Preparación de vesículas unilamelares grandes y gigantes híbridos de polímero de membrana y polímero y lípido

Resumen

Este protocolo demuestra la reconstitución mediada por detergente de una proteína de membrana, la ubiquinol oxidosa citocromo bo3, en grandes vesículas unilamelares hechas de PDMS-g-PEO y su conversión en vesículas gigantes mediante fusión-electroformación. Los compartimentos funcionales resultantes basados en polímeros son adecuados para estudios bioquímicos y biofísicos avanzados.

Resumen

Las vesículas formadas a partir de copolímeros anfifílicos, solos o mezclados con fosfolípidos, ofrecen una estabilidad mecánica y química superior en comparación con las vesículas lipídicas convencionales. Esto los convierte en un chasis atractivo, que puede desarrollarse y ampliarse para permitir aplicaciones específicas, como la administración de fármacos, la biodetección diagnóstica, la construcción de células artificiales y microrreactores bioinspirados. En particular, la funcionalización mediante la incorporación de proteínas de membrana es esencial para muchas de estas aplicaciones. Aquí presentamos un protocolo para preparar las grandes vesículas unilamelares (LUVs) funcionalizadas por proteínas de membrana a partir del copolímero de injerto PDMS-g-PEO mediante reconstitución mediada por detergente. Además, describimos cómo estas grandes vesículas pueden convertirse en vesículas unilamelares gigantes (GUVs) mediante un enfoque de fusión-electroformación. El protocolo abarca el marcaje por fluorescencia de proteínas de membrana, la preparación de LUVs poliméricos e híbridos, la reconstitución de proteínas de membrana, el análisis de distribución de tamaño mediante dispersión dinámica de luz (DLS), la evaluación de la actividad proteica mediante mediciones de consumo de oxígeno, la preparación de GUVs funcionalizados por proteínas y el análisis de la inserción de proteínas y la actividad de bombeo de protones en GUVs mediante microscopía confocal. Los resultados representativos demuestran la formación de proteo-LUVs monodispersos con un índice de polidispersión (PDI) inferior a 0,2, y la generación exitosa de proteo-GUVs con diámetros de entre 5 y 35 μm. La actividad proteica se confirma mediante mediciones de consumo de osígeno tanto en LUVs poliméricos (18,2 nmol/min/mL) como en LUVs híbridos (26,9 nmol/min/mL). La inserción de proteínas en los GUVs se cuantifica mediante intensidad de fluorescencia, lo que da 20,6 ± 3,7 u.a. para los GUVs poliméricos y 26,2 ± 5,0 u.a. para los GUV híbridos. La actividad de bombeo de protones en los GUV, monitorizada mediante un colorante encapsulado sensible al pH, es coherente con la funcionalidad proteica, siendo predominante el bombeo de protones hacia dentro. La suavidad mecánica del copolímero y el grosor de la bicapa similar a lípidos (~5,3 nm) favorecen la inserción eficiente de proteínas y la preservación de su funcionalidad.

Introducción

Los copolímeros bloqueados anfifílicos pueden autoensamblarse en solución acuosa formando membranas, que se curvan y cierran espontáneamente sobre sí mismas para formar compartimentos esféricos cerrados por membrana, conocidos como polimersomas (vesículas poliméricas). En comparación con las membranas lipídicas, los compartimentos basados en polímeros ofrecen una mayor versatilidad química y una mayor estabilidad química¹ y^{mecánica 2}, lo que los hace muy atractivos para aplicaciones como la administración de fármacos, nanorreactores y microrreactores, y la construcción de células artificiales duraderas. Tanto nuestro grupo como otros han funcionalizado membranas poliméricas insertando proteínas de membrana para crear orgánulos y células^artificiales 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Los polímeros que contienen un núcleo hidrofóbico poli(dimetilsiloxano) (PDMS) son especialmente adecuados para la incorporación de proteínas de membrana debido a la alta flexibilidad de la cadena y la posibilidad de ajustar el grosor hidrofóbico de la membrana para que se ajuste mejor al dominio^{transmembrana 5} de la proteína. Mientras que nuestro laboratorio se ha centrado principalmente en el copolímero de injerto poli(dimetilsiloxano)-injerto-poli(óxido de etileno) (PDMS-g-PEO), que forma membranas altamente dinámicas ^4,16,17 más blandas que las bicapas lipídicas convencionales y que presentan un grosor de aproximadamente 5,3^nm1, otros grupos han empleado con éxito copolímeros tribloque basados en PDMS como PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA^5,6,7,8,9,10,11 y PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹² para la reconstitución de proteínas de membrana. Incluso copolímeros dibloque relativamente rígidos como PBD-b-PEO, especialmente en sistemas híbridos mezclados con lípidos, se han utilizado para la incorporación exitosa^{de proteínas 13}. Estos ejemplos destacan la versatilidad de las membranas basadas en polímeros como plataformas de reconstitución, que además pueden proporcionar una mayor estabilidad química¹ y una vida útil^{prolongada 14} para proteínas de membrana incorporadas. Aunque las membranas híbridas polímero/lípido no siempre igualan la estabilidad química de los sistemas puros^{de polímeros,} ofrecen un compromiso atractivo al combinar la robustez mecánica de los polímeros con la relevancia biológica de los lípidos. Esto da lugar a un entorno de membranas que imita más de cerca las membranas biológicas nativas, preservando al mismo tiempo las ventajas clave de los materiales sintéticos. Estas arquitecturas híbridas pueden ofrecer ventajas adicionales, incluyendo la reducción de la permeabilidad a protones derivada del reordenamiento^{a nanoescala 1} y la formación de dominios dentro de la^{membrana 15}.

Existen varias técnicas para reconstituir proteínas de membrana en vesículas nanodimensionadas (LUVs), incluyendo la reconstitución mediada por disolventes orgánicos (por ejemplo, evaporación en fase inversa, rehidratación de películas de proteínas lipídicas), enfoques mecánicos (por ejemplo, sonicación, prensa francesa, congelación-descongelación) y reconstitución mediada por detergente (mediante eliminación de detergentes, dilución o incorporación directa⁾¹⁸, y estrategias más recientes como la transferencia directa de nanodiscos de copolímeros de ácido estireno-maleico19. Mientras que las porinas se han incorporado con éxito en los LUVs poliméricos mediante inserción directa, por ejemplo, añadiendo la proteína a la película polimérica durante la^{rehidratación 8}. Este enfoque generalmente resulta en una baja eficiencia de inserción para proteínas de membrana más grandes o complejas y a menudo conduce a una orientación aleatoria de las proteínas. En consecuencia, la reconstitución mediada por detergente, que implica la adición controlada del detergente seguida de su retirada, sigue siendo el método más utilizado. También es la estrategia preferida para incorporar proteínas de membrana más grandes en LUVs basados en polímeros, especialmente para proteínas asimétricas donde la orientación controlada es crucial para su función. En este enfoque, las membranas de las vesículas se saturan primero con el detergente elegido (la concentración de detergente saturante se indica como R_saturado), se solubilizan parcialmente (coexistencia de vesículas y micelas), o se solubilizan completamente, es decir, se descomponen en micelas (la concentración de detergente se denota como_{R sol}). Este tratamiento inicial de membrana es seguido de la adición de proteínas, incubación y eliminación^{del detergente 18}. Esto último puede lograrse mediante diálisis, cromatografía de exclusión de tamaño o adsorción sobre perlas de poliestireno hidrofóbicas (por ejemplo, Bio-perlas). La elección del detergente, su concentración y el método de eliminación están optimizados para cada tipo de membrana y proteína, maximizando la eficiencia de incorporación y controlando la orientación^{de las proteínas 20}.

Aunque los LUV son muy adecuados para mediciones de actividad masiva, los estudios de vesícula única y los análisis basados en microscopía óptica requieren que las proteínas de membrana se reconstituyan en vesículas unilamelares gigantes (GUVs). Se utilizan cinco enfoques principales para la incorporación de proteínas en los GUVs: coformación en presencia de proteína y disolvente^{orgánico 21}, coformación en presencia de un^{detergente 22}, inserción en GUVs preformados mediante dilución^{de detergente 23}, inserción mediante fusión de membrana con proteo-LUVs^16,24 y fusión-electroformación²⁵. Aunque estos enfoques se han aplicado con éxito a los GUV lipídicos, su transferencia a GUVs de polímero o híbridos polímero/lípido suele ser un desafío. En particular, los métodos de coformación y dilución de detergente suelen resultar en bajas eficiencias de inserción en las membranas poliméricas o son incompatibles con ciertas composiciones^{poliméricas 15}. Las estrategias basadas en^fusión 4,16,24,26,27 que dependen de agentes fusogénicos adicionales también pueden ser problemáticas, ya que los lípidos/polímeros catiónicos sintéticos o los péptidos fusogénicos pueden comprometer la estabilidad de las proteínas de membrana, alterar sus propiedades o reducir la eficiencia de incorporación de la proteína objetivo. La fusión por electroformación supera muchas de estas limitaciones y ha demostrado ser un método robusto y eficiente para incorporar proteínas de membrana en los GUVs ^1,5,15 de polímeros e híbridos polímero/^lipídicos. Este enfoque permite la incorporación controlada de proteínas mientras preserva la integridad y funcionalidad de la membrana, lo que lo hace especialmente adecuado para la generación de GUVs poliméricos funcionalizados por proteínas.

Reconstituir bombeos de protones en vesículas basadas en polímeros es esencial para construir células artificiales duraderas, ya que permite la generación de gradientes transmembrana de protones, la moneda energética fundamental de los sistemas vivos. Al recrear la conversión de energía quimiosmótica en un entorno controlado de membrana^{mínima 28}, estas vesículas pueden impulsar la síntesis de ATP, el transporte activo y las reacciones metabólicas, estableciendo la base energética necesaria para una funcionalidad autónoma y realista. Una bomba de protones representativa utilizada en estos sistemas es la citocromo bo₃ oxidasa de E. coli, una enzima respiratoria terminal que acopla la reducción de oxígeno a la translocación de protones a través de la membrana. Debido a que la transferencia de electrones y el bombeo de protones están estrechamente acoplados, su actividad en vesículas sintéticas puede monitorizarse cuantitativamente ya sea mediante el consumo^{de oxígeno 1,20} o siguiendo la formación del gradiente de^{protones 1}.

En este protocolo, presentamos un flujo de trabajo detallado para la preparación de LUVs basados en PDMS-g-PEO, incluyendo membranas puras de polímero e híbridos polímero/lipídicos, su funcionalización con proteínas de membrana, escalado a GUVs y mediciones de actividad de la bomba de protones reconstituida citocromo bo₃ oxidasa mediante ensayos de consumo de oxígeno a granel y mediciones de bombeo de protones con vesícula simple.

Protocolo

NOTA: Todos los residuos químicos peligrosos generados durante este protocolo deben ser eliminados de acuerdo con las normativas institucionales y locales.

1. Preparación para Bio-Beads SM-2

NOTA: Las Bio-Perlas SM-2 se prelavan con metanol para eliminar conservantes y contaminantes orgánicos antes de la adsorción del detergente.

1. Coloca papel de filtro en un embudo de cristal colocado sobre un vaso o petaca de cristal limpio.
2. Añade al menos 600 mg de Bio-Beads SM-2 al embudo (suficiente para 3 repeticiones de reconstitución tanto para híbridos como polímeros LUVs).
   NOTA: Se requiere un mínimo de 90 mg de Bio-Beads SM-2 por reconstitución, según lo especificado en el paso 4.4.1. Se puede preparar una cantidad mayor si se planifican más reconstrucciones.
3. Lava las perlas tres veces con metanol puro, usando el volumen suficiente para sumergirlas completamente cada vez.
   PRECAUCIÓN: Realiza todos los pasos de manipulación de metanol en una campana extractora química.
4. Lava inmediatamente las cuentas tres veces con agua Milli-Q para eliminar el metanol residual.
   NOTA: No permitas que las cuentas se sequen durante el proceso de lavado. Al retirar las soluciones de lavado, asegúrate de que las gotas permanezcan húmedas y no se dejen secar por completo.
5. Transfiere las cuentas lavadas a un recipiente adecuado para almacenamiento (por ejemplo, un tubo o botella de vidrio estéril de polipropileno de 50 mL con un tapón bien sellado), añade agua Milli-Q hasta que las perlas estén completamente sumergidas y guarda a 4 °C durante hasta 3 meses.

2. Marcado por fluorescencia de proteínas de membrana

1. Dilución de proteínas
   1. Disolver citocromo bo₃ oxidasa a 2,2 mg/mL en un tampón HEPES de 20 mM que contenga 0,05% de n-dodecil β-D-maltósido (DDM) (p/v), pH 8,3. Este pH garantiza una fracción suficiente de aminas primarias no protonada (reactivas) para un marcado eficiente.
      NOTA: Para un marcaje óptimo con colorantes ATTO N-hidroxisuccinimidil (NHS), mantenga el pH del tampón entre 8,3 y 8,5. Para otros colorantes, sigue las instrucciones del fabricante para la conjugación de proteínas, incluyendo las condiciones recomendadas de etiquetado.
2. Adición de tintes
   1. Añadir un exceso molar de éster ATTO 643 N-hidroxisuccinímidil (NHS) reactivo a la amina, disuelto a 2 mg/mL en DMSO anhidro, a la solución proteica.
      NOTA: Para otros colorantes, siga las instrucciones del fabricante para la conjugación de proteínas, incluyendo el exceso molar recomendado de colorante a proteína.
   2. Mezcla suavemente golpeando el tubo de la microcentrífuga tres veces para asegurar una distribución homogénea del tinte.
3. Incubación
   1. Incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente (20–25 °C) durante 1,5 h bajo una suave agitación (250 rpm) en un termomezclador, a oscuridad para evitar el fotoblanqueamiento.
4. Eliminación del tinte no unido
   1. Equilibrar la columna Superdex 200 10/300 GL (CV: 23,562 mL) con al menos 2 volúmenes de columna (aproximadamente 48 mL) de tampón de elución de proteínas de membrana (20 mM HEPES, pH 7,5, 200 mM KCl, 0,05% DDM (p/v)) a un caudal de 0,3 mL/min utilizando un sistema de purificación ÄKTA.
      NOTA: Para la eliminación del exceso de tinte fluorescente, las columnas de filtración en gel más cortas (de 10–20 cm de longitud de lema) suelen ser suficientes, especialmente para tintes menos hidrofílicos. El fabricante del tinte recomienda dessalinizar usando una matriz Sephadex G-25. En este estudio se utilizó una columna Superdex 200 10/300 GL debido a la disponibilidad del instrumento.
   2. Carga hasta 500 μL de la proteína marcada usando un bucle capilar de 1 mL y eluye con el mismo tampón a 0,3 mL/min.
   3. Monitoriza la elución midiendo la absorbancia a 280 nm para proteínas y 643 nm para el colorante ATTO 643.
   4. Recoge fracciones de 0,5 mL sobre volúmenes de columna de 1,5. Identifica fracciones que contengan tanto proteína como colorante. Úsalo directamente si está suficientemente concentrado, o concentra usando unidades de filtro centrífugo Amicon. Para la concentración utilizando filtros Amicon, utiliza un filtro centrífugo con un corte de peso molecular de 30 kDa y centrifuga a 14.000 × g durante 30 minutos a 4 °C.
5. Determinación de la concentración de proteínas y el grado de marcado (DOL)
   1. Mide los espectros de absorbancia del conjugado purificado.
   2. Calcula la concentración de proteínas y el número medio de moléculas de colorante por enzima usando:
      
      donde A_max representa la absorbancia del conjugado en el máximo de absorción del colorante (λ_abs; ATTO 643, λ = 643 nm), A₂₈₀ es la absorbancia a 280 nm (máximo de absorción de proteínas), ε_prot es el coeficiente de extinción molar de la citocromo _bo3 oxidasa desnaturalizada (184.720 M⁻¹cm⁻¹), ε_colorante es el coeficiente de extinción molar del colorante (150.000 M⁻¹cm⁻¹), y CF₂₈₀ es el factor de corrección para la absorbancia ATTO 643 a 280 nm (0,04).

3. Preparación de grandes vesículas unilamelares (LUVs)

1. Preparación de polímero fino o película de polímero/lipídios
   1. Utilice pipetas de desplazamiento positivo con puntas resistentes a disolventes o jeringuillas de vidrio herméticas para transferir soluciones de polímero, lípidos y colorantes fluorescentes disueltas en cloroformo:metanol (2:1, v/v) a un vial de vidrio limpio según las composiciones listadas en la Tabla 1.
      PRECAUCIÓN: Realizar toda la manipulación de disolventes bajo una campana extractora usando guantes protectores y gafas de seguridad.
   2. Mezcla la solución cuidadosamente mediante un suave vórtice mientras mantienes el frasco en posición vertical para asegurar la homogeneidad.
      PRECAUCIÓN: Ajusta cuidadosamente la velocidad del vórtice para evitar que el líquido salpice o salga del frasco sobre tus manos.
   3. Evaporar los disolventes orgánicos bajo un suave chorro de nitrógeno en la campana extractora durante aproximadamente 1 hora, hasta que se forme una película fina uniforme en la pared del vial (Figura 1).
      NOTA: Ajusta el flujo de nitrógeno para que el líquido se mueva suavemente sin salpicar; Un flujo demasiado alto puede causar una formación desigual de la película. Tras 5–10 minutos, el flujo puede aumentarse ligeramente para asegurar un secado completo y una dispersión uniforme de la mezcla de la vesícula a lo largo del fondo del vial.
2. Rehidratación de película
   1. Rehidratar la película seca con 1 mL de tampón de rehidratación (1 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM de sacarosa) para obtener una concentración final de anfifílicos de 5 mg/mL (correspondiente a 1,67 mM para polimersomas y 2,14 mM para vesículas híbridas). Si se usan polimersomas para la reconstitución, suplementa el tampón de rehidratación con colato sódico al 0,1%.
      PRECAUCIÓN: El colato sódico es un irritante leve. Evita el contacto prolongado con la piel y la inhalación de polvo. Manejo según la hoja de datos de seguridad (SDS) del fabricante.
   2. El vórtice se activa vigorosamente hasta que la película queda completamente separada y suspendida, formando vesículas multilamelares (MLVs).
3. Ciclos de congelación-deshielo (solo vesículas híbridas)
   1. Sujetar suspensiones híbridas de MLV a cinco ciclos de congelación-descongelación de la siguiente manera: congelar las muestras en nitrógeno líquido durante 1 minuto, descongelarlas en un baño maria a 35 °C hasta que estén completamente derritidas y hacer un vórtice a 2500–3000 rpm durante 30 s usando un agitador de tubos. Repite este procedimiento durante un total de cinco ciclos.
      NOTA: Sáltate este paso para los polimersomas puros.
      PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido (−196 °C) puede causar quemaduras criogénicas graves. Manipula en un lugar bien ventilado usando el EPI adecuado (guantes criogénicos, gafas de seguridad y bata de laboratorio). Evita el contacto con la piel y los ojos.
4. Extrusión
   1. Transfiere la suspensión de vesículas a un mini-extrusor equipado con una membrana de policarbonato de 100 nm de poros.
   2. Extrude la suspensión 21 veces para obtener LUVs homogéneos en tamaño.
      NOTA: Asegúrese de que el paso final de extrusión deje la suspensión LUV en la jeringuilla opuesta a la jeringuilla de carga inicial. Esto minimiza la contaminación de la muestra final con vesículas más grandes o material residual que puede que no haya atravesado completamente la membrana.
5. Almacenamiento
   1. Almacena la suspensión de LUV a 4 °C y úsala en un plazo de una semana para mantener la distribución del tamaño de la vesícula y prevenir la agregación o el crecimiento microbiano en el tampón que contiene sacarosa.
   2. Antes de usarla, homogeneiza suavemente la suspensión LUV mediante vórtice.

4. Reconstitución de la proteína de membrana en LUVs

1. Pretratamiento de las vesículas con detergente
   1. Transfiere 200 μL de LUVs a un tubo microcentrífuga de 2 mL (Figura 1). Si se utilizan LUVs híbridos, añadir 1 μL de colato sódico al 20% (p/v) para obtener una concentración final de detergente del 0,1% (p/v). Si se usan LUVs poliméricos, no se necesita detergente adicional ya que el colato sódico ya está presente.
      NOTA: Prepara el material de detergente en el mismo tampón utilizado para los experimentos para asegurar la compatibilidad con las vesículas.
   2. Mezcla suavemente dando tres golpecitos en el tubo de la microcentrífuga. Evita la agitación vigorosa o el vórtice, que pueden crear espuma e introducir burbujas de aire.
2. Introducción de proteínas en vesículas tratadas con detergente
   1. Añadir citocromo bo 3 oxidasa (para mediciones de actividad) o citocromo bo₃ oxidasa–ATTO 643 (para imágenes de fluorescencia) a las vesículas desestabilizadas por detergente para lograr las siguientes concentraciones finales de proteínas: para polimersomas, 0,556 μM para experimentos LUV y 1,112 μM para experimentos GUV; para vesículas híbridas, 0,714 μM para experimentos LUV y 1,428 μM para experimentos GUV.
      NOTA: Estas concentraciones corresponden a una proporción molar proteína-polímero de 1:3.000 para los LUV y 1:1.500 para los GUVs.
   2. Añade la proteína lentamente mezclando suavemente, con el objetivo de distribuirla uniformemente por toda la solución y evitar la sobreconcentración local.
      NOTA: El volumen de proteína añadida puede variar entre fracciones debido a diferencias en la concentración de stock de proteína.
3. Ensamblaje de complejos proteína–detergente–polímero
   1. Incubar la mezcla a 4 °C durante 30 minutos con una agitación suave (400 rpm) en un termomezclador para permitir la formación de conjuntos mixtos de proteína, detergente y polímero antes de la retirada del detergente.
4. Eliminación de detergentes
   1. Eliminar el detergente mediante la adición secuencial de Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad). Retira 30 mg de Bio-Beads de la solución de almacenamiento, asegurándote de que permanezcan húmedos (húmedos pero sin exceso de líquido). Añade las perlas a la muestra e incuba durante 30 minutos a 4 °C con una agitación suave a 600 rpm en un termomezclador. Repite este paso dos veces más, para un total de 90 mg de Bio-perlas y un tiempo total de incubación de 1,5 h.
      NOTA: Usa solo bio-perlas completamente hidratadas. No transfieras cuentas secas, perlas adheridas a las paredes del tubo de la base de Bio-Beads ni perlas flotando en la superficie. Si las perlas se adhieren a la pared del tubo de reacción de reconstitución por encima del nivel de líquido tras la adición, centrifuga brevemente el tubo (por ejemplo, 3–5 s en una minicentrífuga de mesa) para recoger las perlas en la parte inferior antes de la incubación.
   2. Pelleta las Bio-Perlas mediante centrifugación a 2.000 × g durante 2 minutos usando una mini centrífuga de mesa. Recoge cuidadosamente el sobrenadante sin mover la bola.
      NOTA: Como alternativa a la centrifugación, deja que las perlas se asienten por gravedad durante aproximadamente 5 minutos y luego retira cuidadosamente el sobrenadante.
5. Almacenamiento
   1. Guarda los bo-3-LUVs reconstituidos a 4 °C y úsalos el mismo día para mediciones de la actividad proteica.

5. Tamaño y dispersión de los LUVs mediante dispersión dinámica de la luz (DLS)

1. Cargando LUVs para mediciones DLS
   1. Transfiere 45 μL de suspensión LUV o proteo-LUV sin diluir a una cuveta de cuarzo limpia. Asegúrate de que la cubetas esté libre de polvo, huellas dactilares u otros residuos para minimizar artefactos de dispersión de la luz.
      NOTA: Evita introducir burbujas de aire, ya que pueden interferir con las mediciones del DLS. Para evitar burbujas, pipetear lentamente la muestra a lo largo de la pared de la cubeta, y no expulses la última gota con fuerza. Si se forman pequeñas burbujas, déjalas subir y disiparse antes de medirlas.
2. Determinación del tamaño y dispersión del LUV mediante DLS
   1. Mide el diámetro hidrodinámico y el índice de polidispersión (PDI) utilizando un instrumento DLS equipado con un láser de helio-neón de 633 nm y detección de retrodispersión a un ángulo fijo de 173°.
   2. Realizar al menos tres mediciones independientes por muestra para asegurar su reproducibilidad.
   3. Analiza los datos utilizando el modelo de propósito general (distribución normal) para obtener el tamaño medio y el PDI.

6. Análisis del consumo de oxígeno de los LUV

1. Configuración de temperatura
   1. Ajusta la cámara de medición de un sistema de electrodos de ogénigeno tipo Clark a 22 °C y permite que el sistema se equilibre.
2. Adición de buffer
   1. Añadir 1 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM de tampón de sacarosa a la cámara de medición hasta un volumen total de 1.000 μL. Ajustar el volumen del tampón según el tipo de muestra: 942,9 μL para polímeros bo_3-LUV y 953,7 μL para híbridos bo 3-LUVs.
      NOTA: El volumen restante estará ocupado por LUVs y la mezcla DTT/Q₁ para alcanzar el volumen de medición final.
3. Adición de LUVs
   1. Añade _bo-3-LUVs a la cámara de medición y comienza a agitar suavemente usando el agitador magnético a 100 rpm y 22 °C. Ajustar el volumen de los bo 3-LUVs para lograr una concentración teórica de bo₃ oxidasa de aproximadamente 27 nM: 48,6 μL para polímeros bo 3-LUVs y 37,8 μL para híbridos bo 3-LUVs.
      NOTA: Para el control negativo, sustituir los _bo-3-LUVs por un volumen equivalente de LUVs libres de proteínas con la misma composición y concentración de lípidos/polímeros. Todos los pasos posteriores permanecen idénticos.
4. Medición de línea base
   1. Permite que la concentración de oxígeno se estabilice y mide durante 3 minutos bajo una agitación constante a 22 °C para obtener una línea base estable.
5. Preparación de la mezcla reductora/quinona
   1. Preparar frescamente la mezcla de DTT/Q₁ inmediatamente antes de su uso, mezclando 9,6 μL de 1 M de DTT en agua Milli-Q con 0,6 μL de 80 mM ubiquinona-1 (Q₁) en DMSO, y luego se vierte bien para asegurar la homogeneidad.
6. Activación enzimática
   1. Activar la_bo-3oxidasa añadiendo 8,5 μL de la mezcla recién preparada de DTT/Q₁ a la cámara de medición, resultando en concentraciones finales de 8 mM de DTT y 40 μM de Q₁.
7. Réplicas
   1. Mide cada muestra tres veces para asegurar su reproducibilidad.
8. Análisis de datos
   1. Grafica la concentración de oxígeno en función del tiempo. Determina la pendiente de la porción lineal de la curva, que corresponde a la tasa de consumo de oxígeno.
9. Reportajes
   1. Informa la tasa de consumo de oxígeno como la media de tres mediciones, con la desviación estándar.

7. Preparación de GUVs funcionalizados por proteínas

1. Limpieza por plasma de portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO
   1. Coloca las láminas de vidrio recubiertas con óxido de indio y estaño (ITO) en el limpiador de plasma con el lado conductor (recubierto con ITO) hacia arriba. El plasma los limpia durante 1 minuto a potencia alta ("HI") (230 V, potencia máxima RF 18 W) y a una presión de aproximadamente 0,5 mbar.
      NOTA: La encendida exitosa por plasma puede confirmarse visualmente por la aparición de un resplandor rosa/púrpura dentro de la cámara.
2. Deshidratación parcial de proteo-LUVs
   1. Mezcla 20 μL de LUVs libres de proteínas con 20 μL de proteo-LUVs que contienen bo-3oxidasa-ATTO 643 reconstituida. Haz un vórtice suave para asegurar una mezcla homogénea.
   2. Depositar siete gotas de 2 μL de la suspensión resultante de 5 mg/mL de LUV/proteo-LUV sobre la superficie conductora (recubierta con ITO) de cada portaobjetos utilizada para la electroformación (Figura 2A). Distribuye las gotas de forma uniforme a lo largo de la superficie de 160,6^mm2 , manteniéndolas separadas para favorecer una formación uniforme de la película.
      NOTA: Para otros sistemas poliméricos, la concentración de LUV y el volumen de gotas pueden requerir optimización (rango típico: 5–100 mg/mL LUVs; 0,2–2 μL gotas).
   3. Permitir que las gotas se deshidraten parcialmente a temperatura ambiente (∼22 °C) y a ∼20% de humedad durante aproximadamente 40 minutos, o hasta que se forme un anillo blanco en el perímetro de las gotas (Figura 2B).
      NOTA: La deshidratación depende de la humedad ambiente. Si la humedad relativa supera el 40%, extiende el tiempo de deshidratación según sea necesario (hasta 20 minutos). Determina el punto final basándose en la aparición de un anillo blanco en el perímetro de la gota en lugar de en un tiempo fijo. Bajo condiciones ambientales consistentes (temperatura y humedad), el tiempo de deshidratación requerido es reproducible. Evita el exceso de secado, que se nota como gotas completamente planas y uniformemente blancas, ya que esto puede causar precipitación de proteínas.
3. Montaje de la cámara de electroformación
   1. Montar la cámara de electroformación santando dos deslizadores recubiertos con ITO (lados recubiertos hacia dentro) separados por un separador de silicona de 1,81 mm de grosor con un corte en un lado, lo que permite añadir o retirar el amortiguador durante el llenado y la recogida.
   2. Llena la cámara con tampón de rehidratación (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM de sacarosa).
      Para experimentos sensibles al pH, añadir piranina de 10 μM (8-hidroxipireno-1,3,6-ácido trisulfónico sal trisódica, HPTS) al tampón.
4. Electroformación
   1. Aplicar un campo eléctrico sinusoidal alternante usando el siguiente programa: 50 Hz a 50, 100, 200, 300, 500, 700 y 900 mV durante 6 minutos cada uno; 50 Hz a 1,1 V durante 2 horas.
      NOTA: Para promover la formación de proteo-GUVs más grandes, este paso puede extenderse a 12 horas y 4 Hz a 2 V durante 30 minutos para el paso de desprendimiento. Cuando el buffer contiene piranina de 10 μM, aumenta la frecuencia a 500 Hz durante los dos primeros pasos de rampa de voltaje.
5. Colección de GUVs
   1. Abre cuidadosamente la cámara con pinzas y recoge los GUVs usando pipetas FineTip Ultra-Micro Pastette (o pipetas equivalentes de baja cizalladura) para minimizar el esfuerzo mecánico.
      NOTA: Evite usar puntas estándar de bajo volumen por debajo de 200 μL, ya que pueden romper GUVs más grandes. Alternativamente, se pueden cortar puntas estándar en el extremo para ensanchar la abertura y reducir el corte durante la recogida.
6. Almacenamiento
   1. Almacena proteo-GUVs a 4 °C y úsalo en un plazo de 48 horas para preservar la actividad proteica.
      NOTA: La tasa de pérdida de actividad depende del tipo y la estabilidad de la proteína de membrana reconstituida, así como de la composición de la membrana.

8. Microscopía de GUVs funcionalizados por proteínas

1. Montaje del microscopio
   1. Enciende el microscopio confocal. Si usas el sistema Leica, lanza el software LAS X. Para otras marcas de microscopios, utiliza el software de adquisición recomendado por el fabricante.
   2. Seleccione un objetivo de inmersión en aceite del 63× (NA 1,40); Ajusta a una ampliación mayor o menor si es necesario, dependiendo del tamaño del GUV.
   3. Abrir dos canales de imagen correspondientes a los fluoróforos: Rodamina Roja (membrana) y ATTO 643 (proteína reconstituida).
      NOTA: Para fluoróforos con espectros parcialmente superpuestos, seleccione líneas láser adecuadas y ventanas de detección estrechas para minimizar la diafonía espectral. Adquiere cada canal secuencialmente para evitar que la señal pase y asegurar una cuantificación precisa de la fluorescencia.
2. Sedimentación de los GUV
   1. Coloque un aislador de silicona prensa-sellado sobre una capa de cubierta de vidrio limpia nº 1,5 (grosor de 0,17 mm).
      NOTA: Para microscopios verticales (no invertidos), pueden usarse portaobjetos de vidrio más gruesos.
   2. Pipete 60 μL de tampón (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM de glucosa) en el centro del espaciador.
   3. Añade suavemente 20 μL de la suspensión GUV encima del amortiguador.
   4. Cubre inmediatamente la cámara con una segunda corredera de tapa de vidrio para evitar la evaporación.
   5. Deja sedimentar los GUVs durante ~5 minutos antes de hacer la imagen.
3. Adquisición de imágenes
   1. Enfoca en la parte inferior de la cámara para capturar secciones eficaces de los GUVs.
   2. Adquiere imágenes de diferentes GUVs a lo largo de la cámara escaneando sistemáticamente desde la esquina superior izquierda hasta la esquina inferior derecha (patrón de serpiente") para obtener una población representativa (~100 GUVs). Imagen de todas las vesículas encontradas durante el escaneo sin preselección, independientemente del tamaño o la intensidad de fluorescencia, para evitar sesgos de selección y asegurar su reproducibilidad.
      NOTA: Evita realizar imágenes repetidas del mismo GUV para evitar el fotoblanqueamiento.
4. Análisis de imágenes
   1. Cuantifique la intensidad de fluorescencia de una proteína reconstituida marcada con ATTO 643 dibujando una polilínea a lo largo de la membrana de GUVs individuales. Al usar el software LAS X, selecciona Cuantificar → Perfil de Línea, luego elige la herramienta polilínea y traza la membrana de cada GUV. Para obtener la intensidad media de fluorescencia, abre Estadísticas y registra el valor medio. Analizar solo GUVs limpios y unilamelares; excluir las vesículas multivesiculares y las vesículas agregadas del análisis.
      NOTA: Si las mediciones se realizan en días diferentes, las intensidades de fluorescencia deben normalizarse a la potencia del láser, medida bajo configuraciones de imagen idénticas (longitud de onda y potencia nominal). Para tener en cuenta las variaciones diarias en la salida del láser, se aplica la siguiente normalización: , donde F_u.a. es la intensidad de fluorescencia medida en unidades arbitrarias, la referencia P es la potencia láser medida en el día de referencia y es la potencia láser medida el día de la adquisición. Esta corrección asume una relación lineal entre la potencia del láser y la intensidad de fluorescencia bajo condiciones de iluminación no saturadas. En el presente estudio, todas las imágenes se adquirieron el mismo día, por lo que no fue necesaria la normalización.
   2. Reporta la intensidad de fluorescencia como una media de 100 GUVs con la desviación estándar correspondiente.

9. Análisis de bombeo de protones en proteo-GUVs

1. Montaje del microscopio
   1. Enciende el microscopio confocal y lanza el software de adquisición adecuado (por ejemplo, LAS X para sistemas Leica).
   2. Selecciona un objetivo de inmersión en aceite del 63× (NA 1,40). Ajusta a un aumento mayor o menor si es necesario, dependiendo del tamaño del GUV.
   3. Configura tres canales de imagen correspondientes a los fluoróforos. Para Rhodamine Red (marcador de membrana), se utiliza una excitación de 561 nm y un rango de emisión de 570–620 nm. Para la piranina (tinte encapsulado sensible al pH), se utilizan excitaciones a 448 nm y 405 nm, y se recogen las emisiones entre 499 y 551 nm.
      NOTA: Si hay un láser de 458 nm disponible, úsalo en lugar de 448 nm para excitar la forma desprotonada (básica) de la piranina.
   4. Ajusta la potencia del láser y la ganancia del detector para evitar la saturación de píxeles y minimizar el fotoblanqueamiento. Mantén los ajustes de adquisición constantes durante todo el experimento.
2. Sedimentación de los GUV
   1. Añadir 280 μL de tampón (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM de glucosa) a un pozo de una lámina con 8 pozos (volumen total del pozo: ~874 μL).
      NOTA: No use menos de 200 μL, ya que los volúmenes por debajo de 200 μL aumentan la evaporación y la deriva del pH. No exceda los 400 μL para evitar derrames y asegurar un pipeteo cómodo. Si usas un formato de cámara diferente, ajusta el volumen en consecuencia. Para microscopios invertidos, utiliza portaobjetos de cámara compatibles con el grosor de cobertura #1.5H.
   2. Añade suavemente 20 μL de la suspensión _{BO 3-GUV} sobre el amortiguador sin introducir burbujas de aire.
      NOTA: Para el control negativo, sustituir la suspensión _{bo 3-GUV} por un volumen equivalente (20 μL) de GUVs libres de proteínas de la misma composición lipídica/polímero, preparados y sedimentados bajo condiciones idénticas. Este control tiene en cuenta cualquier efecto no específico de la DTT y Q₁ sobre la relación de fluorescencia de la piranina que sea independiente de la actividad de la_bo-oxidasa.
   3. Deja sedimentar los GUVs durante aproximadamente 5 minutos antes de la imagen.
3. Adquisición de referencia
   1. Concéntrate en el plano inferior de la cámara donde los GUVs se han sedimentado.
   2. Ajusta el zoom para obtener entre 3 y 6 GUVs dentro del campo de visión.
   3. Registra la fluorescencia de base en todos los canales durante 5 minutos antes de la activación.
4. Activación del bombeo de protones
   1. Prepara una mezcla fresca de DTT–Q₁ justo antes de usarla mezclando 4,8 μL de 1 M de DTT con 0,3 μL de 80 mM Q₁ en DMSO, y luego mezcla a fondo mediante vórtice.
   2. Activa la citocromo bo₃ oxidasa añadiendo suavemente 2,6 μL de la mezcla DTT–Q₁ sobre la superficie de la solución sin insertar la punta de la pipeta en el tampón, resultando en concentraciones finales de aproximadamente 8 mM de DTT y 40 μM Q₁ en la cámara.
   3. Monitorizar la fluorescencia de piranica intravesicular durante 30 minutos bajo adquisición continua.
5. Análisis de la fluorescencia de piranina intravesicular
   1. Para cada GUV, se define una región de interés (ROI) dentro del lumen de la vesícula. En el software LAS X, ve a Cuantificar → Perfil de pila, selecciona Dibujar Elipse y dibuja un ROI circular dentro de cada GUV.
   2. Para determinar la intensidad media de fluorescencia en 499–551 nm para ambas longitudes de onda de excitación (448 nm y 405 nm), abre Statistics en el software y registra el valor medio.
   3. Calcula la relación de fluorescencia como R = I₄₄₈/I₄₀₅.
   4. Grafica la relación a lo largo del tiempo para obtener trazas cinéticas del cambio de pH intravesicular.

Resultados

La citocromo bo₃ oxidasa de E. coli se expresó a partir del plásmido pETcyo en la cepa E. coli C43 (DE3) ΔcyoABCDE y se purificó como se describió^{anteriormente en 29}. La _bo-oxidasa purificada se utilizó directamente para la reconstitución y mediciones de actividad, o se marcó con tintes fluorescentes, como ATTO 643 (este estudio) u otros tintes^{ATTO 1,15}. Para tintes altamente hidrofílicos como ATTO 643, se utilizó una columna de 30 cm para lograr una separación eficiente del colorante no unido de la proteína marcada (Figura 3A). El grado de marcado (DOL), calculado a partir de espectros de absorbancia, oscilaba típicamente entre 1,1 y 1,3 moléculas de colorante por enzima, dependiendo del colorante ATTO utilizado. Para la oxidasa bo₃ marcada con ATTO 643, el DOL fue de 1,16 (Figura 3B).

Para la reconstitución de proteínas, los LUVs se prepararon primero mediante rehidratación de película fina, seguidos de ciclos de congelación-deshielo y extrusión para obtener tamaños uniformes de vesículas. Para los polimeromas, el tampón de rehidratación se complementaba con detergente. Las distribuciones del tamaño de las vesículas se analizaron mediante dispersión dinámica de la luz antes de la reconstitución (Figura 4, Tabla 2). Tanto los LUV híbridos como los poliméricos solían mostrar diámetros medios de 85–95 nm con distribuciones de tamaño estrechas (PDI < 0,2). Se espera que las vesículas basadas en PDMS-g-PEO sean ligeramente más pequeñas que el tamaño nominal de los poros de la membrana de extrusión. Los polimersomas típicos mostraron tamaños muy uniformes, con valores de PDI por debajo de 0,1, mientras que las vesículas híbridas formaron poblaciones razonablemente uniformes con valores de PDI ocasionalmente superiores a 0,1 pero consistentemente por debajo de 0,2.

Después, se insertó proteína de membrana bo₃ oxidasa en los LUVs en presencia de detergente (colito sódico en este estudio). Posteriormente, el detergente se eliminó utilizando Bio-Beads. Tras la reconstitución, el tamaño del polimersoma aumentó solo ligeramente (Figura 4A), mientras que el tamaño de la vesícula híbrida permaneció sin cambios (Figura 4B). En ambos sistemas se observó un pequeño aumento en la IDP (Tabla 2). Se esperan cambios menores de tamaño, ya que la solubilización y eliminación mediada por detergente puede reorganizar las cadenas poliméricas en la membrana. La actividad proteica se evaluó midiendo el consumo de oxígeno, lo que indica si la proteína mantuvo su actividad funcional (Figura 5A). La ausencia de consumo de oxígeno en el control LUV negativo sin proteínas confirma que la señal observada proviene específicamente de la actividad de la oxidasa bo₃ . Con la reconstitución mediada por colato de sodio a las concentraciones utilizadas aquí, la actividad proteica fue típicamente ligeramente mayor en las vesículas híbridas en comparación con los polimersomas (Figura 5B). Se observó cierta variabilidad en la actividad proteica entre lotes de purificación e incluso entre fracciones dentro del mismo lote. Por lo tanto, para estudios comparativos —como comparar la actividad proteica entre diferentes sistemas de membrana— debe utilizarse la misma fracción de proteína purificada para asegurar la consistencia.

Para generar PDMS-g-PEO y PDMS-g-PEO/GUVs de soja funcionalizados por proteína, se empleó un enfoque de fusión y electroformación. En este método, los proteo-LUVs se mezclaron con LUVs libres de proteínas y se depositaron en láminas de vidrio recubiertas con ITO, seguido de una deshidratación parcial para promover la fusión de vesículas y la formación de un polímero/proteína o de polímero/lápido/película proteica. La deshidratación insuficiente resultó en un bajo rendimiento de proteo-GUV, menor tamaño de GUV y la presencia de LUVs (proteo-)no fusionados.

La incorporación exitosa de la proteína marcada, bo₃ oxidasa–ATTO 643, en la membrana, fue confirmada por microscopía confocal tras la sedimentación de los GUVs en un gradiente de densidad de sacarosa/glucosa (Figuras 6A, B). La cuantificación de la fluorescencia asociada a membranas usando un simple perfil de línea puede estar sesgada, ya que la intensidad medida depende del ángulo en el que se traza la línea. Para minimizar este efecto, se evaluó la intensidad de fluorescencia utilizando una polilínea dibujada a lo largo de todo el contorno de membrana de cada GUV.

Para evaluar posibles correlaciones entre el tamaño de la vesícula y la incorporación de proteínas, se analizó el diámetro del GUV en paralelo (Figura 6C, D). Los GUVs más grandes (por encima de 20 μm) típicamente presentaban una menor fluorescencia proteica asociada a la membrana en comparación con las vesículas más pequeñas. Esta observación puede atribuirse al mecanismo de fusión-electroformación: las vesículas más pequeñas se forman antes y pueden incorporar proteínas de forma más eficiente, mientras que las vesículas más grandes surgen de eventos de fusión posteriores y crecimiento de membranas, lo que puede llevar a la dilución con material pobre en proteínas.

La incorporación total de proteínas se determina principalmente en la etapa inicial de reconstitución en LUVs, especialmente por el tipo de detergente, la concentración y el paso en el que se añade. En los LUVs poliméricos, se observó una incorporación ligeramente menor al añadir detergente a las vesículas preformadas en comparación con la adición durante la formación de la vesícula (paso de rehidratación), dando intensidades de fluorescencia de 18,9 ± 3,9 u. y 20,6 ± 3,7 u., respectivamente (Figura 6C, D, izquierda). En sistemas híbridos, donde se añade detergente tras la formación de la vesícula, la concentración de detergente juega un papel notable: aumentar el colato sódico del 0,015% al 0,1% llevó a un notable incremento en la incorporación de proteínas (22,1 ± 5,2 u.a. frente a 26,2 ± 5,0 u.a., Figura 6C, D, derecha). Comparando sistemas poliméricos e híbridos, generalmente se observó una incorporación ligeramente mayor de bo-3oxidasa por membrana en los GUV híbridos. Esto probablemente se deba a la presencia de defectos de empaquetado en las interfaces polímero-lípido, que, además de los defectos inducidos por detergentes, proporcionan sitios de inserción favorables para las proteínas de membrana.

Utilizando un segundo paso de electroformación de 2 h, el diámetro medio de los GUVs funcionalizados por_{oxidasa bo 3} fue aproximadamente de 14–15 μm (13,5 ± 3,7 μm para los GUVs poliméricos y 15,4 ± 6,3 μm para los GUV híbridos), aunque también estaban presentes vesículas notablemente mayores (Figura 6C, D). Aumentar la duración del segundo paso de electroformación a 12 horas resultó en un aumento general del tamaño del^{GUV 1,27}.

El protocolo fusión-electroformación también permite encapsular especies solubles en agua, como tintes sensibles al pH (por ejemplo, piranina), añadiendo el tinte al tampón de rehidratación durante la electroformación (Figura 7A). El tamaño del GUV suele disminuir cuando se forman vesículas en presencia de tintes solubles en agua. Para compensar este efecto, la frecuencia durante los pasos iniciales de electroformación debe aumentarse de 50 a 500 Hz.

La encapsulación de un colorante sensible al pH ratiométrico, como la piranina, permite el monitoreo de la bombeo de protones por una sola vesícula y proporciona información sobre la orientación de las bombas de protones. Al acidificar la luz vesícula, la proporción de fluorescencia de la pirarina excitada a 448 nm y 405 nm disminuye. Esta proporción refleja el estado de protonación de la piranina y, por tanto, se correlaciona con el pH. Las mediciones ratiométricas son ventajosas, ya que son en gran medida insensibles a las variaciones en la eficiencia de encapsulación de tintes y el fotoblanqueo. Un ejemplo de actividad de bombeo de protones se muestra en la Figura 7B, donde se observa una disminución en la relación de fluorescencia de la piranica intravesicular (I₄₄₈/I₄₀₅) en GUVs híbridos que contienen _bo-3oxidasa reconstituida tras la adición de la DTT donante de electrones y el mediador de electrones Q₁. La proporción de fluorescencia comienza a disminuir bruscamente aproximadamente 1 minuto después de la activación y continúa disminuyendo rápidamente durante aproximadamente 1 minuto, para luego disminuir durante los siguientes ~18 minutos. Este comportamiento indica que la mayoría de las moléculas de bo₃ oxidasa están orientadas de tal manera que el bombeo de protones ocurre hacia el interior de los GUVs. Los GUVs libres de proteínas sometidos a condiciones idénticas mostraron una disminución menor en la proporción de fluorescencia, sirviendo como control negativo y confirmando que la mayor disminución observada en los BO_3-GUV se debe específicamente a la actividad de bombeo de protones de la oxidasa bo₃ y no a efectos inespecíficos de la DTT y_{Q 1} sobre la proporción de fluorescencia de la piranina.

Figura 1. Representación esquemática de la preparación de vesículas unilamelar grandes (LUV), reconstrucción de la proteína de membrana citocromo bo₃ oxidasa en LUVs y formación de vesículas unilamelares gigantes funcionalizadas por bo₃ oxidasa (GUVs) mediante el enfoque de fusión y electroformación. Los LUVs se preparan mediante rehidratación de película fina, ciclos de congelación-descongelación y extrusión a través de una membrana de 100 nm del tamaño de un poro. La reconstitución de la citocromo bo₃ oxidasa se realiza en presencia de detergente, que posteriormente se elimina mediante Bio-Beads. Los _bo-3-GUVs se forman depositando _bo-3-LUVs sobre láminas de vidrio recubiertas de óxido de indio-estaño (ITO), seguidas de deshidratación parcial y rehidratación en presencia de corriente eléctrica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2. Formación de una película fusionada de una gran vesícula unilamelar (LUV) por deshidratación. Siete gotas de 2 μL de proteo-LUVs y LUVs mixtos se depositaron sobre portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de estaño de indio (ITO): (A) inmediatamente después de la deposición y (B) tras deshidratación parcial. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3. Marcado fluorescente de citocromo bo₃ oxidasa. (A) Cromatograma (perfil de elución) de bo 3 oxidasa-ATTO 643 purificado en una columna Superdex 200 10/300 GL. Las fracciones resaltadas en gris se recogieron y posteriormente se concentraron. (B) Espectros de absorbancia de la bo-3oxidasa-ATTO 643 concentrada, mostrando picos en 280 nm (proteína), 400 nm (banda de Soret de cofactores hemo en bo₃ oxidasa) y 643 nm (colorante). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4. Distribuciones de tamaño de grandes vesículas unilamelares (LUVs) antes y después de la reconstitución proteica: (A) polímero poli(dimetilsiloxano)-injerto-poli (óxido de etileno) (PDMS-g-PEO) y (B) vesículas híbridas PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina de soja (PC). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 5. Consumo de ogen por bo-oxidasa reconstituida en grandes vesículas unilamelares (LUVs). (A) Traza representativa de la concentración de oxígeno a lo largo del tiempo tras la activación de la citocromo _bo3oxidasa reconstituida mediante la adición de ditiotreitol (DTT) y ubiquinona-1 (Q₁). La traza verde corresponde a los LUVs reconstituidos por proteína, y la traza gris al control negativo (LUVs libres de proteínas). (B) Tasas de consumo de osígeno (OCR) de _bo-3 oxidasa reconstituidas en LUVs de poli(dimetilsiloxano)-injerto-poli (óxido de etileno) (PDMS-g-PEO) y PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina de soja (PC). Las barras representan la desviación estándar media ± (DS) de tres mediciones independientes (n = 3). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6. Inserción de bo-3oxidasa marcada con fluorescencia en vesículas unilamelares gigantes (GUVs). Micrografías representativas de (A) poli(dimetilsiloxano)-injerto-poli(óxido de etileno) (PDMS-g-PEO) y (B) PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina de soja (PC) GUVs (membranas marcadas con fosfatidiletanolamina-Rodamina (PE-Rho), rojo) que contienen citocromo _bo3 oxidasa-ATTO 643 (magenta) reconstituido. Cuantificación de la intensidad de fluorescencia bo₃ oxidasa-ATTO 643 en función del tamaño del GUV (N = 100) para diferentes condiciones de reconstitución: (C) adición de 0,2% de colato sódico (SC) a las grandes vesículas unilamelares (LUVs) de polímero preformadas y 0,015% de SC a LUVs híbridos preformados; (D) los LUVs poliméricos formados en presencia de 0,1% de SC y LUVs híbridos tratados con 0,1% de SC tras la formación. Los valores representan la intensidad de fluorescencia de los GUVs individuales (N = 100 por condición). En el texto se informan valores medios ± desviación estándar (DS). Las comparaciones son descriptivas; no se realizaron pruebas estadísticas formales. A.U. (unidades arbitrarias). Barra de escala = 20 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 7. Bombeo de protones por _bo-3 oxidasa reconstituido en vesículas unilamelares gigantes (GUVs). (A) Micrografía de fluorescencia representativa de poli(dimetilsiloxano)-injerto-poli (óxido de etileno) (PDMS-g-PEO)/fosfatidilcolina de soja (PC), con membranas marcadas con 0,05% fosfatidiletanolamina-Rodamina (PE-Rho, rojo), que contienen citocromo _bo3oxidasa reconstituida y piratina sensible al pH encapsulada (excitación a 405 y 448 nm; canales azul y verde), sedimentadas en una lámina de vidrio con cámara. (B) Cambio en la proporción de fluorescencia de piralina intravesicular al activarse con ditiotreitol (DTT) y ubiquinona-1 (Q₁) en los GUVs de PDMS-g-PEO/soja de PC que contienen bo-3oxidasa reconstituida. La traza verde corresponde a los GUVs reconstituidos por proteínas, y la traza gris al control negativo (GUVs libres de proteínas). La traza representa la media ± desviación estándar (SD) (n = 3 vesículas). Barra de escala = 20 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

	Componente	Material	Cantidad	Composición final de la membrana
Polimersomas	PDMS-g-PEO en cloroformo:metanol (2:1, v/v)	10 mg/mL	499,9 μL	99,95% mol
	PE-Rodamina en cloroformo	1 mg/mL	1,1 μL	0,05% mol
Vesículas híbridas	PDMS-g-PEO en cloroformo:metanol (2:1, v/v)	10 mg/mL	450,1 μL	70%
	Soja PC (95%) en cloroformo	10 mg/mL	49,8 μL	29,95% mol
	PE-Rodamina en cloroformo	1 mg/mL	1,4 μL	0,05% mol

Tabla 1: Soluciones y volúmenes de material usados para la preparación de películas finas para la formación de vesículas unilamelares grandes (LUV). Las concentraciones de stock se indican en mg/mL. Se calculan volúmenes para una concentración total de 5 mg/mL de anfifilios. La composición final de la membrana se expresa en mol%. PDMS-g-PEO: poli(dimetilsiloxano)-injerto-poli (óxido de etileno); PE-Rodamina: fosfatidiletanolamina-Rodamina; soja PC: fosfatidilcolina; V/V: Volumen/volumen.

	Condición de reconstitución	Diámetro (nm)	PDI
Polimersomas	Pre-reconstitución	84,34 ± 0,22	0.084
	Tras la reconstitución	100,73 ± 0,81	0.109
Híbridos	Pre-reconstitución	89,21 ± 0,77	0.129
	Tras la reconstitución	85,01 ± 0,42	0.17

Tabla 2: Tamaño medio de la vesícula e índice de polidispersión (PDI) de polimersomas (poli(dimetilsiloxano)-injerto-poli (óxido de etileno), PDMS-g-PEO) y vesículas híbridas (PDMS-g-PEO/fosfatidilcolina de soja (PC)) antes y después de la reconstitución. Los datos representan la media de tres mediciones independientes.

Discusión

Los polimersomas y las vesículas híbridas polímero/lípido presentan una mayor estabilidad química y mecánica en comparación con las vesículas lipídicas convencionales, lo que las hace muy atractivas para aplicaciones que van desde la administración de fármacos y biodetección hasta nanorreactores y microrreactores y células artificiales. Sin embargo, su arquitectura de membrana distintiva y sus propiedades biofísicas a menudo impiden la transferencia directa de protocolos optimizados para vesículas lipídicas a sistemas basados en^polímeros 15,20,30. El protocolo presentado aquí aborda estas diferencias y proporciona un flujo de trabajo optimizado para la reconstitución de proteínas de membrana en polímeros e híbridos LUVs basados en PDMS-g-PEO, seguido de la escala a GUVs mediante electroformación por fusión.

Un paso crítico en el protocolo es la preparación de LUVs con una distribución de tamaño estrecha y reproducible. Al igual que en las películas lipídicas, las películas PDMS-g-PEO se autoensamblan en vesículas tras la rehidratación con un tampón acuoso. A diferencia de los sistemas lipídicos, que frecuentemente producen una mezcla de vesículas uni- y multilamelares, el PDMS-g-PEO forma preferencialmente estructuras^{unilamelares 1}, eliminando la necesidad de ciclos de congelación-deshielo que se utilizan típicamente para reducir la multilamelaridad en preparaciones lipídicas. La extrusión se realiza para estandarizar la distribución del tamaño de la vesícula. Debido al aumento de la suavidad de las membranas PDMS-g-PEO en relación con las bicapas^{lipídicas 1}, las presiones de extrusión más bajas son suficientes. Aunque las 11 pasadas de extrusión recomendadas por el fabricante suelen ser suficientes, aumentar el número de pasadas suele resultar en una distribución de tamaños más estrecha y una mejor reproducibilidad. Sin embargo, una extrusión excesiva puede producir vesículas ligeramente más pequeñas que el tamaño nominal de los poros de la membrana. La extrusión repetida también puede reducir el rendimiento de la vesícula debido a la pérdida de material; previamente determinamos que aproximadamente el 31% del material de PDMS-g-PEO y el 25% del material de vesícula de soja de PDMS-g-PEO/soja PC se perdieron tras 21 pasadas a través de una^{membrana 1} de 100 nm. Por lo tanto, el número de pasadas de extrusión debe optimizarse para equilibrar la uniformidad del tamaño con la integridad y el rendimiento de la vesícula.

La reconstitución mediada por detergente representa otro determinante crucial del éxito. El tipo y concentración óptimos de detergente dependen tanto de la proteína específica de la membrana como de la composición de^{la membrana, 3,20}. En el caso de las membranas puras de polímero, cuando las condiciones de saturación son óptimas, incorporar detergente durante la rehidratación de la película produce mayores eficiencias de inserción que saturar las vesículas preformadas. Las membranas poliméricas más rígidas, como las formadas a partir de PBD-b-PEO, requieren concentraciones sustancialmente mayores de detergente para la solubilización en^{membrana 30}, lo que subraya la necesidad de optimización específica para polímeros. La inserción exitosa debe verificarse no solo mediante mediciones de actividad —en comparación con micelas detergentes o vesículas lipídicas— sino también mediante análisis estructurales, como crio-TEM, para evaluar la profundidad de inserción y la adaptación de la membrana a la desadaptación^{hidrofóbica 1}. La orientación de proteínas es igualmente crítica, especialmente para bombas de protones, ya que un gradiente funcional de protones requiere que la mayoría de las bombas estén orientadas de manera uniforme. Idealmente, las bombas deberían transportar protones hacia el interior para permitir el acoplamiento con procesos que consumen gradientes, como la síntesis de^{ATP 3,15}. La orientación puede evaluarse utilizando etiquetas de proteínas, por ejemplo, templando selectivamente tintes expuestos al exterior de la vesícula o desplazando marcas fluorescentes adheridas a las etiquetas^His-20. Estos enfoques se presentan como recomendaciones generales para la optimización de protocolos y no se realizaron en este estudio.

La escala desde proteo-LUVs hasta proteo-GUVs mediante fusión electroformación requiere un control cuidadoso de los parámetros de deposición y deshidratación. La concentración de LUVs y el tamaño de las gotas influyen críticamente en el rendimiento y pureza final del GUV. Concentraciones excesivamente altas de LUV (≥10 mg/mL) pueden provocar que los LUVs no fusionados permanezcan en la muestra final, mientras que concentraciones demasiado bajas (<5 mg/mL) reducen el rendimiento de GUV debido a la insuficiencia de material depositado. La deshidratación debe ser parcial y no completa—lo que indica la aparición de un anillo blanco en el perímetro de la gota en lugar de una gota completamente blanca—ya que una deshidratación excesiva puede afectar o abolir la actividad proteica de membrana, especialmente en bombas de protones. Por tanto, la humedad y la temperatura controladas son esenciales para desestabilizar suficientemente las membranas para la fusión, preservando al mismo tiempo la funcionalidad de las proteicas.

Cargas altas de proteínas pueden disminuir el tamaño del GUV, pero este efecto puede mitigarse diluyendo los LUVs funcionalizados por proteínas con LUVs libres de proteínas. De este modo, la densidad proteica dentro de las membranas GUV puede modularse con precisión antes de la deposición. Por ejemplo, mezclar _BO-3-LUVs altamente cargados con LUVs vacíos (hasta 1:10, v/v) produce GUVs con diámetros de 5–30 μm y contenido proteico ajustable, manteniendo una distribución uniforme de^{membrana 27}. Aunque esta estrategia da lugar a poblaciones de vesículas heterogéneas en cuanto a densidad proteica, los procedimientos de calibración permiten una evaluación cuantitativa de los niveles de^{incorporación 23,31}. Es importante destacar que el enfoque de mezcla permite una mayor carga total de proteínas sin una reducción excesiva del tamaño de^{GUV 27}.

El análisis funcional de proteínas reconstituidas puede realizarse encapsulando tintes sensibles al pH como la piranina en el tampón de electroformación para monitorizar los cambios intravesiculares de pH. Para obtener imágenes en vivo fiables, las vesículas deben sedimentarse o ser inmovilizadas para evitar el movimiento, lo que difuminaría las señales de fluorescencia y dificultaría la cuantificación precisa de la dinámica del pH intravesicular. La inmovilización mediante acoplamiento biotina–estreptavidina mediante lípidos biotinilados y superficies recubiertas de^{estreptavidina 32} proporciona una fijación estable, pero puede alterar la composición o la tensión de la membrana. La semiinmovilización en trampas microfluídicas ofrece una alternativa que evita componentes adicionales de membrana y minimiza la^{perturbación 1,33}. Aunque las mediciones de fluorescencia masiva son posibles tras la eliminación del tinte externo mediante sedimentación repetida e intercambio de tampón, el tinte residual asociado a la membrana puede interferir con la lectura; por lo tanto, generalmente se prefiere la microscopía confocal de GUVs individuales.

En comparación con enfoques alternativos que intentan la inserción directa de proteínas en GUVs preformados, la estrategia de fusión-electroformación permite optimizar de forma independiente las condiciones de reconstitución a nivel de LUV antes de escalar a GUVs. Este flujo de trabajo modular mejora la reproducibilidad y el rendimiento funcional, especialmente para membranas poliméricas e híbridas que son menos aptas para protocolos convencionales basados en lípidos. El método es compatible con una amplia gama de proteínas^{de membrana,} incluidos sistemas^{multiproteicos 15}, y permite la funcionalización de membrana y la coencapsulación de componentes adicionales. Como tal, proporciona una plataforma versátil para construir células artificiales duraderas, microrreactores y sistemas modelo para investigar las interacciones polímero-proteína bajo condiciones controladas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
ÄKTA pure™ chromatography system	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8 well chambered coverglass	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS ester	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)	pgo	CEC020S
LAS X software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
Oxytherm+P system	Hansatech Instruments	/
Plasma cleaner (benchtop)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μm	Avanti Research	610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)	Grace Bio-Labs	41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)			laboratory-made, cut from silicone sheet
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS spectrophotometer	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)	Cytiva	28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600