Reacción en cadena de hibridación FISH en el lóbulo óptico en desarrollo de Drosophila

Resumen

Este protocolo describe los pasos necesarios para realizar la hibridación de hibridación fluorescente fluorescente in situ (HCR-FISH) en los lóbulos ópticos larvales de Drosophila melanogaster . Se detallan procedimientos para el diseño de la sonda, hibridación, amplificación y montaje de tejidos para facilitar la visualización del lóbulo óptico en desarrollo.

Resumen

Comprender el desarrollo neuronal requiere una caracterización precisa de cuándo y dónde se expresan los genes. Técnicas como la hibridación in situ han permitido durante mucho tiempo la visualización de la expresión génica en tejidos en desarrollo. Aunque la hibridación in situ se utiliza ampliamente en embriones de Drosophila melanogaster , su aplicación al desarrollo del sistema visual ha estado limitada por varios desafíos técnicos. Por ejemplo, las sondas largas a menudo penetran mal en el lóbulo óptico, y los protocolos que dependen de reporteros catalíticos difusibles, como la peroxidasa de rábano picante, suelen ofrecer bajas relaciones señal-ruido en preparaciones de montaje completo. La hibridación fluorescente in situ por reacción en cadena por hibridación (HCR-FISH) supera muchas de estas limitaciones y permite una detección de señales más robusta. Al igual que en el FISH convencional, los monómeros de sonda de ADN se hibridan con secuencias de ARN dentro de los tejidos. Sin embargo, en HCR-FISH, las sondas amplificadoras conjugadas fluorescentes forman estructuras estables en forma de horquilla que desencadenan la polimerización de monómeros adicionales, amplificando así la intensidad de la señal. El uso de conjuntos de sondas multiplexadas también permite el uso de oligonucleótidos más cortos (~45 nt, frente a hasta 1.000 nt en el FISH convencional), mejorando la penetración de la sonda y produciendo una tinción más uniforme en muestras de montaje completo. Este artículo describe un protocolo HCR-FISH optimizado para el lóbulo óptico larvario de Drosophila . El protocolo adapta los enfoques existentes de HCR-FISH optimizando las condiciones de fijación y aumentando las concentraciones de sonda y horquilla para mejorar la intensidad de la señal y la penetración de tejidos. Se proporcionan listas de reactivos y procedimientos paso a paso. También se presentan aplicaciones potenciales en neurobiología del desarrollo, incluyendo la visualización de neuronas recién nacidas y la caracterización de patrones de expresión génica en casos donde los métodos convencionales, como proteínas marcadas endógenamente o la tinción de anticuerpos, no proporcionan información suficiente.

Introducción

Comprender cómo se ensambla el cerebro requiere identificar tanto la diversidad de tipos celulares presentes como los repertorios génicos expresados dentro de cada tipo celular¹. Los avances recientes en la secuenciación de ARN unicelular han permitido a los investigadores abordar estas preguntas con alta^{resolución 2}. Sin embargo, muchos enfoques de célula única no preservan la información espacial, lo que requiere experimentos adicionales para mapear los grupos celulares transcripcionales en sus ubicaciones dentro del cerebro en desarrollo.

Los sistemas binarios de expresión génica como GAL4-UAS pueden proporcionar información posicional pero no son^{cuantitativos 3}. Además, los retrasos entre la expresión génica y la detección por reporteros pueden ocultar patrones de expresión fisiológicamente relevantes durante las primeras etapas del desarrollo. La inmunotinción es otro enfoque ampliamente utilizado para determinar patrones de expresión específicos de tejido⁴. Sin embargo, las proteínas secretadas suelen ser difusas y difíciles de localizar con precisión.

Los enfoques de marcado por nucleótidos, como la hibridación in situ (ISH), también se han utilizado ampliamente para obtener información espacial sobre la expresión^{génica 5}. En ISH, los oligonucleótidos marcados de ADN se unen a secuencias de ARN complementarias inversas de interés. Los primeros métodos ISH utilizaban sondas de ADN^{radiomarcadas 6}, mientras que los protocolos posteriores incorporaron marcas más seguras como digoxigenina, fluoresceína y^{rodamina 7,8,9}. Los científicos adaptaron rápidamente la ISH para su uso en Drosophila melanogaster, donde se aplicó para caracterizar la organización cromosómica politena y mapear los patrones de expresión de genes de gap como el jorobado en embriones de montaje^{completo 10,11}.

A pesar de su amplia utilidad, varias limitaciones técnicas dificultaron la adopción de ISH en preparaciones más gruesas de montaje completo, como el lóbulo óptico larval. Muchos protocolos in situ se basaban en reporteros catalíticos difusibles, como la peroxidasa de rábano picante, que a menudo resultaban en relaciones señal-ruido^{bajas 12}. Además, muchos enfoques utilizaban sondas largas dirigidas a secuencias individuales para mejorar la especificidad. Aunque son eficaces en embriones de Drosophila y cromosomas politenos, las sondas largas penetran mal en el cerebro larvario y a menudo producen marcajes^desiguales 10,11,13.

El desarrollo de la ISH fluorescente de molécula única (smFISH) y la hibridación fluorescente en cadena in situ (HCR-FISH) abordaron muchas de estas^{limitaciones 14,15}. Al utilizar conjuntos de sondas cortas dispuestas en una sola región génica, smFISH reduce la longitud media de la sonda de aproximadamente 1.000 nt a aproximadamente 40 nt¹⁶. Esto mejora sustancialmente la penetración de la sonda manteniendo una intensidad de señal fuerte. HCR-FISH mejora aún más las relaciones señal-ruido utilizando sondas amplificadoras conjugadas fluorescentemente que aumentan la precisión posicional y amplifican la salida de señal. Es importante destacar que este paso de amplificación parece escalar linealmente con la concentración de los transcritos, permitiendo la medición cuantitativa de los niveles de expresión^{génica 17}.

HCR-FISH comienza con sondas iniciadoras complementarias a la secuencia objetivo. Estos oligonucleótidos de ADN no marcados contienen una secuencia iniciadora monocadena que se une al dominio de entrada de una sonda amplificadora H1 marcada fluorescentemente. Los amplificadores H1 adoptan una estructura en horquilla que mantiene la inactividad catalítica hasta unirse a la secuencia iniciadora. Al unirse, el amplificador H1 se abre y expone una secuencia que se une a una sonda compañera, H2. Esta interacción abre la horquilla H2, permitiendo que se conecte con otra sonda H1 (Figura 1)¹⁵. Los ciclos repetidos de unión H1/H2 generan un polímero estable que amplifica la señal de fluorescencia mientras reduce el ruido de fondo. Dado que cada secuencia de iniciador es específica de un par H1/H2 correspondiente, se pueden usar simultáneamente múltiples sondas con secuencias de iniciador distintas y fluoróforos para marcar varios genes dentro de la misma muestra.

Figura 1: Representación gráfica del flujo de trabajo HCR-FISH. Las sondas de ADN que contienen secuencias iniciadoras se hibridan en un transcrito de ARN objetivo. Las horquillas amplificadoras de ADN marcadas con fluorescencia se unen a la secuencia iniciadora y sufren polimerización secuencial para formar cadenas de amplificación estables de doble hebra. La conjugación directa con fluoróforo mejora la amplificación de la señal y la relación señal-ruido. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Las mejoras recientes en HCR-FISH han incrementado aún más su utilidad. El diseño de la sonda con iniciador dividido mejora la especificidad del amplificador, y los anticuerpos secundarios conjugados a los iniciadores de HCR permiten la inmunohistoquímica simultánea y^{HCR-FISH 18}. Además, las opciones ampliadas de fluoróforos permiten ahora la imagen multiplexada de hasta 10 genes^{simultáneamente 19,20}.

Aunque los experimentos iniciales de prueba de concepto para HCR-FISH se realizaron en pez cebra (Danio rerio), el método ha adquirido un uso generalizado en muchos sistemas, especialmente en organismos no modelo donde los anticuerpos son caros o no están disponibles¹⁵. La síntesis de sonda también ofrece una alternativa más rápida a la generación de anticuerpos, que puede requerir meses de desarrollo. En consecuencia, HCR-FISH proporciona un enfoque rápido para validar genes candidatos identificados mediante conjuntos de datos de secuenciación de ARN unicelular²¹. Incluso en organismos modelo genéticos establecidos, HCR-FISH proporciona un método valioso para mapear espacialmente neuronas recién nacidas cuando los reporteros GAL4 o la inmunohistoquímica no logran etiquetar adecuadamente poblaciones celulares específicas.

Este artículo describe un protocolo HCR-FISH optimizado para el lóbulo óptico larval de Drosophila en tercer estadio. El protocolo adapta métodos previamente publicados en otros organismos para su uso en el sistema visual de Drosophila ²². Las condiciones de fijación comúnmente utilizadas para la inmunohistoquímica de Drosophila se optimizaron para aplicaciones FISH. Se aumentaron las concentraciones de sonda y horquilla para mejorar la intensidad de la señal y la penetración del tejido. Se utilizaron tubos de PCR en lugar de placas puntuales para reducir el consumo de reactivos y facilitar el manejo de pequeñas muestras de tejido. Además, los tiempos de lavado e hibridación se acortaron para acomodar el tamaño más pequeño del cerebro de Drosophila en comparación con otros sistemas de insectos comúnmente usados para HCR-FISH.

Las aplicaciones representativas demuestran cómo este enfoque puede proporcionar información posicional para poblaciones neuronales específicas durante el desarrollo. Estos experimentos indican que ciertos transcritos, como los abruptos, pueden detectarse antes con HCR-FISH que con tinción por anticuerpos o líneas reporteras. También se discuten los posibles desafíos, estrategias de solución de problemas y aplicaciones de HCR-FISH para estudiar el desarrollo de sistemas visuales en Drosophila .

Protocolo

Todos los experimentos con Drosophila melanogaster se realizaron de acuerdo con las directrices del City College of New York, la Universidad de Columbia y la Universidad de Nueva York para el cuidado y uso de organismos de investigación. Las herramientas de investigación utilizadas en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparar los tampones

NOTA: Prepara todos los reactivos en tubos libres de nucleasa usando puntas de filtro.
NOTA: Lleva guantes durante todo el procedimiento. Limpia las superficies de trabajo con solución de descontaminación RNasa antes de empezar.

1. Preparar soluciones libres de nucleasas
   1. Prepara 1x PBS-T diluyendo 20x PBS, Triton X-100 y glicina en agua sin nucleasas a concentraciones finales de 1x PBS, 1% (v/v) Triton X-100 y 1 mM glicina.
   2. Preparar 5 veces SSCT diluyendo 20 veces SSC y Tween-20 en agua libre de nucleasas para preparar 5x SSC que contengan 0,1% (v/v) Tween-20.
   3. Diluye 20 PBS en agua sin nucleasas para preparar 1 PBS.

2. Sondas de diseño

1. Para diseñar sondas comercialmente, se selecciona la isoforma de interés para la especie de interés y se ordenan las sondas que se adapten al amplificador deseado mediante la interfaz web del fabricante.
   NOTA: Las químicas comerciales de las sondas HCR y las secuencias de iniciadores son propietarias y están bajo patente de Molecular Instruments.
   1. Modificar la región objetivo en la interfaz web si se desea detección específica de transcripción o pre-ARNm.
   2. Pide aproximadamente 20 sondas para transcripciones altamente expresadas. Utilizar hasta 40 sondas para transcritos de baja abundancia en preparaciones de Drosophila de montaje completo.
      NOTA: Solicita oligos especializados para transcripciones más cortas que permitan menos sitios de unión a las sondas.
2. Para diseñar sondas manualmente, descarga la secuencia FASTA para la transcripción objetivo. Determina si atacar una única isoforma o todas las isoformas del gen.
   NOTA: Prioriza los exones constitutivos o isoformas altamente expresadas identificadas en conjuntos de datos de secuenciación de ARN para mejorar la señal.
   1. Si se diseñan sondas para la detección previa al ARNm, diseñan sondas que abarquen las uniones intrón-exón. Diseñar sondas que abarcan uniones de empalme para detectar transcritos maduros. Utiliza sondas intrónicas para detectar transcritos incipientes dentro de los núcleos.
      NOTA: Las sondas intrónicas pueden no colocalizarse con los transcritos citoplasmáticos maduros y pueden requerir marcadores adicionales para la identificación celular.
   2. Determina el tamaño del conjunto de sondas. Utilizar un mínimo de aproximadamente 5 sondas para transcripciones cortas cuando no se puedan diseñar conjuntos de sonda más grandes. Utilizar 20 sondas para aplicaciones estándar y aproximadamente 40 sondas para una sensibilidad óptima en muestras de montaje^{completo 18,23}.
   3. Si diseñas tus propias sondas, usa secuencias de 25nt separadas por un separador de 2bp y añade secuencias de iniciadores divididas en el extremo de 5' de cada oligo.
      NOTA: Aunque las secuencias de iniciadores divididos de primera generación están disponibles públicamente, las secuencias comerciales de iniciador de próxima generación son^{propietarias 18}.
   4. Si diseñas tus propias sondas, valida las secuencias de sonda. Asegúrate de que las sondas dentro de cada conjunto tengan temperaturas de fusión similares. Confirma la identidad al 100% entre las sondas.
      NOTA: Evitar regiones fuertemente ricas en G y mantener un contenido de GC similar entre las sondas²⁴. Minimizar las secuencias repetitivas y evaluar la unión fuera del objetivo usando BLAST²⁵.
   5. Utilizar software de diseño de sondas disponible públicamente cuando sea apropiado^26,27.
      NOTA: Las herramientas de diseño de código abierto pueden no reproducir el rendimiento optimizado de las canalizaciones comerciales de diseño de sondas.

3. Diseccionar, fijar y prehibridar cerebros

1. Amortigua de hibridación de sonda precalentada hasta 37 °C.
   PRECAUCIÓN: El Buffer de Hibridación de la Sonda contiene formamida. Maneja bajo una campana extractora química mientras llevas el equipo de protección personal adecuado.
2. Diluir cada sonda fijada a una concentración final de 1 μM utilizando agua destilada libre de nucleasa.
3. Aproximadamente 250 μL de PBS libre de nucleasa sobre una placa de disección.
4. Transfiere una larva errante de tercer estadio al PBS usando pinzas. Sujeta el abdomen con un par de pinzas y agarra los ganchos bucales con un segundo par. Retira los ganchos bucales del cuerpo para aislar el cerebro y el cordón nervioso ventral (VNC).
5. Elimina los cuerpos grasos y las glándulas salivales manteniendo el VNC. Transfiere cerebros diseccionados a un tubo que contiene 600 μL de PBS libre de nucleasas heladas.
   NOTA: Mantén los lóbulos ópticos sumergidos durante toda la disección para evitar que el tejido se reseque.
6. Repite la disección hasta que se hayan recogido aproximadamente seis lóbulos ópticos. Completar las disecciones en 20 minutos para minimizar la degradación del tejido.
7. Añadir 200 μL de paraformaldehído (PFA) al 16% para lograr una concentración final del 4% de PFA. Invierte el tubo suavemente para mezclarlo e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente.
   PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico y mutageno. Maneja bajo una campana extractora química mientras llevas guantes.
8. Retira el fijador de las muestras y deposétalo como residuo químico designado. Lava muestras tres veces con 600 μL de PBS libre de nucleasas frías, utilizando un plato de disección para recoger las soluciones de lavado.
   NOTA: Inspecciona las soluciones de lavado para detectar pérdida de tejido y recupera cualquier cerebro desplazado bajo un microscopio disecable.
9. Transfiere cerebros a un tubo PCR que contiene 100 μL de buffer de hibridación de sonda precalentado.
   Mezcla suavemente haciendo un movimiento con el tubo y incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   NOTA: Asegúrate de que los cerebros permanezcan sumergidos y no se adhieran a las paredes del tubo.

4. Hibridar sondas

1. Prepara una solución de sonda de 4 nM añadiendo 0,4 pmol de cada sonda en el Buffer de Hibridación de la Prueba para un volumen final de 100 μL.
   NOTA: Aumenta la concentración de la sonda hasta 16 nM si la intensidad de la señal es baja en las tinciones iniciales.
2. Retirar el tampón de prehibridación sin alterar el tejido. Añade solución de sonda diluida a cada muestra.
3. Incubar muestras a 37 °C en un nutador durante 16–24 horas.

5. Amplificar la señal de la sonda

1. Lleva el buffer de amplificación a temperatura ambiente. Preparar aproximadamente 200 μL de buffer de amplificación por muestra.
2. Amortiguador de lavado equilibrado. Limpia el buffer de limpieza con sonda a 37 °C usando un baño maria.
   PRECAUCIÓN: El buffer de lavado de sonda contiene formamida. Manija bajo una campana extractora química.
3. Retirar la solución de la sonda y almacenarla a -20 °C para su reutilización.
   NOTA: Reutiliza las soluciones de la sonda hasta que la intensidad de la tinción disminuya.
4. Lava las muestras cuatro veces durante 10 minutos cada una en un tampón de lavado de sonda precalentado a 37 °C. Lava muestras dos veces durante 5 minutos cada una en 5 minutos a temperatura ambiente con 5x SSCT.
5. Añade 100 μL de buffer de amplificación sin horquillas. Incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente.
6. Calienta un termociclador a 95 °C. Añade 2 μL de cada pasador de 3 μM a tubos de PCR separados. Prepara un tubo para cada especie de horquilla.
   NOTA: Aumenta la concentración del amplificador si la tinción produce puntos dispersos o una baja relación señal-ruido.
7. Incuba horquillas a 95 °C durante 90 s. Protege los tubos de la luz e incuba a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.
8. Prepara la solución de amplificación. Combinar horquillas en Amplification Buffer hasta un volumen final de 100 μL por muestra.
9. Elimina el buffer de amplificación de las muestras. Añade un buffer de amplificación que contiene pasador.
   Incuba toda la noche a temperatura ambiente en un nutator protegido de la luz (envuelto en papel de aluminio).
10. Quita la solución de amplificación. Lava muestras dos veces durante 5 minutos en 150 μL de 5x SSCT. Lava muestras tres veces durante 10 minutos en 150 μL de 5x SSCT en un nutator. Realiza dos lavados breves en PBS libre de nucleasas para eliminar el detergente.

6. Montar cerebros para imágenes

1. Pega una pegatina de espaciador de imagen a una lámina de cristal. Presiona suavemente con la parte inferior de una pinza para eliminar las burbujas de aire atrapadas.
2. Divide el cerebro por la mitad a través del cordón nervioso ventral usando fórceps.
3. Coloca el cerebro en el centro del pozo espaciador. Orienta el tejido lateralmente con el lóbulo óptico orientado hacia arriba.
4. Añade suficiente medio de montaje antifade (unos 25 μL) para llenar el pozo sin introducir burbujas de aire. Distribuye el medio de montaje de forma uniforme usando pinzas.
5. Coloca un engobe sobre la muestra y sella con esmalte de uñas.

Resultados

Para los científicos que estudian la neurobiología del desarrollo, HCR-FISH proporciona un método robusto para visualizar patrones de expresión génica y determinar las posiciones espaciales de las neuronas en desarrollo dentro del lóbulo óptico de Drosophila .

En el lóbulo óptico de Drosophila (Figura 2A), las neuronas dentro del neuropilo de la médula surgen de células madre neuronales (neuroblastos) derivadas d...

Discusión

Este estudio describe una adaptación de HCR-FISH para su uso en el lóbulo óptico larval de Drosophila melanogaster . Los enfoques convencionales de hibridación in situ suelen funcionar mal en tejido cerebral larvario de montaje completo debido a la limitada penetración de la sonda y baja intensidad de señal. El protocolo presentado aquí optimiza varios pasos críticos para mejorar la calidad de la tinción en el lóbulo óptico en desarrollo. Las condiciones de fijación com...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10% Tween-20	Bio-Rad Laboratories	1662404	NA
20x PBS, pH7.4	Growcells.com	MRGF-6396	2.74M NaCl, 53.7 mM KCl, 20.3 mM Na2HPO4, 29.4 mM KH2PO4
20x SSC	Quality Biological	351-003-131	3M NaCl, 0.3M Sodium Citrate
37 °C incubator	Fisher Scientific (Isotemp)	15-015-2633	NA
37 °C water bath	Fisher Scientific	FSGPD15D	NA
Aluminum foil	Reynolds Wrap/Fisher Brand	15-078-291	NA
Antibody: Mouse-anti-Abrupt	DSHB	Abrupt; RRID: AB_528344	Dilution: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFP	Millipore Sigma	Catalog# 06-896; RRID: AB-619712	Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFP	Life Technologies	#11122; RRID: AB_221569	Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-Dll	Genscript/Desplan lab	-	Dilution: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherin	DSHB	DN-Ex #8, RRID: AB_528121	Dilution: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxN	Genscript/Desplan lab	-	Dilution: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jam	Gift from D. Godt	-	Dilution: 1:2,000
Antibody: Donkey anti-Rat 405	Jackson ImmunoResearch	Code # 712-475-150; RRID: AB_2340680	Dilution: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488	Jackson ImmunoResearch	Code #703-545-155; RRID: AB_2340375	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488	Jackson ImmunoResearch	Code #715-545-151; RRID: AB_2341099	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488	Jackson ImmunoResearch	Code #711-545-152; RRID: AB_2313584	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555	Thermo Scientific	Catalog #A-31572; RRID: AB_162543	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3	Jackson ImmunoResearch	Code #712-165-153; RRID: AB_2340667	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647	Jackson ImmunoResearch	Code #706-605-148; RRID: AB_2340476	Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647	Jackson ImmunoResearch	Code #712-605-153; RRID: AB_2340694	Dilution: 1:200
Antifade mountant	Thermo Fisher Scientific	S36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)	Other slowfades will work as well, including ones with DAPI (S36936)
Confocal Microscope	Zeiss	LSM-880	NA
Cover slips (22 x 30)	VWR	16004-332	NA
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAG	BDSC	38626; RRID: BDSC_38626	NA
Fly: D. melanogaster: Canton S	BDSC	64349; RRID: BDSC_64349	NA
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4	BDSC	1553; RRID: BDSC_1553	NA
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTB	BDSC	83660; RRID: BDSC_83660	NA
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;	BDSC	32198; RRID: BDSC_32198	NA
Fly: D. melanogaster: UAS-Stinger	BDSC	84277; RRID: BDSC_84277	NA
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4	BDSC	600136; RRID: BDSC_600136	NA
Forceps	Dumont	#5 or #55s	NA
Glass slides	VWR	16005-106	NA
Glycine	Millipore Sigma	G7126-10MG	NA
HCR Amplification buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR-Gold Amplifiers	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR HiFi Probes	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	NA
HCR Probe Hybridization Buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Contains formamide
HCR Probe Wash Buffer	Molecular Instruments	HCR Gold RNA-FISH Kit	Contains formamide
Nail polish (clear)	Electron Microscopy Sciences	72180	NA
Nuclease-free water (not DEPC-treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9937	NA
Nutating mixer	Corning/Fisher Scientific	10-320-100	NA
Paraformaldehyde, 16% (w/v)	Electron Microscopy Sciences	15710	Toxic
PCR Machine/Thermal Cycler	Bio-Rad	1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)	NA
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL)	USA Scientific	#1402-2400	NA
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)	Fisher Scientific	FB0875714	NA
RNase ZAP	ThermoFisher Scientific	AM9780	NA
Slide spacer stickers	SUNJin	IS016 (iSpacer stickers (0.2 mm deep))	NA
Sylgard elastomer kit (for making dissecting dishes)	Fisher Scientific	NC9285739	NA
Triton X-100	Merck Millipore Sigma	X100	NA