Imagen por espectrometría de masas de célula única usando ionización por electrospray por desorción acoplada a espectrómetros de masas Orbitrap

Resumen

Este protocolo describe la imagen por espectrometría de masas de célula única de células OVCAR-8 utilizando ionización por electropulverización por desorción acoplada a espectrómetros de masas Orbitrap para análisis metabolómico de alta resolución espacial.

Resumen

Imágenes por espectrometría de masas por ionización por electrospray por desorción (DESI–MSI) permiten la imagen molecular ambiental libre de matrices con una preparación mínima de muestras. Este protocolo describe un flujo de trabajo para la MSI de celda única de celdas OVCAR-8 utilizando DESI acoplado a espectrómetros de masas Orbitrap. El sistema integra un pulverizador DESI, una interfaz modificada para espectrómetro de masas, una etapa motorizada XYZ y una placa de pruebas óptica para imágenes de alta resolución espacial. Las células se cultivan en cubiertas de vidrio rejilladas, se lavan con solución de formiato de amonio para reducir la interferencia salina, se secan y se analizan en condiciones ambientales. El disolvente se administra continuamente mediante un sistema de cromatografía nanolíquida, y se regula el gas nitrógeno nebulizador para mantener la estabilidad del spray. El protocolo también describe la imagen rasterizada, el control de píxeles y el registro de imágenes de espectrometría óptica a masa para la localización de célula única. La alta resolución de masa y la precisión de masa proporcionadas por la detección por Orbitrap permiten diferenciar especies moleculares estrechamente relacionadas y apoyan el análisis metabolómico de células individuales. Este protocolo proporciona una estrategia adaptable para implementar MSI de alta resolución espacial de celda única utilizando múltiples plataformas de espectrómetro de masas Orbitrap.

Introducción

La metabolómica busca caracterizar de forma exhaustiva metabolitos de moléculas pequeñas que reflejan el estado funcional de los sistemas^biológicos 1,2,3,4,5. Dado que los metabolitos son productos directos de la actividad enzimática, proporcionan una lectura dinámica del fenotipo celular y la regulación bioquímica. Sin embargo, los flujos de trabajo metabolómicos convencionales suelen depender de métodos de extracción masiva que promedian las señales entre miles y millones de células, ocultando así la heterogeneidad^{celular 6,7,8}.

La metabolómica unicelular aborda esta limitación al permitir el perfilado molecular a nivel de células individuales, revelando la diversidad metabólica dentro de poblaciones complejas y mejorando la comprensión mecanicista de la progresión de la enfermedad, la respuesta a fármacos y la diferenciación celular. La espectrometría de masas (EM) es una herramienta indispensable para el análisis molecular de muestras biológicas. Los avances recientes en las técnicas de EM, incluyendo la preparación de muestras, la instrumentación y el análisis de datos, permiten realizar estudios de metabolómica de EM a nivel^{de célula única} 9,10,11,12.

La imagen de MS (MSI), que permite el análisis molecular espacialmente resuelto de muestras biológicas, integra un movimiento preciso de la muestra, un muestreo minimizado, una ionización eficiente y la visualización de datos al adquirir un espectro de masas completo en cada coordenada espacial definida a lo largo de una superficie^{muestral 12, 13 y 14}. Las imágenes de la EM se reconstruyen graficando la intensidad de los valores seleccionados de la relación masa-carga (m/z) a lo largo de coordenadas x–y, preservando así la información espacial química dentro de sistemas biológicos^complejos 12,13,15,16,17,18. Lograr metabolómica de célula única resuelta espacialmente requiere plataformas analíticas capaces de preservar la localización molecular manteniendo suficiente sensibilidad y resolución de masa para detectar especies^{de baja abundancia} 9,12,19,20.

La MSI de célula única presenta desafíos adicionales porque las células individuales suelen medir entre 5 y 20 μm de diámetro ^8,21. A esta escala espacial, la abundancia de analitos por evento de muestreo es extremadamente limitada. Por lo tanto, múltiples factores, incluyendo el control preciso del movimiento de la muestra, la minimización del muestreo, la alta eficiencia de ionización y la transmisión eficiente de iones, son igualmente esenciales para obtener información molecular interpretable de células^{individuales 14,22}. La desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI)–MSI, una técnica basada en vacío utilizada habitualmente para estudios MSI de alta resolución espacial, requiere deposición matricial y operación en vacío; sin embargo, la cristalización matricial en MALDI puede introducir deslocalización y variabilidad de analitos a escala^{de célula única 23,24,25,26,27}. En cambio, los enfoques MSI ambientales operan en condiciones ambientales, y las muestras mantienen estados químicos cercanos a los nativos porque se requiere poca o ninguna preparación de muestras. Entre los métodos de MSI ambiental, DESI²⁸, nano-DESI²¹, nano-DESI²⁹ asistido neumáticamente y Single-probe ^{8,30,31,32,33,34,35}, se han utilizado anteriormente para estudios MSI de célula única. Aunque las técnicas basadas en extracción de microlíquidos, incluyendo nano-DESI, nano-DESI asistida neumáticamente y sonda simple, proporcionan alta eficiencia de muestreo e ionización, dependen de mantener un puente líquido estable en la punta de la sonda, mientras que la perturbación del puente líquido, como cambios en la morfología superficial o obstrucción de la sonda, puede afectar la calidad de los experimentos^{MSI 5,8, 21, 30, 35}.

DESI es una técnica de ionización ambiental en la que las gotas de disolvente cargado impactan en una superficie, extraen analitos y generan gotas secundarias que contienen la especie^{ionizada 36}. DESI proporciona muestreo sin contacto y sin obstrucciones, con compatibilidad para flujos de trabajo de imagen basados en ráster, lo que lo hace muy adecuado para el mapeo molecular multi-iónico de alta resolución de células individuales identificadas ópticamente cuando están acopladas a plataformas Orbitrap de alta potencia^{de resolución 20,37,38,39,40}. DESI se utiliza ampliamente para la imagen de tejidos, pero rara vez se ha aplicado a MSI unicelulares, principalmente debido a desafíos técnicos^20,28. Estudios recientes realizados con un montaje comercial que consiste en un Waters DESI XS acoplado a un espectrómetro de masas IMS cíclico SELECT SERIES demostraron que se puede lograr una resolución de una sola célula para múltiples líneas celulares. Lograr una alta resolución espacial en DESI–MSI requiere un control coordinado de la eficiencia de ionización, transmisión iónica, tasa de adquisición y alineación del^pulverizador 12,20,28. En particular, los avances en el diseño de nuevas generaciones de pulverizadores DESI, incluyendo DESI XS y la ionización de enfoque por desorción por electroflujo (DEFFI), han reducido significativamente el área de^{muestreo 41,42}. Además, reducir los caudales de disolventes, como los caudales de nanolitros por minuto suministrados por bombas de cromatografía nanolíquida (LC), puede mejorar sustancialmente el confinamiento espacial para lograr la delimitación molecular de una sola^{célula 28}. Aunque este enfoque logró la resolución de una sola celda MSI, depende de instrumentación de un proveedor específico (Waters). Por tanto, una implementación más amplia de DESI–MSI de celda única requiere estrategias que puedan integrarse con espectrómetros de masas de alta resolución ampliamente disponibles, como los sistemas Orbitrap, para proporcionar alta sensibilidad, precisión de masa y potencia de resolución. La combinación de DESI con espectrómetros de masas Orbitrap ofrece nuevas oportunidades en estudios de MSI unicelulares, incluyendo la diferenciación de especies muy próximas e isobáricas en extractos celulares^complejos 20,43,44.

Este protocolo describe una estrategia modular para integrar un pulverizador Waters DESI XS con espectrómetros de masas Orbitrap para estudios MSI de célula única. El flujo de trabajo integra coberturas en cuadrícula para la fijación de celdas y correlación óptica, una etapa motorizada XYZ para escaneo raster controlado, administración de disolventes a nanoescala para una formación estable de pulverización y detección Orbitrap de alta resolución. Aunque se seleccionó un espectrómetro de masas Thermo Orbitrap Tribrid Lumos como plataforma, muchos otros modelos de espectrómetro de masas Orbitrap equipados con geometrías de interfaz fuente compatibles podrían acoplarse potencialmente a configuraciones DESI XS personalizadas similares tras una adaptación mecánica y optimización adecuadas.

Protocolo

Las células OVCAR-8 se obtuvieron de la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC). Todos los procedimientos de cultivo celular se realizaron conforme a las directrices de bioseguridad institucional. Las células se analizaban rutinariamente para detectar contaminación por micoplasma utilizando un kit de detección de micoplasmas según las instrucciones del fabricante.

NOTA: Realizar todos los procedimientos conforme a las directrices de bioseguridad institucional. Lleva el equipo de protección personal adecuado. Manipula disolventes orgánicos en una campana extractora química.

1. Cultivar y preparar las células OVCAR-8 en cubiertas rejilladas

1. Preparar el medio completo suplementando el medio RPMI-1640 con suero fetal bovino al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina. Calienta el medio a 37°C.
2. Mantener las células OVCAR-8 en platos de cultivo celular de 10 cm que contengan 10 mL de medio completo. Incuba las células a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂.
3. Pasar las células cuando aproximadamente el 80% de la superficie del cultivo está visualmente ocupada por células adherentes, normalmente cada 2 días bajo las condiciones descritas del cultivo.
   1. Aspira el medio del recipiente de cultivo de 10 cm y enjuaga las células una vez con 5 mL de suero salino tamponado con fosfato a 1×.
   2. Añadir 2 mL de ácido tripsina–etilendediamina al 0,25% al recipiente de cultivo. Incubar las células a 37°C durante aproximadamente 3 minutos, o hasta que la mayoría de las células se desprendan visiblemente de la superficie del cultivo al examinarlas al microscopio.
   3. Añade 8 mL de medio completo precalentado al plato para neutralizar la tripsina. Utilizando una pipeta serológica de 10 mL, haz una piteada suave en la suspensión celular hacia arriba y abajo aproximadamente 15–20 veces para dispersar las células.
   4. Transfiere 1 mL de la suspensión a 9 mL de medio completo fresco.
   5. Cuenta las celdas usando un contador automático. Carga 10 μL de la suspensión de la celda resuspendida directamente en la lámina de conteo sin dilución adicional y realiza el recuento de celdas según las instrucciones del fabricante.
      NOTA: No se utilizaron tintes de viabilidad celular como el azul de tripán en este protocolo. Evalúa la condición celular visualmente monitorizando la morfología y la inserción celular antes de la tripsinización.
4. Siembra las células en los cubrepones.
   1. Diluye las células hasta una concentración final de ~1 × 10⁶ células/mL usando un medio completo. Calcular el volumen requerido de suspensión de celda usando C₁V₁ = C₂V₂, donde C₁ es la concentración de celda contada, V₁ es el volumen de suspensión de celda requerido, C₂ es la concentración objetivo y V₂ es el volumen final deseado.
   2. Coloca los cubreabritos de vidrio cuadriculado individuales de 28 mm con un espaciamiento de 50 μm en pozos de una placa de 6 pozos.
      NOTA: Autoclave cubre las cubiertas de vidrio antes de usarlas para cultivo celular. Coloca el lado de la rejilla hacia abajo para minimizar la interferencia con el crecimiento celular.
   3. Añade 2 mL de medio completo y 200 μL de la suspensión de celda (~2 × 10⁵ celdas/pozo) a cada pozo. Balancea suavemente la placa de 6 pozos en un patrón de "X" para distribuir uniformemente las celdas sobre la superficie del abrigo.
   4. Incubar las células durante aproximadamente 15–20 horas para permitir la unión celular.
      NOTA: Monitoriza la morfología celular de forma rutinaria usando un microscopio para asegurar un crecimiento celular normal. Examina la posible contaminación por micoplasma utilizando un kit de detección de micoplasmas si las células crecen mal.

2. Lavado celular con solución de formiato de amonio (AF)

NOTA: Prepara una solución de primer primer nivel antes de cada uso.

1. Prepara el buffer de lavado isotónico AF inmediatamente antes de usarlo. Pesa 0,45 g de FA y disuelve en 50 mL de agua de grado LC/MS para preparar una concentración final de FA de 0,14 M (0,9% p/w). No ajustes el pH ^5,45.
   NOTA: Utiliza la solución AF recién preparada el mismo día de la preparación. Mantén la solución bien fría (0°C–4°C) hasta la utilización.
2. Aspira el medio de cultivo de cada pozo de la placa de 6 pozos. Inmediatamente añade 2 mL de solución de AF fría a cada pozo.
3. Utilizando pinzas estériles, levanta suavemente cada capa que contiene células adherentes del pozo, manteniendo la superficie recubierta de células hacia arriba. Coloca brevemente el engobe de cobertura durante 2–3 s en un pozo separado prellenado con 2 mL de solución fría de 0,9% AF.
4. Repite el proceso de enjuague para un total de dos enjuagues usando una solución fresca de AF para cada enjuague. Tras el enjuague final, retira el engobe de la solución AF y déjalo secar al aire a temperatura ambiente en una campana extractora química durante aproximadamente 20–30 minutos antes del análisis DESI–MSI.
   NOTA: Enjuaga las células suavemente para evitar alterarlas durante el paso de lavado.

3. Fabricación de interfaz MS modificada basada en FAIMS

1. Desmonta el adaptador de la carcasa de la fuente de iones del electrodo FAIMS Pro para acceder a la región interna del electrodo. Confirma que el adaptador es compatible con espectrómetros de masas Thermo Orbitrap equipados con la configuración de interfaz FAIMS Pro.
2. Retira los componentes del electrodo FAIMS, incluidos los cables internos, conjuntos de electrodos, juntas tóricas y estructuras internas de soporte. Conservar la carcasa externa, las bridas de montaje y el pasador de detección de interfaz necesario para el reconocimiento del adaptador con espectrómetro de masas.
3. Modificar la abertura circular utilizando los procedimientos estándar de mecanizado de taller. Ampliar la abertura hasta que proporcione suficiente espacio alrededor del conjunto saliente de entrada/embudo iónico Orbitrap.
4. Alisa y desbarba el filo mecanizado después de cortar. Confirma que la abertura modificada permite una posición libre del adaptador de carcasa en el espectrómetro de masas.
5. Modifica la longitud de dos patas del adaptador de carcasa usando una sierra. Recorta las patas hasta una longitud final de aproximadamente 2 1/4 pulgadas para permitir la conexión con la placa de prueba óptica.
   NOTA: Utilice herramientas de mecanizado adecuadas y evite dañar la integridad estructural de la carcasa restante.
6. Prepara una placa de pruebas óptica de aluminio (10 pulgadas × 12 pulgadas × agujeros roscados de 0,5 pulgadas, 1/4"-20 pulgadas). Coloca la tabla de pruebas horizontalmente debajo del adaptador FAIMS modificado.
7. Utiliza dos soportes de montaje para conectar el adaptador FAIMS modificado a la placa de prueba óptica. Recortar los soportes según sea necesario para reducir peso y permitir una correcta posición de la tabla de pruebas respecto a la entrada Orbitrap.
8. Fija la interfaz FAIMS modificada en la placa de pruebas óptica usando hardware de montaje mecánicamente compatible alineado con el patrón de orificios roscado de 1/4"-20 de la placa de prueba. Asegura una posición estable durante los experimentos de imagen.
   NOTA: Asegúrese de que la interfaz esté rígidamente fijada para minimizar la vibración durante el movimiento de la etapa y la adquisición de datos.
9. Máquina o corta una ranura poco profunda en la placa de pruebas óptica justo debajo de la zona de contacto de la carcasa del FAIMS. Tamaño y posición de la ranura para proporcionar suficiente espacio para un asiento estable y una alineación de la carcasa modificada del FAIMS en relación con la entrada Orbitrap.
   NOTA: Dimensiona la ranura para acomodar la base del adaptador de carcasa FAIMS y mejorar la reproducibilidad posicional.
10. Alinea la interfaz montada con la entrada del espectrómetro de masas. Confirma que las bridas de montaje que se mantienen bien colocadas en el instrumento y que la placa de pruebas óptica permanece nivelada bajo la interfaz.
11. Verifica que la abertura circular modificada proporcione un espacio libre alrededor del conjunto de entrada/embudo iónico Orbitrap antes de instalar el pulverizador DESI.

4. Montar el pulverizador DESI y la interfaz Orbitrap

1. Monta el pulverizador DESI en el sistema integrado que consiste en el chasis FAIMS personalizado, la etapa motorizada XYZ, el regulador de gas y la placa de pruebas óptica. Utiliza una etapa motorizada controlada por un controlador CONEX-MFACC.
2. Define el eje x como la dirección de barrido ráster de izquierda a derecha y define el eje y como la dirección del paso de línea de arriba a abajo. Establece la posición del eje z antes de la adquisición y mantenla fija durante la imagen.
3. Utiliza un rango de recorrido de etapa de aproximadamente 1 mm en la dirección x y 1 mm en la dirección y. No aplique movimiento en el eje z durante la adquisición.
4. Coloca el pulverizador DESI en un ángulo de aproximadamente 70° respecto a la superficie de la muestra. Coloca la muestra directamente debajo del pulverizador y coloca la punta del pulverizador lo más cerca posible de la entrada Orbitrap sin contacto físico.
5. Conecta el metal de masa DESI a una fuente terrestre bajo el espectrómetro de masas. Controla el movimiento ráster usando el software de control de escenario (Figura 1).
   NOTA: El pulverizador DESI utilizado en este estudio está disponible únicamente para usuarios con instrumentos DESI–MSI.
6. Utiliza un controlador motorizado XYZ para el movimiento y posicionamiento del escenario. Conecta la línea de voltaje, la línea de gas nitrógeno, la línea de disolventes y la línea de toma de tierra antes de operar.
7. Instala un tubo de transferencia de iones de acero inoxidable fabricado a medida (1/16 in de diámetro exterior × 0,033 in de diámetro interior) diseñado para coincidir con la entrada de fuente de iones Orbitrap. Coloca el tubo de transferencia iónica de modo que se alinee directamente con la entrada Orbitrap mientras se extiende lo suficiente hacia afuera para permitir un acceso sin obstáculos a la pluma DESI.
   NOTA: Personaliza el tubo de transferencia iónica según la configuración del espectrómetro de masas. Fabrica el tubo de transferencia iónica utilizando procedimientos de mecanizado adecuados.
8. Utiliza un tubo de transferencia iónica con geometría doblada para mejorar la posición del pulverizador DESI en relación con la superficie de la muestra y la entrada Orbitrap.
9. Alinear el pulverizador en un ángulo de aproximadamente 70° respecto a la superficie de la muestra para que la pluma de pulverización DESI cruce la región de entrada de Orbitrap sin tocar la superficie de la muestra.
10. Defina una pluma de pulverización estable por la presencia de espectros de masas estables y valores consistentes de niveles normalizados (NL) durante la adquisición. Ajusta la posición del pulverizador hasta que se observe una señal iónica estable.
11. Establece la distancia entre el pulverizador y la superficie aproximadamente entre 1,0 y 1,5 mm como condición inicial. Ajusta manualmente la posición del pulverizador mientras monitorizas los valores de NL para lograr la señal iónica más estable.

Figura 1. Sistema integrado de ionización por electropulverización por desorción (DESI) y imagen por espectrometría de masas (MSI) acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap. El pulverizador DESI está montado sobre una plataforma integrada que consiste en un adaptador modificado de espectrometría de movilidad iónica asimétrica de alto campo (FAIMS ), una etapa XYZ motorizada, un regulador de gas y una placa de pruebas óptica. El disolvente se administra mediante un sistema de cromatografía nanolíquida, y se suministra gas nitrógeno a aproximadamente 12 psi para la estabilización por pulverización. La figura también muestra la conexión por voltaje de ionización, la línea de disolvente y la posición del pulverizador respecto a la entrada Orbitrap. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

5. Configurar las condiciones de entrega y pulverización del disolvente

1. Preparar disolvente en spray fresco compuesto de metanol/agua/ácido fórmico (98:2:0.1, v/v/v) antes del análisis DESI–MSI.
   NOTA: Otros sistemas solventes compatibles con DESI, incluyendo disolventes basados en acetonitrilo y diferentes proporciones metanol/agua, pueden utilizarse tras la optimización. Metanol/agua/ácido fórmico (98:2:0.1, v/v/v) se utilizó como condición inicial estándar en este protocolo porque proporcionaba una formación estable de plumas, reducción de la dispersión del disolvente y señales lipídicas reproducibles en modo iónico positivo durante experimentos DESI–MSI de célula única.
   PRECAUCIÓN: El metanol es inflamable y tóxico. El ácido fórmico es corrosivo. Manipula los disolventes en una campana extractora química.
2. Administrar el disolvente utilizando un sistema nano-LC Ultimate 3000 operado como una bomba isocrática de disolvente a 750 nL/min para los experimentos reportados. Conecta la salida nano-LC al pulverizador DESI usando tubo PEEK (1/16 in de diámetro exterior × 0,005 in de diámetro interior).
3. Instalar una columna C18 (por ejemplo, nanoEase M/Z Peptide BEH; 130 Å, 1,7 μm, 300 μm × 150 mm) en línea para proporcionar suficiente contrapresión para una formación estable de pulverización a bajos caudales.
4. Ajusta el método del espectrómetro de masas en modo de iones positivos con detección Orbitrap, un voltaje de pulverización de 0,85 kV, resolución Orbitrap de 120.000 a m/z 200 y un rango m/z de 150–1200.
5. Ajusta el objetivo normalizado del AGC al 100%, el tiempo máximo de inyección a 100 ms, la lente RF al 45% y los microescaneos a 1. Desactiva el aislamiento de cuadrupolos y la fragmentación de la fuente.
6. Suministrar gas de vaina de nitrógeno desde un generador de nitrógeno o fuente líquida de nitrógeno a aproximadamente 12 psi para estabilizar la columna de pulverización DESI. Utiliza 12 psi como presión inicial de operación y realiza ajustes manuales menores solo si es necesario para mejorar los valores de NL y mantener un espectro de masas estable.

6. Realizar imágenes raster y control de píxeles

1. Identificar una región de interés que contenga celdas individuales ópticamente visibles usando las cubiertas cuadriculadas como referencia. Selecciona células aisladas con clara separación visual de las células vecinas, morfología adherente intacta y sin solapamiento evidente con escombros o grupos celulares.
2. Define la región raster usando el software⁴⁶ de Fance Stage Controller. Ajusta el tamaño del paso raster a 0,01 mm, la velocidad de la etapa a 0,01 mm/s y el tiempo de permanencia a 20 s.
3. Utiliza un escaneo raster de izquierda a derecha a través de cada línea seguido de un movimiento hacia la siguiente línea en la dirección y. Establece el tamaño ortogonal del paso entre líneas ráster a 10 μm.
4. Ajustar la velocidad de la etapa según la tasa de adquisición de Orbitrap para lograr la dimensión deseada en el píxel en dirección de barrido (por ejemplo, aproximadamente 2,5–6,5 μm). Calcular la dimensión del píxel en dirección de barrido usando la siguiente relación: dimensión de píxel en dirección de barrido = velocidad de etapa × tiempo de adquisición por escaneo.
5. Utilizando una velocidad de etapa de 0,01 mm/s (10 μm/s), adquiere 376 escaneos en 102 s para obtener un tiempo de adquisición de 0,271 s por escaneo y una dimensión correspondiente de píxel en la dirección de escaneo de aproximadamente 2,7 μm. Sincroniza el movimiento de la etapa y la adquisición espectral de masas ajustando el tiempo de adquisición de Orbitrap ligeramente más corto que la combinación de los parámetros de movimiento de la etapa y de estabilidad.
   NOTA: La dimensión ortogonal del píxel está determinada por el tamaño del paso programado y las limitaciones físicas y mecánicas de la etapa, mientras que la dimensión de la dirección de barrido está gobernada por la velocidad de la etapa y la tasa de adquisición espectral.
6. Adquirir datos de imagen en el rango de masas seleccionado hasta completar la región ráster predefinida. Para una región de imagen de 1 mm × 1 mm adquirida mediante un paso de línea de 0,01 mm y una velocidad de etapa de 0,01 mm/s, el tiempo total de adquisición es aproximadamente de 4–5 h.
7. Generar archivos de datos RAW durante la adquisición y detener la adquisición tras completar las coordenadas ráster x–y especificadas y la duración correspondiente del método de instrumento. Bajo las condiciones de modo iónico positivo descritas aquí, cada línea raster suele generar un archivo RAW de aproximadamente 50 MB, lo que resulta en un total de aproximadamente 5 GB de datos para 101 líneas raster.

7. Registro de imagen óptica a MS

1. Capturar imágenes en campo claro de las células en la región de la rejilla seleccionada tras el lavado y secado AF y antes de la adquisición de DESI utilizando un microscopio de campo claro equipado con un objetivo de 10×.
2. Convierte archivos RAW en archivos mzML usando msConvert desde ProteoWizard⁴⁸. Convierte los archivos mzML a formato imzML usando imzML Converter⁴⁹.
3. Utiliza ajustes de conversión de centroide/perfil coherentes con el formato de datos adquirido. Sube los archivos imzML directamente a METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ para la visualización de imágenes.
4. No aplique normalización, eliminación de puntos calientes ni correcciones adicionales de procesamiento de imagen antes de la visualización. Alinea manualmente las imágenes ópticas y MS usando los puntos de referencia de la cuadrícula como referencias posicionales.
5. Escala la imagen óptica usando las dimensiones conocidas de la imagen y el espaciado de la cuadrícula. Superponer manualmente la imagen MS para evaluar la correspondencia entre las posiciones ópticamente visibles de las células y las señales de iones localizadas.
6. Confirmar la localización de una sola célula mediante acuerdo visual entre las celdas aisladas en la imagen del campo claro y las correspondientes distribuciones iónicas MS.

Resultados

La ejecución exitosa de este protocolo produce conjuntos de datos DESI–MSI en los que células individuales identificadas ópticamente corresponden espacialmente a señales moleculares localizadas de iones (Figura 2). Las imágenes de microscopía de campo claro adquiridas antes del análisis DESI–MSI permiten la identificación visual de celdas individuales de OVCAR-8 y facilitan el registro de imagen óptica a MS utilizando el portafolio cuadriculado como referencia posicional. Las imágenes representativas de iones DESI–MSI demuestran distribuciones iónicas localizadas que se correlacionan espacialmente con células individuales identificadas en la imagen correspondiente de campo claro (Figura 2A–2D).

Figura 2. Comparación de la microscopía de campo brillante y la MSI de células OVCAR-8. (A) Imagen de microscopía de campo claro de las células OVCAR-8 adquiridas a un aumento del 10×. (B–D) Imágenes MS adquiridas usando DESI–MSI con un tamaño de píxel de 5,5 μm × 10 μm. Se muestran distribuciones iónicas representativas para (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562 y (D) m/z 788.616. Barra de escala = 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Las células individuales generan espectros de masas completos que contienen múltiples iones relacionados con lípidos y pequeñas moléculas. En lugar de depender de un único marcador molecular, cada célula presenta un perfil molecular multi-iónico que funciona como una huella química. Imágenes iónicas representativas en m/z 317.111, m/z 808.562 y m/z 788.616 demuestran distribuciones moleculares heterogéneas entre células vecinas, indicando una heterogeneidad metabólica medible a nivel de célula única (Figura 2B–2D). Las anotaciones basadas en METASPACE sugirieron que los iones detectados en m/z 808.562 y m/z 788.616 estaban principalmente asociados con especies de lípidos fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, mientras que m/z 317.111 correspondía a varias moléculas pequeñas candidatas y especies relacionadas con dipéptidos. Estos resultados demuestran que la plataforma permite la detección de características moleculares espacialmente localizadas de células individuales identificadas ópticamente en condiciones ambientales. Resultados adicionales, incluyendo especies anotadas tentativamente, especies identificadas como EM/EM, imágenes representativas de EM y espectros de masas, se proporcionan en estudios^{previos 20}.

La plataforma integrada DESI–MSI consta de un pulverizador DESI, un adaptador FAIMS modificado, una etapa XYZ motorizada y una placa de pruebas óptica montada junto a la entrada Orbitrap (Figura 1). El montaje permite una entrega estable de disolventes, movimiento controlado de la etapa y alineación de la pluma de pulverización DESI con la entrada del espectrómetro de masas para experimentos de imagen de célula única ambiental. El tubo de transferencia iónica personalizado mostrado en la Figura 3 permite la transmisión de iones entre la región fuente DESI y la entrada Orbitrap. La geometría capilar curvada facilita la posición del pulverizador DESI respecto a la superficie de la muestra y la región de entrada, manteniendo la transferencia de iones sin obstrucciones.

Figura 3. Tubo de transferencia iónica personalizado para Orbitrap MSI. Fotografía del tubo de transferencia iónica fabricado a medida utilizado para acoplar el pulverizador DESI al espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos. La figura muestra la geometría capilar de transferencia doblada y el conjunto de montaje utilizado para la transmisión iónica durante experimentos MSI de célula única en ambiente. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La Figura 4 muestra el adaptador FAIMS modificado integrado con la placa de pruebas óptica y la etapa motorizada XYZ. La vista superior (Figura 4A) ilustra la posición de la etapa de muestra y el adaptador modificado respecto a la entrada Orbitrap, mientras que la vista inferior (Figura 4B) muestra los soportes de montaje y el conjunto de la etapa usados para soportar la plataforma de imagen. La estabilidad mecánica del conjunto integrado es importante para mantener un movimiento raster consistente y minimizar la deriva posicional durante la adquisición de imágenes.

Figura 4. Adaptador modificado de espectrometría de movilidad iónica asimétrica de alto campo (FAIMS) integrado con la placa de pruebas óptica y la etapa motorizada XYZ. (A) Vista superior del adaptador modificado montado junto a la entrada de aire y la etapa de muestra Orbitrap. (B) Vista inferior mostrando los soportes modificados, la placa de pruebas óptica y el conjunto motorizado de la etapa XYZ utilizado para soportar y alinear la plataforma de imagen. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

La alta resolución de masa proporcionada por la detección por Orbitrap permite diferenciar especies lipídicas muy próximas e isobáricas, mejorando así la especificidad molecular y el contraste de imagen en comparación con sistemas de menor resolución de masa. Se pueden lograr dimensiones de píxel pequeñas mediante la sincronización de la velocidad de la etapa y la tasa de adquisición espectral. Por ejemplo, dimensiones de píxeles tan pequeñas como 2,7 μm × 10 μm se han logrado utilizando plataformas Orbitrap de adquisición rápida y parámetros ráster^{optimizados 42}. La imagen de alta resolución espacial permite la delimitación molecular de células muy adyacentes mientras minimizan la superposición de señales entre regiones celulares vecinas.

Los experimentos exitosos con DESI–MSI se caracterizan por condiciones de pulverización estables, intensidad iónica constante a través de líneas raster y localización espacial de señales moleculares que corresponden a células individuales en la imagen óptica. Los experimentos subóptimos pueden producir distribuciones iónicas difusas, baja intensidad de señal, patrones de ráster inconsistentes o pérdida de localización celular debido a formación inestable de pulverización, alineación incorrecta del pulverizador, dispersión excesiva del disolvente o movimiento de la muestra durante la adquisición. Una optimización cuidadosa de la alineación del spray, el caudal del disolvente, la velocidad de la etapa y la posición de la muestra mejora la fidelidad espacial y la estabilidad de la señal iónica durante los experimentos de imagen de célula única.

Discusión

Este protocolo permite DESI–MSI de célula única ambiental utilizando espectrómetros de masas Orbitrap de alta resolución de masa mediante la integración de control preciso de etapas, entrega de disolventes a nanoescala, segmentación óptica y análisis de masas de alta resolución espacial. La combinación de estos elementos aborda múltiples barreras técnicas que históricamente han limitado la aplicación de DESI–MSI a nivel de celda única. En particular, el control coordinado de la estabilidad del spray, la transmisión de iones y el momento de adquisición permite la detección fiable de señales moleculares de volúmenes de muestreo extremadamente pequeños correspondientes a células individuales. Un factor central que regula el rendimiento en este flujo de trabajo es la estabilidad y confinamiento de la pluma de pulverización DESI. A resoluciones espaciales a escala micrométrica, pequeñas perturbaciones en el caudal del disolvente, la presión del gas o la posición del pulverizador pueden alterar significativamente el área efectiva de muestreo. El uso de la administración de disolventes a nanoescala combinada con una contrapresión adecuada mejora la estabilidad del pulverizador y reduce la dispersión del disolvente, mejorando así la fidelidad espacial. Además, mantener una distancia y un ángulo consistentes entre pulverizador y superficie es fundamental para la eficiencia de ionización reproducible. Incluso pequeñas desviaciones en geometría pueden provocar una variación considerable en la intensidad de la señal, especialmente al analizar muestras celulares heterogéneas. En la práctica, la optimización empíricamente de las condiciones de pulverización DESI se realizó monitorizando la corriente total de iones, la estabilidad espectral y los valores de NL (típicamente alrededor de 10⁵–10⁶) durante la adquisición. La calidad de la señal reproducible se logró mediante el ajuste iterativo de la posición del pulverizador, la estabilidad del flujo de disolventes, la presión del gas y la alineación de la pluma DESI respecto a la entrada Orbitrap.

La eficiencia de transmisión de iones representa otra limitación clave a escala de célula única, ya que la abundancia de analitos es inherentemente baja dentro de las células individuales. A estas escalas espaciales, la transmisión eficiente de iones puede convertirse en una limitación práctica mayor que la eficiencia de ionización en algunas implementaciones, ya que solo una fracción muy pequeña de los iones desorbidos llega finalmente a la entrada del espectrómetro de masas. Por tanto, es esencial la transferencia eficiente de iones desde la región de muestreo hacia la entrada del espectrómetro de masas. El adaptador modificado de alojamiento FAIMS utilizado en este protocolo proporciona una interfaz entre la fuente de pulverización DESI y un espectrómetro de masas termodinámica, permitiendo compatibilidad con múltiples modelos de instrumentos, incluyendo las plataformas Orbitrap Tribrid, Exploris y Astral. La integración del adaptador modificado de carcasa FAIMS con una placa de pruebas óptica también proporciona estabilidad mecánica, minimizando así la desalineación durante experimentos de imagen prolongados. La sincronización entre el movimiento de la etapa y la adquisición espectral de masas es igualmente crítica para lograr una alta resolución espacial. En DESI–MSI, la dimensión del píxel en la dirección de barrido está gobernada por la relación entre la velocidad de la etapa y la tasa de adquisición, mientras que la dimensión ortogonal se define por el tamaño del paso programado. Un control preciso de estos parámetros permite un muestreo preciso. Dado que muchas células de mamíferos suelen medir entre aproximadamente 5 y 20 μm de diámetro, se requieren dimensiones de píxeles que se acercan a solo unos pocos micrómetros para minimizar la superposición de señales entre células adyacentes y mejorar la localización de características moleculares en regiones celulares individuales. Sin embargo, el tamaño nominal del píxel no corresponde necesariamente a la huella real de muestreo porque la interacción de la pluma de disolvente con la superficie de la muestra puede introducir dispersión lateral y solapamiento parcial de señales entre píxeles adyacentes. Por tanto, las dimensiones de píxeles reportadas deben interpretarse en el contexto de la resolución espacial efectiva en lugar de definiciones estrictamente geométricas. El tubo de transferencia iónico personalizado utilizado en este estudio fue diseñado según la geometría del tubo estándar de transferencia iónica para preservar las características de transmisión de iones y permitir la integración con la configuración de la fuente DESI.

El alto poder de resolución de masa y la precisión de masa proporcionados por los espectrómetros de masas Orbitrap son esenciales para resolver la compleja mezcla de metabolitos y lípidos presentes en las células individuales. Muchas características moleculares detectadas fueron anotadas tentativamente mediante mediciones de masa precisas y análisis METASPACE. Dado que múltiples asignaciones candidatas pueden corresponder a un solo valor m/z medido, la validación adicional de MS/MS y estrategias ortogonales de confirmación molecular podrían fortalecer aún más la identificación molecular en futuros estudios. En modo iónico positivo, los espectros DESI suelen estar dominados por especies fosfolípidas con valores m/z muy próximos o isobáricos. La detección de alta resolución por Orbitrap permite diferenciar estas especies, mejorando así la especificidad molecular y reduciendo la ambigüedad espectral. Esta capacidad es especialmente importante para análisis de células individuales, donde la dependencia de un número limitado de iones puede llevar a una mala interpretación de la heterogeneidad celular. Esta adaptabilidad sugiere que estrategias similares pueden aplicarse a otras plataformas de espectrometría de masas utilizando interfaces correspondientes con modificaciones apropiadas. A pesar de estas ventajas, deben considerarse varias limitaciones. En primer lugar, la fuente DESI utilizada en el trabajo actual solo está disponible para usuarios con sistemas DESI–MSI, y la construcción de sistemas de pulverizador/Orbitrap DESI puede estar limitada por la disponibilidad de fuentes DESI. Sin embargo, dispositivos DESI alternativos, incluido DEFFI, también pueden implementarse para estudios MSI de alta resolución^{espacial 42,47}. En segundo lugar, la implementación de esta plataforma requiere una personalización significativa, incluyendo el mecanizado de interfaces de instrumentos y la fabricación de componentes de montaje. Estos requisitos pueden limitar la accesibilidad para laboratorios sin experiencia en desarrollo de instrumentos o fabricación mecánica. En la implementación actual, la carcasa de la interfaz FAIMS sirvió como una plataforma mecánica de montaje conveniente para posicionar el conjunto del pulverizador DESI respecto a la entrada Orbitrap. En consecuencia, la implementación de la configuración descrita es más práctica para laboratorios con acceso a sistemas Orbitrap compatibles con FAIMS y soporte básico de mecanizado. Sin embargo, el concepto más amplio de acoplar mecánicamente fuentes DESI a las entradas Orbitrap puede lograrse usando diseños alternativos sin modificar el hardware de la interfaz FAIMS. Tercero, aunque los bajos caudales de disolventes mejoran el confinamiento espacial, también pueden reducir el rendimiento iónico total, lo que requiere una optimización cuidadosa para equilibrar la sensibilidad y la resolución espacial.

Otra consideración importante es el potencial de deslocalización de analitos durante el muestreo. Aunque DESI opera en condiciones ambientales y no requiere aplicación de matriz, la interacción de las gotas del disolvente con la superficie de la muestra puede conducir a la redistribución de los analitos, especialmente en especies altamente solubles. Por tanto, minimizar el volumen del disolvente y optimizar las condiciones de pulverización son fundamentales para preservar la integridad espacial a nivel de célula única. De manera similar, el procedimiento de lavado utilizando formiato de amonio isotónico puede reducir la supresión de iones asociados a la sal manteniendo la integridad celular y preservando las especies celulares, como se informó anteriormente en los flujos de trabajo de esclerosis múltiple^{unicelular 5}.

Los desarrollos futuros podrían mejorar aún más el rendimiento y la aplicabilidad de esta plataforma. Por ejemplo, la integración con sistemas de adquisición de datos más rápidos podría permitir tamaños de píxeles efectivos más pequeños y experimentos MSI de mayor rendimiento. La implementación de sistemas automatizados de alineación o control de retroalimentación en tiempo real puede reducir la variabilidad y mejorar la reproducibilidad. Además, combinar este enfoque con técnicas complementarias, como la imagen de fluorescencia o estrategias de marcado dirigido, podría mejorar la identificación de tipos celulares y permitir análisis multimodales.

Más allá de consideraciones técnicas, esta plataforma tiene amplias implicaciones para la investigación biológica y biomédica. La capacidad de caracterizar perfiles moleculares a nivel de células individuales bajo condiciones ambientales permite nuevas oportunidades para estudiar la heterogeneidad celular en sistemas complejos. DESI–MSI ya se ha aplicado con éxito a nivel tisular en estudios de microambientes tumorales, enfermedades neurológicas, interacciones huésped-patógeno y poblaciones celulares resistentes^{a fármacos} 12,15,16,35. Extender DESI–MSI al nivel de célula única puede mejorar aún más la capacidad para delimitar la heterogeneidad química localizada entre células vecinas, identificar subpoblaciones celulares raras y descubrir marcadores moleculares que de otro modo podrían estar ocultos en mediciones de tejido a granel. Sin embargo, el presente estudio se realizó utilizando un modelo simplificado de cultivo celular monocapa, y se necesitan estudios adicionales para demostrar la compatibilidad con otros sistemas biológicos complejos, incluyendo diferentes modelos celulares, tejidos, organoides y cultivos 3D. El flujo de trabajo actual podría proporcionar una base para extender las mediciones DESI de alta resolución espacial hacia entornos biológicos cada vez más heterogéneos tras una posterior validación y optimización. Dado que este método preserva el contexto espacial mientras proporciona información molecular detallada, puede servir como puente entre los enfoques basados en imágenes y ómicos. En resumen, este protocolo establece un marco flexible y adaptable para lograr DESI–MSI de resolución de célula única en espectrómetros de masas Orbitrap. Al abordar los principales desafíos relacionados con la eficiencia de ionización, la transmisión de iones, el control espacial y la resolución de masas, este enfoque permite una caracterización molecular detallada de células individuales. Aunque se necesitan más optimizaciones y validaciones, la metodología proporciona una base para ampliar el uso de MSI ambiental en estudios de metabolómica unicelular y espacial.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
−80 °C freezer	Eppendorf New Brunswick	U700	Almacenamiento de muestras biológicas antes de la preparación.
6" vertical bracket for breadboards, 1/4"-20 holes (2 pieces)	Millipore Sigma	VB01A	Soporte mecánico y estabilización del ensamblaje personalizado de soporte del rociador
Acetonitrilo	Fisher Chemical	240744	Solvente orgánico para la preparación y optimización del solvente compatible con DESI
Formato de amonio	Thermo Fisher Scientific	401152500	Preparación del tampón de lavado de formato de amonio isotónico para el lavado de células antes de DESI–MSI
Microscopio de campo brillante	Fisher Scientific	12575252	Imágenes ópticas y visualización de células adherentes antes de la adquisición DESI–MSI
Columna C18	Waters	186009259	Generación de contrapresión en línea para la formación estable del aerosol DESI de nanoflujo
Alambre de cobre	N/A	N/A	Conexión eléctrica y puesta a tierra durante la fabricación del soporte del rociador
Spray DESI XS	Waters	700014033	Fuente de ionización DESI ambiental para experimentos DESI–MSI de una sola célula
Resina epoxi	Devcon	20945	Estabilización mecánica y fijación de los componentes personalizados del soporte del rociador
Adaptador de carcasa de fuente de iones de electrodo FAIMS Pro	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Modificación y fabricación de la interfaz DESI compatible con Orbitrap personalizada
Ácido fórmico	Ward’s Science	470301-120	Modificador ácido para la preparación del solvente de aerosol DESI
Metanol	Fisher Chemical	A456-4 Optima	Solvente orgánico para la preparación del solvente de aerosol DESI
Regulador de gas	Millipore Sigma	23831-U	Regulación de la presión del gas de envoltura de nitrógeno durante la operación DESI
Lámina de cubreobjetos de vidrio reticulado	Ibidi	10817	Sustrato de cultivo celular y referencia posicional para el registro de imágenes ópticas a MS
Alambre de puesta a tierra	N/A	N/A	Conexión de puesta a tierra eléctrica para el rociador DESI y el ensamblaje de la interfaz
Incubadora	HeraCell	51026282	Mantenimiento de cultivos de células de mamíferos en condiciones de temperatura y CO2 controladas
Agua de grado LC/MS	Thermo Fisher Scientific	W6500	Preparación del tampón de lavado de formato de amonio y del solvente de aerosol DESI
Plataforma METASPACE	METASPACE	https://metaspace2020.eu	Visualización de imágenes MS basada en la nube y análisis de datos de metabolómica espacial
Interfaz FAIMS modificada	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Interfaz personalizada para acoplar el rociador DESI con los espectrómetros de masas Orbitrap
Etapa XYZ motorizada	Newport Corporation	CONEX-MFACC	Movimiento controlado de la etapa rasterizada durante la adquisición DESI–MSI
Kit de detección de micoplasma MycoAlert PLUS	Lonza	LT07-703	Monitoreo rutinario de la contaminación por micoplasma en células cultivadas
Sistema de cromatografía líquida nano	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	Sistema de suministro de solvente de nanoflujo para la generación del aerosol DESI
Breadboard óptico	Thorlabs	MB1012	Plataforma de soporte mecánico para el rociador DESI y el ensamblaje de la interfaz modificada
Espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific	UVPD	Espectrómetro de masas Orbitrap de alta resolución para la adquisición de datos DESI–MSI
Tubo PEEK	IDEX	1535	Conexión de línea de solvente entre el sistema nano-LC y el rociador DESI
Penicilina–estreptomicina	Gibco	15140-122	Suplemento antibiótico para el medio de cultivo celular de mamíferos
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	VWR	0780-50L	Solución de lavado para células cultivadas durante el pase
Medio RPMI-1640	Gibco	11875093	Medio de cultivo celular de mamíferos para el mantenimiento de células OVCAR-8
Software de control de etapa	Lasken Group	Versión 6	Control de software de escaneo rasterizado, movimiento de la etapa y parámetros de adquisición de imágenes
Tubo de acero inoxidable	MicroGroup	316H16H	Tubo de transferencia de iones fabricado a medida (1/16" OD, 0.033" ID) para la integración de la interfaz Orbitrap
Jeringa, 250 µL	Hamilton	1725LTN250UL	Carga de solvente y suministro de solvente de nanoflujo
Suero fetal bovino sintético (FBS)	HyClone	SH3006603	Suplemento sérico para la preparación del medio de cultivo celular de mamíferos completo
Contador celular automático TC20	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	Conteo automatizado de células cultivadas antes de sembrar en cubreobjetos
Placa de cultivo de tejidos, 100 mm	Fisher Scientific	FB012924	Expansión y mantenimiento de cultivos de células OVCAR-8 adherentes
Trypsina-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	Desprendimiento enzimático de células adherentes durante el pase
Resina de curado UV	Prime Dental	6.03	Fabricación y estabilización de los componentes personalizados del soporte del rociador DESI
Software Xcalibur	Thermo Fisher Scientific	4.7	Control del instrumento, configuración del método Orbitrap y adquisición de datos de espectros de masas