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Artículo de método

Fabricación de un dispositivo de órgano en un chip de complejo dentina-pulpa apilado verticalmente utilizando un disco de dentina humana

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DOI:

10.3791/71713

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14 de agosto de 2026

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1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

En este artículo

Resumen

Describir la fabricación y ensamblaje de un dispositivo órgano-sobre-un-chip de complejo dentino-pulpar apilado verticalmente, que incorpora un disco de dentina humana y microcanales fabricados mediante fotolitografía, seguido del siembra y cultivo de células madre de la pulpa dental.

Resumen

Los modelos preclínicos convencionales utilizados en la investigación odontológica, incluidos los modelos animales y los cultivos celulares estáticos, presentan limitaciones importantes para reproducir las condiciones fisiológicas de la interfaz dentina-pulpa y predecir las respuestas biológicas humanas a los biomateriales dentales. La tecnología de órgano-en-un-chip (OoC) ofrece un enfoque alternativo al permitir la recreación de microentornos específicos de tejidos dentro de sistemas microfluídicos controlados. Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la fabricación y ensamblaje de un dispositivo OoC del complejo dentina-pulpa que incorpora un disco de dentina humana en una plataforma microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS) de tres capas. El protocolo incluye la preparación del disco de dentina, la fabricación de moldes microestructurados mediante fotolitografía, el moldeado y curado de PDMS, la unión de capas asistida por plasma, el ensamblaje del dispositivo, la prueba de fugas y la siembra de células madre de la pulpa dental en condiciones de cultivo estático. Se discuten parámetros críticos de fabricación que influyen en el rendimiento del dispositivo, incluido el control del grosor de las capas de PDMS, el tratamiento superficial con plasma y la integración del disco de dentina en el dispositivo para minimizar las fugas. La adhesión celular y la viabilidad dentro del dispositivo se evaluaron mediante microscopía electrónica de barrido y tinción confocal de células vivas/muertas. Los resultados representativos demuestran la integración exitosa del disco de dentina en el ensamblaje microfluídico, el mantenimiento de condiciones libres de fugas y la adhesión de células madre de la pulpa dental viables a la superficie de la dentina. Este protocolo proporciona un enfoque reproducible para la fabricación de una plataforma OoC del complejo dentina-pulpa que podría apoyar estudios futuros sobre las respuestas celulares a biomateriales dentales y estímulos microambientales.

Introducción

La experimentación con animales ha sido fundamental durante mucho tiempo para avanzar en la comprensión de los procesos fisiológicos y patológicos y ha desempeñado un papel central en las primeras etapas del desarrollo de fármacos1. A lo largo del siglo XX, la esperanza de vida humana aumentó sustancialmente, y aunque no es posible cuantificar con precisión en qué medida esta mejora se debe únicamente a la investigación con animales, se reconoce ampliamente que muchos tratamientos médicos contemporáneos se han desarrollado o validado utilizando modelos animales2. Ejemplos notables incluyen el desarrollo de vacunas contra la poliomielitis, el sarampión y la hepatitis B, la evaluación de la seguridad y eficacia de la penicilina, y la producción de insulina. En el campo de la investigación odontológica y de biomateriales, estos modelos han sido fundamentales para explorar el proceso de caries, la biología y regeneración del complejo dentina-pulpa, y la fisiopatología de los tejidos periodontales3,4.

A pesar del uso extenso de estas metodologías, la actual secuencia de desarrollo de fármacos continúa mostrando altas tasas de fracaso, con muchos candidatos a fármacos que no logran aprobarse durante los ensayos clínicos a pesar de haber demostrado eficacia y seguridad en entornos preclínicos de laboratorio y en modelos animales5. Esta discrepancia se ha asociado con diferencias interespecíficas que podrían limitar la predictibilidad traslacional de los modelos animales debido a diferencias anatómicas, genéticas y fisiológicas entre especies6. Además, el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos sigue siendo un proceso lento y costoso7. Asimismo, los modelos convencionales in vitro emplean predominantemente cultivos monocapa simples en dos dimensiones (2D) sobre sustratos plásticos no fisiológicos, lo que impide reproducir las señales bioquímicas y físicas, las interacciones célula-célula y la señalización de la matriz extracelular (ECM) presentes en la cavidad oral humana8,9. Aunque los modelos 2D ofrecen ciertas ventajas experimentales, son inherentemente incapaces de reproducir las interacciones complejas que ocurren simultáneamente entre múltiples componentes, como biopelículas, biomateriales, dentina y células pulpar10. En consecuencia, existe un interés creciente en el desarrollo de plataformas experimentales alternativas capaces de reproducir con mayor precisión las respuestas biológicas humanas. En 2022, la Ley de Modernización de la FDA 2.0 eliminó el requisito obligatorio de pruebas en animales en el proceso de aprobación de fármacos y reconoció el potencial uso de plataformas alternativas, incluyendo tecnologías de órganos-en-un-chip (OoC), en la investigación preclínica11.

Un órgano-en-un-chip (OoC) es un dispositivo microfluídico diseñado para replicar la estructura, función y microentorno de un órgano o componente tisular específico12. Estos dispositivos están poblados con células y tejidos vivos cultivados dentro de microcanales ingenierizados que reproducen aspectos clave del microentorno fisiológico al que las células están naturalmente expuestas. Más allá de la imitación estructural, los microcanales permiten un control espacio-temporal sobre el entorno celular y apoyan el mantenimiento de funciones específicas del tejido, proporcionando así condiciones experimentales que pueden asemejarse más a la fisiología in vivo que los sistemas convencionales de cultivo12. De especial relevancia, los microcanales en los dispositivos OoC facilitan el flujo controlado del medio de cultivo, el cual ejerce un estrés cortante sobre las células residentes13. Estos estímulos mecánicos influyen en las respuestas celulares, incluyendo adhesión, proliferación, migración, expresión génica e interacciones célula-célula14,15. Además, el flujo continuo del medio contribuye al mantenimiento del microentorno mediante el suministro de nutrientes y la eliminación de productos de desecho metabólicos16. Asimismo, en comparación con los cultivos convencionales en 2D, se ha informado que algunas plataformas OoC ofrecen un mejor control sobre lecturas relacionadas con el estrés oxidativo, incluyendo especies reactivas de oxígeno intracelulares y viabilidad celular, en modelos tridimensionales (3D) integrados en el chip17. Por lo tanto, los sistemas OoC han surgido como plataformas prometedoras para estudiar la fisiología tisular, las interacciones con biomateriales y los procesos de enfermedad bajo condiciones experimentales controladas18. En la investigación odontológica, la tecnología OoC se ha aplicado progresivamente para modelar interfaces tisulares orales cada vez más complejas19. Las primeras plataformas de diente-en-un-chip emularon la interfaz biomaterial-dentina-pulpa20, mientras que versiones más avanzadas han incorporado desde entonces vasculatura e inervación trigeminal para replicar con mayor fidelidad la complejidad estructural y funcional del complejo pulpa-dentina21. Más allá de la pulpa, modelos 3D de conductos radiculares inmaduros han permitido evaluar irrigantes endodónticos y la formación de brotes angiogénicos en células madre de la papila apical22,23. A nivel periodontal, las plataformas encía-en-un-chip se han empleado para investigar las interacciones huésped-microbio y evaluar el potencial inmunomodulador de probióticos como agentes terapéuticos24, mientras que dispositivos ligamento periodontal-en-un-chip han demostrado cómo el flujo de líquido intersticial modula la formación de redes vasculares y la diferenciación osteogénica de esferoides de células madre del ligamento periodontal25,26. Complementando estos modelos, sistemas especializados de mucosa oral-en-un-chip e implante dental-en-un-chip han ampliado aún más el alcance de la investigación microfluídica odontológica al caracterizar interacciones huésped-material y la citotoxicidad de monómeros dentales bajo condiciones fisiológicamente relevantes27,28.

Aunque los sistemas de órgano-en-un-chip (OoC) se han aplicado cada vez más en investigaciones dentales, orales y craneofaciales, los esfuerzos continuos hacia la estandarización y la reproducibilidad de los flujos de trabajo de fabricación siguen siendo importantes. Varios modelos de diente-en-un-chip se han descrito en la literatura20,29,30,31, que demuestran diferentes configuraciones del dispositivo y aplicaciones experimentales. Sin embargo, las variaciones en la arquitectura del dispositivo, los métodos de fabricación, la incorporación de dentina y la descripción de los parámetros experimentales pueden limitar la reproducibilidad y la comparación directa entre estudios. En particular, las diferencias en la geometría de los microcanales, las estrategias de integración de la dentina y los enfoques de fabricación pueden influir en el microentorno biológico y mecánico dentro del dispositivo. Algunos modelos descritos incorporan dentina para reproducir aspectos de la interfaz dentina-pulpa20,29,30, mientras que otros utilizan configuraciones alternativas31. Además, los métodos de fabricación, como la fotolitografía, el corte láser, el micromecanizado y la impresión 3D, presentan ventajas y limitaciones específicas según el diseño y la aplicación previstos del dispositivo. Asimismo, un determinante crítico de la utilidad biológica es la orientación arquitectónica del dispositivo, específicamente si los canales y la sección de dentina están dispuestos en una configuración horizontal o vertical19,32. En las configuraciones apiladas horizontalmente, los compartimentos dispuestos lateralmente facilitan la compartimentación lateral y la visualización en tiempo real de las células, lo que las hace particularmente adecuadas para modelar tejidos con una organización espacial lateral inherente, como el complejo periodontal24,32. Sin embargo, este diseño tiene una limitación inherente en su capacidad para recrear interfaces biológicas perpendiculares, como el complejo biomaterial-dentina-pulpa, ya que la disposición lateral de los compartimentos no replica fielmente la orientación in vivo de la barrera de dentina entre la cavidad y la pulpa20,32. Las configuraciones apiladas verticalmente abordan estas limitaciones al superponer dos compartimentos a lo largo del eje y, separados por una sección de dentina nativa, lo que permite la cuantificación simultánea del transporte molecular a través de la dentina intacta y el monitoreo en tiempo real de las respuestas de las células de la pulpa, medido en el medio de salida30. No obstante, una limitación reconocida de esta orientación radica en la obtención de imágenes en sección transversal de la interfaz dentina-célula, ya que adquirir imágenes en sección transversal de esta interfaz dentro del mismo plano focal sigue siendo técnicamente más desafiante que en las configuraciones apiladas horizontalmente, donde las células y las matrices extracelulares están dispuestas lateralmente. Aunque se han descrito múltiples modelos de complejo dentina-pulpa-en-un-chip en la literatura, la mayoría adopta una configuración apilada horizontalmente, en la que los compartimentos están dispuestos lateralmente dentro del mismo plano10,20,21,29, mientras que relativamente pocos han incorporado una sección de dentina nativa dentro de una configuración apilada verticalmente30. Aun así, las variaciones en los enfoques de fabricación y en la descripción de los parámetros entre estos modelos continúan limitando la reproducibilidad y las comparaciones entre estudios33. El presente manuscrito tiene como objetivo mejorar la reproducibilidad metodológica al proporcionar un protocolo detallado de fabricación para un dispositivo de diente-en-un-chip con configuración apilada verticalmente, facilitando así la adopción más amplia de esta plataforma dentro de la comunidad de investigación dental.

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la fabricación y ensamblaje de un dispositivo de complejo dentino-pulpar en chip (OoC) con apilamiento vertical, que incorpora un disco de dentina humana dentro de una plataforma microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS) de tres capas, fabricada mediante un molde producido por fotolitografía. El protocolo también describe la siembra y el cultivo de células madre de la pulpa dental dentro del dispositivo bajo condiciones estáticas.

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Protocolo

El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de La Frontera para estudios que involucran muestras humanas.

1. Adquisición del disco de dentina

NOTA: Prepare el diseño del dispositivo antes de comenzar el protocolo (Figura 1A–1C).

  1. Recolección y almacenamiento de dientes
    1. Recolecte molares o premolares humanos sanos tras obtener el consentimiento informado del paciente.
    2. Mantenga todas las muestras en solución de cloramina al 0,5 % a 4 °C para prevenir la deshidratación de la dentina y la desnaturalización de proteínas.
    3. Reemplace la solución de cloramina una vez por semana durante el almacenamiento.
  2. Preparación de discos de dentina
    1. Seccione cada diente horizontalmente en el tercio medio de la corona utilizando una pieza de alta velocidad que funcione a 350 000 rpm y esté equipada con una fresa cilíndrica de diamante (diámetro de 1 mm; tamaño de grano de 100–150 µm).
    2. Realice la sección bajo irrigación continua de agua a aproximadamente 50 mL/min.
    3. Posicione el corte en el tercio medio de la corona para evitar la cámara pulpar y el esmalte presente en los surcos y fisuras oclusales, obteniendo así un disco compuesto predominantemente de tejido dentinario.
      ADVERTENCIA: Realice la sección del diente bajo irrigación continua y use equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, mascarilla y protección ocular.
  3. Acabado de los discos de dentina
    1. Pulir el disco de dentina utilizando discos de acabado con grano decreciente sucesivamente.
    2. Continúe el pulido hasta alcanzar un espesor final de dentina de aproximadamente 0,8 mm (±± 0,3 mm) y dimensiones laterales de aproximadamente 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) (Figura 1D).
  4. Almacenamiento de discos de dentina
    1. Almacene los discos de dentina preparados en solución de cloramina al 0,5 % a 4 °C hasta el ensamblaje del dispositivo OoC.

Diagrama de ensamblaje del dispositivo microfluídico; etapas de fabricación con pinzas, herramienta de perforación y canalización de líquidos.
Figura 1: Diseño y flujo de trabajo de fabricación del dispositivo de órgano-en-un-chip (OoC) del complejo dentina-pulpa. (A) Diseño tridimensional del dispositivo que muestra la arquitectura de tres capas. (B) Vista superior del diseño del dispositivo con las dimensiones principales. (C) Vista lateral de la configuración del dispositivo de tres capas. (D) Disco representativo de dentina preparado con un espesor aproximado de 0,8 mm y dimensiones laterales de aproximadamente 5 mm × 5 mm. (E) Molde maestro de silicio fabricado mediante fotolitografía y utilizado para fundir las capas superior e inferior de polidimetilsiloxano (PDMS). (F) Extracción de una capa de PDMS curada del molde de silicio tras la polimerización térmica. (G) Tratamiento con plasma de la superficie de PDMS antes de la unión de capas. (H) Dispositivo OoC final del complejo dentina-pulpa de tres capas ensamblado mediante unión por plasma e incorporando la interfaz de dentina. (I) Dispositivo ensamblado conectado a tubos para pruebas de fugas y preparación para experimentos microfluídicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Fabricación del dispositivo de órgano sobre un chip del complejo pulpa-dentin

  1. Preparación del espacio de trabajo y los materiales
    1. Preparar materiales y equipo
      1. Preparar todos los materiales y equipos enumerados en la Tabla de Materiales antes de comenzar la fabricación del dispositivo.
      2. Preparar los punzones de biopsia antes del ensamblaje del dispositivo.
      3. Realizar todos los procedimientos de fabricación en un entorno limpio y libre de polvo.
      4. Usar guantes, protección ocular y equipo de protección personal adecuado durante toda la fabricación y el ensamblaje del dispositivo.
        NOTA: Preparar el molde producido por fotolitografía antes de iniciar el protocolo (Figura 1E).
  2. Fabricación del molde microestructurado
    1. Preparación del oblea de silicio
      1. Fabricar el molde sobre un oblea de silicio pulido por una sola cara de 4 pulgadas (tipo N, dopado con As, método de crecimiento CZ, orientación <100>, espesor de 500 ±± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, resistividad de 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Lavar el oblea secuencialmente en acetona, isopropanol y agua ultrapura durante 10 min cada uno bajo ultrasonido.
      3. Secar el oblea con aire comprimido.
      4. Calentar el oblea a 200°C durante 10 min sobre una placa calefactora para eliminar la humedad residual.
      5. Dejar que el oblea se enfríe hasta temperatura ambiente (TA; 20°C–25°C).
    2. Activación de la superficie y recubrimiento con fotoresina
      1. Activar la superficie del oblea de silicio utilizando un limpiador de plasma al vacío operado con plasma de aire a nivel 7 durante 120 s.
      2. Aplicar la fotoresina negativa a base de epoxi GM 1060 mediante centrifugado a 300 rpm durante 10 s.
      3. Continuar el centrifugado a 565 rpm durante 100 s y a 965 rpm durante 1 s, utilizando una aceleración de 200 rpm/s.
      4. Dejar reposar el oblea recubierto durante 10 min.
      5. Realizar una precocción a 65°C durante 10 min.
      6. Continuar la precocción a 95°C durante 1 h.
      7. Dejar que el oblea se enfríe hasta TA.
    3. Exposición y revelado
      1. Exponer la fotoresina utilizando un sistema de litografía láser directa con una dosis de 1.950 mJ/cm2.
      2. Realizar una postcocción a 65°C durante 10 min.
      3. Continuar la postcocción a 95°C durante 30 min.
      4. Dejar que el oblea se enfríe hasta TA.
      5. Dejar que el oblea repose durante 10 min.
      6. Revelar el patrón en PGMEA durante 4 min.
      7. Extender el revelado en intervalos de 30 s si queda fotoresina residual.
      8. Detener el revelado enjuagando con isopropanol.
      9. Secar el oblea utilizando aire comprimido.
    4. Cocción final
      1. Realizar una cocción final a 135°C durante 2 h.
      2. Obtener un molde maestro microestructurado que contenga microcanales de 1 mm de ancho y 50 µm de alto.
  3. Preparación y desgasificación de la mezcla de PDMS
    1. Preparación de la mezcla de PDMS
      1. Mezclar la base de PDMS y el agente de curado en una proporción de 10:1 en peso.
      2. Agitar la mezcla manualmente con una varilla de vidrio en un vaso de plástico durante aproximadamente 5 min.
      3. Mantener movimientos circulares lentos y continuos durante la mezcla.
        NOTA: Evitar introducir burbujas de aire durante la mezcla.
    2. Desgasificación
      1. Colocar la mezcla de PDMS en un desecador al vacío conectado a una bomba de vacío.
      2. Desgasificar la mezcla a aproximadamente 700 mmHg durante 5 min.
      3. Liberar brevemente el vacío para permitir que las burbujas superficiales estallen.
      4. Volver a aplicar el vacío.
      5. Repetir el ciclo hasta que no queden burbujas visibles.
        NOTA: El tiempo total de desgasificación es típicamente de aproximadamente 30 min.
  4. Vertido del PDMS sobre el molde
    1. Preparación del molde
      1. Colocar el molde sobre una superficie plana.
      2. Limpiar el molde utilizando aire comprimido.
      3. Evitar el contacto directo con la superficie grabada.
      4. Verificar que el molde esté libre de polvo y contaminantes.
    2. Dispensación del PDMS
      1. Dispensar aproximadamente 8 g de PDMS alrededor del disco de dentina para fabricar la capa de inclusión de dentina.
      2. Ajustar la altura del PDMS para que coincida con el espesor del disco de dentina (0,8 ±± 0,3 mm).
      3. Evitar que el PDMS cubra la superficie de la dentina.
      4. Dispensar aproximadamente 0,26 g de PDMS por unidad del molde para fabricar cada capa de microcanal.
      5. Golpear suavemente el molde o aplicar vibración para facilitar el llenado de las microestructuras.
      6. Dejar que el PDMS se asiente en las características más pequeñas.
      7. Cubrir el molde con una tapa o cubierta plana sin tocar la superficie del PDMS.
        NOTA: La capa de inclusión de dentina tiene aproximadamente 0,8 mm de espesor, y cada capa de microcanal tiene aproximadamente 0,4 mm de espesor, lo que da un espesor total del dispositivo de aproximadamente 1,6 mm.
        NOTA: Ajustar el espesor de la capa según la distancia de trabajo del objetivo confocal cuando se planee la imagenología confocal.
  5. Curado
    1. Colocar los moldes en un horno a 50°C.
    2. Curar el PDMS durante 4 h.
  6. Extracción de las capas de PDMS
    1. Extracción del PDMS curado
      1. Despegar cuidadosamente las capas de PDMS curado del molde (Figura 1F).
      2. Manipular las capas de PDMS con cuidado para evitar dañar las microestructuras.
  7. Unión de las capas de PDMS y fabricación de los puertos de entrada y salida
    1. Fabricación de los puertos de entrada y salida
      1. Crear perforaciones en las ubicaciones designadas de entrada y salida utilizando un punzón de biopsia de 1 mm.
      2. Colocar el lado del microcanal hacia arriba durante la perforación.
        NOTA: Colocar la capa de PDMS sobre una superficie de corte para evitar daños estructurales.
      3. Crear dos perforaciones en la capa superior correspondientes al microcanal superior.
    2. Limpieza de las capas de PDMS
      1. Limpiar las capas de PDMS utilizando alcohol isopropílico o etanol.
      2. Eliminar partículas residuales de polvo utilizando cinta adhesiva estéril.
      3. Verificar que todas las superficies de unión estén libres de contaminantes antes del ensamblaje.
    3. Activación por plasma de las superficies de PDMS
      1. Colocar las capas superior e intermedia de PDMS para el tratamiento con plasma (Figura 1G).
      2. Activar las superficies utilizando un tratador de plasma corona portátil que opere a aproximadamente 25 W con aire ambiente como gas de trabajo.
      3. Mantener una distancia de trabajo de aproximadamente 1 mm entre la fuente de plasma y la superficie de PDMS.
        ADVERTENCIA: Realizar el tratamiento con plasma bajo ventilación adecuada y evitar la exposición directa al ozono generado por el plasma.
      4. Activar el dispositivo de tratamiento con plasma y permitir su estabilización durante 5 s.
      5. Verificar la generación de un haz de plasma uniforme antes del tratamiento.
      6. Tratar la capa superior de PDMS durante 10 s utilizando un movimiento continuo de ida y vuelta a aproximadamente 5 mm/s.
      7. Tratar la capa intermedia de PDMS durante 10 s utilizando el mismo movimiento y distancia.
      8. Aplicar un tratamiento adicional de 1 s con plasma a la capa superior inmediatamente antes de la unión.
    4. Unión de las capas superior e intermedia
      1. Alinear el microcanal superior con el disco de dentina inmediatamente después del tratamiento con plasma.
      2. Unir las capas superior e intermedia.
      3. Colocar el conjunto unido en un horno a 75°C durante 5 min.
      4. Consolidar la unión durante la incubación.
        NOTA: El disco de dentina y el microcanal son visibles a simple vista y pueden alinearse sin herramientas adicionales de alineación.
    5. Fabricación de los puertos del microcanal inferior
      1. Perforar dos orificios correspondientes al microcanal inferior a través de las capas superior e intermedia unidas.
      2. Realizar la perforación a través de ambas capas simultáneamente para asegurar la alineación.
        NOTA: Este procedimiento genera cuatro perforaciones en la capa superior y dos perforaciones en la capa intermedia.
      3. Colocar el conjunto unido sobre una superficie de corte firme antes de perforar.
      4. Aplicar presión descendente constante en un solo movimiento.
        NOTA: Evitar fuerzas rotacionales o laterales para minimizar el riesgo de deslaminación.
      5. Eliminar los residuos de los sitios de perforación utilizando gasa estéril sin pelusa humedecida con alcohol isopropílico.
      6. Inspeccionar las perforaciones y las áreas unidas circundantes con iluminación adecuada.
      7. Verificar la ausencia de deslaminación, desgarros o perforaciones incompletas antes de continuar.
    6. Unión de la capa inferior
      1. Tratar con plasma la capa inferior según se describe en el Paso 2.7.4.
      2. Alinear los puertos de entrada y salida del microcanal inferior con las perforaciones en las capas superior e intermedia.
      3. Unir la capa inferior para completar el ensamblaje del dispositivo.
        NOTA: Marcar las ubicaciones de entrada y salida en la superficie externa de la capa inferior antes de la unión para facilitar la alineación.
        NOTA: Las cámaras de plasma pueden proporcionar uniones más fuertes que las plumas de plasma, según se reporta en la literatura36.
        NOTA: El dispositivo terminado consiste en una plataforma microfluídica de tres capas que incorpora una interfaz de dentina (Figura 1H). La superficie inferior de la dentina representa el lado pulpar del modelo, mientras que la superficie superior de la dentina representa el lado coronal para la exposición a biomateriales dentales o preparaciones bacterianas.
  8. Prueba de fugas del dispositivo microfluídico
    1. Inspección del dispositivo ensamblado
      1. Inspeccionar el dispositivo ensamblado en busca de desalineaciones.
      2. Inspeccionar el ensamblaje en busca de uniones incompletas y fugas visibles.
    2. Prueba de fugas
      1. Conectar agujas Luer-lock de 19G a los puertos de entrada (Figura 1E).
      2. Conectar las agujas a los tubos de la bomba microfluídica.
      3. Presionar suavemente los conectores de las agujas en los puertos perforados para obtener un ajuste hermético.
      4. Inyectar PBS estéril o medio de cultivo a un flujo de 10 µL/min.
      5. Mantener el flujo de líquido durante al menos 5 min.
      6. Inspeccionar todas las interfaces unidas, los márgenes de los canales y los bordes del disco de dentina durante el flujo.
      7. Observar el dispositivo con iluminación adecuada durante y después de la inyección.
      8. Confirmar la ausencia de acumulación de líquido, humedad o formación de gotas.
      9. Clasificar el dispositivo como libre de fugas si no se detecta ninguna fuga.
      10. Desechar los dispositivos que presenten fugas.
        NOTA: Realizar la prueba de fugas en cada dispositivo fabricado antes de la siembra celular o su uso experimental.
  9. Sterilización y almacenamiento del dispositivo microfluídico
    1. Sterilización
      1. Exponer la superficie superior del dispositivo ensamblado a luz UV (254 nm) durante 30 min dentro de un gabinete de flujo laminar.
      2. Exponer la superficie inferior a luz UV durante 30 min adicionales.
      3. Flujo de 70% de etanol a través de los microcanales durante 20 min.
      4. Lavar los microcanales tres veces con PBS estéril para eliminar el etanol residual.
    2. Almacenamiento
      1. Utilizar el dispositivo esterilizado inmediatamente para experimentos de cultivo celular.
      2. Alternativamente, almacenar el dispositivo sumergido en PBS estéril a 4°C dentro de un recipiente estéril hasta su uso.
        ​ADVERTENCIA: No utilizar cloramina ni otras soluciones desinfectantes después del ensamblaje del dispositivo porque el PDMS puede absorber estos compuestos y comprometer la viabilidad celular.

3. Evaluación de la adhesión y viabilidad de las células madre del pulpo dental

  1. Preacondicionamiento de la superficie dentinaria
    1. Inyecte EDTA al 10 % en el dispositivo.
    2. Mantenga el contacto entre la solución de EDTA y la superficie dentinaria durante 15 min.
    3. Inyecte 0,5 mL de EDTA cada 3 min para mantener el movimiento del fluido dentro del microcanal.
    4. Lave el disco de dentina tres veces con agua ultrapura.
    5. Mantenga cada lavado durante 5 min.
      NOTA: El tratamiento con EDTA elimina la capa de esmear y expone las proteínas de la matriz dentinaria.
      ADVERTENCIA: Manipule las soluciones de EDTA utilizando guantes y protección ocular para evitar irritación en la piel y los ojos.
  2. Siembra de células madre del pulpo dental
    1. Expansión de células madre del pulpo dental
      1. Siembre células madre del pulpo dental en un frasco T75 a una densidad de 1 × 106 células por frasco.
      2. Incube las células a 37 °C y 5 % de CO2 hasta alcanzar aproximadamente un 80 % de confluencia.
      3. Desprenda las células utilizando tripsina.
      4. Neutralice la tripsina utilizando medio de cultivo completo.
      5. Centrifugue la suspensión celular para obtener un precipitado celular.
      6. Evalue la viabilidad celular utilizando azul de tripano.
      7. Utilice suspensiones celulares con viabilidad ≥90 %.
    2. Preparación de la suspensión celular
      1. Prepare una suspensión celular precalentada a 37 °C.
      2. Ajuste la concentración celular a 100 000 células/mL en medio de cultivo completo.
      3. Prepare un volumen final de suspensión de 1–2 mL.
        NOTA: En el presente estudio se utilizaron células en el pase 5.
    3. Siembra celular
      1. Inyecte la suspensión celular en el puerto de entrada del microcanal inferior.
      2. Invierta el dispositivo tras la siembra celular
        NOTA: La inversión del dispositivo promueve la sedimentación celular hacia la superficie dentinaria y mejora la adhesión celular.
    4. Incubación
      1. Coloque el dispositivo invertido dentro de una placa de Petri.
      2. Añada 1 mL de medio de cultivo a la placa de Petri para minimizar la evaporación.
      3. Incube el dispositivo a 37 °C y 5 % de CO2 durante 24 h.
      4. Mantenga condiciones de cultivo estático durante todo el periodo de incubación.
        NOTA: En el presente estudio no se realizó validación bajo flujo dinámico.
        NOTA: El presente protocolo describe condiciones de cultivo estático para la validación inicial del dispositivo y la evaluación de la adhesión celular.
    5. Validación inicial del dispositivo
      1. Evalue la adhesión celular mediante microscopía electrónica de barrido.
      2. Recupere el disco de dentina mediante desmontaje del dispositivo antes del análisis.
  3. Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido
    1. Recuperación y lavado de muestras
      1. Desmonte el dispositivo tras 24 h de incubación.
      2. Recupere el disco de dentina y transfiéralo a una placa de cultivo o placa de Petri.
      3. Coloque la superficie dentinaria sembrada con células mirando hacia arriba.
      4. Lave el disco de dentina dos veces utilizando 1 mL de PBS.
    2. Fijación
      1. Añada 2 mL de glutaraldehído al 2,5 % en tampón fosfato de Sorensen 0,1 M.
      2. Incube la muestra durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
        ADVERTENCIA: El glutaraldehído es tóxico y puede causar irritación en la piel, los ojos y el tracto respiratorio. Realice los procedimientos de fijación dentro de una campana extractora química utilizando equipo de protección personal adecuado.
    3. Lavado tras la fijación
      1. Retire la solución de glutaraldehído.
      2. Lave el disco de dentina tres veces con agua destilada ultrapura a temperatura ambiente (RT).
    4. Análisis por MEB
      1. Analice las muestras utilizando un microscopio electrónico de barrido ambiental.
      2. Opere el microscopio bajo condiciones de vacío bajo (25 Pa).
      3. Utilice un voltaje de aceleración de 10,0 kV y una distancia de trabajo de 7,0 mm.
      4. Adquiera imágenes utilizando el modo de detección 3D de electrones retrodispersados (BSE-3D).
      5. Capture imágenes a un aumento de ×200 (Figura 2A).
  4. Evaluación de la viabilidad celular mediante microscopía confocal
    1. Preparación de muestras
      1. Siembre y cultive las células según se describe en el paso 3.2.
      2. Incube el dispositivo durante 24 h a 37 °C y 5 % de CO2.
      3. Desmonte el dispositivo y exponga la superficie dentinaria.
      4. Transfiera el disco de dentina a una placa de pocillos que contenga HBSS+/+ suplementado con Ca2+ y Mg2+.
    2. Lavado de muestras
      1. Lave el disco de dentina dos veces con HBSS+/+.
      2. Elimine el suero residual y el rojo de fenol antes de la tinción.
        NOTA: El suero residual y el rojo de fenol pueden aumentar la autofluorescencia de fondo.
    3. Tinción de células viables
      1. Prepare una solución trabajo fresca de Calceína AM a 2 µM en HBSS+/+.
      2. Añada suficiente solución de tinción para cubrir completamente la superficie dentinaria.
      3. Incube la muestra durante 20 min a 37 °C en oscuridad.
      4. Retire la solución de tinción tras la incubación.
    4. Tinción de células muertas
      1. Añada solución trabajo de yoduro de propidio (1–2 µg/mL en HBSS+/+).
      2. Incube la muestra durante 5–8 min a 37 °C en oscuridad.
      3. No supere los 10 min de incubación.
      4. Lave la muestra dos veces con HBSS+/+.
      5. Mantenga la muestra sumergida en tampón hasta la adquisición de imágenes.
    5. Adquisición de imágenes por microscopía confocal
      1. Adquiera imágenes confocales dentro de los 30 min posteriores a la tinción.
      2. Adquiera las imágenes secuencialmente en los canales verde y rojo.
      3. Utilice λex 490 nm y λem 515 nm para la imagen de células viables.
      4. Utilice λex 535 nm y λem 617 nm para la imagen de células muertas.
        ​NOTA: Proteja las soluciones de tinción fluorescente y las muestras teñidas de la exposición a la luz durante los procedimientos de incubación y adquisición de imágenes (Figura 2B).

Comparación entre microscopía electrónica y microscopía de fluorescencia, análisis de estructura celular.
Figura 2: Evaluación representativa de la adhesión y viabilidad de células madre del pulpo dental dentro del dispositivo de complejo pulpo-dentinario tipo órgano en chip (OoC). (A) Imagen de microscopía electrónica de barrido que muestra células madre del pulpo dental adheridas (asterisco blanco) sobre la superficie de dentina tras 24 h de cultivo estático dentro del dispositivo OoC. Tras 24 h de cultivo, las células adheridas cubrieron el 54,35 ± 0,92 % de la superficie de dentina expuesta al microcanal. No se observan células en la región de dentina cubierta por PDMS (asterisco negro), lo que indica un sellado efectivo entre las capas del dispositivo. Barra de escala = 200 µm. (B) Imagen de microscopía confocal que muestra células madre del pulpo dental viables teñidas en verde y adheridas a la superficie de dentina (flechas blancas) tras 24 h de cultivo estático. También se observan células no viables teñidas en rojo (flechas azules). Barra de escala = 50 µm. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Resultados

La fabricación exitosa del dispositivo de diente-en-un-chip siguió el flujo de trabajo ilustrado en la Figura 1A–1I, que incluye la preparación del disco de dentina (Figura 1D), la fabricación del molde derivado de fotolitografía (Figura 1E), la eliminación de las capas de PDMS curadas (Figura 1F), la activación con plasma antes de la unión (Figura 1G), el ...

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Discusión

Este estudio describe un protocolo paso a paso para la fabricación de un dispositivo tipo diente-en-un-chip con estructura vertical que incorpora dentina y células madre del pulpo dental, y demuestra la adhesión celular y viabilidad representativas dentro del dispositivo bajo condiciones de cultivo estático. El protocolo fue desarrollado para proporcionar un flujo de trabajo reproducible para la fabricación y ensamblaje de una plataforma OoC (órgano-en-un-chip) del complejo dentinopulpar adecuada para estudios in vitro d...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros competitivos ni conflictos de interés que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Proyecto DIM24-0004 y el Proyecto PP24-0031, Dirección de Investigación, Universidad de La Frontera; FONDECYT Regular N.º 1260116; y FONDECYT de Iniciación N.º 11230701, Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo (ANID), Chile.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Materiales biológicos y químicos
AcetonaExpertQSOLV 8Limpieza de obleas de silicio
Medio de cultivo Alpha MEMCytivaSH30265.02Medio de cultivo para células madre del pulpo dental
Cloramina (0,5 %)Merck7080-50-4Solución de almacenamiento para discos de dentina
Células madre del pulpo dentalNo aplicableNo aplicableCultivo primario de células. Ver pasos 3.2.1 y 3.2.2
EDTA (10 %)WinklerN2222158EEliminación de la capa de detritus
Fotorresistente negativo basado en epoxiGersteltecGM1060Fabricación de moldes por fotolitografía
Glutaraldehído (2,5%) en Sorensen 0,1 M’buffer fosfato sSigma-Aldrich210908-06Fijación para MEB
Dientes humanos sanos (molares o premolares)No aplicableNo aplicableMuestra humana
IsopropanolExpertQSOLV 16Limpieza del oblea, detención del revelado y limpieza de PDMS
Kit de Viabilidad LIVE/DEADSigma-Aldrich451Tinción de viabilidad por fluorescencia. 
PBS (solución salina tamponada con fosfato)Corning46-013-CMLavado y prueba de fugas
Base de PDMS y agente de curado (polidimetilsiloxano)DowSylgard 184Fabricación del dispositivo
PGMEASigma Aldrich484431Desarrollo del fotoresistente
Azul de tripanoSigma Aldrich T8154-100mlEvaluación de la viabilidad celular
TripsinaCorning25-053-CIDesprendimiento celular
Agua ultrapuraCytivaSH30529.01Solución de lavado
Materiales de consumo y utensilios de laboratorio
Agujas de jeringa de 19GVmaticVCB19050Conexión del dispositivo con microbomba o jeringa
Punzón de biopsia (diámetro: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Fabricación de los puertos de entrada y salida
Mandril de corteNicecoolNo aplicableProtección de la superficie durante el punzonado
Discos para acabado dental (por ejemplo, Sof-Lex)3MSof-LexPulido de dentina
Adaptadores hembra de Luer a espigaRunze FluidicsRH-M016Conexión de tubos
Varilla de mezcla de vidrio o plásticoDuranNo aplicableMezcla de PDMS
Jeringas hipodérmicasArándano rojopc-12246Siembra celular y prueba de fugas
Gasas estériles sin pelusaLindersonNo aplicableEliminación de los residuos de perforación
Adaptadores macho LuerRunze FluidicsRH-G016Conexión de tubos
Recipiente de mezcladoDuranNo aplicablePreparación del PDMS
placa de Petri (140 mm) × 20 mmDeltalab2000219Cultivo de células/incubación
Base de politetrafluoroetilenoCCTValNo aplicableFabricación de la capa de dentina intermedia
Oblea de silicioJiaozuo Commercial FineWinNo aplicableFabricación del molde
Tubo de siliconaRunze Fluidics96421Conexión fluidica
matraz T75Corning 353136Expansión de células madre del pulpo dental
Placa de cultivoSPL Life Sciences30006Tinción y preparación para imagen confocal
Equipos e instrumentos
Secador de aireMETALPLANTITAN-040Secado del aire comprimido
Fuente de aire comprimidoSCHULZCSD-18.1Molde y limpieza de superficies
microscopio confocalOlympusNo aplicableModelo: FV1000
Sistema de litografía láser directaHeidelberguPG 101Exposición del fotoresist
Microscopio electrónico de barrido ambientalHitachiNo aplicableModelo: Quanta 400 
Pieza de mano de alta velocidadNakanishiNo aplicableModelo: Pana-max2
Placa calefactoraLabTechEH20A PlusCocción del sustrato y cocción del fotoresist
Cabina de flujo laminarBioBaseBBS8V1708313DEsterilización del dispositivo
Bomba microfluídicaNueva EraNo aplicableModelo: 1002X-ES. Prueba de fugas a 10 µL/min
Molde microestructurado (fabricado mediante fotolitografía)CCTValNo aplicableVéase el paso 2.2 para las especificaciones de fabricación del molde
Horno o incubadoraMemmertUN110Curado de PDMS a 50°C y consolidación de enlaces a 75°C
Cámara de limpieza por plasma al vacíoFari PlasmaGD-5Activación de obleas por plasma
Plasma corona portátil Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACActivación de PDMS con plasma
UltrasonificadorElma SonicS 10 (H)Limpieza de obleas
Cámara de vacío o desecador (250 mm)WinglassNo aplicableDesgasificación del PDMS
Bomba de vacíoROCKER300Desgasificación del PDMS

Referencias

  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

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