SMART (Tecnología de Reconstrucción Automatizada Shuimu): Una plataforma computacional integrada para agilizar el flujo de trabajo de criomicroscopía electrónica

Resumen

Este protocolo demuestra un flujo de trabajo de criomicroscopía electrónica paso a paso utilizando una plataforma de software integrada (SMART) que conecta adquisición de datos, reconstrucción tridimensional y construcción de modelos atómicos en una única interfaz basada en navegador. Como ejemplo representativo, la estructura humana TRPML1 se determina a una resolución de 2,38 Å.

Resumen

La criomicroscopía electrónica (crio-EM) se ha convertido en una herramienta central en biología estructural, pero los flujos de trabajo actuales suelen requerir múltiples paquetes de software especializados para la adquisición de datos, la reconstrucción tridimensional (3D) y la construcción de modelos atómicos, lo que conduce a tuberías fragmentadas y a frecuentes intervenciones manuales. Aquí presentamos SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology), una plataforma de software integrada que combina tres módulos: DataSmart para la recogida automatizada de datos, CryoSmart para el procesamiento de imágenes y reconstrucción 3D, y ModelSmart para la construcción de modelos atómicos basados en aprendizaje profundo, dentro de una interfaz unificada accesible por navegador. Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para operar los tres módulos. El flujo de trabajo abarca navegación automatizada de muestras y adquisición de datos, corrección de movimiento, estimación de funciones de transferencia de contraste (CTF), selección de partículas, clasificación bidimensional (2D), refinamiento 3D, mejora cartográfica y generación de modelos atómicos. Como ejemplo representativo, aplicamos el flujo de trabajo completo para determinar la estructura de TRPML1 humano, un canal catiónico lisosomal permeable a Ca²⁺, logrando una resolución global de 2,38 Å mediante correlación de conchas de Fourier (FSC) de estándar oro en el criterio de 0,143. Los tres módulos (DataSmart, CryoSmart y ModelSmart) se aplicaron secuencialmente al mismo conjunto de datos TRPML1 dentro de este estudio. El protocolo está diseñado para ser accesible a usuarios con distintos niveles de experiencia en crio-EM.

Introducción

Microscopía crioelectrónica: evolución tecnológica e impacto biológico. La determinación de la estructura tridimensional de proteínas sigue siendo un desafío central en biología molecular, ya que la función biológica está intrincadamente ligada a la disposición espacial de los residuos de aminoácidos. Esclarecer estas configuraciones estructurales es imprescindible para descifrar mecanismos enzimáticos, interacciones con ligandos y vías de señalización celular a resolución atómica. Este imperativo ha impulsado desarrollos transformadores en crio-EM, que se ha convertido en una técnica de biología estructural ampliamente^{adoptada 1,2}.

El análisis de partícula única crio-EM (SPA) sirve como un enfoque poderoso para obtener conocimientos biológicos entre diversos tipos de muestras, resolviendo estructuras de alta resolución de complejos^{aislados 3}. Estos incluyen virus, proteínas de membrana, ensamblajes helicoidales y otros complejos macromoleculares dinámicos y heterogéneos, que abarcan una amplia gama de tamaños moleculares—desde aproximadamente 50 kDa hasta decenas de megadaltones.

La Cryo-EM SPA ha surgido como una técnica fundamental para resolver las arquitecturas tridimensionales (3D) de macromoléculas biológicas, abarcando tres etapas computacionales interdependientes: adquisición de datos, reconstrucción 3D y construcción de modelos atómicos (Figura 1).

Durante la adquisición de datos, se capturan muestras vitrificadas bajo condiciones de baja dosis para generar películas micrográficas, capturando miles de proyecciones de partículas en estados cercanos a los nativos. Estos conjuntos de datos en bruto se procesan posteriormente mediante algoritmos iterativos de alineación y clasificación para reconstruir mapas de densidad volumétrica. Finalmente, se construyen y refinan modelos atómicos para ajustarse a la densidad, elucidando interacciones moleculares a una resolución cercana a la atómica.

El análisis anterior demuestra que la salida de crio-EM representa simplemente el punto de partida de la tubería estructural. Transformar estos datos en bruto en modelos atómicos interpretables requiere una cascada de herramientas informáticas especializadas. Así, el software actúa como el puente crítico que transforma los datos en bruto en modelos atómicos.

Ecosistema fragmentado de software crio-EM: herramientas actuales y limitaciones. Los flujos de trabajo crio-EM modernos se basan en un mosaico de herramientas de software especializadas, cada una abordando etapas discretas:

Adquisición de datos. Aunque numerosos paquetes de software para adquisición de datos crio-EM están disponibles públicamente—incluyendo Leginon ^4,5, SerialEM⁶, UCSFImage4⁷, TFS EPU ^8,9, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰ y ^{Auto-EMation 11}—estas herramientas producen principalmente datos de película en bruto con capacidades limitadas de procesamiento post-adquisición. Pasos críticos del flujo de trabajo, como la configuración de parámetros y la personalización de plantillas, siguen exigiendo operaciones manuales intensivas en mano de obra, a menudo requiriendo demasiados parámetros por conjunto de datos. Esta dependencia de la intervención de expertos introduce desafíos de reproducibilidad e ineficiencias en los flujos de trabajo, especialmente en escenarios de alto rendimiento.

Reconstrucción 3D. la crio-EM ha experimentado avances significativos en el software de reconstrucción 3D, permitiendo una resolución casi atómica de macromoléculas biológicas. Entre las herramientas más utilizadas se encuentran RELION, cryoSPARC y EMAN2, cada una con ventajas y limitaciones distintas. RELION emplea un enfoque bayesiano para el refinamiento iterativo, destacando en el manejo de conjuntos de datos heterogéneos y logrando reconstrucciones de alta^{resolución 12}. Sin embargo, su intensidad computacional y su curva de aprendizaje pronunciada a menudo requieren la intervención de un experto. cryoSPARC, que aprovecha la aceleración de GPU y el deep learning, reduce significativamente el tiempo de procesamiento y es fácil de usar¹³. EMAN2 ofrece un conjunto completo para el picking de partículas y la reconstrucción 3D, pero requiere un ajuste manual extenso y carece de capacidades de retroalimentación en^{tiempo real 14}. Aunque estas herramientas destacan en aspectos específicos de la reconstrucción 3D, permanecen limitadas a funcionalidades singulares, careciendo de integración con la adquisición de datos ascendentes o la modelización atómica posterior. Por ejemplo, RELION y cryoSPARC requieren transferencia manual de datos desde software de control de microscopio, lo que introduce ineficiencias y posibles errores. Además, ninguna de estas herramientas proporciona una evaluación de calidad en tiempo real durante la recogida de datos ni una transición fluida a la construcción del modelo atómico, lo que resulta en flujos de trabajo fragmentados que dificultan el rendimiento y la reproducibilidad.

La etapa computacional final en la determinación estructural basada en crio-EM es la construcción de modelos atómicos, donde las coordenadas moleculares se ajustan iterativamente en mapas de densidad reconstruidos para elucidar interacciones a nivel atómico.

Aunque los enfoques convencionales de construcción de modelos emplean algoritmos de minimización de energía basados en física —incorporando potenciales electrostáticos, interacciones de van der Waals y restricciones de geometría de enlaces covalentes— siguen dependiendo en gran medida de la intervención manual para la colocación inicial del modelo, la interpretación de densidad y la validación estereoquímica 15,16,17,18 . Esta dependencia de la curación experta no solo limita el rendimiento sino que también introduce sesgos subjetivos, especialmente en regímenes de baja resolución (< 4 Å) donde las características de densidad son ambiguas.

Para superar estas limitaciones, las metodologías basadas en aprendizaje profundo (DL) han surgido como soluciones transformadoras, aprovechando redes neuronales para automatizar la extracción de características, la inicialización y el refinamiento de modelos. Estos enfoques demuestran un mejor rendimiento en el manejo de mapas de densidad ruidosos o incompletos, al tiempo que reducen significativamente la intervención manual, como lo demuestran recientes benchmarks que muestran reducciones del 40–60% en los pasos dependientes del usuario en comparación con las tuberías^{convencionales} 19,20,21,22.

Sin embargo, estos métodos requieren invariablemente exportar mapas de densidad desde software de reconstrucción 3D e importarlos a sistemas de construcción de modelos. Antes de la importación, pueden ser necesarios pasos adicionales de preprocesamiento—a menudo involucrando herramientas de terceros—para optimizar los mapas de densidad. Este flujo de trabajo fragmentado requiere transferencias repetitivas de datos y conversiones de formatos, lo que genera ineficiencias. Además, si los resultados iniciales de construcción del modelo no son satisfactorios, los investigadores deben volver a la fase de reconstrucción para su recálculo, seguida de otra ronda de construcción y validación del modelo. Estos ciclos iterativos dificultan significativamente el rendimiento y la eficiencia operativa de las tuberías de determinación estructural crio-EM.

1.3 SMART: Una solución integrada para crio-EM de extremo a extremo

A pesar de los avances significativos en la crio-EM SPA, la falta de soluciones computacionales totalmente integradas sigue obstaculizando su potencial para la biología estructural de alto rendimiento. Los paquetes de software existentes, aunque destacan en la automatización de componentes aislados de flujos de trabajo —como la adquisición de datos o la reconstrucción 3D— no logran salvar brechas críticas entre la recogida de micrografías en bruto, el refinamiento de mapas de densidad y la construcción de modelos atómicos. Esta fragmentación requiere transferencia manual de datos, conversiones de formatos y ajustes redundantes de parámetros, lo que resulta en ineficiencias que se agravan con la escala del conjunto de datos.

Para abordar estas limitaciones, presentamos la Plataforma Integrada de Flujo de Trabajo Crio-EM, una plataforma computacional integrada que unifica toda la cadena CRYO-EM SPA en un flujo de trabajo cohesivo impulsado por IA. La plataforma integrada integra tres módulos principales: DataSmart (adquisición automatizada de datos), CryoSmart (reconstrucción 3D habilitada por redes neuronales híbridas) y ModelSmart (modelado atómico basado en aprendizaje profundo).

Los tres módulos computacionales de la plataforma están interconectados mediante un flujo de datos estandarizado, lo que permite un flujo de datos optimizado donde la salida de un módulo puede informar ajustes de parámetros en los pasos de procesamiento posteriores. Esta integración pretende reducir el número de pasos manuales y transferencias de datos requeridos en los flujos de trabajo convencionales de crio-EM, mejorando potencialmente la accesibilidad y la eficiencia de los laboratorios de biología estructural.

Protocolo

La línea celular Expi293F utilizada para la expresión de proteínas de la proteína TRPML1 humana fue adquirida a Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd (Número de catálogo: SC0236058). La identidad de la línea celular se autenticó correctamente mediante el perfilado Short Tandem Repeat (STR) (Archivo Suplementario 1).

Declaración Ética
Este estudio no involucró participantes humanos, animales ni muestras obtenidas directamente de humanos o animales. La proteína TRPML1 humana se produjo por expresión recombinante y se purificó in vitro. La línea celular Expi293F utilizada para la expresión de proteínas recombinantes es una línea celular inmortalizada e establecida disponible comercialmente. En consecuencia, no se requería la aprobación ética institucional ni el consentimiento informado por escrito.

NOTA: La plataforma integrada de flujo de trabajo crio-EM está estructurada en tres módulos principales: un módulo automatizado de adquisición de datos, un módulo de reconstrucción 3D habilitado por redes neuronales híbridas y un módulo de modelado atómico basado en aprendizaje profundo, con los datos sirviendo como interfaz de comunicación entre estos componentes de software, como se ilustra en la Figura 2. El sistema integrado de plataforma de flujo de trabajo crio-EM adopta una arquitectura Navegador-Servidor (B/S), que permite a los usuarios realizar todas las operaciones a través de una interfaz web, asegurando así la usabilidad y accesibilidad operativa.

1. Adquisición automatizada de datos

NOTA: La plataforma integrada de flujo de trabajo crio-EM consta de tres módulos principales: un módulo automatizado de adquisición de datos, un módulo de reconstrucción 3D habilitado por redes neuronales híbridas y un módulo de modelado atómico basado en aprendizaje profundo. Los datos sirven como interfaz de comunicación entre estos componentes de software (Figura 2). El sistema utiliza una arquitectura Navegador-Servidor (B/S) que permite todas las operaciones a través de una interfaz web.

1. Inicialización del proyecto
   1. Crea un nuevo proyecto en una plataforma automatizada de módulos de adquisición de datos.
   2. Selecciona la opción para heredar la configuración de un proyecto reciente, si lo deseas. Reutiliza los parámetros heredados para la configuración del microscopio electrónico en lugar de crear una nueva configuración.
2. Inspección de desplazamiento de viga
   NOTA: Realizar ajustes de desplazamiento de haz dentro del software de control del microscopio electrónico de transmisión (TEM).
   1. Comprobación de bajo aumento (Atlas y GridSquare)
      1. Abre el módulo de Filtrado . Obtén imágenes con las ampliaciones Atlas y GridSquare.
      2. Verifica que las imágenes estén correctamente iluminadas y libres de desplazamiento del haz. Asegúrate de que el centro de imagen no esté situado sobre las barras de la cuadrícula.
   2. Comprobación de ampliación de adquisición de datos
      1. Adquiere imágenes con la ampliación de adquisición de datos (por ejemplo, 60K o 100K). Evalúa la alineación de la viga.
      2. Corrija el desplazamiento del haz antes de proceder si la adquisición de imagen falla o se observa un desplazamiento significativo del haz.
   3. Comprobación de aumento eucéntrico de agujeros
      1. Toma imágenes con el agujero/aumento eucéntrico (normalmente 8K). Ajusta el desplazamiento del haz hasta que el punto de iluminación esté centrado si el haz no está centrado.
      2. No modifiques la posición del diafragma. Verifica que el tamaño de apertura coincida con el utilizado durante la adquisición de datos.
3. Ajuste de altura Z
   1. Auto-eucéntrico Ajuste
      1. Ve a la página de Filtrado . Mueve el escenario a una zona limpia de película de carbono con la ampliación de agujero/altura eucéntrica. Abre el módulo Auto-Eucéntrico en la página de AutoFunción .
      2. Haz clic en Iniciar. Vigila el panel de registros para recibir retroalimentación. Muévete a otra zona y repite el procedimiento si la operación falla.
   2. Ajuste de enfoque automático
      1. Abre el módulo AutoFocus en la página de AutoFunción . Haz clic en Iniciar.
      2. Revisa los mensajes del registro. Ajusta los parámetros según lo indicado o repite la Sección 1.3.1 si falla el enfoque automático.
4. Comprobación de alineación de aumento
   1. Inspección de alineación
      1. Localiza una característica distintiva en la ampliación de datos y toma una imagen. Obtén una imagen con la ampliación de Agujero/Altura Eucéntrica.
      2. Compara las regiones centrales de ambas imágenes. Procede a la calibración si se observa un desalineamiento entre las ampliaciones de Datos y de Huecos.
      3. Inspecciona la alineación entre las ampliaciones de Agujero y Cuadrícula si las aumentaciones de Datos y Agujero están alineadas. Proceder sin calibración si todos los niveles de aumento están alineados.
   2. Calibración por desplazamiento de ampliación
      1. Ve a la página de Calibración . Abre el módulo de Cambio de Ampliación . Comienza con el aumento de datos o el aumento más bajo desalineado.
      2. Adquiere una imagen de gran aumento que contenga una característica específica. Adquiere una imagen correspondiente de bajo aumento. Evalúa el desplazamiento entre las dos imágenes.
      3. Haz clic derecho en la ubicación correspondiente al centro de la característica en la imagen de bajo aumento. Selecciona mover aquí. Recupera la imagen de alta ampliación y comprueba la alineación.
      4. Repite el ajuste si es necesario. Haz clic en Siguiente para pasar al siguiente par de aumento una vez logrado la alineación. Repite el procedimiento de calibración para todos los pares de aumento desalineados restantes.
5. Preparación para la recopilación de datos
   1. Realiza adquisición de atlas, selección de cuadrados, imagen de cuadrados y selección de huecos
      1. Abre el módulo de Atlas . Deja el campo de fichas en blanco para conseguir las 81 fichas, o introduce el número deseado de fichas para conseguir.
      2. Navega a la interfaz de Selección de Casillas . Haz clic derecho para seleccionar los cuadrados adecuados.
      3. Navega a la página de Selección de Agujeros . Haz clic en Preparar todo. Monitoriza la ventana de registro hasta que se complete la adquisición de la imagen.
      4. Selecciona una imagen cuadrada capturada de la lista de imágenes. Utiliza la función de Buscar agujeros para realizar la selección automática de agujeros cuando los agujeros son claramente visibles.
         PRECAUCIÓN: La detección automática de agujeros puede fallar en rejillas con hielo denso o contaminación superficial. Verifica visualmente los agujeros detectados antes de la adquisición y utiliza el método semi-automatizado de selección de agujeros cuando la detección automática no sea fiable.
      5. Utiliza la función de Selección Basada en Semillas cuando el hielo espeso o la contaminación impiden una selección automática fiable (Figura 3).
         1. Elige un agujero central. Selecciona dos agujeros adyacentes que formen un ángulo recto.
         2. Selecciona dos agujeros distantes a lo largo de las direcciones definidas por el segundo y tercer agujero.
         3. Haz clic en Enviar. Activa Mover Todo al procesar otra casilla. Arrastra uno de los cinco agujeros de semilla hasta un agujero despejado. Haz clic en Enviar.
   2. Definición de plantilla
      1. Ve a la página de Definición de Plantilla . Haz clic en Adquirir para obtener una imagen. Verifica que la imagen contenga un agujero completo.
      2. Haz clic derecho en el área objetivo y selecciona MoveStageTo si no se ve un agujero completo. Recupera la imagen de la plantilla. Especifica la posición de imagen y la ubicación del enfoque automático arrastrando los marcadores correspondientes.
      3. Introduce el número de fotogramas por agujero. Introduce el valor deseado de desenfoque (por ejemplo, −1,5 μm). Verificar todos los parámetros de adquisición (Figura 4).
6. Revisión del cambio de haz
   1. Repita la Sección 1.2 tras completar todos los procedimientos de preparación.
7. Astigmatismo y corrección del coma
   1. Corrección por astigmatismo
      1. Mueve el escenario a una zona limpia de película de carbón. Ajusta la altura usando AutoFocus al valor de desenfoque deseado (por ejemplo, −1,5 μm). Abre el módulo Autostigmate en la página de AutoFunción .
      2. Haz clic en Iniciar. Monitoriza la salida de Ctffind en el panel de logs. Revisa el astigmatismo y los valores de ajuste a la resolución. Repite el procedimiento en otra zona si el astigmatismo sigue alto.
   2. Corrección de coma
      1. Abre el módulo de Autocoma si los resultados de Autostigmate siguen siendo subóptimos tras varios intentos. Haz clic en Iniciar.
8. Recogida automatizada de datos
   1. Navega a la página de AutoRecogida . Haz clic en Iniciar. Permite que el sistema realice automáticamente las calibraciones de AutoEmisión y AutoZLP .
   2. Adquiere datos utilizando los parámetros definidos en los ajustes de Filtrado, Adquisición de Datos y Preparación. Monitoriza el proceso automatizado de recogida (Figura 5).
      PUNTO DE PAUSA: Una vez completada la recogida de datos, las pilas de películas adquiridas pueden almacenarse y el protocolo reanudarse en la etapa de procesamiento de imagen en un momento posterior sin afectar los resultados posteriores.
9. Monitorización remota instantánea
   1. Monitoriza el progreso de la recogida utilizando el módulo de monitorización remota. Revisa los resultados de corrección de movimiento en tiempo real generados con MotionCor2²³. Revisa las mediciones en tiempo real de astigmatismo y desenfoque.
   2. Comparte la URL de monitorización con los usuarios autorizados. Accede al estado de la recopilación y a la información sobre la calidad de los datos desde un ordenador o dispositivo móvil. Revisa un ejemplo de funcionalidad de monitorización remota en la Figura 6.

2. Reconstrucción tridimensional

NOTA: Utiliza un módulo de reconstrucción 3D para realizar reconstrucciones tridimensionales a partir de conjuntos de datos de imágenes previamente adquiridos. El flujo de trabajo incluye creación de proyectos, importación de micrografías, estimación de funciones de transferencia de contraste (CTF), selección de partículas, extracción de partículas, clasificación 2D, generación inicial de modelos y refinamiento 3D (Figura 7).

1. Creación del Proyecto
   1. Accede a la página principal del módulo de reconstrucción 3D. Haz clic en Proyectos para abrir la página de gestión de proyectos. Haz clic en NUEVO PROYECTO.
   2. Introduce el nombre del proyecto y especifica la ubicación de almacenamiento. Haz clic en CREAR PROYECTO. Haz clic en Abrir junto al proyecto recién creado. Haz clic en NUEVO experimento para crear un nuevo experimento.
      NOTA: Un proyecto representa una sesión global de procesamiento de datos, mientras que un experimento representa un flujo de trabajo individual dentro de un proyecto. Se pueden crear múltiples experimentos dentro de un mismo proyecto.
2. Archivos de importación
   1. Haz clic en Nuevo trabajo. Selecciona Importar y haz clic en Crear. Selecciona el tipo de archivo adecuado. Importa los archivos .mrc generados durante la adquisición de datos. Entra el tamaño de píxel, el voltaje de aceleración y el número de CPUs. Haz clic en Trabajo en cola.
      NOTA: Para terminar una tarea en ejecución, haz clic en Matar y luego en Borrar para devolver la tarea al estado del Edificio. Para trabajos completados o en cola, haz clic en Borrar para restablecer el estado del trabajo.
3. Estimación del CTF
   1. Haz clic en Nuevo trabajo. Selecciona Estimación CTF y haz clic en Crear.
      NOTA: El módulo de reconstrucción 3D soporta múltiples algoritmos de estimación de CTF. Este protocolo utiliza CTFFIND4.
   2. Haz clic en el botón Conectar para Exposiciones. Selecciona las micrografías importadas. Ajusta el contraste de amplitud a 0,1, resolución mínima de ajuste a 30 Å. Resolución máxima de ajuste a 4 Å, valor mínimo de búsqueda de desenfoque a 5.000 Å, valor máximo de búsqueda de desenfoque a 50.000 Å y tamaño de paso de búsqueda de desenfoque a 500 Å.
   3. Haz clic en Trabajo en cola.
4. Selección manual de partículas
   1. Haz clic en Nuevo trabajo. Selecciona Selección de partículas y luego selecciona Selector de Blobs. Haz clic en Crear. Haz clic en el botón Conectar para Micrografías (Exposiciones).
   2. Selecciona las micrografías importadas. Introduce los parámetros requeridos. Haz clic en Trabajo en cola. Inspecciona 3–4 micrografías representativas. Selecciona partículas usando el botón izquierdo del ratón.
   3. Desseleccionar partículas usando el botón derecho del ratón. Determinar el rango de diámetros de partículas a partir de las partículas seleccionadas. ¡Haz clic para terminar de elegir! Extraer partículas.
      NOTA: Mide partículas a partir de al menos tres micrografías.
5. Selector de blobs
   1. Haz clic en Nuevo trabajo. Selecciona Selección de partículas y luego selecciona Selector de Blobs. Haz clic en Crear. Conecta la entrada de Micrografías (Exposiciones).
   2. Selecciona las micrografías importadas. Introduce los parámetros requeridos. Haz clic en Trabajo en cola.
6. Inspeccionar Selecciones de Partículas
   1. Haz clic en Nuevo trabajo. Selecciona Inspeccionar Selecciones de partículas. Haz clic en Crear. Conecta la entrada de Micrografías (Exposiciones). Conecta las partículas de entrada.
   2. Selecciona los archivos correspondientes. Introduce los parámetros requeridos. Haz clic en Trabajo en cola. Inspecciona 3–4 imágenes representativas tras finalizar el trabajo.
   3. Verifica la selección correcta de partículas. ¡Haz clic para terminar de elegir! Ubicaciones de salida.
7. Extraer partículas de micrografías
   1. Haz clic en Nuevo trabajo. Seleccione extraer de micrografías. Haz clic en Crear. Conecta la entrada de Micrografías (Exposiciones). Conecta las partículas de entrada. Selecciona los archivos correspondientes.
   2. Ajusta el tamaño de la caja de extracción a 2–3 veces el diámetro de la partícula. Usa un tamaño de caja de extracción de 400 píxeles para TRPML1. Establece el tamaño del cultivo de Fourier a un cuarto a la mitad del tamaño de la caja de extracción.
   3. Usa un tamaño de recorte de Fourier de 100 píxeles para TRPML1. Haz clic en Trabajo en cola.
      NOTA: Reducir el tamaño del cultivo de Fourier disminuye la demanda computacional de la GPU.
8. Clasificación bidimensional
   1. Haz clic en Nuevo trabajo. Selecciona Clasificación 2D. Haz clic en Crear. Conecta las partículas de entrada.
   2. Importa la pila de partículas. Introduce los parámetros requeridos. Haz clic en Trabajo en cola.
      NOTA: Selecciona entre 50 y 200 clases. Usa menos clases para conjuntos de datos pequeños y más clases para conjuntos de datos más grandes.
9. Selecciona clases bidimensionales
   1. Haz clic en Nuevo trabajo. Selecciona Clases 2D seleccionadas. Haz clic en Crear. Conecta las partículas de entrada. Conecta la entrada de Plantillas.
   2. Importa los archivos necesarios. Haz clic en Trabajo en cola. Espera hasta que el trabajo entre en estado de espera. Haz clic en Esperando.
   3. Selecciona clases 2D claras y bien definidas. Haz clic en Hecho.
10. Generación inicial de modelos
    1. Haz clic en Nuevo trabajo. Selecciona Reconstrucción de Abinit. Conecta las partículas de entrada. Importa las partículas seleccionadas.
    2. Introduce el número de clases iniciales. Introduce el parámetro de simetría. Haz clic en Trabajo en cola.
11. Refinamiento heterogéneo
    NOTA: Utilice refinamiento heterogéneo para muestras heterogéneas y refinamiento homogéneo para muestras homogéneas.
    1. Haz clic en Nuevo trabajo. Crea un trabajo de refinamiento heterogéneo. Conecta las partículas de entrada. Conecta la entrada de volumen.
    2. Selecciona los archivos correspondientes. Introducen los parámetros de refinamiento. Especificar la simetría adecuada (por ejemplo, C1). Haz clic en Trabajo en cola.
12. Refinamiento homogéneo
    1. Haz clic en Nuevo trabajo. Crea un trabajo de refinamiento homogéneo. Conecta las partículas de entrada. Conecta la entrada de volumen.
    2. Opcionalmente, conecta la entrada de la máscara. Importa la pila de partículas y la clase de volumen con mejor rendimiento del paso de refinamiento anterior. Introduce los parámetros requeridos.
    3. Especifica la simetría adecuada (por ejemplo, O o C1). Haz clic en Trabajo en cola. Haz clic en Salida tras completar el trabajo. Inspeccione el mapa de densidad reconstruido en la interfaz del navegador (Figura 8).
13. Mejora del mapa
    NOTA: El Potenciador de Mapas utiliza DeepEMhancer²⁴. Usa los mapas a medias siempre que sea posible. Las modificaciones postraduccionales y las moléculas de ligando no se incluyeron en el conjunto de entrenamiento de DeepEMhancer y pueden no mejorarse con precisión. Map Enhancer realiza nitidez local, enmascaramiento automatizado y reducción de ruido.
    1. Haz clic en Nuevo trabajo. Crea un trabajo de Potenciador de Mapas. Importa el volumen generado durante el refinamiento homogéneo.
    2. Importa la máscara correspondiente. Importa archivos de mapas a través de la opción Ruta de Datos del Mapa si es necesario. Ejecuta el trabajo.

3. Un modelado atómico basado en aprendizaje profundo

NOTA: Un módulo de modelado atómico basado en aprendizaje profundo se basa en el marco^{SMARTFold 25} desarrollado previamente y soporta la construcción de modelos atómicos para proteínas y ácidos nucleicos (ARN/ADN) a partir de mapas de densidad crio-EM.

1. Lanzar un módulo de modelado atómico basado en aprendizaje profundo
   1. Inicia sesión en un sistema de módulos de modelado atómico basado en aprendizaje profundo. Abre la interfaz de envío de tareas. Sube el mapa de densidad crio-EM en el panel izquierdo.
   2. Introduce los parámetros de entrada requeridos. Entrega la tarea de modelado.
2. Sube el mapa de densidad crio-electromagnético
   1. Sube el mapa de densidad en formato .mrc, .ccp4 o .map. Verifica que el tamaño del archivo sea inferior a 100 MB.
      NOTA: Si el mapa de densidad supera los 100 MB, reduce el tamaño del archivo antes de subirlo.
      1. Recorta el mapa de densidad a la región de interés usando UCSF ChimeraX²⁶ con el comando: zona de volumen. Remuestreo del mapa a un tamaño de píxel mayor.
      2. Aplica una mascarilla suave para eliminar las zonas del disolvente.
         NOTA: Inspeccione el mapa de densidad antes de subirlo para asegurar un rendimiento óptimo del modelo y reducir el riesgo de errores de procesamiento.
3. Inspeccionar y preparar el mapa de densidad
   1. Realiza el recorte de mapas de densidad. Para este cultivo, el mapa de densidad elimina regiones innecesarias. Verifica que el mapa recortado contenga solo la región requerida para la construcción de modelos.
      NOTA: El recorte reduce el tamaño del archivo y ayuda a evitar el desbordamiento de memoria durante la generación del modelo.
   2. Luego comprueba si hay inversión de espejo. Inspecciona el mapa de densidad para detectar posibles inversiones espejadas. Examina las regiones α-helicoidales dentro del mapa. Verifica que las hélices α presenten una configuración diestra y espiralen hacia arriba en sentido antihorario. Inverte el mapa de densidad si se detecta una estructura espejada.
4. Sube el archivo de secuencia
   1. Sube el archivo de secuencia correspondiente. Alternativamente, introduce la secuencia manualmente. Proporciona todas las secuencias de proteínas o ácidos nucleicos incluidas en la reconstrucción.
   2. Especificar información de secuencias heteroméricas u homoméricas cuando sea aplicable. Introduce el nombre de la proteína, si lo deseas (paso opcional).
5. Especifica la resolución del mapa. Introduce la resolución reportada del mapa de densidad crio-EM. Selecciona la partición de cómputo. Seleccione el nodo de computación de la GPU que se usará para la generación de modelos.
6. Para especificar los Recursos de CPU, introduzca el número de CPUs a asignar. No superes los ocho procesadores. Revisa todos los archivos y parámetros subidos. Haz clic en ENVIAR para iniciar la generación del modelo.
7. Inspeccionar el modelo atómico predicho
   1. Abre la ventana de visualización interactiva tras completar el trabajo. Gira el modelo para inspeccionar las características estructurales. Haz zoom para examinar detalles estructurales locales y globales.
   2. Inspecciona el modelo desde múltiples orientaciones. Evalúa la calidad del modelo, la conformación espacial y las características a nivel atómico. Utiliza el modelo generado para análisis y validación aguas abajo.
   3. Consulte la Figura 9 para un ejemplo de la interfaz de visualización.

Resultados

TRPML1, también conocido como mucolilina-1 (MCOLN1), es un canal catiónico lisosomal esencial para mantener la homeostasis iónica, regular el tráfico vesicular y apoyar la autofagia en células de^{mamíferos 27,28}. La disfunción de TRPML1 debida a mutaciones genéticas se ha relacionado directamente con la mucolipidosis tipo IV, un grave trastorno neurodegenerativo de almacenamiento lisosomal caracterizado por un desarrollo neuronormal anormal, degeneración retiniana...

Discusión

La determinación estructural de macromoléculas biológicas mediante criomicroscopía electrónica (crio-EM) implica inherentemente un flujo de trabajo prolongado y de varias etapas que requiere una estrecha integración de herramientas computacionales y la dependencia de la intervención de expertos. La plataforma integrada aborda este desafío unificando la adquisición de datos, la reconstrucción 3D y el modelado atómico en un único marco verticalmente integrado, un paso hacia flujos de traba...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Módulo de reconstrucción 3D de la plataforma SMART; habilitado para red neuronal híbrida
Microscopio de cryo-electrón	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	Utilizado para la adquisición de datos; equipado con filtro de energía
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Módulo de adquisición de datos automatizada de la plataforma SMART
DeepEMhancer	Código abierto	V0.17	Post-procesamiento de volumen cryo-EM basado en aprendizaje profundo; integrado dentro de CryoSmart Map Enhancer
Detector de electrones directo	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	Cámara utilizada para la grabación de películas
Rejilla	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Rejilla de muestra cryo-EM
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Módulo de modelado atómico basado en aprendizaje profundo de la plataforma SMART; extiende el marco SMARTFold
Plataforma SMART	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Plataforma cryo-EM integrada; arquitectura Browser-Server (B/S); incluye los módulos DataSmart, CryoSmart y ModelSmart
Software de control TEM	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	Software de control de microscopio electrónico para ajuste del cambio de haz
Topaz	Código abierto	V 2.5	Herramienta de selección de partículas basada en aprendizaje profundo; integrado como complemento dentro de CryoSmart
Muestra de proteína TRPML1	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	TRPML1 humano (mucolipidosis-1); preparado internamente por el Departamento de Proteína y Cristalografía
Dispositivo de vitrificación	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Para la preparación de muestras cryo-EM
UCSF Chimera X	UCSF, EE. UU.	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Software de propósito general para visualización, análisis y más
SMART (Tecnología de Reconstrucción Automatizada Shuimu)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Plataforma de flujo de trabajo cryo-EM integrada
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Marco de aprendizaje profundo subyacente a ModelSmart
Leginon	Recurso Nacional para Microscopía Molecular Automatizada (NRAMM)	RRID:SCR_016731	Software automatizado de adquisición de datos cryo-EM
SerialEM	Universidad de Colorado	RRID:SCR_017293	Software automatizado de adquisición TEM/cryo-EM
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	Software automatizado de recopilación de datos cryo-EM
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	Adquisición cryo-EM automatizada de múltiples cuadrículas
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	Software de adquisición de microscopía electrónica
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	Sistema automatizado de adquisición cryo-EM
Auto-EMation	Universidad de Tsinghua	N/A	Software automatizado de adquisición cryo-EM
RELION	Laboratorio MRC de Biología Molecular	RRID:SCR_016274	Software de reconstrucción cryo-EM bayesiana
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Procesamiento de imágenes y reconstrucción cryo-EM
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Suite de procesamiento de imágenes cryo-EM
CTFFIND4	Laboratorio MRC de Biología Molecular	RRID:SCR_016732	Software de estimación CTF
Gctf	Laboratorio MRC de Biología Molecular	RRID:SCR_016500	Estimación CTF acelerada por GPU
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	Software de corrección de movimiento
DeepEMhancer	Centro Nacional Español para la Biotecnología (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	Mejora de mapas cryo-EM basada en aprendizaje profundo
Topaz	Universidad de California Berkeley	RRID:SCR_018037	Selección de partículas basada en aprendizaje profundo
UCSF ChimeraX	Universidad de California San Francisco	RRID:SCR_015872	Software de visualización molecular
CTFFIND4	Laboratorio Grigorieff	RRID:SCR_016732	Ajuste CTF utilizado en el flujo de trabajo CryoSmart
EMDB-8840	Banco de Datos de Microscopía Electrónica	Accesion: EMD-8840	Mapa de referencia TRPML1 humano
EMPIAR-10204	Archivo de Imágenes Públicas de Microscopía Electrónica	Accesion: EMPIAR-10204	Conjunto de datos de referencia de β-galactosidasa
Microscopio de Transmisión de Electrones (TEM)	No especificado	N/A	Utilizado para la adquisición de datos cryo-EM
Microscopio Electrónico Tecnai de FEI	FEI (ahora Thermo Fisher Scientific)	No especificado	Mencionado en el flujo de trabajo citado
Filtro de Energía	No especificado	N/A	Utilizado durante la recopilación automatizada
Nodo de Computación GPU	No especificado	N/A	Utilizado para cálculos ModelSmart