Fabricación de un dispositivo de órgano en un chip de complejo dentina-pulpa apilado verticalmente utilizando un disco de dentina humana

Resumen

Describir la fabricación y ensamblaje de un dispositivo órgano-sobre-un-chip de complejo dentino-pulpar apilado verticalmente, que incorpora un disco de dentina humana y microcanales fabricados mediante fotolitografía, seguido del siembra y cultivo de células madre de la pulpa dental.

Resumen

Los modelos preclínicos convencionales utilizados en la investigación odontológica, incluidos los modelos animales y los cultivos celulares estáticos, presentan limitaciones importantes para reproducir las condiciones fisiológicas de la interfaz dentina-pulpa y predecir las respuestas biológicas humanas a los biomateriales dentales. La tecnología de órgano-en-un-chip (OoC) ofrece un enfoque alternativo al permitir la recreación de microentornos específicos de tejidos dentro de sistemas microfluídicos controlados. Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la fabricación y ensamblaje de un dispositivo OoC del complejo dentina-pulpa que incorpora un disco de dentina humana en una plataforma microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS) de tres capas. El protocolo incluye la preparación del disco de dentina, la fabricación de moldes microestructurados mediante fotolitografía, el moldeado y curado de PDMS, la unión de capas asistida por plasma, el ensamblaje del dispositivo, la prueba de fugas y la siembra de células madre de la pulpa dental en condiciones de cultivo estático. Se discuten parámetros críticos de fabricación que influyen en el rendimiento del dispositivo, incluido el control del grosor de las capas de PDMS, el tratamiento superficial con plasma y la integración del disco de dentina en el dispositivo para minimizar las fugas. La adhesión celular y la viabilidad dentro del dispositivo se evaluaron mediante microscopía electrónica de barrido y tinción confocal de células vivas/muertas. Los resultados representativos demuestran la integración exitosa del disco de dentina en el ensamblaje microfluídico, el mantenimiento de condiciones libres de fugas y la adhesión de células madre de la pulpa dental viables a la superficie de la dentina. Este protocolo proporciona un enfoque reproducible para la fabricación de una plataforma OoC del complejo dentina-pulpa que podría apoyar estudios futuros sobre las respuestas celulares a biomateriales dentales y estímulos microambientales.

Introducción

La experimentación con animales ha sido fundamental durante mucho tiempo para avanzar en la comprensión de los procesos fisiológicos y patológicos y ha desempeñado un papel central en las primeras etapas del desarrollo de fármacos¹. A lo largo del siglo XX, la esperanza de vida humana aumentó sustancialmente, y aunque no es posible cuantificar con precisión en qué medida esta mejora se debe únicamente a la investigación con animales, se reconoce ampliamente que muchos tratamientos médicos contemporáneos se han desarrollado o validado utilizando modelos animales². Ejemplos notables incluyen el desarrollo de vacunas contra la poliomielitis, el sarampión y la hepatitis B, la evaluación de la seguridad y eficacia de la penicilina, y la producción de insulina. En el campo de la investigación odontológica y de biomateriales, estos modelos han sido fundamentales para explorar el proceso de caries, la biología y regeneración del complejo dentina-pulpa, y la fisiopatología de los tejidos periodontales^3,4.

A pesar del uso extenso de estas metodologías, la actual secuencia de desarrollo de fármacos continúa mostrando altas tasas de fracaso, con muchos candidatos a fármacos que no logran aprobarse durante los ensayos clínicos a pesar de haber demostrado eficacia y seguridad en entornos preclínicos de laboratorio y en modelos animales⁵. Esta discrepancia se ha asociado con diferencias interespecíficas que podrían limitar la predictibilidad traslacional de los modelos animales debido a diferencias anatómicas, genéticas y fisiológicas entre especies⁶. Además, el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos sigue siendo un proceso lento y costoso⁷. Asimismo, los modelos convencionales in vitro emplean predominantemente cultivos monocapa simples en dos dimensiones (2D) sobre sustratos plásticos no fisiológicos, lo que impide reproducir las señales bioquímicas y físicas, las interacciones célula-célula y la señalización de la matriz extracelular (ECM) presentes en la cavidad oral humana^8,9. Aunque los modelos 2D ofrecen ciertas ventajas experimentales, son inherentemente incapaces de reproducir las interacciones complejas que ocurren simultáneamente entre múltiples componentes, como biopelículas, biomateriales, dentina y células pulpar¹⁰. En consecuencia, existe un interés creciente en el desarrollo de plataformas experimentales alternativas capaces de reproducir con mayor precisión las respuestas biológicas humanas. En 2022, la Ley de Modernización de la FDA 2.0 eliminó el requisito obligatorio de pruebas en animales en el proceso de aprobación de fármacos y reconoció el potencial uso de plataformas alternativas, incluyendo tecnologías de órganos-en-un-chip (OoC), en la investigación preclínica¹¹.

Un órgano-en-un-chip (OoC) es un dispositivo microfluídico diseñado para replicar la estructura, función y microentorno de un órgano o componente tisular específico¹². Estos dispositivos están poblados con células y tejidos vivos cultivados dentro de microcanales ingenierizados que reproducen aspectos clave del microentorno fisiológico al que las células están naturalmente expuestas. Más allá de la imitación estructural, los microcanales permiten un control espacio-temporal sobre el entorno celular y apoyan el mantenimiento de funciones específicas del tejido, proporcionando así condiciones experimentales que pueden asemejarse más a la fisiología in vivo que los sistemas convencionales de cultivo¹². De especial relevancia, los microcanales en los dispositivos OoC facilitan el flujo controlado del medio de cultivo, el cual ejerce un estrés cortante sobre las células residentes¹³. Estos estímulos mecánicos influyen en las respuestas celulares, incluyendo adhesión, proliferación, migración, expresión génica e interacciones célula-célula^14,15. Además, el flujo continuo del medio contribuye al mantenimiento del microentorno mediante el suministro de nutrientes y la eliminación de productos de desecho metabólicos¹⁶. Asimismo, en comparación con los cultivos convencionales en 2D, se ha informado que algunas plataformas OoC ofrecen un mejor control sobre lecturas relacionadas con el estrés oxidativo, incluyendo especies reactivas de oxígeno intracelulares y viabilidad celular, en modelos tridimensionales (3D) integrados en el chip¹⁷. Por lo tanto, los sistemas OoC han surgido como plataformas prometedoras para estudiar la fisiología tisular, las interacciones con biomateriales y los procesos de enfermedad bajo condiciones experimentales controladas¹⁸. En la investigación odontológica, la tecnología OoC se ha aplicado progresivamente para modelar interfaces tisulares orales cada vez más complejas¹⁹. Las primeras plataformas de diente-en-un-chip emularon la interfaz biomaterial-dentina-pulpa²⁰, mientras que versiones más avanzadas han incorporado desde entonces vasculatura e inervación trigeminal para replicar con mayor fidelidad la complejidad estructural y funcional del complejo pulpa-dentina²¹. Más allá de la pulpa, modelos 3D de conductos radiculares inmaduros han permitido evaluar irrigantes endodónticos y la formación de brotes angiogénicos en células madre de la papila apical^22,23. A nivel periodontal, las plataformas encía-en-un-chip se han empleado para investigar las interacciones huésped-microbio y evaluar el potencial inmunomodulador de probióticos como agentes terapéuticos²⁴, mientras que dispositivos ligamento periodontal-en-un-chip han demostrado cómo el flujo de líquido intersticial modula la formación de redes vasculares y la diferenciación osteogénica de esferoides de células madre del ligamento periodontal^25,26. Complementando estos modelos, sistemas especializados de mucosa oral-en-un-chip e implante dental-en-un-chip han ampliado aún más el alcance de la investigación microfluídica odontológica al caracterizar interacciones huésped-material y la citotoxicidad de monómeros dentales bajo condiciones fisiológicamente relevantes^27,28.

Aunque los sistemas de órgano-en-un-chip (OoC) se han aplicado cada vez más en investigaciones dentales, orales y craneofaciales, los esfuerzos continuos hacia la estandarización y la reproducibilidad de los flujos de trabajo de fabricación siguen siendo importantes. Varios modelos de diente-en-un-chip se han descrito en la literatura^20,29,30,31, que demuestran diferentes configuraciones del dispositivo y aplicaciones experimentales. Sin embargo, las variaciones en la arquitectura del dispositivo, los métodos de fabricación, la incorporación de dentina y la descripción de los parámetros experimentales pueden limitar la reproducibilidad y la comparación directa entre estudios. En particular, las diferencias en la geometría de los microcanales, las estrategias de integración de la dentina y los enfoques de fabricación pueden influir en el microentorno biológico y mecánico dentro del dispositivo. Algunos modelos descritos incorporan dentina para reproducir aspectos de la interfaz dentina-pulpa^20,29,30, mientras que otros utilizan configuraciones alternativas³¹. Además, los métodos de fabricación, como la fotolitografía, el corte láser, el micromecanizado y la impresión 3D, presentan ventajas y limitaciones específicas según el diseño y la aplicación previstos del dispositivo. Asimismo, un determinante crítico de la utilidad biológica es la orientación arquitectónica del dispositivo, específicamente si los canales y la sección de dentina están dispuestos en una configuración horizontal o vertical^19,32. En las configuraciones apiladas horizontalmente, los compartimentos dispuestos lateralmente facilitan la compartimentación lateral y la visualización en tiempo real de las células, lo que las hace particularmente adecuadas para modelar tejidos con una organización espacial lateral inherente, como el complejo periodontal^24,32. Sin embargo, este diseño tiene una limitación inherente en su capacidad para recrear interfaces biológicas perpendiculares, como el complejo biomaterial-dentina-pulpa, ya que la disposición lateral de los compartimentos no replica fielmente la orientación in vivo de la barrera de dentina entre la cavidad y la pulpa^20,32. Las configuraciones apiladas verticalmente abordan estas limitaciones al superponer dos compartimentos a lo largo del eje y, separados por una sección de dentina nativa, lo que permite la cuantificación simultánea del transporte molecular a través de la dentina intacta y el monitoreo en tiempo real de las respuestas de las células de la pulpa, medido en el medio de salida³⁰. No obstante, una limitación reconocida de esta orientación radica en la obtención de imágenes en sección transversal de la interfaz dentina-célula, ya que adquirir imágenes en sección transversal de esta interfaz dentro del mismo plano focal sigue siendo técnicamente más desafiante que en las configuraciones apiladas horizontalmente, donde las células y las matrices extracelulares están dispuestas lateralmente. Aunque se han descrito múltiples modelos de complejo dentina-pulpa-en-un-chip en la literatura, la mayoría adopta una configuración apilada horizontalmente, en la que los compartimentos están dispuestos lateralmente dentro del mismo plano^10,20,21,29, mientras que relativamente pocos han incorporado una sección de dentina nativa dentro de una configuración apilada verticalmente³⁰. Aun así, las variaciones en los enfoques de fabricación y en la descripción de los parámetros entre estos modelos continúan limitando la reproducibilidad y las comparaciones entre estudios³³. El presente manuscrito tiene como objetivo mejorar la reproducibilidad metodológica al proporcionar un protocolo detallado de fabricación para un dispositivo de diente-en-un-chip con configuración apilada verticalmente, facilitando así la adopción más amplia de esta plataforma dentro de la comunidad de investigación dental.

Este manuscrito describe un protocolo paso a paso para la fabricación y ensamblaje de un dispositivo de complejo dentino-pulpar en chip (OoC) con apilamiento vertical, que incorpora un disco de dentina humana dentro de una plataforma microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS) de tres capas, fabricada mediante un molde producido por fotolitografía. El protocolo también describe la siembra y el cultivo de células madre de la pulpa dental dentro del dispositivo bajo condiciones estáticas.

Protocolo

El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de La Frontera para estudios que involucran muestras humanas.

1. Adquisición del disco de dentina

NOTA: Prepare el diseño del dispositivo antes de comenzar el protocolo (Figura 1A–1C).

1. Recolección y almacenamiento de dientes
   1. Recolecte molares o premolares humanos sanos tras obtener el consentimiento informado del paciente.
   2. Mantenga todas las muestras en una solución de cloramina al 0,5 % a 4 °C para prevenir la deshidratación de la dentina y la desnaturalización de proteínas.
   3. Reemplace la solución de cloramina una vez por semana durante el almacenamiento.
2. Preparación de discos de dentina
   1. Seccione cada diente horizontalmente en el tercio medio de la corona utilizando una pieza de mano de alta velocidad que funcione a 350 000 rpm y equipada con una fresa cilíndrica de diamante (diámetro de 1 mm; tamaño de grano de 100–150 µm).
   2. Realice la sección bajo irrigación continua de agua a aproximadamente 50 mL/min.
   3. Coloque la sección en el tercio medio de la corona para evitar la cámara pulpar y el esmalte presente en los surcos y fisuras oclusales, obteniendo así un disco compuesto predominantemente de tejido dentinario.
      ADVERTENCIA: Realice la sección del diente bajo irrigación continua y use equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, mascarilla y protección ocular.
3. Acabado de los discos de dentina
   1. Pulido del disco de dentina utilizando discos de acabado con granulometría decreciente secuencialmente.
   2. Continúe el pulido hasta alcanzar un espesor final de dentina de aproximadamente 0,8 mm (±± 0,3 mm) y dimensiones laterales de aproximadamente 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) (Figura 1D).
4. Almacenamiento de los discos de dentina
   1. Guarde los discos de dentina preparados en solución de cloramina al 0,5 % a 4 °C hasta el ensamblaje del dispositivo OoC.

Figura 1: Flujo de trabajo del diseño y fabricación del dispositivo de órgano-sobre-un-chip (OoC) del complejo dentina-pulpa. (A) Diseño tridimensional del dispositivo que muestra la arquitectura de tres capas. (B) Vista superior del diseño del dispositivo con las dimensiones principales. (C) Vista lateral de la configuración del dispositivo de tres capas. (D) Disco representativo de dentina preparado con un grosor aproximado de 0,8 mm y dimensiones laterales de aproximadamente 5 mm × 5 mm. (E) Molde matriz de silicio fabricado mediante fotolitografía y utilizado para moldear las capas superior e inferior de polidimetilsiloxano (PDMS). (F) Extracción de una capa de PDMS curada del molde de silicio tras la polimerización térmica. (G) Tratamiento con plasma de la superficie de PDMS antes de la unión de capas. (H) Dispositivo OoC final del complejo dentina-pulpa de tres capas ensamblado mediante unión por plasma e incorporando la interfaz de dentina. (I) Dispositivo ensamblado conectado a tubos para pruebas de fugas y preparación para experimentos microfluídicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Fabricación del dispositivo de órgano sobre un chip del complejo dentina-pulpa

1. Preparación del espacio de trabajo y los materiales
   1. Preparar materiales y equipo
      1. Preparar todos los materiales y equipos enumerados en la Tabla de Materiales antes de comenzar la fabricación del dispositivo.
      2. Preparar los punzones de biopsia antes del ensamblaje del dispositivo.
      3. Realizar todos los procedimientos de fabricación en un entorno limpio y libre de polvo.
      4. Usar guantes, protección ocular y equipo de protección personal adecuado durante toda la fabricación y el ensamblaje del dispositivo.
         NOTA: Preparar el molde producido por fotolitografía antes de comenzar el protocolo (Figura 1E).
2. Fabricación del molde microestructurado
   1. Preparación de la oblea de silicio
      1. Fabricar el molde sobre una oblea de silicio pulida por una sola cara de 4 pulgadas (tipo N, dopada con As, método de crecimiento CZ, orientación <100>, espesor de 500 ±± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, resistividad de 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Lavar la oblea secuencialmente en acetona, isopropanol y agua ultrapura durante 10 min cada uno bajo ultrasonido.
      3. Secar la oblea con aire comprimido.
      4. Calentar la oblea a 200°C durante 10 min en una placa calefactora para eliminar la humedad residual.
      5. Dejar que la oblea se enfríe a temperatura ambiente (TA; 20°C–25°C).
   2. Activación de la superficie y recubrimiento con fotoresina
      1. Activar la superficie de la oblea de silicio utilizando un limpiador de plasma al vacío operado con plasma de aire a nivel 7 durante 120 s.
      2. Aplicar la fotoresina negativa a base de epoxi GM 1060 mediante centrifugado a 300 rpm durante 10 s.
      3. Continuar el centrifugado a 565 rpm durante 100 s y a 965 rpm durante 1 s, utilizando una aceleración de 200 rpm/s.
      4. Dejar reposar la oblea recubierta durante 10 min.
      5. Realizar un prehorneado a 65°C durante 10 min.
      6. Continuar el prehorneado a 95°C durante 1 h.
      7. Dejar que la oblea se enfríe a TA.
   3. Exposición y revelado
      1. Exponer la fotoresina utilizando un sistema de litografía láser directa con una dosis de 1.950 mJ/cm².
      2. Realizar un posthorneado a 65°C durante 10 min.
      3. Continuar el posthorneado a 95°C durante 30 min.
      4. Dejar que la oblea se enfríe a TA.
      5. Dejar que la oblea repose durante 10 min.
      6. Revelar el patrón en PGMEA durante 4 min.
      7. Extender el revelado en intervalos de 30 s si queda fotoresina residual.
      8. Detener el revelado enjuagando con isopropanol.
      9. Secar la oblea utilizando aire comprimido.
   4. Horneado final
      1. Realizar un horneado final a 135°C durante 2 h.
      2. Obtener un molde maestro microestructurado que contenga microcanales de 1 mm de ancho y 50 µm de alto.
3. Preparación y desgasificación de la mezcla de PDMS
   1. Preparación de la mezcla de PDMS
      1. Mezclar la base de PDMS y el agente de curado en una proporción de 10:1 en peso.
      2. Agitar la mezcla manualmente con una varilla de vidrio en un vaso de plástico durante aproximadamente 5 min.
      3. Mantener movimientos circulares lentos y continuos durante la mezcla.
         NOTA: Evitar introducir burbujas de aire durante la mezcla.
   2. Desgasificación
      1. Colocar la mezcla de PDMS en un desecador al vacío conectado a una bomba de vacío.
      2. Desgasificar la mezcla a aproximadamente 700 mmHg durante 5 min.
      3. Liberar brevemente el vacío para permitir que las burbujas superficiales estallen.
      4. Volver a aplicar el vacío.
      5. Repetir el ciclo hasta que no queden burbujas visibles.
         NOTA: El tiempo total de desgasificación es típicamente de aproximadamente 30 min.
4. Vertido del PDMS sobre el molde
   1. Preparación del molde
      1. Colocar el molde sobre una superficie plana.
      2. Limpiar el molde utilizando aire comprimido.
      3. Evitar el contacto directo con la superficie grabada.
      4. Verificar que el molde esté libre de polvo y contaminantes.
   2. Dispensación del PDMS
      1. Dispensar aproximadamente 8 g de PDMS alrededor del disco de dentina para fabricar la capa de inclusión de dentina.
      2. Ajustar la altura del PDMS para que coincida con el espesor del disco de dentina (0,8 ±± 0,3 mm).
      3. Evitar que el PDMS cubra la superficie de la dentina.
      4. Dispensar aproximadamente 0,26 g de PDMS por unidad del molde para fabricar cada capa de microcanal.
      5. Golpear suavemente el molde o aplicar vibración para facilitar el llenado de las microestructuras.
      6. Dejar que el PDMS se asiente en las características más pequeñas.
      7. Cubrir el molde con una tapa o cubierta plana sin tocar la superficie del PDMS.
         NOTA: La capa de inclusión de dentina tiene aproximadamente 0,8 mm de espesor, y cada capa de microcanal tiene aproximadamente 0,4 mm de espesor, lo que da un espesor total del dispositivo de aproximadamente 1,6 mm.
         NOTA: Ajustar el espesor de la capa según la distancia de trabajo del objetivo confocal cuando se planee la imagenología confocal.
5. Curado
   1. Colocar los moldes en un horno a 50°C.
   2. Curar el PDMS durante 4 h.
6. Extracción de las capas de PDMS
   1. Extracción del PDMS curado
      1. Despegar cuidadosamente las capas de PDMS curado del molde (Figura 1F).
      2. Manipular las capas de PDMS con cuidado para evitar dañar las microestructuras.
7. Unión de las capas de PDMS y fabricación de los puertos de entrada y salida
   1. Fabricación de los puertos de entrada y salida
      1. Crear perforaciones en las ubicaciones designadas de entrada y salida utilizando un punzón de biopsia de 1 mm.
      2. Colocar el lado del microcanal hacia arriba durante la perforación.
         NOTA: Colocar la capa de PDMS sobre una esterilla de corte para evitar daños estructurales.
      3. Crear dos perforaciones en la capa superior correspondientes al microcanal superior.
   2. Limpieza de las capas de PDMS
      1. Limpiar las capas de PDMS utilizando alcohol isopropílico o etanol.
      2. Eliminar partículas residuales de polvo utilizando cinta adhesiva estéril.
      3. Verificar que todas las superficies de unión estén libres de contaminantes antes del ensamblaje.
   3. Activación por plasma de las superficies de PDMS
      1. Colocar las capas superior e intermedia de PDMS para el tratamiento con plasma (Figura 1G).
      2. Activar las superficies utilizando un tratador de plasma corona portátil que opere a aproximadamente 25 W con aire ambiente como gas de trabajo.
      3. Mantener una distancia de trabajo de aproximadamente 1 mm entre la fuente de plasma y la superficie de PDMS.
         ADVERTENCIA: Realizar el tratamiento con plasma bajo ventilación adecuada y evitar la exposición directa al ozono generado por el plasma.
      4. Activar el dispositivo de tratamiento con plasma y permitir su estabilización durante 5 s.
      5. Verificar la generación de un haz de plasma uniforme antes del tratamiento.
      6. Tratar la capa superior de PDMS durante 10 s utilizando un movimiento continuo de ida y vuelta a aproximadamente 5 mm/s.
      7. Tratar la capa intermedia de PDMS durante 10 s utilizando el mismo movimiento y distancia.
      8. Aplicar un tratamiento adicional de 1 s con plasma a la capa superior inmediatamente antes de la unión.
   4. Unión de las capas superior e intermedia
      1. Alinear el microcanal superior con el disco de dentina inmediatamente después del tratamiento con plasma.
      2. Unir las capas superior e intermedia.
      3. Colocar el conjunto unido en un horno a 75°C durante 5 min.
      4. Consolidar la unión durante la incubación.
         NOTA: El disco de dentina y el microcanal son visibles a simple vista y pueden alinearse sin herramientas adicionales de alineación.
   5. Fabricación de los puertos del microcanal inferior
      1. Perforar dos orificios correspondientes al microcanal inferior a través de las capas superior e intermedia unidas.
      2. Realizar la perforación a través de ambas capas simultáneamente para asegurar la alineación.
         NOTA: Este procedimiento genera cuatro perforaciones en la capa superior y dos perforaciones en la capa intermedia.
      3. Colocar el conjunto unido sobre una esterilla de corte firme antes de perforar.
      4. Aplicar presión descendente constante en un solo movimiento.
         NOTA: Evitar fuerzas rotacionales o laterales para minimizar el riesgo de deslaminación.
      5. Eliminar los residuos de los sitios de perforación utilizando gasa estéril sin pelusa humedecida con alcohol isopropílico.
      6. Inspeccionar las perforaciones y las áreas unidas circundantes con iluminación adecuada.
      7. Verificar la ausencia de deslaminación, desgarros o perforaciones incompletas antes de continuar.
   6. Unión de la capa inferior
      1. Tratar con plasma la capa inferior según se describe en el Paso 2.7.4.
      2. Alinear los puertos de entrada y salida del microcanal inferior con las perforaciones en las capas superior e intermedia.
      3. Unir la capa inferior para completar el ensamblaje del dispositivo.
         NOTA: Marcar las ubicaciones de entrada y salida en la superficie externa de la capa inferior antes de la unión para facilitar la alineación.
         NOTA: Las cámaras de plasma pueden proporcionar uniones más fuertes que las plumas de plasma, según se informa en la literatura³⁶.
         NOTA: El dispositivo terminado consiste en una plataforma microfluídica de tres capas que incorpora una interfaz de dentina (Figura 1H). La superficie inferior de la dentina representa el lado pulpar del modelo, mientras que la superficie superior de la dentina representa el lado coronal para la exposición a biomateriales dentales o preparaciones bacterianas.
8. Prueba de fugas del dispositivo microfluídico
   1. Inspección del dispositivo ensamblado
      1. Inspeccionar el dispositivo ensamblado en busca de desalineaciones.
      2. Inspeccionar el ensamblaje en busca de uniones incompletas y fugas visibles.
   2. Prueba de fugas
      1. Conectar agujas Luer-lock de 19G a los puertos de entrada (Figura 1E).
      2. Conectar las agujas a los tubos de la bomba microfluídica.
      3. Presionar suavemente los conectores de las agujas en los puertos perforados para obtener un ajuste hermético.
      4. Inyectar PBS estéril o medio de cultivo a un flujo de 10 µL/min.
      5. Mantener el flujo de líquido durante al menos 5 min.
      6. Inspeccionar todas las interfaces unidas, los márgenes de los canales y los bordes del disco de dentina durante el flujo.
      7. Observar el dispositivo con iluminación adecuada durante y después de la inyección.
      8. Confirmar la ausencia de acumulación de líquido, humedad o formación de gotas.
      9. Clasificar el dispositivo como libre de fugas si no se detecta ninguna fuga.
      10. Desechar los dispositivos que presenten fugas.
          NOTA: Realizar la prueba de fugas en cada dispositivo fabricado antes de la siembra celular o del uso experimental.
9. Sterilización y almacenamiento del dispositivo microfluídico
   1. Sterilización
      1. Exponer la superficie superior del dispositivo ensamblado a luz UV (254 nm) durante 30 min dentro de una cabina de flujo laminar.
      2. Exponer la superficie inferior a luz UV durante 30 min adicionales.
      3. Enjuagar los microcanales con etanol al 70% durante 20 min.
      4. Lavar los microcanales tres veces con PBS estéril para eliminar el etanol residual.
   2. Almacenamiento
      1. Utilizar el dispositivo esterilizado inmediatamente para experimentos de cultivo celular.
      2. Alternativamente, almacenar el dispositivo sumergido en PBS estéril a 4°C dentro de un recipiente estéril hasta su uso.
         ​ADVERTENCIA: No utilizar cloramina ni otras soluciones desinfectantes después del ensamblaje del dispositivo porque el PDMS puede absorber estos compuestos y comprometer la viabilidad celular.

3. Evaluación de la adhesión y viabilidad de las células madre del pulpo dental

1. Preacondicionamiento de la superficie de dentina
   1. Inyecte EDTA al 10 % en el dispositivo.
   2. Mantenga el contacto entre la solución de EDTA y la superficie de dentina durante 15 min.
   3. Inyecte 0,5 mL de EDTA cada 3 min para mantener el movimiento del fluido dentro del microcanal.
   4. Lave el disco de dentina tres veces con agua ultrapura.
   5. Mantenga cada lavado durante 5 min.
      NOTA: El tratamiento con EDTA elimina la capa de esmear y expone las proteínas de la matriz de la dentina.
      ADVERTENCIA: Manipule las soluciones de EDTA utilizando guantes y equipo de protección ocular para evitar irritación en la piel y los ojos.
2. Siembra de células madre del pulpo dental
   1. Expansión de células madre del pulpo dental
      1. Siembre células madre del pulpo dental en un matraz T75 a una densidad de 1 × 10⁶ células por matraz.
      2. Incube las células a 37 °C y 5 % de CO₂ hasta alcanzar aproximadamente un 80 % de confluencia.
      3. Desprenda las células utilizando tripsina.
      4. Neutralice la tripsina utilizando medio de cultivo completo.
      5. Centrifugue la suspensión celular para obtener un precipitado celular.
      6. Evalue la viabilidad celular utilizando azul de tripano.
      7. Utilice suspensiones celulares con viabilidad ≥90 %.
   2. Preparación de la suspensión celular
      1. Prepare una suspensión celular precalentada a 37 °C.
      2. Ajuste la concentración celular a 100 000 células/mL en medio de cultivo completo.
      3. Prepare un volumen final de suspensión de 1–2 mL.
         NOTA: En el presente estudio se utilizaron células en el pase 5.
   3. Siembra celular
      1. Inyecte la suspensión celular en el puerto de entrada del microcanal inferior.
      2. Invierta el dispositivo tras la siembra celular
         NOTA: La inversión del dispositivo promueve la sedimentación celular hacia la superficie de la dentina y mejora la adhesión celular.
   4. Incubación
      1. Coloque el dispositivo invertido dentro de una placa de Petri.
      2. Añada 1 mL de medio de cultivo a la placa de Petri para minimizar la evaporación.
      3. Incube el dispositivo a 37 °C y 5 % de CO₂ durante 24 h.
      4. Mantenga condiciones de cultivo estático durante todo el período de incubación.
         NOTA: En el presente estudio no se realizó validación con flujo dinámico.
         NOTA: El presente protocolo describe condiciones de cultivo estático para la validación inicial del dispositivo y la evaluación de la adhesión celular.
   5. Validación inicial del dispositivo
      1. Evalue la adhesión celular mediante microscopía electrónica de barrido.
      2. Recupere el disco de dentina desmontando el dispositivo antes del análisis.
3. Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido
   1. Recuperación y lavado de muestras
      1. Desmonte el dispositivo tras 24 h de incubación.
      2. Recupere el disco de dentina y transfiéralo a una placa de cultivo o placa de Petri.
      3. Coloque la superficie de dentina sembrada con células mirando hacia arriba.
      4. Lave el disco de dentina dos veces utilizando 1 mL de PBS.
   2. Fijación
      1. Añada 2 mL de glutaraldehído al 2,5 % en tampón fosfato de Sorensen 0,1 M.
      2. Incube la muestra durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
         ADVERTENCIA: El glutaraldehído es tóxico y puede causar irritación en la piel, los ojos y el tracto respiratorio. Realice los procedimientos de fijación dentro de una campana extractora de gases químicos y utilizando equipo de protección personal adecuado.
   3. Lavado tras la fijación
      1. Retire la solución de glutaraldehído.
      2. Lave el disco de dentina tres veces con agua destilada ultrapura a temperatura ambiente (RT).
   4. Análisis por MEB
      1. Analice las muestras utilizando un microscopio electrónico de barrido ambiental.
      2. Opere el microscopio en condiciones de bajo vacío (25 Pa).
      3. Utilice un voltaje de aceleración de 10,0 kV y una distancia de trabajo de 7,0 mm.
      4. Adquiera imágenes utilizando el modo de detección 3D de electrones retrodispersados (BSE-3D).
      5. Capture imágenes a un aumento de ×200 (Figura 2A).
4. Evaluación de la viabilidad celular mediante microscopía confocal
   1. Preparación de muestras
      1. Siembre y cultive las células según se describe en el paso 3.2.
      2. Incube el dispositivo durante 24 h a 37 °C y 5 % de CO₂.
      3. Desmonte el dispositivo y exponga la superficie de la dentina.
      4. Transfiera el disco de dentina a una placa de pocillos que contenga HBSS⁺/+ suplementado con Ca²⁺ y Mg²⁺.
   2. Lavado de muestras
      1. Lave el disco de dentina dos veces con HBSS⁺/⁺.
      2. Elimine el suero residual y el rojo de fenol antes de la tinción.
         NOTA: El suero residual y el rojo de fenol pueden aumentar la autofluorescencia de fondo.
   3. Tinción de células viables
      1. Prepare una solución trabajo fresca de Calceína AM a 2 µM en HBSS⁺/⁺.
      2. Añada suficiente solución de tinción para cubrir completamente la superficie de la dentina.
      3. Incube la muestra durante 20 min a 37 °C en la oscuridad.
      4. Retire la solución de tinción tras la incubación.
   4. Tinción de células muertas
      1. Añada solución trabajo de yoduro de propidio (1–2 µg/mL en HBSS⁺/⁺).
      2. Incube la muestra durante 5–8 min a 37 °C en la oscuridad.
      3. No supere los 10 min de incubación.
      4. Lave la muestra dos veces con HBSS⁺/⁺.
      5. Mantenga la muestra sumergida en tampón hasta la adquisición de imágenes.
   5. Adquisición de imágenes por microscopía confocal
      1. Adquiera imágenes confocales dentro de los 30 min posteriores a la tinción.
      2. Adquiera imágenes secuencialmente en los canales verde y rojo.
      3. Utilice λ_ex 490 nm y λ_em 515 nm para la imagen de células viables.
      4. Utilice λ_ex 535 nm y λ_em 617 nm para la imagen de células muertas.
         ​NOTA: Proteja las soluciones de tinción fluorescente y las muestras teñidas de la exposición a la luz durante los procedimientos de incubación y adquisición de imágenes (Figura 2B).

Figura 2: Evaluación representativa de la adhesión y viabilidad de células madre del pulpo dental dentro del dispositivo de órgano sobre un chip (OoC) del complejo dentina-pulpo. (A) Imagen de microscopía electrónica de barrido que muestra células madre del pulpo dental adheridas (asterisco blanco) sobre la superficie de dentina tras 24 h de cultivo estático dentro del dispositivo OoC. Tras 24 h de cultivo, las células adheridas cubrieron el 54,35 ± 0,92 % de la superficie de dentina expuesta al microcanal. No se observan células en la región de dentina cubierta por PDMS (asterisco negro), lo que indica un sellado efectivo entre las capas del dispositivo. Barra de escala = 200 µm. (B) Imagen de microscopía confocal que muestra células madre del pulpo dental viables teñidas en verde y adheridas a la superficie de dentina (flechas blancas) tras 24 h de cultivo estático. También se observan células no viables teñidas en rojo (flechas azules). Barra de escala = 50 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

La fabricación exitosa del dispositivo de diente-en-un-chip siguió el flujo de trabajo ilustrado en la Figura 1A–1I, que incluye la preparación del disco de dentina (Figura 1D), la fabricación del molde derivado de la fotolitografía (Figura 1E), la eliminación de las capas de PDMS curadas (Figura 1F), la activación por plasma antes de la unión (Figura 1G), el ensamblaje del dispositivo final (Figura 1H) y la conexión del dispositivo al sistema microfluídico (Figura 1I). El dispositivo resultante consistió en un ensamblaje de tres capas de PDMS en el que el disco de dentina estaba completamente integrado dentro de la capa media, con los microcanales superior e inferior colocados a ambos lados de la superficie de la dentina (Figura 1H).

Un resultado positivo en esta etapa se caracterizó por la ausencia de burbujas de aire visibles o desprendimiento, y por el paso libre de fugas del fluido tras la inyección de PBS o medio de cultivo a través de los puertos de entrada (Figura 1I). El desalineamiento de los puertos del microcanal, la unión incompleta por plasma o las fugas en la interfaz dentina-PDMS indicaban un ensamblaje fallido y requerían la repetición del procedimiento de fabricación.

Se fabricaron un total de 30 dispositivos, de los cuales aproximadamente el 20 % fallaron durante la fabricación o las pruebas. Los fallos se asociaron principalmente con fugas de fluido más allá de los límites del microcanal debido a una unión por plasma incompleta, mientras que una proporción menor de fallos se debió a desprendimiento en otras regiones del dispositivo. No se atribuyó ningún fallo a fugas en la interfaz dentina-PDMS ni a un mal alineamiento de los puertos de entrada y salida del microcanal.

Tras 24 h de cultivo estático, se confirmó el éxito del sembrado celular mediante la presencia de células madre del tejido pulpar adheridas que exhibían morfología fibroblástica sobre la superficie de dentina. La microscopía electrónica de barrido permitió evaluar tanto la adhesión celular como la integridad del dispositivo (Figura 2A). Utilizando el presente protocolo, las células adheridas cubrieron el 54,35 ± 0,92 % de la superficie de dentina expuesta al microcanal tras 24 h de cultivo. Un resultado positivo se evidenció por la presencia de células adheridas exclusivamente dentro del área del microcanal, mientras que la superficie de dentina cubierta por PDMS permaneció libre de adhesión celular (Figura 2A). Esta distribución espacial respaldó un sellado exitoso entre las capas del dispositivo y un ensamblaje adecuado del mismo. Por el contrario, la presencia de células más allá de los límites del microcanal indicaba una fuga y debía considerarse un resultado negativo.

La microscopía confocal mediante tinción de viables/no viables permitió evaluar de forma no destructiva la viabilidad celular dentro del dispositivo. Un resultado exitoso se caracterizó por una predominancia de células viables que exhibían fluorescencia verde y morfología fibroblástica, con solo ocasionales células no viables teñidas en rojo (Figura 2B). En contraste, una alta proporción de células no viables indicaría un acondicionamiento subóptimo de la dentina, un lavado inadecuado o condiciones de cultivo inadecuadas.

Durante la optimización del protocolo, se evaluó una estrategia inicial de fabricación en la que se utilizó un molde fijo que incorporaba una hendidura predeterminada para posicionar el disco de dentina dentro de la capa media de PDMS (Figura 3A). Aunque esta aproximación tenía como objetivo estandarizar la colocación del disco y reducir las fugas en la interfaz entre el disco y el PDMS, resultó ser ineficaz en la práctica. Dado que la región correspondiente a la hendidura del disco de dentina debía cortarse manualmente de la capa de PDMS curada, no fue posible lograr de forma confiable una adaptación precisa entre los márgenes del disco y los bordes cortados del PDMS, lo que provocó la aparición de espacios interfaciales que causaron fugas en aproximadamente el 50 % de los dispositivos fabricados (Figura 3A).

Figura 3: Imágenes representativas que ilustran enfoques de fabricación infructuosos identificados durante la optimización del dispositivo de complejo dentino-pulpar en un chip (OoC). (A) Molde de silicio que contiene rebajes fijos diseñados para la colocación estandarizada de discos de dentina (flechas blancas). Debido a la variabilidad inherente en las dimensiones de los discos de dentina resultante de la preparación manual de las muestras, no se logró una adaptación confiable a la geometría fija del molde, lo que provocó brechas interfaciales y fugas en aproximadamente el 50 % de los dispositivos fabricados. (B) Imagen de microscopía electrónica de barrido de la superficie de la dentina tras la aplicación de un material sellante en la interfaz disco-PDMS. Se indican la dentina expuesta (asterisco negro) y los depósitos del material sellante (asterisco blanco). La dispersión no intencionada del material sellante sobre la superficie de la dentina comprometió la adhesión celular y redujo la superficie disponible para la colonización celular. Barra de escala = 100 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para abordar esta limitación, se aplicó un material de sellado en la interfaz entre el disco y el PDMS. Sin embargo, este enfoque introdujo un inconveniente adicional, ya que el material de sellado se extendió sobre la superficie de dentina y evitó la adhesión celular en las regiones cubiertas, como se demostró mediante microscopía electrónica de barrido (Figura 3B). Estos resultados subóptimos pusieron de manifiesto dos limitaciones críticas de la estrategia inicial de fabricación: la adaptación inadecuada entre el hueco de PDMS cortado manualmente y el disco de dentina, y la reducción de la adhesión celular asociada al material de sellado.

Discusión

Este estudio describe un protocolo paso a paso para la fabricación de un dispositivo tipo diente-en-un-chip con estructura vertical que incorpora dentina y células madre del pulpo dental, y demuestra la adhesión celular y viabilidad representativas dentro del dispositivo bajo condiciones de cultivo estático. El protocolo fue desarrollado para proporcionar un flujo de trabajo reproducible para la fabricación y ensamblaje de una plataforma OoC (órgano-en-un-chip) del complejo dentinopulpar adecuada para estudios in vitro de la interfaz dentinaria. El establecimiento de dicho flujo de trabajo es particularmente significativo porque nuestra reciente revisión sistemática destacó que el campo de los modelos microfluídicos para el complejo dentinopulpar aún se encuentra en una etapa emergente, caracterizada por una alta heterogeneidad metodológica en la arquitectura del dispositivo y en los materiales, lo que compromete gravemente la reproductibilidad y estandarización de los modelos actuales de diente-en-un-chip³⁴. Al proporcionar un protocolo detallado y reproducible, este estudio aborda estas limitaciones y contribuye al desarrollo de modelos biológicos mejor definidos. En el contexto más amplio del desarrollo de OoC aplicado a la biología oral, França et al.¹⁵ fueron pioneros en el campo con un modelo microfluídico de diente-en-un-chip que incorporaba discos de dentina y células similares a odontoblastos, demostrando la viabilidad de recrear la interfaz dentinopulpar en un entorno microfluídico dinámico y evaluando la respuesta citotóxica a materiales dentales. Desde esta contribución pionera, se ha reportado un número creciente de plataformas orales OoC en la literatura³⁴, abordando diversos aspectos de la biología de los tejidos dentales, las interacciones con biomateriales y la microbiología oral, consolidando este enfoque como un campo de investigación activo y en rápido crecimiento. El presente protocolo contribuye a este panorama al ofrecer un flujo de trabajo detallado y reproducible para la fabricación de una plataforma de diente-en-un-chip con estructura vertical, accesible para grupos de investigación con capacidades microfluídicas estándar.

Varios pasos del protocolo son fundamentales para la correcta fabricación y funcionamiento del dispositivo. En particular, verter PDMS sobre el molde requiere un control cuidadoso para obtener un espesor uniforme de la capa y una formación adecuada de los microcanales. El espesor de las capas de PDMS debe seleccionarse según la aplicación posterior prevista. Por ejemplo, la microscopía confocal requiere capas de PDMS suficientemente delgadas para permitir la visualización óptica de las células adheridas a la superficie de la dentina. Sin embargo, las capas más delgadas pueden ser más difíciles de manipular durante los procedimientos de fabricación y ensamblaje. Por consiguiente, la optimización del espesor del PDMS representa un equilibrio importante entre la accesibilidad para la imagen y la manipulación práctica durante la fabricación del dispositivo. Además, en el presente estudio, la microscopía confocal de dispositivos intactos no fue factible porque la capa de PDMS que cubría las células tenía un espesor de 0,4 mm, lo cual excedía la profundidad de penetración del microscopio confocal disponible (0,2 mm). Como resultado, la adquisición de imágenes confocales se realizó tras el desmontaje del dispositivo y la exposición directa de la superficie de la dentina. Asimismo, la microscopía de fluorescencia no fue aplicable en este dispositivo porque la opacidad inherente de la dentina impedía la visualización óptica directa de las células adheridas a su superficie.

Esta limitación es particularmente relevante en configuraciones de OoC apiladas verticalmente, en las que el microcanal que contiene las células se sitúa debajo del disco de dentina, lo que dificulta el acceso óptico debido tanto a la capa de PDMS sobrepuesta como a la opacidad de la dentina misma. Esta limitación no se presenta en diseños de chips apilados horizontalmente, donde los microcanales discurren lateralmente junto a la dentina en lugar de debajo de ella, permitiendo así un acceso óptico directo a la superficie sembrada con células sin interferencias por la opacidad de la dentina o el grosor del PDMS. Por lo tanto, la elección entre configuraciones apiladas vertical u horizontalmente debe considerar no solo los requisitos fluidicos y biológicos, sino también las modalidades de imagen disponibles en el laboratorio. En un sistema de OoC, el diseño del dispositivo desempeña un papel importante, y el microentorno debe mantenerse lo más cercano posible a las condiciones in vivo. Como ocurre con la mayoría de los tejidos, el diente está sometido a estímulos mecánicos y presenta un comportamiento anisótropo³⁵, lo que significa que sus propiedades varían según la dirección del estímulo aplicado. Además, existen diferencias histológicas entre la porción coronal del complejo dentino-pulpar, donde la dentina y los odontoblastos están dispuestos verticalmente, y la porción lateral, donde los odontoblastos se encuentran adyacentes a la dentina, con diferencias notables en el número de células, su organización y la orientación de los túbulos dentinarios. Por lo tanto, un diseño de chip apilado verticalmente proporciona una representación anatómica más fiel de las lesiones cariosas y de los materiales restauradores que afectan la parte coronal del complejo dentino-pulpar.

El tratamiento preciso de superficies con plasma es esencial para el ensamblaje exitoso de dispositivos y sigue siendo uno de los principales desafíos en la producción de chips³⁶. En este estudio, se produjo desprendimiento en el 20 % de los dispositivos fabricados. Este resultado no es inesperado porque la unión PDMS–PDMS lograda con una pluma de plasma manual, como la utilizada en el presente estudio, genera una concentración menor de especies reactivas de oxígeno en comparación con los sistemas de cámara de plasma basados en vacío, que permiten concentraciones de oxígeno superiores a las atmosféricas y, por consiguiente, producen un mayor número de grupos superficiales covalentes disponibles para la unión³⁶. Como resultado, la resistencia de unión alcanzada mediante una pluma de plasma es inherentemente menor y menos reproducible que la obtenida con una cámara de plasma dedicada, lo que probablemente contribuyó a la tasa de desprendimiento observada. La optimización de la estrategia de integración de dentina también requirió múltiples iteraciones de fabricación para lograr un contacto estrecho entre el disco de dentina y la capa intermedia de PDMS, minimizando al mismo tiempo las fugas. Un enfoque inicial implicó la fabricación de un rebaje predeterminado dentro de la capa intermedia para colocar la dentina; sin embargo, el corte manual del rebaje impidió una adaptación consistente entre el disco de dentina y los márgenes de PDMS, lo que provocó fugas durante la inyección del medio de cultivo y dio como resultado una tasa de éxito global de fabricación de aproximadamente el 50 %.

Posteriormente se evaluó un adhesivo para prótesis con el fin de mejorar el sellado en la interfaz dentina-PDMS, pero la microscopía electrónica de barrido demostró interferencia con la adhesión celular y una visualización reducida de las células sobre la superficie de la dentina. Por lo tanto, el protocolo final se optimizó colocando directamente el disco de dentina dentro del molde antes de verter cuidadosamente el PDMS alrededor de la muestra, mejorando así la integración del disco de dentina dentro del dispositivo y reduciendo la necesidad de materiales adicionales de sellado. Este enfoque eliminó eficazmente las fugas en la interfaz dentina-PDMS al garantizar un contacto íntimo y conformado entre los márgenes del disco de dentina y el PDMS circundante, sin depender de agentes de sellado secundarios que pudieran interferir con la adhesión celular a la superficie de la dentina. También deben considerarse varias limitaciones del método actual. La fabricación de dispositivos microfluídicos sigue siendo parcialmente dependiente de procedimientos manuales, lo que puede introducir variabilidad entre dispositivos y operadores. Aunque la fotolitografía ofrece alta precisión y reproducibilidad en la fabricación de geometrías de microcanales, el proceso puede requerir equipo especializado y experiencia técnica. Enfoques alternativos de fabricación, incluidas técnicas de impresión tridimensional, podrían facilitar la creación de prototipos y mejorar la accesibilidad para algunos laboratorios; sin embargo, factores como la resolución de impresión, los monómeros residuales y la biocompatibilidad del material requieren una optimización cuidadosa³⁷.

El suministro continuo de medio proporciona a las células un entorno estable y las protege de la acumulación de desechos o del desequilibrio de calcio/fosfato¹⁶. Varios estudios han demostrado que el estrés cortante inducido por un flujo constante puede simular procesos de mecanotransducción similares a la señalización in vivo, que son determinantes clave del comportamiento celular^38,39, contribuyendo a la diferenciación y maduración celular e induciendo cambios significativos en la morfología celular, la expresión génica y la función³⁹. El presente estudio describe la fabricación y validación inicial del dispositivo, demostrando la adhesión y viabilidad celular tras 24 h bajo condiciones de cultivo estático; por lo tanto, los efectos del flujo dinámico no se evaluaron. La implementación de condiciones de flujo dinámico representa una importante vía de investigación futura y será abordada en estudios posteriores. El presente protocolo proporciona un flujo de trabajo reproducible para la fabricación de un dispositivo OoC de complejo dentino-pulpar apilado verticalmente, incorporando dentina en una plataforma microfluídica de PDMS de tres capas. Las aplicaciones potenciales del modelo incluyen la investigación de las interacciones entre dentina y biomateriales, las respuestas celulares a materiales dentales y la evaluación in vitro de la interfaz dentino-pulpar bajo condiciones experimentales controladas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales biológicos y químicos
Acetona	ExpertQ	SOLV 8	Limpieza de obleas de silicio
Medio de cultivo Alpha MEM	Cytiva	SH30265.02	Medio de cultivo para células madre del pulpo dental
Cloramina (0,5 %)	Merck	7080-50-4	Solución de almacenamiento para discos de dentina
Células madre del pulpo dental	No aplicable	No aplicable	Cultivo primario de células. Ver pasos 3.2.1 y 3.2.2
EDTA (10 %)	Winkler	N2222158E	Eliminación de la capa de detritus
Fotorresistente negativo basado en epoxi	Gersteltec	GM1060	Fabricación de moldes por fotolitografía
Glutaraldehído (2,5%) en Sorensen 0,1 M’buffer fosfato s	Sigma-Aldrich	210908-06	Fijación para MEB
Dientes humanos sanos (molares o premolares)	No aplicable	No aplicable	Muestra humana
Isopropanol	ExpertQ	SOLV 16	Limpieza del oblea, detención del revelado y limpieza de PDMS
Kit de Viabilidad LIVE/DEAD	Sigma-Aldrich	451	Tinción de viabilidad por fluorescencia.
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Corning	46-013-CM	Lavado y prueba de fugas
Base de PDMS y agente de curado (polidimetilsiloxano)	Dow	Sylgard 184	Fabricación del dispositivo
PGMEA	Sigma Aldrich	484431	Desarrollo del fotoresistente
Azul de tripano	Sigma Aldrich	T8154-100ml	Evaluación de la viabilidad celular
Tripsina	Corning	25-053-CI	Desprendimiento celular
Agua ultrapura	Cytiva	SH30529.01	Solución de lavado
Materiales de consumo y utensilios de laboratorio
Agujas de jeringa de 19G	Vmatic	VCB19050	Conexión del dispositivo con microbomba o jeringa
Punzón de biopsia (diámetro: 1 mm)	Harris Unicore	WHAWB100073	Fabricación de los puertos de entrada y salida
Mandril de corte	Nicecool	No aplicable	Protección de la superficie durante el punzonado
Discos para acabado dental (por ejemplo, Sof-Lex)	3M	Sof-Lex	Pulido de dentina
Adaptadores hembra de Luer a espiga	Runze Fluidics	RH-M016	Conexión de tubos
Varilla de mezcla de vidrio o plástico	Duran	No aplicable	Mezcla de PDMS
Jeringas hipodérmicas	Arándano rojo	pc-12246	Siembra celular y prueba de fugas
Gasas estériles sin pelusa	Linderson	No aplicable	Eliminación de los residuos de perforación
Adaptadores macho Luer	Runze Fluidics	RH-G016	Conexión de tubos
Recipiente de mezclado	Duran	No aplicable	Preparación del PDMS
placa de Petri (140 mm) × 20 mm	Deltalab	2000219	Cultivo de células/incubación
Base de politetrafluoroetileno	CCTVal	No aplicable	Fabricación de la capa de dentina intermedia
Oblea de silicio	Jiaozuo Commercial FineWin	No aplicable	Fabricación del molde
Tubo de silicona	Runze Fluidics	96421	Conexión fluidica
matraz T75	Corning	353136	Expansión de células madre del pulpo dental
Placa de cultivo	SPL Life Sciences	30006	Tinción y preparación para imagen confocal
Equipos e instrumentos
Secador de aire	METALPLAN	TITAN-040	Secado del aire comprimido
Fuente de aire comprimido	SCHULZ	CSD-18.1	Molde y limpieza de superficies
microscopio confocal	Olympus	No aplicable	Modelo: FV1000
Sistema de litografía láser directa	Heidelberg	uPG 101	Exposición del fotoresist
Microscopio electrónico de barrido ambiental	Hitachi	No aplicable	Modelo: Quanta 400
Pieza de mano de alta velocidad	Nakanishi	No aplicable	Modelo: Pana-max2
Placa calefactora	LabTech	EH20A Plus	Cocción del sustrato y cocción del fotoresist
Cabina de flujo laminar	BioBase	BBS8V1708313D	Esterilización del dispositivo
Bomba microfluídica	Nueva Era	No aplicable	Modelo: 1002X-ES. Prueba de fugas a 10 µL/min
Molde microestructurado (fabricado mediante fotolitografía)	CCTVal	No aplicable	Véase el paso 2.2 para las especificaciones de fabricación del molde
Horno o incubadora	Memmert	UN110	Curado de PDMS a 50°C y consolidación de enlaces a 75°C
Cámara de limpieza por plasma al vacío	Fari Plasma	GD-5	Activación de obleas por plasma
Plasma corona portátil	Aurora Pro Scientific	APS-CD-20AC	Activación de PDMS con plasma
Ultrasonificador	Elma Sonic	S 10 (H)	Limpieza de obleas
Cámara de vacío o desecador (250 mm)	Winglass	No aplicable	Desgasificación del PDMS
Bomba de vacío	ROCKER	300	Desgasificación del PDMS