Imágenes representativas de microscopía confocal que muestran tinción nuclear y F-actina en astrocitos cultivados en platos de cultivo con fondo de vidrio. (B) Vista ampliada de la región encapsulada en el panel A. Las flechas blancas indican estructuras similares a TNT entre celdas adyacentes. (C) Imágenes representativas que muestran estructuras similares a TNT alteradas tras un manejo inadecuado de la muestra. (D) Vista ampliada de la región encapsulada en el panel C. Las flechas amarillas indican estructuras fragmentadas similares a TNT. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Tinción para transferencia mitocondrial de astrocitos a neuronas mediante TNTs

1. Siembra de astrocitos y marcaje mitocondrial
   1. Semilla, aislar astrocitos primarios de rata en el pasaje 3 (P3) en platos de cultivo de fondo de vidrio de 35 mm a una densidad de 3 × 10⁴ celdas por plato. Añadir 2 mL de medio completo DMEM/F-12 suplementado con mezcla de antibióticos al 10% FBS y 1% triple de antibióticos (penicilina G, estreptomicina y anfotericina B). Cultiva las células a 37°C en una incubadora humidificada que contenga un 5% de CO₂.
   2. Incuba las células durante aproximadamente 24 horas hasta que se produzca la inserción.
   3. Transfiere los platos de cultivo a un banco limpio bajo poca luz después de la unión de la celda.
      NOTA: Minimizar los movimientos y vibraciones innecesarios durante el manejo para preservar la integridad del TNT.
   4. Retira el medio de cultivo con cuidado en condiciones protegidas de la luz. Evita interrumpir los TNTs durante la extracción del medio.
      NOTA: Evitar el secado completo de la superficie celular durante la eliminación del medio porque los TNT pueden colapsar y adherirse al sustrato del cultivo.
   5. Reconstituir 50 μg de tinte MitoTracker liofilizado en dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar una solución de 1 mM y almacenarla a −20°C. Antes de su uso, diluir la solución original en 400 μL de medio DMEM/F-12 completo suplementado con mezcla de antibióticos al 10% FBS y 1% triple de antibióticos para obtener una concentración final de MitoTracker de 50 μM.
      PRECAUCIÓN: Proteja los tintes fluorescentes de la exposición directa a la luz durante los procedimientos de preparación e incubación.
   6. Añade la solución de trabajo de tinción mitocondrial a los platos de cultivo.
   7. Incubar las células a 37°C en una incubadora humidificada que contenga un 5% de CO₂ durante 30 minutos en condiciones protegidas de la luz.
   8. Retira la solución de tinción mitocondrial en condiciones protegidas de la luz.
   9. Lava suavemente las células una vez con 500 μL de PBS sin iones de calcio ni magnesio (pH 7,3–7,5). Añade y retira el PBS lentamente a lo largo de la pared del plato de cultivo para evitar interrumpir los TNTs intercelulares durante el lavado.
   10. Quita el PBS con cuidado.
2. Cocultura astrocito-neurona
   1. La semilla inmortalizó las células neuronales del hipocampo del ratón en el paso 3 (P3) hacia los platos de cultivo que contienen astrocitos a una densidad de 3 × 10⁴ células por plato. Añadir células en un volumen total de 2 mL que consiste en una mezcla 1:1 de DMEM y medio completo DMEM/F-12 suplementada con mezcla de 10% FBS y 1% triple de antibióticos. Establece la cocultura usando un método de contacto directo sin inserción Transwell. Cultiva las células a 37°C en una incubadora humidificada que contenga un 5% de CO₂.
      NOTA: Añadir células neuronales suavemente para minimizar la alteración de las estructuras preexistentes de TNT.
   2. Mantener la cocultura durante 24 horas bajo condiciones estándar de incubadora, protegiendo las muestras de la exposición innecesaria a la luz durante los procedimientos de manipulación.
3. Fijación y permeabilización
   1. Retira el medio de cultivo en condiciones de protección a la luz.
   2. Lava las células una vez con PBS.
   3. Fijar las células con una solución fijadora de células tisulares al 4% que contenga paraformaldehído durante 30 minutos en temperatura retrógrada bajo condiciones de luz tenue.
      PRECAUCIÓN: Manipular soluciones fijadoras utilizando el equipo de protección individual adecuado y realizar todos los procedimientos conforme a las directrices de seguridad química institucional.
   4. Elimina la solución fijadora.
   5. Lava las células una vez con PBS.
   6. Permeabiliza las células con 500 μL de solución de permeabilización Triton X-100 lista para usar durante 20 minutos en temperatura relámpago bajo condiciones de luz tenue.
      PRECAUCIÓN: El Triton X-100 puede alterar estructuras frágiles de TNT. Minimizar la agitación excesiva durante la permeabilización.
   7. Elimina la solución de permeabilidad.
   8. Lava las células una vez con PBS.
4. Tinción e Imagen por Fluorescencia
   1. Prepara la solución de tinte inmediatamente antes de usarla. Diluir el tinte de F-actina en PBS hasta una concentración final de 1 μM y usar DAPI como tinte nuclear listo para usar. Mezcla bien las soluciones de tinción antes de usarlas.
      NOTA: Los reactivos de tinción basados en faloidinas pueden usarse como alternativas para la visualización de F-actina.
   2. Mezclar las soluciones de tinción F-actina y nuclear en una proporción 1:1 (volúmenes iguales) bajo condiciones protegidas de la luz justo antes de su uso.
   3. Añade la solución de tinción preparada a los platos de cultivo.
   4. Incuba las células durante 30 minutos a 37°C en la oscuridad.
   5. Quita la solución de manchas.
   6. Lava las células tres veces con PBS usando 500 μL por lavado durante 1 minuto en cada lavado.
   7. Añade 1 mL de PBS para evitar que las células se sequen durante la preparación por imagen.
   8. Toma imágenes usando un microscopio confocal invertido Nikon equipado con un objetivo ×20. Usa excitación de 405 nm para DAPI, excitación de 488 nm para la tinción de F-actina y excitación de 665 nm para la tinción con MitoTracker. Captura imágenes con una resolución de 1024 × 1024 píxeles bajo condiciones protegidas de la luz en RT.
   9. Realizar una evaluación cualitativa utilizando al menos cinco campos de visión seleccionados al azar por muestra. Evalúa la presencia de estructuras similares a TNT y señales de fluorescencia asociadas a mitocondrias dentro de las conexiones intercelulares de membrana (Figuras 2A y 2B).
      NOTA: Adquiere imágenes inmediatamente después de la tinción para minimizar la pérdida de fluorescencia y la alteración estructural de las TNT.

Figura 2: Tinción por fluorescencia de mitocondrias y TNTs en un sistema de cocultura astrocito-neurona. (A) Imágenes representativas de microscopía confocal que muestran tinción nuclear, mitocondrial y de F-actina en astrocitos y neuronas cultivadas en platos de cultivo con fondo de cristal. Los astrocitos mostraban morfologías irregulares similares a las de estrellas o poligonales con procesos celulares extendidos, mientras que las células neuronales aparecían redondas u ovaladas con extensiones delgadas similares a neuritas. (B) Vista ampliada de la región encapsulada en el panel A. Las flechas blancas indican estructuras similares a TNT asociadas a mitocondrias entre células. Las dos poblaciones celulares se distinguieron principalmente por su morfología celular característica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Tinción por colocalización por inmunofluorescencia para mitocondrias y Miro1 en TNTs

1. Siembra de astrocitos y marcaje mitocondrial
   1. Semilla, aislar astrocitos primarios de rata en el pasaje 3 (P3) en platos de cultivo de fondo de vidrio de 35 mm a una densidad de 3 × 10⁴ celdas por plato. Añadir 2 mL de medio completo DMEM/F-12 suplementado con mezcla de antibióticos al 10% FBS y 1% triple de antibióticos (penicilina G, estreptomicina y anfotericina B). Cultiva las células a 37°C en una incubadora humidificada que contenga un 5% de CO₂.
   2. Incuba las células durante aproximadamente 24 horas hasta que se produzca la inserción.
   3. Transfiere los platos de cultivo a un banco limpio bajo poca luz después de la unión de la celda.
      NOTA: Minimizar los movimientos y vibraciones innecesarios durante el manejo para preservar la integridad del TNT.
   4. Retira el medio de cultivo con cuidado en condiciones protegidas de la luz. Evita interrumpir los TNTs durante la extracción del medio.
      NOTA: Evitar el secado completo de la superficie celular durante la eliminación del medio porque los TNT pueden colapsar y adherirse al sustrato del cultivo.
   5. Reconstituir 50 μg de tinte MitoTracker liofilizado en DMSO para preparar una solución de 1 mM y almacenar la solución de stock a −20°C. Antes de su uso, diluir la solución original en 400 μL de medio DMEM/F-12 completo suplementado con mezcla de antibióticos al 10% FBS y 1% triple de antibióticos para obtener una concentración final de MitoTracker de 50 μM.
      PRECAUCIÓN: Proteja los tintes fluorescentes de la exposición directa a la luz durante los procedimientos de preparación e incubación.
   6. Añade la solución de trabajo de tinción mitocondrial a los platos de cultivo.
   7. Incubar las células a 37°C en una incubadora humidificada que contenga un 5% de CO₂ durante 30 minutos en condiciones protegidas de la luz.
   8. Retira la solución de tinción mitocondrial en condiciones protegidas de la luz.
   9. Lava suavemente las células una vez con 500 μL de PBS sin iones de calcio ni magnesio (pH 7,3–7,5). Añade y retira el PBS lentamente a lo largo de la pared del plato de cultivo para evitar interrumpir los TNTs intercelulares durante el lavado.
   10. Quita el PBS con cuidado.
2. Cocultura astrocito-neurona
   1. La semilla inmortalizó las células neuronales del hipocampo del ratón en el paso 3 (P3) hacia los platos de cultivo que contienen astrocitos a una densidad de 3 × 10⁴ células por plato. Añadir células en un volumen total de 2 mL que consiste en una mezcla 1:1 de DMEM y medio completo DMEM/F-12 suplementada con mezcla de 10% FBS y 1% triple de antibióticos. Establece la cocultura usando un método de contacto directo sin inserción Transwell. Cultiva las células a 37°C en una incubadora humidificada que contenga un 5% de CO₂.
      NOTA: Añadir células neuronales suavemente para minimizar la alteración de las estructuras preexistentes de TNT.
   2. Mantener la cocultura durante 24 horas bajo condiciones estándar de incubadora, protegiendo las muestras de la exposición innecesaria a la luz durante los procedimientos de manipulación.
3. Fijación y permeabilización
   1. Retira el medio de cultivo en condiciones de protección a la luz.
   2. Lava las células una vez con PBS.
   3. Fijar las células con una solución fijadora comercial de células tisulares al 4% que contiene paraformaldehído (pH 7,2–7,4) durante 30 minutos en RT bajo condiciones de luz tenue.
      PRECAUCIÓN: Manipular soluciones fijadoras utilizando el equipo de protección individual adecuado y realizar todos los procedimientos conforme a las directrices de seguridad química institucional.
   4. Elimina la solución fijadora.
   5. Lava las células una vez con PBS.
   6. Permeabiliza las células con 500 μL de solución de permeabilización Triton X-100 lista para usar durante 20 minutos en temperatura relámpago bajo condiciones de luz tenue.
      PRECAUCIÓN: El Triton X-100 puede alterar estructuras frágiles de TNT. Minimizar la agitación excesiva durante la permeabilización.
   7. Elimina la solución de permeabilidad.
   8. Lava las células una vez con PBS.
4. Bloqueo e Tinción por Inmunofluorescencia
   1. Bloquea las células con suero de cabra al 5% durante 1 hora en RT en condiciones de poca luz. Prepara la solución bloqueadora diluyendo el suero de cabra 1:20 en PBS.
   2. Quita la solución de bloqueo.
   3. Diluir anticuerpo anti-Miro1 monoclonal de conejo en PBS con una proporción de dilución de 1:100. Añadir la solución primaria diluida de anticuerpos a los recipientes de cultivo e incubar durante la noche (12–16 h) a 4°C.
      NOTA: Proteger las muestras marcadas con fluorescencia de la exposición directa a la luz durante todo el proceso de tinción.
   4. Retira la solución primaria de anticuerpos.
   5. Lava las células tres veces con PBS usando 500 μL por lavado durante 1 minuto en cada lavado.
   6. Diluye el anticuerpo secundario fluorescente anti-conejo IgG de la cabra en PBS con una proporción de dilución de 1:100. Añadir 500 μL de solución secundaria diluida de anticuerpos a cada cuenca de cultivo e incubar durante 1 hora bajo condiciones protegidas por la luz.
      NOTA: No se incluyó un control sin anticuerpos primarios en el presente estudio. Futuros experimentos deberían incorporar controles de inmunofluorescencia adecuados para validar aún más la especificidad de la tinción.
   7. Retira la solución secundaria de anticuerpos fluorescentes.
5. Contratinción e Imagen con Luz Fluorescente
   1. Prepara la solución de tinte inmediatamente antes de usarla. Diluir el tinte de F-actina en PBS hasta una concentración final de 1 μM y usar DAPI como tinte nuclear listo para usar. Mezcla bien las soluciones de tinción antes de usarlas.
      NOTA: Los reactivos de tinción basados en faloidinas pueden usarse como alternativas para la visualización de F-actina.
   2. Añade la solución de tinción a los platos de cultivo.
   3. Incuba las células durante 30 minutos a 37°C en la oscuridad.
   4. Quita la solución de manchas.
   5. Lava las células tres veces con PBS usando 500 μL por lavado durante 1 minuto en cada lavado.
   6. Añade 1 mL de PBS para evitar que las células se sequen durante la preparación por imagen.
   7. Toma imágenes usando un microscopio confocal invertido Nikon equipado con un objetivo ×20. Recoge imágenes en pila Z usando un tamaño de paso de 5 μm sobre un rango total de imagen de 40 μm (8 secciones ópticas). Utiliza excitación de 405 nm para DAPI, excitación de 488 nm para tinción de F-actina, excitación de 594 nm para inmunotinción con Miro1 y excitación de 665 nm para tinción con MitoTracker. Captura imágenes con una resolución de 1024 × 1024 píxeles bajo condiciones protegidas de la luz en RT.
   8. Realizar una evaluación cualitativa utilizando al menos cinco campos de visión seleccionados al azar por muestra. Evaluar estructuras similares a TNT, señales de fluorescencia asociadas a mitocondrias y la aparente colocalización entre Miro1 y la tinción asociada a mitocondrias dentro de las conexiones intercelulares de membranas (Figuras 3A–3C).
      NOTA: Adquiere imágenes inmediatamente después de la tinción para minimizar la pérdida de fluorescencia y la alteración estructural de las TNT.

Figura 3: Tinción por colocalización de mitocondrias y Miro1 en TNTs en un sistema de cocultura astrocito-neurona. (A) Imágenes representativas de microscopía confocal que muestran tinción nuclear, mitocondrial, Miro1 y F-actina en astrocitos y neuronas cultivadas en platos de cultivo con fondo de cristal. Las flechas blancas indican regiones de aparente colocalización entre señales asociadas a mitocondrias y Miro1 dentro de estructuras similares a TNT. (B) Imagen tridimensional reconstruida en pila Z que muestra estructuras tipo TNT formadas entre celdas adyacentes. (C) Reconstrucción lateral de la misma imagen Z-stack que muestra estructuras tipo TNT que se extienden entre celdas adyacentes. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Resultados

En preparaciones de monocultivo de astrocitos, se observaron delgadas protuberancias de membrana que conectan células adyacentes tras la tinción de F-actina y nuclear (Figuras 1A y 1B). Se detectaron múltiples estructuras similares a TNT extendiéndose entre astrocitos vecinos, y los astrocitos individuales frecuentemente formaban conexiones con varias células circundantes. La preservación exitosa de estructuras similares a TNT se asoció con un manejo suave durante los procedimientos de lavado y fijación. Una perturbación mecánica excesiva durante la eliminación o lavado del medio resultó en una menor detectabilidad y alteración estructural de estas conexiones de membrana, como se muestra en estructuras tipo TNT alteradas tras un manejo inadecuado de muestras (Figuras 1C y 1D).

En preparaciones de cocultivo astrocito-neurona, se observaron señales de fluorescencia asociadas a mitocondrias dentro de estructuras similares a TNT que conectan células adyacentes tras la tinción con MitoTracker e imágenes confocales (Figuras 2A y 2B). Estas estructuras se visualizaron junto con F-actina y tinción nuclear para apoyar la evaluación morfológica de conexiones similares a TNT. Una protección adecuada de la luz y la intensidad del lavado minimizada mejoraron la preservación de la señal de fluorescencia y la morfología del TNT durante la preparación de imágenes.

En experimentos de colocalización por inmunofluorescencia, se observaron señales de fluorescencia superpuestas correspondientes a la tinción asociada a mitocondrias y a la inmunotinción con Miro1 dentro de estructuras tipo TNT en preparaciones de cocultivo de astrocitos y neuronas (Figura 3A). Estas observaciones sugieren una posible asociación entre Miro1 y mitocondrias localizadas dentro de estructuras similares a TNT. La imagen tridimensional reconstruida con pila Z apoyó aún más la presencia de estructuras similares a TNT que se extenden entre celdas adyacentes (Figuras 3B y 3C). La preservación del TNT, la intensidad de la señal de fluorescencia y la calidad de imagen estuvieron influenciadas por las condiciones de fijación, permeabilización y imagen.

Discusión

El primer paso crítico en el protocolo experimental descrito anteriormente es el pretratamiento protegido con luz antes de la fijación. Las estructuras similares al TNT son muy frágiles, y mantener condiciones de protección a la luz tras la extracción de la incubadora es importante para preservar la intensidad de la señal de fluorescencia y la integridad estructural durante la preparación de la muestra. El segundo paso crítico es realizar un lavado de PBS con manipulación suave para minimizar la alteración de estructuras similares a TNT causada por el flujo de fluidos. El cumplimiento de estos procedimientos clave de manipulación ayuda a preservar la morfología y estabilidad de las estructuras similares al TNT y mejora la consistencia de los resultados de imagen posteriores. La aspiración excesiva, el lavado prolongado o una fuerte agitación del fluido pueden provocar el colapso o fragmentación de estructuras similares a TNT durante el procesamiento de la muestra. Debido a su naturaleza altamente dinámica, las TNT son sensibles a la luz. La fototoxicidad inducida por la exposición a la luz puede causar alteraciones en TNT, dificultando la visualización de estas^estructuras. Por lo tanto, se deben mantener condiciones protegidas de la luz durante los experimentos relacionados con TNT.

El movimiento mitocondrial intracelular contribuye a la distribución de energía celular, especialmente en las neuronas. Los estudios han demostrado que las mitocondrias pueden moverse a lo largo de los filamentos de actina y los^{microtúbulos 12}. Estudios recientes también han demostrado que las TNTs pueden funcionar como estructuras de comunicación intercelular a larga distancia asociadas a la transferencia mitocondrial entre células^{neuronales 13}. El enfoque metodológico descrito en este estudio permite la visualización de estructuras similares a TNT y señales de fluorescencia asociadas a mitocondrias en sistemas de cultivo celular neuronal. Estudios previos han demostrado que la transferencia intercelular mitocondrial entre células neuronales puede contribuir a la reparación tisular y a los procesos neuroprotectores en trastornos neurológicos como la enfermedad de Parkinson y la lesión isquémica^{cerebral 14,15}. Utilizando los métodos descritos en este estudio, se observaron estructuras similares a TNT entre astrocitos y entre astrocitos y neuronas, junto con señales de fluorescencia asociadas a mitocondrias localizadas dentro de estas estructuras.

Como se señaló en estudios^previos, la tinción con MitoTracker está sujeta a fugas de colorante y transferencia de señal no mitocondrial, lo que puede reducir la fiabilidad de los datos. Para abordar esta limitación, futuras investigaciones deberían emplear métodos más robustos, como el marcaje mitocondrial codificado genéticamente, para obtener resultados más concluyentes. Bajo las condiciones experimentales actuales, los dos tipos celulares se distinguieron principalmente en función de la morfología celular, un enfoque que puede reducir la especificidad de identificación de tipos celulares. Futuros estudios deberían incorporar marcaje fluorescente específico por tipo celular para mejorar la precisión del análisis de cocultivo. Miro1 es una proteína adaptadora localizada en la membrana mitocondrial externa y ha sido implicada en procesos de transporte mitocondrial en las^{neuronas 16,17}. Utilizando el protocolo de colocalización por inmunofluorescencia descrito en este estudio, se observaron señales de fluorescencia superpuestas correspondientes a la tinción asociada a mitocondrias y a la inmunotinción con Miro1 dentro de estructuras similares a TNT. Estas observaciones sugieren una posible asociación entre Miro1 y mitocondrias localizadas dentro de estructuras similares a TNT. Sin embargo, la resolución espacial de la microscopía confocal convencional puede limitar la evaluación definitiva de la colocalización molecular dentro de delgadas protuberancias de membrana.

Realizamos imágenes con pila en Z para confirmar la presencia de estructuras similares a TNT entre células, apoyando así la validación estructural de estas conexiones membranas. Aunque el protocolo actual es adecuado para la mayoría de entornos experimentales, la imagen confocal de células fijas puede resultar en la pérdida de estructuras frágiles similares al TNT durante el procesamiento de muestras en comparación con la imagen de células vivas, limitando así la cuantificación precisa del^{TNT 18}. Además, la imagen de células fijas no permite determinar de forma inequívoca la direccionalidad de transferencia mitocondrial, lo que justifica una investigación adicional en futuros estudios. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo experimental estandarizado para teñir estructuras similares a TNT, señales asociadas a mitocondrias y proteínas relacionadas en sistemas de cultivo celular neuronal. En comparación con los procedimientos de lavado y fijación no controlados, el protocolo enfatiza el manejo suave de la muestra y la preservación de la fluorescencia durante la preparación de imágenes. Estos métodos pueden ayudar a mejorar la consistencia y reproducibilidad experimental en estudios de imagen relacionados con TNT.

En resumen, este estudio proporciona un protocolo de laboratorio práctico y ampliamente aplicable para la evaluación cualitativa de las TNT y la investigación del transporte mitocondrial mediante estructuras similares a las TNT. Sin embargo, pasos de procesamiento de muestras como la fijación y el lavado pueden introducir variabilidad en la cuantificación en comparación con los enfoques de imagen de células vivas. Además, la microscopía confocal proporciona una resolución espacial menor que la microscopía de superresolución, lo que limita la caracterización estructural detallada de los TNTs. Además, la tinción mitocondrial basada en MitoTracker se ve afectada por la fuga de colorante y la transferencia de señales inespecíficas, que deberían abordarse en futuros estudios para mejorar la precisión experimental.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1% triple antibiotic mixture	Biosharp	BL142A	Previene la contaminación bacteriana y fúngica durante la cultivo celular
4% Tissue Cell Fixative	Solarbio	P1110	Reactivo de fijación celular
Anti-Miro1 antibody	Abcam	AB319154	Anticuerpo primario contra Miro1
Astrocytes	Primary cells isolated in the laboratory	NA	Los astrocitos se aislaron de la corteza cerebral de crías de ratas SD neonatales de entre 1 y 3 días de edad. La pureza de las células aisladas se confirmó que era >95% mediante tinción de GFAP, y se utilizaron células de pasaje 3 (P3) para todos los experimentos
Astrocyte cell culture medium medium (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	Se mezcló DMEM y F-12 en una proporción de 1:1 (v/v), complementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibióticos triples
Confocal microscope	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio confocal Nikon AX (Nikon Corporation, Japón) controlado por NIS-Elements (versión 5.4)
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	Tinte de tinción nuclear
DMSO	BioFroxx	1084ML100	Solvente utilizado para la preparación de soluciones de stock de colorantes fluorescentes
F-actin staining dye	Thermo Fisher Scientific	A57243	Reactivo de tinción de F-actina para la visualización de estructuras citoesqueléticas y nanotúbulos de tunelización
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSD500	Proporciona nutrientes esenciales para el cultivo celular
Fluorescent secondary antibody (Goat Anti-Rabbit IgG)	ABclonal	AS039	Anticuerpo secundario para tinción de inmunofluorescencia
Glass-bottom cell culture dish	NEST	801001	Plato de cultivo celular con fondo de vidrio para microscopía confocal
Goat serum	Solarbio	210C051	Reactivo de bloqueo para tinción de inmunofluorescencia
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	Tinte de tinción mitocondrial
Neurons	Cell Bank of CAS	HT22-GNM47	Células neuronales hipocampales de ratón inmortalizadas se mantuvieron en medio completo DMEM. Se recolectaron células en pasaje 3 (P3) y se utilizaron para experimentos posteriores.
Neuron cell culture medium (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	DMEM complementado con GlutaPlus y piruvato de sodio, sin HEPES, complementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de antibióticos triples
Phosphate-buffered saline (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	Buffer de lavado utilizado durante la fijación y tinción
Triton X-100	Solarbio	P1080	Reactivo de permeabilización celular