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Plataforma de nanoactuación magnética para la mecanoestimulación remota y controlable de células de Schwann con imágenes confocales en tiempo real

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DOI:

10.3791/71685

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8 de septiembre de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, 2Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, 3International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin Universit, 4Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

En este artículo

Resumen

Este protocolo presenta una plataforma de nanoactuación magnética compatible con microscopio que integra nanopartículas superparamagnéticas fluorescentes, un electroimán calibrado y un sistema de imagen confocal en tiempo real para estimular a distancia y de manera controlada a las células de Schwann y monitorear dinámicamente sus respuestas mecanosensoriales.

Resumen

Las fuerzas mecánicas regulan de forma crítica el comportamiento celular, sin embargo, muchos de los métodos existentes de estimulación mecánica dependen del contacto físico directo o de entornos extracelulares artificialmente diseñados, lo que limita su flexibilidad en estudios dinámicos con células vivas. Aquí presentamos una plataforma de nanoactivación magnética para la mecanoestimulación remota, sin contacto y controlable de células de Schwann in vitro. Este sistema integrado permite la estimulación magnética remota y la imagenología sincronizada de células vivas en una misma sesión experimental. Este manuscrito describe la preparación de nanopartículas superparamagnéticas fluorescentes (SPIONs), opcionalmente SPIONs funcionalizadas dirigidas al actin (f-SPIONs), la construcción y calibración de un dispositivo electromagnético compatible con microscopio para estimulación, la estimación de fuerzas magnéticas a nivel individual de partícula y de célula, y la integración de la activación magnética con imagenología confocal en tiempo real. Las células de Schwann son células gliales altamente mecanosensibles que desempeñan funciones esenciales en el desarrollo, mantenimiento y reparación de los nervios periféricos. La monitorización en tiempo real de sus respuestas a la estimulación mecánica es crucial para comprender cómo las fuerzas mecánicas influyen en la organización del citoesqueleto y el comportamiento celular. Esta plataforma proporciona un flujo de trabajo reproducible para el estudio de la mecanobiología de las células de Schwann y podría adaptarse a otros tipos celulares mecanoresponsivos y sistemas multicelulares.

Introducción

Las señales mecánicas regulan una amplia gama de procesos celulares, incluyendo adhesión, migración, proliferación, diferenciación y plasticidad fenotípica1,2,3. Estudios en mecanobiología han demostrado que tanto las neuronas como las células gliales exhiben una marcada mecanosensibilidad y capacidad de respuesta durante todo el desarrollo4,5,6,7. Para investigar cómo las células detectan y responden a las fuerzas, se han desarrollado múltiples enfoques experimentales, incluyendo microscopía de fuerza atómica (AFM), aspiración con micropipeta, pinzas ópticas, sistemas de cultivo basados en estiramiento y plataformas microfluídicas8,9,10,11,12. Estas técnicas han avanzado considerablemente el estudio de la mecanotransducción. Sin embargo, muchas requieren contacto físico directo con las células o dependen de entornos mecánicos artificiales predeterminados, lo que las hace menos adecuadas para estimulaciones remotas, dinámicamente controlables y compatibles con imágenes.

La administración de fuerzas mediante nanopartículas magnéticas ofrece una estrategia alternativa para la mecanoestimulación remota13,14,15,16,17,18. Dado que la mayoría de los tejidos biológicos presentan baja susceptibilidad magnética, los campos magnéticos aplicados externamente pueden penetrar muestras biológicas sin contacto directo y actuar selectivamente sobre partículas magnéticamente responsivas introducidas en células o tejidos. En presencia de un gradiente de campo magnético, estas partículas experimentan fuerzas direccionales que pueden utilizarse para imponer perturbaciones mecánicas a nivel subcelular, celular o tisular8,9. Este enfoque resulta atractivo porque es no invasivo, ajustable, compatible con imágenes en tiempo real y potencialmente extensible a sistemas biológicos más complejos.

Las células de Schwann son células gliales altamente mecanosensibles19,20 que desempeñan funciones esenciales en el desarrollo, mantenimiento y reparación de los nervios periféricos21,22. La observación dinámica de las respuestas de las células de Schwann a la estimulación física es fundamental para comprender cómo la fuerza regula la organización del citoesqueleto y el comportamiento celular. Sin embargo, muchos sistemas convencionales de aplicación de fuerzas no son fácilmente compatibles con la microscopía en tiempo real de alta resolución. Para abordar esta limitación, desarrollamos una plataforma de nanoactivación magnética que combina partículas magnéticas superparamagnéticas fluorescentes dirigidas al citoesqueleto de actina (f-SPIONs), un dispositivo electromagnético personalizado compatible con la platina de un microscopio confocal y un marco cuantitativo para la estimación de fuerzas. Este sistema integrado permite la estimulación magnética remota y la adquisición sincronizada de imágenes de células vivas en una misma sesión experimental.

El procedimiento descrito aquí incluye la preparación de superpartículas magnéticas fluorescentes (SPIONs), la funcionalización opcional dirigida a la actina mediante faloídicina para generar f-SPIONs, la caracterización de nanopartículas, la construcción del dispositivo electromagnético y la calibración del campo, la estimación de la fuerza magnética, y la combinación de estimulación magnética con imágenes confocales en tiempo real. Aunque en este caso se optimizó para células de Schwann, la plataforma podría proporcionar un marco práctico para estudios relacionados en otros sistemas vivos mecanosensibles.

Protocolo

Los experimentos descritos en este protocolo utilizaron una línea celular de Schwann de rata establecida (RSC96) y no involucraron participantes humanos ni animales vivos. Este estudio se realizó como parte de un proyecto de investigación más amplio que incluía experimentos con animales, el cual fue aprobado por el Comité de Bienestar y Ética Animal del Primer Hospital de la Universidad de Jilin (Número de aprobación: 2022-0045).

1. Preparación de superpartículas magnéticas fluorescentes

  1. Sintetice nanopartículas de Fe₃O₄ recubiertas con ácido oleico.
    ​NOTA: Las nanopartículas de Fe₃O₄ recubiertas con ácido oleico se sintetizaron mediante descomposición térmica según se describió previamente20,23.
    1. Agregue 2 mmol de Fe(acac)₃, 6 mmol de ácido oleico, 6 mmol de oleilamina y 5 mmol de 1,2-hexadecanodiol a 20 mL de éter bencílico en un matraz de reacción.
    2. Agite la mezcla bajo atmósfera de nitrógeno durante 15 min hasta obtener una solución precursora homogénea.
    3. Caliente la mezcla hasta 200 °C a una velocidad de 20 °C/min.
    4. Mantenga la reacción a 200 °C durante 30 min.
    5. Aumente la temperatura hasta 265 °C y mantenga la mezcla en reflujo durante 30 min.
    6. Deje enfriar la mezcla de reacción naturalmente hasta temperatura ambiente.
    7. Recupere las nanopartículas de Fe₃O₄ mediante separación magnética.
    8. Lave las nanopartículas tres veces con etanol.
    9. Redispersa las nanopartículas purificadas en tolueno.
  2. Ensamble superpartículas de Fe₃O₄·Cy3.5.
    ​NOTA: Las superpartículas de Fe₃O₄·Cy3.5 se prepararon según se describió previamente20,24,25.
    1. Disperse 28 mg de nanopartículas de Fe₃O₄ recubiertas con ácido oleico en 4 mL de tolueno en un matraz redondo de fondo plano de 50 mL con tres bocas.
    2. Prepare una fase acuosa que contenga 12,5 mg de dodecilsulfato de sodio y 3 mg de cianina 3.5 (Cy 3.5) en 12,5 mL de agua.
    3. Combine la suspensión de nanopartículas de Fe₃O₄ en tolueno (28 mg en 4 mL; 7 mg/mL) con la solución acuosa de tensioactivo/colorante para formar una microemulsión de aceite en agua.
    4. Mezcle completamente hasta obtener una emulsión estable.
    5. Caliente el matraz redondo de tres bocas a 60 °C y agite continuamente a 300 rpm durante 6 h.
      NOTA: No se requiere un procedimiento de evaporación bajo presión reducida ni evaporación rotatoria.
    6. Evapore el tolueno bajo las condiciones descritas anteriormente para inducir la agregación de las nanopartículas de Fe₃O₄. Utilizando una pipeta desechable, transfiera una pequeña alícuota de la solución a un tubo de ensayo y déjela reposar. La ausencia de separación de fases indica que el tolueno se ha eliminado completamente.
    7. Transfiera la suspensión de superpartículas de Fe₃O₄·Cy3.5 a tubos cónicos de 15 mL. Centrifugue a 2.370 × g durante 5 min a temperatura ambiente para recolectar las superpartículas, y deseche cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
    8. Redispersa el sedimento en agua desionizada ultrapura y centrifugue nuevamente a 2.370 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y repita el procedimiento de lavado tres veces para eliminar el colorante Cy3.5 libre residual y el dodecilsulfato de sodio.
  3. Recubra las superpartículas con polidopamina (PDA).
    ​NOTA: Las superpartículas recubiertas con polidopamina se prepararon según se describió previamente20,26.
    1. Centrifugue la suspensión de superpartículas de Fe₃O₄·Cy3.5 a 2.370 × g durante 5 min a temperatura ambiente, y deseche el sobrenadante.
    2. Redispersa el sedimento en tampón Tris 10 mM (pH 8,5).
    3. Agregue 26 mg de monómero de dopamina a la suspensión.
    4. Agite la mezcla a temperatura ambiente durante 3 h en condiciones alcalinas.
    5. Centrifugue la suspensión a 2.370 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    6. Elimine el sobrenadante y redispersa el sedimento en agua ultrapura para obtener partículas de Fe₃O₄·Cy3.5@PDA (SPIONs).
  4. Funcionalice opcionalmente las partículas con faloídicina-Alexa Fluor 350.
    ​NOTA: Las superpartículas se funcionalizaron en la superficie utilizando faloídicina-Alexa Fluor 350 disponible comercialmente20.
    1. Prepare 5 mL de solución acuosa que contenga 100 unidades de faloídicina-Alexa Fluor 350.
    2. Agregue 200 µL de suspensión de Fe₃O₄·Cy3.5@PDA que contenga 2 mg de partículas a la solución.
    3. Agite suavemente la mezcla a temperatura ambiente durante 24 h.
    4. Centrifugue la mezcla a 2.370 × g durante 5 min a temperatura ambiente.
    5. Deseche el sobrenadante y redispersa el sedimento en agua desionizada.
    6. Guarde la formulación final de Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@faloídicina (f-SPIONs) protegida de la luz hasta su uso.

2. Caracterización de las nanopartículas

  1. Determine la morfología y el tamaño.
    1. Prepare muestras de nanopartículas para microscopía electrónica de transmisión (TEM) o microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) según los requisitos del instrumento.
    2. Obtenga imágenes para determinar la morfología general de las partículas, la estructura núcleo-cáscara y el diámetro promedio (Figura 1).
    3. Prepare suspensiones acuosas de nanopartículas para dispersión dinámica de luz (DLS).
    4. Mida el diámetro hidrodinámico y el índice de politispersión (PDI).
    5. Compare los resultados de microscopía electrónica y DLS para evaluar la uniformidad de la formulación y el comportamiento coloidal.
  2. Determine las propiedades magnéticas.
    1. Prepare muestras de nanopartículas secas o concentradas adecuadas para análisis mediante dispositivo de interferencia cuántica superconductor (SQUID).
    2. Registre curvas de histéresis magnética a 300 K.
    3. Determine la magnetización de saturación, la remanencia y la coercitividad.
    4. Confirme que las partículas presentan un comportamiento superparamagnético con remanencia y coercitividad despreciables.
  3. Determine las propiedades de fluorescencia.
    1. Prepare una suspensión de f-SPION en agua desionizada ultrapura y transfiera la suspensión a una cubeta de cuarzo.
    2. Registre espectros de fotoluminiscencia utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia.
    3. Confirme que la señal fluorescente permanece detectable tras el lavado y la resuspensión.
  4. Valide la localización asociada a la actina al utilizar la formulación dirigida.
    1. Obtenga células RSC96.
      ​NOTA: Las células RSC96 utilizadas en este estudio, una línea de células de Schwann de rata transformada espontáneamente obtenida mediante cultivo prolongado de células de Schwann primarias de rata, fueron adquiridas del Banco de Células de la Academia China de Ciencias, Shanghái, China (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6) y dieron negativo para contaminación por micoplasma y hongos. Se utilizaron células entre los pasajes 3 y 10.
    2. Cultive las células en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y solución de penicilina-estreptomicina al 1% (100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina).
    3. Siembre células RSC96 a una densidad de 1 × 105 células por placa de microscopía de cultivo celular de 35 mm y cultívelas durante 24 h a 37 °C en una atmósfera humedecida que contenga 5% de CO₂ para permitir la adhesión celular.
    4. Aspire el medio de cultivo existente, lave las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y añada medio de cultivo completo que contenga 15 µg/mL de f-SPIONs. Incube las células con f-SPIONs durante 12 h.
    5. Aspire el medio de cultivo y lave las células dos veces con PBS frío que contenga 1 mM de deferoxamina para eliminar completamente las partículas no internalizadas.
    6. Obtenga imágenes confocales para evaluar la distribución intracelular de las partículas. Establezca los parámetros de imagen en una abertura de 1 unidad Airy (AU) y un paso z de 0.43 µm para obtener secciones ópticas de alta resolución de las estructuras intracelulares.
    7. Examine si las partículas muestran enriquecimiento en regiones celulares asociadas a la actina.

3. Construcción y calibración del dispositivo de estimulación electromagnética (Figura 2)

  1. Monte el dispositivo electromagnético.
    1. Construya un sistema compacto de bobinas electromagnéticas dimensionado para adaptarse al portaobjetos del microscopio confocal y a la cámara para células vivas (Figura 2A,B).
    2. Conecte la bobina a una fuente de alimentación regulable o a una fuente de corriente externa.
    3. Simular numéricamente el entorno de campo magnético gradiente utilizando COMSOL Multiphysics 4.3b (Figura 2C,D).
    4. Confirme que el electroimán genera el campo magnético gradiente (CMG) correspondiente bajo diferentes corrientes de entradaFigura 2G).
  2. Medir la densidad de flujo magnético y calibrar el campo magnético gradiente.
    1. Coloque el electroimán al lado del platillo de cultivo, con la punta del polo dirigida hacia el centro del platillo y situada a 1 mm de la pared exterior del mismo (Figura 2E,F).
    2. Mantenga esta configuración geométrica relativa entre el electroimán y la placa de cultivo durante todos los experimentos posteriores de estimulación magnética en células vivas y de imágenes.
    3. Utilice un medidor digital de Gauss para medir la densidad de flujo magnético en posiciones predeterminadas dentro de la región de estimulación, utilizando la cuadrícula de posicionamiento en la parte inferior de la placa de cultivo como referencia espacial.
    4. Calcule el gradiente del campo local a partir del cambio espacial en la densidad de flujo magnético.
    5. Calibre y valide el gradiente de campo magnético simulado numéricamente utilizando los valores de gradiente de campo magnético medidos experimentalmente y calculados.

4. Estimación de las fuerzas magnéticas entregadas por la plataforma.

  1. Defina el modelo de estimación de fuerza.
    1. Utilice la ecuación de fuerza para nanopartículas magnéticas en un campo magnético no uniforme27,28:
      Ecuación de equilibrio estático, F=(m·∇)B, sobre la interacción del campo magnético, para uso educativo.
    2. Bajo el supuesto de alineación superparamagnética con el campo aplicado, simplifique la ecuación a
      Ecuación de fuerza magnética \(F_{\text{f-SPION}}=m\frac{dB}{dr}\); fórmula para estudio de campo magnético.
      donde:
      F es la fuerza nanomagnética
      m es el momento dipolar magnético
      Ecuación Nabla B, símbolo de cálculo vectorial, que ilustra el flujo magnético en un diagrama de física. es el gradiente del campo magnético
      dB/dr es el gradiente del campo magnético (T/m) generado por el dispositivo correspondiente de generación de campo magnético.
    3. Utilice el gradiente de campo medido del dispositivo calibrado en todos los cálculos.
  2. Estime la fuerza que actúa sobre una sola nanopartícula.
    1. Determine las dimensiones promedio de las partículas a partir de imágenes de METAR.
    2. Calcule el volumen del núcleo magnético suponiendo geometría esférica.
    3. Estime el volumen magnético específico de Fe₃O₄ basado en la fracción magnética del núcleo.
    4. Calcule el momento dipolar magnético según Fórmula de cálculo de masa química \(m=\rho \cdot V \cdot M_m\), ecuación para estequiometría.
      donde:
      Mm representa la magnetización por masa de los f-SPIONs (16 A·m2/kg) bajo la intensidad de campo dada;
      ρ es la densidad del Fe₃O₄ (5,24 g/cm3).
      V es el volumen del núcleo magnético de Fe₃O₄ dentro de cada f-SPION (5,89 × 10⁻17 cm3).
    5. Multplique el momento dipolar por el gradiente de campo medido para estimar la fuerza que actúa sobre una sola nanopartícula (Ecuación de fuerza de equilibrio estático Ff-SPION; símbolo; uso educativo.).
  3. Estime la captación de nanopartículas por célula de Schwann.
    1. Siembre células de Schwann RSC96 a 5 × 105 células por pocillo en placas de microscopía para cultivo celular de 35 mm.
    2. Incube las células durante 24 h bajo condiciones estándar de cultivo.
    3. Sustituya el medio por medio fresco que contenga 15 µg/mL de f-SPIONs.
    4. Incube las células durante 12 h adicionales.
    5. Lave las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría (4 °C) que contenga 1 mM de deferoxamina.
    6. Recopile y cuente las células.
    7. Mida el contenido intracelular de hierro mediante espectroscopía de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente (ICP-AES).
    8. Calcule el número de partículas internalizadas por célula dividiendo la masa promedio de hierro por célula entre la masa de hierro por partícula Ecuación para la captación celular de SPIONs (n_cell^f-SPIONs) en investigación de imágenes médicas..
  4. Estime la fuerza entregada a una sola célula de Schwann.
    1. Calcule la fuerza a nivel celular según
      Ecuación de equilibrio estático, F_cell=n^f-SPIONs_cell·F_f-SPION, fórmula; análisis de balance de fuerzas.
      donde:
      Ecuación de fuerza de equilibrio estático Ff-SPION; símbolo; uso educativo. es la fuerza magnética ejercida sobre un solo f-SPION.
      Ecuación de concentración de SPIONs, \( n^\text{f-SPIONs}_\text{cell} \), notación científica, diagrama. es el número de f-SPIONs internalizados por célula.
      Fcell es la fuerza magnética ejercida sobre una sola célula.
    2. Informe el valor resultante como la fuerza magnética estimada entregada a una sola célula de Schwann (Fcell).
    3. Indique claramente que el valor es una estimación basada en un modelo y no una medición directa de la fuerza intracelular.

5. Combinación de la estimulación magnética con imágenes en tiempo real mediante microscopía confocal de barrido láser (CLSM)

  1. Cargar células de Schwann con nanopartículas magnéticas.
    1. Siembre células de Schwann en placas de cultivo ibidi compatibles con imágenes o en cámaras de cultivo microfluídicas.
    2. Permita que las células se adhieran y se recuperen.
    3. Sustituya el medio existente por medio de cultivo fresco que contenga 15 µg/mL de f-SPIONs.
    4. Incube las células durante 12 h para permitir la carga con f-SPIONs.
    5. Inspeccione la morfología celular antes de continuar.
  2. Eliminar las partículas no internalizadas.
    1. Retire el medio que contiene las nanopartículas.
    2. Lave las células dos veces con PBS que contenga 1 mM de deferoxamina.
    3. Sustituya la solución de lavado por medio para células vivas compatible con imágenes.
    4. Confirme un fondo bajo de partículas extracelulares antes de la adquisición de imágenes.
  3. Integrar el dispositivo electromagnético con el sistema de imágenes CLSM.
    1. Monte el electromagneto con la cámara de cultivo para células vivas, colocando el electromagneto en su posición previamente calibrada.
    2. Coloque la cámara de cultivo ensamblada sobre la platina del microscopio confocal (Figura 3). Confirme que la placa de cultivo se encuentra dentro de la región efectiva de estimulación (Figura 3A).
    3. Active el electromagneto según los parámetros preestablecidos y confirme la exposición a un campo magnético con gradiente efectivo en el área de la placa de cultivo (Figura 3B).
    4. Confirme que el objetivo puede alcanzar el plano focal sin interferencias.
    5. Confirme que el dispositivo no obstaculiza la posición del objetivo ni el movimiento de la platina.
    6. Considerando el calor generado durante el funcionamiento del electromagneto, ajuste la configuración de temperatura de los componentes de la cámara para células vivas según las condiciones óptimas de cultivo previamente determinadas, para asegurar un entorno interno de 37 °C y 5% CO₂ (Figura 3C).
    7. Confirme que todo el sistema funcione de manera normal y estable.
  4. Imagen funcional de Ca2⁺ en células vivas.
    1. Incube las células con solución de Krebs–Ringer (pH 7.4) que contenga 3 µM de Fluo-4 AM y 0.1% de Pluronic F-127 a 37 °C durante 30 min.
    2. Tras la incubación, lave los cultivos dos veces con PBS y transfiéralos a la plataforma de imágenes para células vivas del sistema CLSM para la adquisición de imágenes (Figura 4A).
    3. Utilizando la cuadrícula de posicionamiento en el fondo de la placa de cultivo ibidi, capture imágenes de cinco ubicaciones predefinidas.
    4. Divida cada campo de imagen en 25 regiones iguales y seleccione de 0 a 3 células de cada región para la cuantificación de fluorescencia, según la densidad celular real en dicha región.
    5. Defina el contorno completo de una célula individual como la región de interés (ROI) y supervise la respuesta de calcio inducida magnéticamente analizando los cambios en la intensidad de fluorescencia (ΔF) dentro de la ROI.
    6. Calcule el cambio en la intensidad de fluorescencia como ΔF = (Fstim - F0). Considere que un cambio en la intensidad de fluorescencia antes y después de la estimulación (ΔF/F0) superior al 10% constituye un evento de respuesta de calcio.
      ​NOTA: Funstim representa la intensidad de fluorescencia antes de la estimulación con fuerza magnética, F0 representa la intensidad de fluorescencia basal y Fstim representa la intensidad de fluorescencia evocada tras la estimulación con fuerza magnética.
    7. Para la corrección del fondo, reste la intensidad media de fluorescencia de fondo medida en una región sin células del valor de intensidad de fluorescencia de cada ROI.
    8. Realice tres experimentos independientes, incluyendo una placa de cultivo en cada experimento.
  5. Realice imágenes de lapso de tiempo y aplique estimulación magnética durante la adquisición.
    1. Configure los parámetros de imágenes de lapso de tiempo de la siguiente manera: un intervalo de adquisición de 2.1 s por cuadro, una duración total de adquisición de 650 s y una imagen de sección óptica de alta resolución estándar usando 1 AU.
    2. Durante la obtención de imágenes celulares, adquiera imágenes continuamente durante 50 s sin entrada de corriente para registrar la intensidad de fluorescencia de calcio intracelular en ausencia de estimulación con fuerza magnética (Funstim) (Figura 2H y Figura 4B).
    3. Normalice la intensidad de fluorescencia registrada durante los primeros 50 s y defínala como la intensidad de fluorescencia basal (F0).
    4. Posteriormente, aplique una corriente constante de 3.0 A al electromagneto, exponiendo a las células de Schwann cargadas con nanopartículas magnéticas a un campo magnético con gradiente de 3.25 T/m y sometiéndolas así a una estimulación con fuerza magnética. Continúe con la adquisición de imágenes de lapso de tiempo durante 10 min para registrar la intensidad de fluorescencia de calcio intracelular durante la estimulación con fuerza magnética (Fstim) (Figura 2H y Figura 4C).
    5. Calcule cuantitativamente el cambio en la intensidad de fluorescencia como ΔF/F0 (Figura 4D,E).
  6. Realice análisis estadístico y analice los datos de fluorescencia de Ca2⁺.
    1. Para cada célula, calcule el valor mediano de ΔF/F₀ a lo largo de la serie temporal analizada y utilice este valor como métrica de respuesta de Ca2⁺ a nivel celular.
    2. Realice tres experimentos independientes para cada condición experimental, con una placa de cultivo por condición en cada experimento. Agrupe las células analizadas a través de los tres experimentos independientes para su presentación descriptiva y reporte n como el número total de células analizadas en cada grupo.
    3. Evalue la normalidad de los datos de ΔF/F₀ a nivel celular mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov.
    4. Dado que los datos de respuesta de fluorescencia de Ca2⁺ no siguen una distribución normal, presente los datos como mediana y rango intercuartílico (RIC).
    5. Analice las diferencias entre grupos utilizando la prueba no paramétrica de Friedman, seguida de pruebas de rangos con signo de Wilcoxon para comparaciones por pares, como se ha reportado previamente.
    6. Considere que un valor de P < 0.05 indica significancia estadística.

Resultados

La microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) mostró que la formulación final de nanopartículas poseía un núcleo magnético agrupado y una capa externa tras la modificación de la superficie (Figura 1). Los f-SPIONs finales tenían un diámetro total promedio de 63,36 ± 16,65 nm, con un núcleo magnético rico en Fe₃O₄ de aproximadamente 56,60 ± 6,19 nm y una capa externa compuesta de polidopamina y faloidina-Alexa Fluor 350 con un espesor promedio de aproximadamente 5,79 ± 1,36 nm. Estos resultados confirmaron la construcción exitosa de una arquitectura de superpartícula adecuada para la actuación magnética y la visualización basada en fluorescencia.

El análisis de la histéresis magnética mostró que las partículas presentaban un comportamiento superparamagnético pronunciado, con remanencia y coercitividad despreciables. Bajo un campo magnético aplicado de 10,000 Oe (1,0 T), su magnetización de saturación alcanzó aproximadamente 35 A·m2/kg (Figura 5). En ausencia de un gradiente de campo magnético, los f-SPION mostraron buena dispersibilidad en un medio acuoso (Figura 6A). Al exponerse a un campo magnético con gradiente, los f-SPION demostraron una respuesta magnética sensible (Figura 6B). El análisis de fluorescencia confirmó además que las partículas conservaron la detectabilidad óptica tras la síntesis y la modificación de superficie (Figura 7).

El dispositivo de estimulación electromagnética se integró con éxito en el sistema de imagenología de células vivas (Figura 3). La calibración del campo magnético mostró que el dispositivo generó un campo magnético gradiente estable a través de la región de cultivo celular (Figura 2E,F), con un campo magnético gradiente in vitro de aproximadamente 3,25 T/m bajo la configuración experimental actual (Figura 2G).

La imagen confocal demostró una carga eficiente de las nanopartículas magnéticas fluorescentes en las células de Schwann (Figura 7). Después del lavado, la señal de fluorescencia permaneció principalmente asociada a las células en lugar de a partículas libres en el medio. Para la formulación dirigida a la actina, la imagen confocal mostró además un enriquecimiento de las partículas en regiones celulares asociadas a la actina.

La imagen confocal de lapso de tiempo demostró que la estimulación magnética y la imagen de células vivas pueden realizarse dentro del mismo flujo experimental, manteniendo un acceso óptico estable a las células durante todo el período de estimulación. (Figura 2H y Figura 4A).

Un resumen cuantitativo vinculó además el diseño de nanopartículas, la calibración del dispositivo y la carga celular. Bajo el campo magnético gradiente in vitro de 3,25 T/m, se estimó que la fuerza magnética que actúa sobre un solo f-SPION era aproximadamente 1,59 × 10-5 pN. Basándose en la cuantificación intracelular de hierro, cada célula de Schwann RSC96 internalizó aproximadamente 9,30 ± 2,88 × 103 partículas, lo que corresponde a una fuerza magnética total estimada de aproximadamente 0,15 ± 0,05 pN por célula.

En comparación con la fluorescencia basal, bajo la estimulación magnética mediada por f-SPIONs, las células RSC96 mostraron dinámicas activas de Ca2+ y señales de fluorescencia de Ca2+ significativamente aumentadas (Figura 4D). El análisis cuantitativo de las señales de fluorescencia de Ca2+ reveló que el cambio en la intensidad de fluorescencia de Ca2+ (ΔF/F0) dentro de las células RSC96 en el grupo con estimulación magnética (62,96 [35,07–91,67]) fue significativamente mayor que en el grupo control normal (-5,74 [-15,66–1,20]), el grupo control con f-SPIONs (-16,70 [-22,02–-12,00]) y el grupo control con campo magnético gradiente (-12,90 [-21,24–-6,97]) (Figura 4E).

Estructura de nanopartículas en imágenes de microscopía electrónica; análisis de microscopía electrónica que muestra detalles de nanopartículas agrupadas.
Figura 1: Morfología y estructura núcleo-cáscara de los f-SPIONs mediante HRTEM. (A) Los f-SPIONs son esféricos y presentan una estructura típica de tipo núcleo-cáscara, con un núcleo magnético interno compuesto por nanopartículas de Fe₃O₄ y Cy3.5. (B) La capa externa está compuesta por PDA y faloídicina-Alexa Fluor 350. Las imágenes del panel B muestran vistas ampliadas representativas de las regiones delimitadas por cuadros rojos en el panel A, donde las líneas blancas y las flechas indican el grosor medido de la cáscara. La barra de escala en el panel B representa 10 nm. Se realizaron tres mediciones independientes, con un total de 680 nanopartículas analizadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama del dispositivo electromagnético con alambre de cobre y núcleo de hierro; simulaciones del campo magnético; gráfico del campo.
Figura 2: Construcción, calibración y funcionamiento del electroimán personalizado para la estimulación magnética en células vivas. (A,B) La bobina del electroimán se enrolló alrededor de un núcleo de hierro utilizando alambre de cobre esmaltado de 1,1 mm, con un total de 410 vueltas. La bobina tenía un diámetro exterior de 60 mm, un diámetro interior de 20 mm, una longitud de 110 mm y una resistencia de corriente continua de aproximadamente 1,2 Ω. La punta polar medía 13,0 mm × 12,0 mm × 3,0 mm (longitud × ancho × altura) y estaba fabricada con permalloy 1J50. (C,D) La corriente de entrada máxima del electroimán no superó los 3 A. Con una corriente de entrada de 3 A, se generó un gradiente de campo magnético de aproximadamente 6,7 T/m cerca de la punta polar. (E,F) Distribución del gradiente de campo magnético dentro del recipiente de cultivo cerca de la punta polar con una corriente de entrada de 3 A. Se generó un gradiente de campo magnético estático promedio de aproximadamente 3,25 T/m en toda la región de imagen celular. (G) Gradientes de campo magnético generados por el electroimán con diferentes corrientes de entrada de 1 A, 2 A y 3 A. (H) Protocolo para la adquisición de imágenes de lapso de tiempo en células vivas, aplicación de corriente y exposición al gradiente de campo magnético en este estudio. Se adquirieron imágenes de lapso de tiempo continuamente durante 50 s sin entrada de corriente. Luego se aplicó una corriente continua constante de 3,0 A, y la adquisición de imágenes de lapso de tiempo continuó durante 10 min. CC: Corriente continua. GMF: Gradiente de campo magnético. Los paneles E, F y G se adaptaron con autorización de Liu et al.20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cámara de cultivo de células vivas con imagenología CLSM, electroimán, calentadores y configuración de corriente continua.
Figura 3: Integración del electroimán en la cámara de cultivo de células vivas. (A) Un electroimán compacto personalizado colocado en la posición calibrada dentro de la cámara de cultivo de células vivas para exponer el área del recipiente de cultivo celular a un campo magnético gradiente. (B) Configuración integrada del sistema de microscopía de barrido láser confocal (CLSM), la plataforma de nanoactivación magnética y la fuente de alimentación externa de corriente continua. (C) La optimización de los ajustes de temperatura para los componentes individuales de la cámara de cultivo celular garantiza una temperatura estable dentro del recipiente de cultivo durante el funcionamiento del electroimán. (D) Parámetros de ajuste de temperatura para los componentes individuales de la cámara de cultivo celular. CLSM: microscopía láser confocal de barrido. PV: Valor medido. SV: Valor establecido. Calentador superior: Temperatura del calentador de la tapa superior. Calentador de la platina: Temperatura de calentamiento de la platina del microscopio y de la base de la cámara de cultivo. Calentador del baño: Temperatura del baño de agua. Calentador del objetivo: Temperatura del calentador del objetivo del microscopio. Sensor de temperatura: Temperatura real medida por la sonda de temperatura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de nanoactivación magnética; f-SPIONs, iones de calcio, microscopía DIC, resultados de fluorescencia.
Figura 4: Imágenes representativas de las respuestas de calcio en células de Schwann bajo estimulación por fuerza magnética. (A) Flujo de trabajo integrado para la estimulación magnética y la obtención de imágenes de Ca2+ en células vivas en la plataforma de nanoactivación magnética. (B) Imagen de fluorescencia de Ca2+ en condiciones basales adquirida antes de la estimulación magnética (Funstim). (C) Imagen de fluorescencia de Ca2+ adquirida después de la estimulación magnética (Fstim), que muestra el cambio en la intensidad de fluorescencia (ΔF). (D) Trazas del señal de Ca2+ resueltas en el tiempo registradas antes y después de la estimulación magnética. (E) Análisis cuantitativo y comparación de los cambios en la fluorescencia de Ca2+ (ΔF/F₀) entre los diferentes grupos experimentales. DIC: Contraste por interferencia diferencial. Funstim: la intensidad de fluorescencia antes de la estimulación por fuerza magnética. F0: la intensidad de fluorescencia basal. Fstim: la intensidad de fluorescencia inducida tras la estimulación por fuerza magnética. ΔF: el cambio en la intensidad de fluorescencia. «Normal» representa el grupo control normal, «f-SPIONs+GMF» representa el grupo de nanoactivación magnética, «f-SPIONs» representa el grupo control de f-SPIONs y «GMF» representa el grupo control de campo magnético gradiente. Se realizaron tres experimentos independientes, con un plato de cultivo por condición experimental en cada experimento. Para cada célula, el valor mediano de ΔF/F₀ a lo largo de la serie temporal analizada se utilizó como métrica de respuesta a nivel celular. Los datos se presentan como mediana y rango intercuartílico (RIC), y n indica el número total de células analizadas en los tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba de Friedman seguida de la prueba de rangos con signo de Wilcoxon, como se informó previamente en Liu et al. Los datos cuantitativos del panel E fueron adaptados con permiso de Liu et al.20. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Gráficos de magnetización frente a campo, bucle de histéresis a 300 K, análisis de propiedades magnéticas, gráfico.
Figura 5: Propiedades superparamagnéticas de los f-SPIONs. (A) Bucle de histéresis magnética de los f-SPIONs, que muestra un comportamiento superparamagnético típico. (B) Vista ampliada del bucle de histéresis cerca del campo magnético cero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Experimento de campo magnético: bobina con vial. Efecto de encendido/apagado del CMG sobre la dispersión (IPD: 0.16).
Figura 6: Dispersabilidad acuosa y respuesta a campos magnéticos graduados de los f-SPIONs. (AEn ausencia de un campo magnético gradiente, los f-SPION permanecen bien dispersos en el medio acuoso.B) Cuando se aplica el campo magnético gradiente, los f-SPIONs migran y se acumulan rápidamente a lo largo de la dirección del gradiente del campo. GMF: Campo magnético gradiente. PDI: Índice de politdisersión. La flecha indica la dirección del campo magnético gradiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Imagen de células con nanopartículas de Fe3O4; microscopía de fluorescencia que muestra fusión de DIC, Cy3.5 y faloína.
Figura 7: Imagen de fluorescencia por microscopía confocal láser (CLSM) de la internalización de f-SPION en células de Schwann. (A) Imagen por CLSM de células de Schwann tras coincubación con f-SPION (15 µg/mL) durante 12 h y posterior lavado (pinza = 1 AU; paso z = 0,43 µm), que muestra morfología celular conservada y fondo mínimo de partículas extracelulares. (B) Fluorescencia roja detectada en el canal Cy3.5 (Ex/Em: 561–568/607 nm), que indica la presencia de f-SPION marcados con Cy3.5 dentro de las células de Schwann. (C) Fluorescencia azul detectada en el canal Alexa Fluor 350 (Ex/Em: 350–360 nm/440–460 nm), lo que respalda la incorporación exitosa del módulo de funcionalización con faloína-Alexa Fluor 350. (D) Imagen fusionada que muestra una superposición espacial considerable entre las señales de fluorescencia roja y azul, lo que concuerda con la construcción exitosa de las superpartículas magnéticas-fluorescentes. DIC: Contraste por interferencia diferencial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Se reconoce ampliamente a las nanopartículas de óxido de hierro como nanomateriales magnéticos con biocompatibilidad favorable. Como agentes de contraste ampliamente utilizados en imágenes por resonancia magnética, las nanopartículas superparamagnéticas de Fe₃O₄ se han aplicado extensamente en el diagnóstico clínico por imágenes29,30. En un estudio reciente de nuestro grupo20, se demostró que las f-SPIONs exhiben citotoxicidad extremadamente baja y una excelente biosseguridad. La plataforma de actuación nanomagnética, construida utilizando f-SPIONs como actuadores mecánicos en combinación con un electroimán controlable, activó eficazmente la dinámica del citoesqueleto en células de Schwann, indujo la apertura del canal iónico mecanosensible Piezo1, desencadenó la entrada transmembranal de Ca2⁺ y, posteriormente, promovió la «reprogramación» de la expresión génica y cambios fenotípicos en las células20.

Varios pasos son particularmente importantes para la implementación exitosa de esta plataforma. El primer paso crítico es la preparación de las nanopartículas. Las partículas deben mantenerse bien dispersas, magnéticamente responsivas y ópticamente detectables tras la síntesis y la modificación de superficie. La agregación en cualquier etapa puede reducir la consistencia de la absorción celular, alterar las propiedades magnéticas efectivas y comprometer la calidad de la imagen en células vivas.

El segundo paso crítico es el procedimiento de carga y lavado celular. La concentración de nanopartículas y el tiempo de incubación deben ser suficientes para producir una carga intracelular detectable sin causar una acumulación excesiva extracelular ni comprometer la morfología celular. Es esencial la eliminación completa de las partículas no internalizadas y las asociadas a la membrana, particularmente cuando se utiliza imagen de fluorescencia para evaluar la localización intracelular. Un lavado inadecuado puede llevar a una interpretación errónea de los patrones de localización y también puede distorsionar las estimaciones de fuerza a nivel celular.

El tercer paso crítico es la alineación geométrica del dispositivo de estimulación magnética con respecto a la muestra. Dado que la fuerza magnética depende directamente del gradiente local del campo, la posición relativa entre la bobina electromagnética y el plano de la muestra debe mantenerse constante respecto a la configuración de calibración. Incluso pequeños cambios en la distancia o alineación entre la bobina y la muestra pueden alterar las condiciones efectivas de estimulación.

La plataforma puede modificarse según la pregunta biológica que se esté abordando. Cuando es suficiente una carga magnética general y la aplicación de fuerza, pueden utilizarse las superpartículas fluorescentes recubiertas con PDA (SPIONs) sin funcionalización dirigida a la actina. Cuando se desea una localización subcelular cercana a regiones ricas en actina, puede utilizarse en su lugar la formulación funcionalizada con faloidina (f-SPIONs). Esta modularidad constituye una ventaja práctica de la plataforma.

La técnica actual tiene varias limitaciones. En primer lugar, el número calculado de partículas magnéticas incorporadas por célula representa un valor promedio de la población, mientras que la carga de partículas a nivel de célula individual muestra inevitablemente heterogeneidad. En segundo lugar, los valores de fuerza magnética reportados en este estudio son estimaciones basadas en modelos, no mediciones directas de cargas mecánicas intracelulares. En tercer lugar, este protocolo fue diseñado y desarrollado principalmente para células de Schwann cultivadas bajo condiciones de imagen in vitro. En sistemas de cultivo celular tridimensionales densos y en tejidos, puede ser necesario un ajuste sustancial, ya que la incorporación de nanopartículas, la distribución intracelular, la accesibilidad óptica y el acoplamiento mecánico pueden diferir de los observados en cultivos bidimensionales. Por último, la estrategia opcional dirigida al actinio aumenta la probabilidad de que las partículas se localicen en regiones asociadas al actinio, pero no garantiza una localización uniforme ni específica de todas las estructuras ricas en actinio dentro de células vivas.

A pesar de estas limitaciones, la presente plataforma de nanoactuación magnética ofrece varias ventajas metodológicas claras frente a las técnicas existentes de aplicación de fuerzas. Por ejemplo, la microscopía de fuerza atómica (AFM) permite una aplicación precisa de fuerzas localizadas, pero requiere contacto mecánico directo con el objetivo y no siempre se integra fácilmente con imágenes de células vivas a largo plazo8. Los sistemas basados en estiramiento y los sustratos diseñados pueden proporcionar señales mecánicas a nivel de población celular, pero dependen de interfaces materiales predefinidas y no son adecuados para la aplicación remota de fuerzas intracelulares10. Las pinzas ópticas ofrecen una alta resolución espacial para la aplicación de fuerzas, pero conllevan riesgos de daño tisular inducido por láser8. Los métodos basados en micropipetas son relativamente sencillos de operar, pero tienen un rendimiento y una resolución de fuerza relativamente bajos12. Los sistemas microfluídicos son ventajosos para generar microentornos mecánicos específicos, como el esfuerzo cortante y la presión del fluido, pero enfrentan desafíos técnicos para reproducir entornos celulares complejos e integrar múltiples modos de estimulación mecánica11. En contraste, la presente plataforma integra dentro de un único flujo de trabajo la estimulación remota y sin contacto, la nanoactuación magnética controlable, el seguimiento de partículas basado en fluorescencia y la compatibilidad directa con imágenes confocales en tiempo real.

La misma estrategia general puede adaptarse a otros tipos celulares mecanorresponsivos y a modelos biológicos más complejos. También podría extenderse a sistemas multicelulares más densos, como organoides neuronales, quistes epiteliales u epitelios similares al riñón de perro Madin-Darby (MDCK). En tales contextos, se requeriría una optimización adicional para la penetración de partículas, la distribución de partículas y la estimación de fuerzas en muestras tridimensionales mecánicamente acopladas. Incluso con estos desafíos, el procedimiento actual proporciona una base práctica para el desarrollo más amplio de estrategias de estimulación magnetomecánica en sistemas vivos.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (números de beca 82571677 y 82001304 para Y.W.), el Programa Especial para Talentos en Medicina y Salud de la Provincia de Jilin (número de beca JLSRCZX2025-134 para Y.W.) y el Proyecto del Programa Bethune de la Universidad de Jilin (número de beca 2024B19 para Y.W.). Los autores agradecen al Colegio de Química de la Universidad de Jilin (Laboratorio Clave Estatal de Estructura Supramolecular y Materiales) y al Instituto de Química Aplicada de Changchun, Academia de Ciencias de China, por la asistencia en el diseño, la síntesis y la caracterización de nanomateriales. Los autores también agradecen al Instituto de Medicina Traducional del Primer Hospital de la Universidad de Jilin por la ayuda con imágenes de microscopía de barrido láser confocal (CLSM).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1,2-HexadecanodiolSigma-Aldrich213748Grado técnico, 90 %; utilizado en síntesis por descomposición térmica
35 mm ibidi µ-placasibidi80156Utilizado para el cultivo e imagen de células de Schwann
Éter bencílicoSigma-Aldrich10801498 %; disolvente para Fe3O4 síntesis de nanopartículas
microscopio confocal de barrido láserNikonAXR (Ti2-E)Utilizado para imágenes de células vivas e imágenes de fluorescencia 
Electroimán personalizadoConstruido a medidaN/AElectroimán unipolar compacto para la generación de campos magnéticos de gradiente in vitro 
Ácido carboxílico de cianina 3.5Duofluor Inc.D10128Colorante fluorescente utilizado para Fe3O4·Ensamblaje de superpartículas Cy3.5; PM 593,20; almacenar a -20 °C, protegido de la luz 
Sal de mesilato de deferoxaminaSigma-AldrichD9533Agente quelante del hierro utilizado para eliminar el hierro no internalizado y asociado a la membrana
Medidor digital de GaussWEITE MAGNÉTICOWT103Utilizado para medir la densidad de flujo magnético y calibrar el campo magnético gradiente generado por el electroimán personalizado
Clorhidrato de dopaminaSigma-AldrichH8502≥98 % (CCL); utilizado para recubrimiento de polidopamina
Instrumento de dispersión dinámica de luzMalvern InstrumentsZetasizer Nano-ZSUtilizado para la medición del diámetro hidrodinámico y el PDI 
Fluo-4 AM Invitrogen, Thermo Fisher ScientificF14201Indicador de calcio utilizado para Ca²⁺ en células vivas2+ imagenología
Espectrofotómetro de fluorescenciaShimadzuRF-6000Utilizado para la caracterización de fotoluminiscencia 
Microscopio electrónico de transmisión de alta resoluciónJEOLJEM-F200Utilizado para la imagenología por microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) de la morfología de nanopartículas y del núcleo–estructura de la concha 
Espectrómetro de emisión atómica con plasma acoplado inductivamentePerkinElmerOptima 3300 DVUtilizado para la cuantificación de hierro intracelular
Acetilacetonato de hierro(III), Fe(acac)3Sigma-AldrichF30097 %; precursor del Fe3O4 síntesis de nanopartículas
Incubadora para microscopía en tiempo real con platina integradaTOKAI HITTENP&CO2Utilizado para la imagen confocal de células vivas durante la estimulación magnética 
Ácido oleicoSigma-AldrichO1008≥99% (CG); ligando superficial para Fe3O4 síntesis de nanopartículas
OleilaminaSigma-AldrichO7805Grado técnico, 70 %; ligando para la síntesis de nanopartículas
Falloidina–Alexa Fluor 350Invitrogen, Thermo Fisher ScientificA22281Reactivo opcional de funcionalización dirigida a la actina 
Pluronic F-127 Invitrogen, Thermo Fisher ScientificP3000MPUtilizado para facilitar la carga de Fluo-4 AM para mediciones de Ca²⁺ en células vivas2+ imagenología
Fuente de alimentación regulada de corriente continua programableTongmeneTM-L605SPL (60 V, 5 A)Utilizado para alimentar el electroimán personalizado para la generación in vitro de un campo magnético gradiente
Células de Schwann RSC96Banco de Células de la Academia China de CienciasN/ALínea celular de Schwann derivada de rata 
Dodecilsulfato de sodio (SDS)Sigma-Aldrich436143reactivo ACS, ≥99,0 %; agente tensoactivo para microemulsión de aceite en agua
magnetómetro SQUIDQuantum Design Inc.MPMS-XLUtilizado para la medición de la histéresis magnética a 300 K 
ToluenoSigma-Aldrich244511Anhidro, 99,8 %; disolvente para ensamblaje de superpartículas
Microscopio electrónico de transmisiónFEIEP 5018/40, Tecnai Spirit BiotwinUtilizado para la observación de la ultraestructura de tejidos celulares y nerviosos 

Referencias

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