Disección y aislamiento de los ganglios dorsales de la raíz del ratón

Resumen

Los ganglios de la raíz dorsal (DRG) contienen cuerpos celulares de neuronas sensoriales primarias y transmiten señales sensoriales periféricas a la médula espinal. Este protocolo describe un método para la disección por DRG en ratón que permite el aislamiento estandarizado de ganglios estructuralmente intactos, la identificación anatómica segmentaria, una guía intuitiva para usuarios principiantes y la reducción de lesiones tejidulares procedimentales.

Resumen

Los ganglios de la raíz dorsal (DRG), que contienen los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales primarias, actúan como estructuras de relevo críticas para la transmisión de señales sensoriales desde los tejidos periféricos hacia la médula espinal. Desempeñan un papel esencial en estudios sobre el dolor, las lesiones nerviosas y las enfermedades neurodegenerativas. La adquisición de tejido DRG intacto es crucial para investigar las propiedades funcionales, la expresión molecular y las alteraciones patológicas de las neuronas sensoriales. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y ubicación profunda dentro del conducto vertebral, la identificación y aislamiento precisos de la DRG presenta desafíos técnicos significativos. En este estudio, desarrollamos un protocolo estandarizado para el aislamiento de la DRG en ratones. Este método proporciona una descripción detallada de la localización anatómica de la DRG, la exposición del conducto vertebral y los pasos clave implicados en el aislamiento ganglionar. Todo el procedimiento se ilustra con imágenes representativas y grabaciones de vídeo. Este enfoque apoya la adquisición de DRG estructuralmente intacta con guía anatómica para la identificación segmentaria y es adecuado para la tinción H&E y el análisis de inmunofluorescencia. En comparación con métodos anteriores de disección con DRG, este método permite la recuperación estandarizada de los ganglios identificados segmentalmente, proporciona una guía anatómica intuitiva para usuarios principiantes y reduce lesiones tejituales procedimentales.

Introducción

Los ganglios de la raíz dorsal (DRG), que contienen los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales primarias, son estructuras esenciales para transmitir señales sensoriales periféricas —incluyendo estímulos mecánicos, térmicos y nociceptivos— a la médula^{espinal 1,2,3} . Aunque actualmente existen recursos de alta calidad que describen la DRG, aún se requiere una guía procedimental detallada para apoyar la identificación y aislamiento precisos de la DRG desde los segmentos torácicos hasta los sacros dentro de una sola muestra, minimizando al mismo tiempo el riesgo de daño por DRG durante la recogida del tejido.

Las neuronas DRG son componentes clave de la vía sensorial periférica. Sus axones se bifurcan, con una rama extendiéndose hacia tejidos periféricos y la otra proyectándose hacia el cuerno dorsal de la médula espinal, desempeñando así un papel crítico en la transmisión del dolor, la lesión nerviosa, las respuestas inflamatorias y la patogénesis de diversos trastornos neurológicos⁴. Además, la DRG ha atraído una considerable atención en áreas de investigación como la reparación de lesiones nerviosas, los mecanismos del dolor crónico, la plasticidad de las neuronas sensoriales y la regulación^{neuroinmune 5,6}. Una amplia gama de estudios experimentales requiere tejido DRG intacto para aplicaciones que incluyen tinción inmunohistoquímica, análisis de secuenciación de ARN, cultivo neuronal primario y estudios^{electrofisiológicos.} Por lo tanto, la adquisición de tejido DRG estructuralmente intacto y con precisión identificado por segmentos es fundamental para el estudio de circuitos neuronales sensoriales, características moleculares neuronales y alteraciones patológicas.

Los DRG se encuentran cerca de los forámenes intervertebrales y están conectados a la médula espinal a través de las raíces dorsales. Debido a su pequeño tamaño, el recinto dentro de estructuras óseas y la complejidad de la anatomía circundante, el aislamiento intacto presenta considerables desafíos técnicos. Además, la falta de puntos anatómicos claros y procedimientos estandarizados aumenta el riesgo de daño estructural o identificación errónea segmentaria durante la recogida de tejidos.

En comparación con los métodos existentes de disección con DRG en ratones, el método establecido en este estudio presenta varias ventajas. En primer lugar, los métodos de aislamiento de DRG en ratones previamente reportados generalmente requieren la extracción de la columna vertebral del animal, seguida de segmentación y apertura de la línea media de la columna aislada, tras lo cual los DRG se diseccionan de los forámenes intervertebrales. Durante este proceso, la tranzadura de la columna vertebral y el corte repetido pueden causar fácilmente daños mecánicos en la DRG y también pueden resultar en la omisión de ciertos segmentos o en una identificación segmentaria^{poco clara 8}. En cambio, nuestro método se realiza directamente in situ en el ratón, sin aislamiento o transección previa de la columna vertebral, reduciendo así el riesgo de pérdida de DRG durante la recogida de tejido. Durante todo el procedimiento, los instrumentos se aplican principalmente a las estructuras óseas y tejidos conectivos que rodean la DRG, en lugar de agarrar o tirar directamente del ganglio, preservando así su integridad.

En segundo lugar, los métodos existentes a menudo carecen de puntos anatómicos claros y estables para identificar diferentes segmentos de DRG. Debido a que los nervios conectados a la DRG son frecuentemente transectados durante la extirpación de la columna vertebral, resulta difícil determinar con precisión el origen segmentario de la DRG individual basándose en el curso nervioso y los patrones de ramificación. En cambio, nuestro método se realiza directamente in situ en el ratón y, por tanto, preserva las relaciones anatómicas naturales entre la DRG, los nervios conectados y las estructuras circundantes, permitiendo la identificación de diferentes segmentos de DRG según las conexiones nerviosas y los puntos anatómicos locales. Proponemos el uso de las características morfológicas de L2 y L3 como puntos de referencia anatómicos clave, junto con la relación anatómica entre L3–L5 y el nervio ciático, seguido de la identificación secuencial de los segmentos adyacentes tanto en las direcciones rostral como caudal.

Además, este método proporciona una descripción relativamente sistemática de los pasos clave, incluyendo la exposición de la columna vertebral y el conducto vertebral, la apertura del conducto vertebral con la posterior exposición de la médula espinal, la exposición de la DRG y la localización y disección guiadas por estereomicroscopio. El flujo de trabajo es claro y los hitos anatómicos están bien definidos, lo que puede mejorar la estandarización y la reproducibilidad de los procedimientos, especialmente para principiantes. Los DRG obtenidos con este método mantienen buena integridad tisular y, por tanto, son muy adecuados para análisis posteriores, incluyendo inmunofluorescencia y tinción H&E.

En este estudio, establecimos un método estandarizado de disección y aislamiento para la DRG en ratones y proporcionamos ilustraciones esquemáticas para la localización anatómica, junto con imágenes representativas y documentación en vídeo del procedimiento de muestreo. Este método permite aislar la DRG desde los niveles torácico hasta sacro en una sola muestra, al tiempo que reduce el riesgo de daño por DRG durante la recogida de tejido.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron estrictamente conforme al protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal del Hospital Shanghai East. Los procedimientos de disección descritos en este estudio se realizaron con ratones adultos C57BL/6 (macho o hembra, 12 semanas de edad, 25–30 g). La Figura 1 muestra los instrumentos de disección utilizados en este protocolo.

1. Preparación

NOTA: Para muestras fijadas en perfusión, adopte medidas protectoras adecuadas para evitar la exposición al fijador. Realiza la disección en una campana extractora o en un banco bien ventilado, y lleva el equipo de protección personal adecuado durante todo el procedimiento, incluyendo guantes, ropa protectora y gafas de seguridad.

1. Mantener a los ratones bajo un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a una temperatura ambiente de aproximadamente 24 °C y una humedad relativa del 55%, con acceso ad libitum a comida y agua.
2. Antes de comenzar la disección, eutanasia al ratón en una cámara de dióxido de carbono hasta que la respiración haya cesado por completo. Confirma la muerte, luego coloca al animal en posición supina sobre una tabla de disección y asegura las extremidades con alfileres para mantener una postura estable.
3. Rocía el pelaje sobre la región toracoabdominal con etanol al 70% para reducir la contaminación del pelo y mantener un campo operativo limpio.
4. Usa tijeras para abrir la piel a lo largo de la línea media del tórax y el abdomen. Extiende la incisión de forma craneal a lo largo de la línea media ventral para exponer completamente la jaula torácica. Eleva el extremo inferior del esternón y corta la pared torácica a ambos lados del arco costal para abrir la cavidad torácica y exponer el corazón. Retira parte del esternón y las costillas si es necesario para obtener una vista clara del corazón.
5. Haz una pequeña incisión en la aurícula derecha con tijeras para establecer una salida de sangre y perfundir. Llena una jeringuilla de 20 mL con PBS preenfriado (4 °C) e inserta lentamente la aguja en el ventrículo izquierdo cerca del ápice del corazón. Estabiliza la aguja y evita perforar la pared ventricular.
6. Perfunda PBS preenfriado lenta y uniformemente hasta que el hígado se ponga pálido, la salida sea clara y la mayor parte de la sangre haya sido lavada. Luego, se sustituye el PBS por 20 mL de paraformaldehído preenfriado al 4% (4 °C) y se continúa la perfusión a un ritmo lento y constante hasta que las extremidades se vuelvan rígidas, la cola se enrosca y los tejidos cambien de rojo a pálido, indicando que la fijación está en gran medida completa.
7. Tras la perfusión, retirar la aguja, eliminar cualquier líquido residual de la cavidad torácica y proceder inmediatamente a la recogida de tejido. Si se requiere tejido no fijado para los análisis posteriores, perfúnese solo con PBS preenfriado y omite el paso de fijación del paraformaldehído al 4%.
   NOTA: Mantenga una tasa de perfusión lenta, constante y uniforme durante todo el procedimiento para evitar roturas cardíacas o hinchazón tisular causada por presión excesiva. Realiza todos los procedimientos anteriores a temperatura ambiente.

2. DRG y nervios adyacentes (Figura 2)

1. Exposición de la columna vertebral y del conducto vertebral (3–5 min)
   1. Coloca el ratón en posición prona y asegúralo en la tabla de disección. Realiza una incisión longitudinal a lo largo de la línea media de la piel dorsal con tijeras, extendiendo la incisión desde la cola hacia el cuello.
   2. Utiliza tijeras para separar la piel dorsal del tejido conectivo subyacente, y refleja la piel lateralmente a ambos lados para exponer completamente la musculatura dorsal. Limpia el cabello adherido a la superficie del tejido conectivo con papel absorbente, o enjuaga el campo quirúrgico con solución fisiológica para mantener limpia la zona de operación.
   3. Incisa longitudinalmente los músculos dorsales y el tejido conectivo a ambos lados de la columna vertebral para exponer completamente las estructuras vertebrales.
      NOTA: Evitar que las tijeras penetren demasiado profundamente en la cavidad torácica o abdominal durante la incisión de los tejidos dorsales, ya que esto puede afectar a procedimientos de disección posteriores.
   4. Limpia cuidadosamente el tejido conectivo y el músculo residual que cubre la columna vertebral con un ronger óseo. Si el tejido residual interfiere con la visualización, recórtalo con tijeras según sea necesario para lograr la exposición completa de la columna vertebral. A continuación, corta las vértebras cervicales desde la parte dorsal con tijeras para separar el extremo craneal de la columna vertebral de la cabeza y facilitar los siguientes pasos.
2. Abre el conducto vertebral y expone la médula espinal (Figura 3; 8–10 min).
   1. Inserta tijeras microcurvas en el canal vertebral a nivel cervical y corta a ambos lados de las láminas para abrir el conducto.
      NOTA: Ten cuidado de evitar lesiones en la médula espinal durante el procedimiento.
   2. Retirar las láminas dorsales para exponer gradualmente la parte dorsal de la médula espinal.
   3. Continúe cortando las láminas dorsales a lo largo del eje longitudinal de la columna vertebral con tijeras microcurvas, extendiéndose progresivamente desde la región torácica hasta la sacra para exponer completamente la parte dorsal de la médula espinal.
3. Exposición del DRG (Figura 4; 8–10 min)
   1. Tras exponer completamente la superficie dorsal de la médula espinal, utiliza un rongeur óseo para abrir suavemente las estructuras del conducto vertebral lateralmente a ambos lados y alterna la manipulación entre el lado izquierdo y derecho.
   2. Una vez que el conducto vertebral ha sido completamente separado por ambos lados, observa la DRG situada dentro de los forámenes intervertebrales bajo un estereomicroscopio.
4. Identificación de la DRG (Figura 5; 8–10 min)
   1. Una vez que el conducto vertebral ha sido completamente reflejado bilateralmente y la médula espinal ha quedado completamente expuesta, examina los haces nerviosos de la raíz dorsal que surgen de la superficie dorsal de la médula espinal bajo un estereomicroscopio. Sigue las raíces dorsales lateralmente e identifica la DRG cerca de los forámenes intervertebrales como estructuras ovaladas u ovoides.
   2. Confirma durante la identificación que la DRG se encuentra en la interfaz entre la raíz dorsal del nervio espinal y el foramen intervertebral, y observa que está dispuesta como un par bilateral en cada segmento espinal. Identifica la DRG como un ganglio formado por los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales, con un lado entrando en el cuerno dorsal de la médula espinal y el lado opuesto extendiéndose hacia los tejidos periféricos.
   3. Utiliza un estereomicroscopio para identificar la DRG como una estructura tenue de color amarillo o gris blanco, ligeramente hinchada, con una forma más completa y límites comparativamente definidos.
5. Realizar la identificación segmentaria y disección del DRG (Figura 6; 8–10 min)
   1. Utiliza pinzas microquirúrgicas bajo un estereomicroscopio para elevar suavemente el haz nervioso de la raíz dorsal y así lograr la exposición completa del DRG adherido.
   2. Utilice las siguientes características para determinar la identidad segmentaria de la DRG: designar DRG conectadas a fibras nerviosas múltiples ramificadas (>2 ramas) como DRG L2 y más DRGs craneales, y designar DRG conectadas a fibras nerviosas bifurcadas (solo dos ramas) como DRG L3 y más caudales. A continuación, identifica secuencialmente los segmentos restantes de DRG arriba y abajo según la ubicación de los forámenes intervertebrales.
      NOTA: Las fibras nerviosas que surgen del DRG L3–L5 se fusionan para formar el nervio ciático.
   3. Utiliza tijeras curvas microquirúrgicas o pinzas microquirúrgicas para separar cuidadosamente el tejido conectivo y las fibras nerviosas que rodean la DRG, y liberar progresivamente el ganglio de sus fijaciones a los tejidos alrededor del foramen intervertebral.
   4. Transectar las fibras nerviosas de la raíz dorsal que conectan la DRG con la médula espinal, y al mismo tiempo cortar el haz nervioso que se extiende hacia la periferia para aislar el ganglio.
   5. Aísla cuidadosamente la DRG usando pinzas microquirúrgicas. Si se requiere preservación a largo plazo y un posterior análisis de inmunofluorescencia, colocar inmediatamente el DRG aislado en un tubo centrífugo de 0,5 mL que contenga un 4% de paraformaldehído y fijar el tejido durante 3 horas. Tras la fijación, lava el tejido durante 3 × 5 minutos con 0,1 M PBS (componentes principales: NaCl, KCl, Na2HPO4 y KH2PO4), y transfiere el tejido a una solución de sacarosa al 30% para la deshidratación hasta que se hunde en el fondo. Finalmente, incrustar el tejido en OCT y almacenarlo a −80 °C para su preservación a largo plazo.

3. Confirmar los componentes ganglionares.

1. Resultados de la tinción H&E (Figura 7)
   1. Fija el DRG aislado inmediatamente en un fijador histológico convencional, por ejemplo, paraformaldehído al 4%. Tras la fijación, enjuaga el tejido en un tampón fosfato de 0,1 M, realiza deshidratación, limpieza e incrustación de parafina según los procedimientos histológicos estándar, y prepara secciones de tejido de 4 a 6 μm para el análisis de tinción aguas abajo.
   2. Realizar tinción de hematoxilina y eosina (H&E) en las secciones para evaluar la estructura general y la morfología celular de la DRG. Utiliza las secciones teñidas para identificar los componentes celulares y la organización tisular del ganglio y para determinar la calidad del DRG extraído.
   3. Examina las secciones teñidas con H&E bajo un microscopio y confirma que la DRG está compuesta predominantemente por numerosos cuerpos neuronales sensoriales. Identifica neuronas con somatas grandes, redondeadas a ovoidales, y observa sus núcleos claramente visibles, así como los nucleolos prominentes presentes en algunas neuronas. También confirma la presencia de células gliales satélite muy opuestas que rodean las neuronas en una disposición característica en forma de anillo.
   4. Examina el interior del ganglio e identifica los haces de fibras nerviosas y los septos del tejido conectivo para confirmar que la arquitectura general del tejido está intacta y claramente organizada. Verifica que los límites celulares estén bien definidos y que no haya alteraciones tisulares evidentes ni desorganización estructural.
   5. Confirmar el aislamiento exitoso de DRG en la tinción H&E mediante la presencia de una estructura general preservada, morfología celular bien definida y ausencia de lesiones mecánicas evidentes. Detectar daños en la muestra observando la arquitectura celular alterada, márgenes tisulares indistintos o destrucción localizada del tejido que surgen durante la disección o el procesamiento. Utiliza estos hallazgos de H&E como base práctica para evaluar la calidad de la recogida de DRG y la integridad del tejido.
2. Resultados de la tinción por inmunofluorescencia de TUBB3 (Figura 8)
   1. Fija el DRG aislado inmediatamente en paraformaldehído al 4% durante 3 horas. Una vez finalizada la fijación, enjuaga el pañuelo tres veces en 0,1 M PBS, dejando 5 minutos para cada lavado. A continuación, coloca el tejido en una solución de sacarosa al 30% hasta que se asiente en el fondo, incorpóralo en OCT y corta secciones congeladas a 8–12 μm para la tinción de inmunofluorescencia posterior.
   2. Calienta las secciones a temperatura ambiente, enjuágalas 3 × 5 minutos en PBS y realiza la extracción de antígenos con la solución Tris-EDTA para la recuperación. Deja que las secciones se enfríen de forma natural hasta la temperatura ambiente, lávalas de nuevo 3 × 5 minutos con PBS y bloquea con un 5% de BSA durante 30–60 minutos a temperatura ambiente. Tras el paso de bloqueo, aplica el anticuerpo primario TUBB3 marcado con fluoróforo e incuba las secciones durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, lava las secciones tres veces con PBS, tiñe los núcleos con DAPI, monta las secciones y toma imágenes usando un microscopio de fluorescencia.
   3. Inspecciona las secciones de DRG y verifica que los ejemplares bien conservados presenten un contorno ganglionar distintivo, estructura tisular intacta y disposición celular ordenada. Observa la inmunofluorescencia de TUBB3 principalmente en los cuerpos celulares neuronales sensoriales y las fibras nerviosas para definir la distribución neuronal general dentro del ganglio. Utiliza la contratinción DAPI para identificar las células TUBB3 más grandes como neuronas sensoriales, y observa que los pequeños núcleos DAPI positivos distribuidos alrededor de estas células muestran un patrón morfológico consistente con los núcleos de células gliales satélite. Identificar daños relacionados con la disección o el procesamiento por alteración de la continuidad tisular, localización irregular de la señal TUBB3, morfología neuronal mal definida o aumentos focales en la señal de fondo.
   4. Aplicar tinción por inmunofluorescencia TUBB3 como indicador suplementario de la integridad del tejido DRG. Reconoce el aislamiento exitoso de DRG mediante la presencia de un contorno ganglionar preservado, señales de fluorescencia distintas en los cuerpos neuronales sensoriales y fibras nerviosas, morfología celular clara y una tinción de fondo mínima.

Resultados

El aislamiento exitoso de DRG requiere preservar la integridad del ganglio, sin compresión, aplastamiento ni desgarro evidentes. Levantar suavemente las fibras nerviosas conectadas lateralmente, liberar progresivamente el ganglio de los tejidos circundantes y transectar las fibras nerviosas conectadas solo después de que el ganglio haya sido completamente movilizado, para que pueda ser extraído intacto. Evita la tracción directa sobre el cuerpo ganglionar con instrumentos durante el proc...

Discusión

La DRG, como componentes clave del sistema nervioso sensorial periférico, desempeña un papel fundamental en la transmisión de información sensorial mecánica, térmica y nociceptiva al sistema nervioso^{central 9,10,11}. Las neuronas de la DRG presentan una morfología pseudounipolar característica, con un proceso que se extiende a los tejidos periféricos y el otro proyectándose hacia el cuerno dorsal...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.5 mL centrifuge tube	No especificado	No especificado	Usado para almacenamiento fijo de DRG
20 mL syringe	No especificado	No especificado	Usado para perfusión cardíaca
30% sucrose solution	No especificado	No especificado	Usado para deshidratación de tejido antes de la incrustación OCT
4% paraformaldehyde	Servicebio	G1101
5% BSA	Solarbio	SW3015
70% ethanol	No especificado	No especificado	Usado para reducir la contaminación por pelo antes de la disección
Absorbent paper	No especificado	No especificado	Usado para eliminar el pelo del tejido conectivo
Adult C57BL/6 mice	Vital River	No especificado	macho o hembra; 12 semanas de edad; 25–30 g
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG	Servicebio	GB25303
Anti-TUBB3 antibody	Proteintech	CL488-66375	Usado para inmunofluorescencia TUBB3
Carbon dioxide chamber	No especificado	No especificado	Usado para eutanasia
DAPI	Servicebio	G1012
Dissection board	No especificado	No especificado	Usado para asegurar el ratón durante la disección
Fluorescence microscope	No especificado	No especificado	Usado para imagen de secciones teñidas por inmunofluorescencia
Friedman-Pearson bone rongeurs	RWD	S21022-14	Extraído del manuscrito: bone rongeur (RWD, S21022-14)
H&E staining solution kit	Servicebio	G1005
Microsurgical curved scissors	ASSI	SDCT16R8	Extraído del manuscrito: micro curved scissors (ASSI, SDCT16R8)
Microsurgical forceps	Fine Science Tools	11254-20	Extraído del manuscrito: microsurgical forceps (FST, 11254-20)
OCT compound	Sakura Finetek	No. 4583
PBS	Servicebio	G2156
Pins	No especificado	No especificado	Usado para asegurar las extremidades en la tabla de disección
Saline	No especificado	No especificado	Usado para enjuagar el campo quirúrgico
Scissors	Fine Science Tools	14060-09	Extraído del manuscrito: scissors (FST, 14060-09)
Stereomicroscope	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania	10447197	Extraído del manuscrito: stereomicroscope (Leica, 10447197)
Tris-EDTA antigen retrieval solution	Solarbio	C1038