Plataforma de nanoactuación magnética para la mecanoestimulación remota y controlable de células de Schwann con imágenes confocales en tiempo real

Resumen

Este protocolo presenta una plataforma de nanoactuación magnética compatible con microscopio que integra nanopartículas superparamagnéticas fluorescentes, un electroimán calibrado y un sistema de imagen confocal en tiempo real para estimular a distancia y de manera controlada a las células de Schwann y monitorear dinámicamente sus respuestas mecanosensoriales.

Resumen

Las fuerzas mecánicas regulan de forma crítica el comportamiento celular, sin embargo, muchos de los métodos existentes de estimulación mecánica dependen del contacto físico directo o de entornos extracelulares artificialmente diseñados, lo que limita su flexibilidad en estudios dinámicos con células vivas. Aquí presentamos una plataforma de nanoactivación magnética para la mecanoestimulación remota, sin contacto y controlable de células de Schwann in vitro. Este sistema integrado permite la estimulación magnética remota y la imagenología sincronizada de células vivas en una misma sesión experimental. Este manuscrito describe la preparación de nanopartículas superparamagnéticas fluorescentes (SPIONs), opcionalmente SPIONs funcionalizadas dirigidas al actin (f-SPIONs), la construcción y calibración de un dispositivo electromagnético compatible con microscopio para estimulación, la estimación de fuerzas magnéticas a nivel individual de partícula y de célula, y la integración de la activación magnética con imagenología confocal en tiempo real. Las células de Schwann son células gliales altamente mecanosensibles que desempeñan funciones esenciales en el desarrollo, mantenimiento y reparación de los nervios periféricos. La monitorización en tiempo real de sus respuestas a la estimulación mecánica es crucial para comprender cómo las fuerzas mecánicas influyen en la organización del citoesqueleto y el comportamiento celular. Esta plataforma proporciona un flujo de trabajo reproducible para el estudio de la mecanobiología de las células de Schwann y podría adaptarse a otros tipos celulares mecanoresponsivos y sistemas multicelulares.

Introducción

Las señales mecánicas regulan una amplia gama de procesos celulares, incluyendo adhesión, migración, proliferación, diferenciación y plasticidad fenotípica^1,2,3. Estudios en mecanobiología han demostrado que tanto las neuronas como las células gliales exhiben una marcada mecanosensibilidad y capacidad de respuesta durante todo el desarrollo^4,5,6,7. Para investigar cómo las células detectan y responden a las fuerzas, se han desarrollado múltiples enf....

Protocolo

Los experimentos descritos en este protocolo utilizaron una línea celular de Schwann de rata establecida (RSC96) y no involucraron participantes humanos ni animales vivos. Este estudio se realizó como parte de un proyecto de investigación más amplio que incluía experimentos con animales, el cual fue aprobado por el Comité de Bienestar y Ética Animal del Primer Hospital de la Universidad de Jilin (Número de aprobación: 2022-0045).

1. Preparación de superpartículas magnéticas fluorescentes

1. Sintetice nanopartículas de Fe₃O₄ recubiertas con ácido oleico.
   ​NOTA: Las nanopartículas de Fe₃O₄ recubiertas con ácido ....

Resultados

La microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) mostró que la formulación final de nanopartículas poseía un núcleo magnético agrupado y una capa externa tras la modificación de la superficie (Figura 1). Los f-SPIONs finales tenían un diámetro total promedio de 63,36 ± 16,65 nm, con un núcleo magnético rico en Fe₃O₄ de aproximadamente 56,60 ± 6,19 nm y una capa externa compuesta de polidopamina y faloína-Alexa Fluor 350 con un espesor promedio de aproximadamente 5,79 ± 1,.......

Discusión

Se reconoce ampliamente a las nanopartículas de óxido de hierro como nanomateriales magnéticos con biocompatibilidad favorable. Como agentes de contraste ampliamente utilizados en imágenes por resonancia magnética, las nanopartículas superparamagnéticas de Fe₃O₄ se han aplicado extensamente en el diagnóstico clínico por imágenes^29,30. En un estudio reciente de nuestro grupo²⁰, se demostró que las f-SPIONs exhiben citotoxicidad extremadamen.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,2-Hexadecanodiol	Sigma-Aldrich	213748	Grado técnico, 90 %; utilizado en síntesis por descomposición térmica
35 mm ibidi µ-placas	ibidi	80156	Utilizado para el cultivo e imagen de células de Schwann
Éter bencílico	Sigma-Aldrich	108014	98 %; disolvente para Fe3O4 síntesis de nanopartículas
microscopio confocal de barrido láser	Nikon	AXR (Ti2-E)	Utilizado para imágenes de células vivas e imágenes de fluorescencia
Electroimán personalizado	Construido a medida	N/A	Electroimán unipolar compacto para la generación de campos magnéticos de gradiente in vitro
Ácido carboxílico de cianina 3.5	Duofluor Inc.	D10128	Colorante fluorescente utilizado para Fe3O4·Ensamblaje de superpartículas Cy3.5; PM 593,20; almacenar a -20 °C, protegido de la luz
Sal de mesilato de deferoxamina	Sigma-Aldrich	D9533	Agente quelante del hierro utilizado para eliminar el hierro no internalizado y asociado a la membrana
Medidor digital de Gauss	WEITE MAGNÉTICO	WT103	Utilizado para medir la densidad de flujo magnético y calibrar el campo magnético gradiente generado por el electroimán personalizado
Clorhidrato de dopamina	Sigma-Aldrich	H8502	≥98 % (CCL); utilizado para recubrimiento de polidopamina
Instrumento de dispersión dinámica de luz	Malvern Instruments	Zetasizer Nano-ZS	Utilizado para la medición del diámetro hidrodinámico y el PDI
Fluo-4 AM	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	F14201	Indicador de calcio utilizado para Ca²⁺ en células vivas2+ imagenología
Espectrofotómetro de fluorescencia	Shimadzu	RF-6000	Utilizado para la caracterización de fotoluminiscencia
Microscopio electrónico de transmisión de alta resolución	JEOL	JEM-F200	Utilizado para la imagenología por microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) de la morfología de nanopartículas y del núcleo–estructura de la concha
Espectrómetro de emisión atómica con plasma acoplado inductivamente	PerkinElmer	Optima 3300 DV	Utilizado para la cuantificación de hierro intracelular
Acetilacetonato de hierro(III), Fe(acac)3	Sigma-Aldrich	F300	97 %; precursor del Fe3O4 síntesis de nanopartículas
Incubadora para microscopía en tiempo real con platina integrada	TOKAI HIT	TENP&CO2	Utilizado para la imagen confocal de células vivas durante la estimulación magnética
Ácido oleico	Sigma-Aldrich	O1008	≥99% (CG); ligando superficial para Fe3O4 síntesis de nanopartículas
Oleilamina	Sigma-Aldrich	O7805	Grado técnico, 70 %; ligando para la síntesis de nanopartículas
Falloidina–Alexa Fluor 350	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A22281	Reactivo opcional de funcionalización dirigida a la actina
Pluronic F-127	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Utilizado para facilitar la carga de Fluo-4 AM para mediciones de Ca²⁺ en células vivas2+ imagenología
Fuente de alimentación regulada de corriente continua programable	Tongmen	eTM-L605SPL (60 V, 5 A)	Utilizado para alimentar el electroimán personalizado para la generación in vitro de un campo magnético gradiente
Células de Schwann RSC96	Banco de Células de la Academia China de Ciencias	N/A	Línea celular de Schwann derivada de rata
Dodecilsulfato de sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	436143	reactivo ACS, ≥99,0 %; agente tensoactivo para microemulsión de aceite en agua
magnetómetro SQUID	Quantum Design Inc.	MPMS-XL	Utilizado para la medición de la histéresis magnética a 300 K
Tolueno	Sigma-Aldrich	244511	Anhidro, 99,8 %; disolvente para ensamblaje de superpartículas
Microscopio electrónico de transmisión	FEI	EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin	Utilizado para la observación de la ultraestructura de tejidos celulares y nerviosos