SMART (Tecnología de Reconstrucción Automatizada Shuimu): Una plataforma computacional integrada para agilizar el flujo de trabajo de criomicroscopía electrónica

Resumen

Este protocolo demuestra un flujo de trabajo de criomicroscopía electrónica paso a paso utilizando una plataforma de software integrada (SMART) que conecta adquisición de datos, reconstrucción tridimensional y construcción de modelos atómicos en una única interfaz basada en navegador. Como ejemplo representativo, la estructura humana TRPML1 se determina a una resolución de 2,38 Å.

Resumen

La criomicroscopía electrónica (crio-EM) se ha convertido en una herramienta central en biología estructural, pero los flujos de trabajo actuales suelen requerir múltiples paquetes de software especializados para la adquisición de datos, la reconstrucción tridimensional (3D) y la construcción de modelos atómicos, lo que conduce a tuberías fragmentadas y a frecuentes intervenciones manuales. Aquí presentamos SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology), una plataforma de software integrada que combina tres módulos: DataSmart para la recogida automatizada de datos, CryoSmart para el procesamiento de imágenes y reconstrucción 3D, y ModelSmart para la construcción de modelos atómicos basados en aprendizaje profundo, dentro de una interfaz unificada accesible por navegador. Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para operar los tres módulos. El flujo de trabajo abarca navegación automatizada de muestras y adquisición de datos, corrección de movimiento, estimación de funciones de transferencia de contraste (CTF), selección de partículas, clasificación bidimensional (2D), refinamiento 3D, mejora cartográfica y generación de modelos atómicos. Como ejemplo representativo, aplicamos el flujo de trabajo completo para determinar la estructura de TRPML1 humano, un canal catiónico lisosomal permeable a Ca²⁺, logrando una resolución global de 2,38 Å mediante correlación de conchas de Fourier (FSC) de estándar oro en el criterio de 0,143. Los tres módulos (DataSmart, CryoSmart y ModelSmart) se aplicaron secuencialmente al mismo conjunto de datos TRPML1 dentro de este estudio. El protocolo está diseñado para ser accesible a usuarios con distintos niveles de experiencia en crio-EM.

Introducción

Microscopía crioelectrónica: evolución tecnológica e impacto biológico. La determinación de la estructura tridimensional de proteínas sigue siendo un desafío central en biología molecular, ya que la función biológica está intrincadamente ligada a la disposición espacial de los residuos de aminoácidos. Esclarecer estas configuraciones estructurales es imprescindible para descifrar mecanismos enzimáticos, interacciones con ligandos y vías de señalización celular a resolución atómica. Este imperativo ha impulsado desarrollos transformadores en crio-EM, que se ha convertido en una técnica de biología estructural ampliamente

Protocolo

La línea celular Expi293F utilizada para la expresión de proteínas de la proteína TRPML1 humana fue adquirida a Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd (Número de catálogo: SC0236058). La identidad de la línea celular se autenticó correctamente mediante el perfilado Short Tandem Repeat (STR) (Archivo Suplementario 1).

Declaración Ética
Este estudio no involucró participantes humanos, animales ni muestras obtenidas directamente de humanos o animales. La proteína TRPML1 humana se produjo por expresión recombinante y se purificó in vitro. La línea celular Expi293F uti....

Resultados

TRPML1, también conocido como mucolilina-1 (MCOLN1), es un canal catiónico lisosomal esencial para mantener la homeostasis iónica, regular el tráfico vesicular y apoyar la autofagia en células de^{mamíferos 27,28}. La disfunción de TRPML1 debida a mutaciones genéticas se ha relacionado directamente con la mucolipidosis tipo IV, un grave trastorno neurodegenerativo de almacenamiento lisosomal caracterizado por un desarrollo neuronormal anormal, degeneración retiniana.......

Discusión

La determinación estructural de macromoléculas biológicas mediante criomicroscopía electrónica (crio-EM) implica inherentemente un flujo de trabajo prolongado y de varias etapas que requiere una estrecha integración de herramientas computacionales y la dependencia de la intervención de expertos. La plataforma integrada aborda este desafío unificando la adquisición de datos, la reconstrucción 3D y el modelado atómico en un único marco verticalmente integrado, un paso hacia flujos de traba.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Módulo de reconstrucción 3D de la plataforma SMART; habilitado para red neuronal híbrida
Microscopio de cryo-electrón	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	Utilizado para la adquisición de datos; equipado con filtro de energía
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Módulo de adquisición de datos automatizada de la plataforma SMART
DeepEMhancer	Código abierto	V0.17	Post-procesamiento de volumen cryo-EM basado en aprendizaje profundo; integrado dentro de CryoSmart Map Enhancer
Detector de electrones directo	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	Cámara utilizada para la grabación de películas
Rejilla	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Rejilla de muestra cryo-EM
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Módulo de modelado atómico basado en aprendizaje profundo de la plataforma SMART; extiende el marco SMARTFold
Plataforma SMART	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Plataforma cryo-EM integrada; arquitectura Browser-Server (B/S); incluye los módulos DataSmart, CryoSmart y ModelSmart
Software de control TEM	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	Software de control de microscopio electrónico para ajuste del cambio de haz
Topaz	Código abierto	V 2.5	Herramienta de selección de partículas basada en aprendizaje profundo; integrado como complemento dentro de CryoSmart
Muestra de proteína TRPML1	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	TRPML1 humano (mucolipidosis-1); preparado internamente por el Departamento de Proteína y Cristalografía
Dispositivo de vitrificación	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Para la preparación de muestras cryo-EM
UCSF Chimera X	UCSF, EE. UU.	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Software de propósito general para visualización, análisis y más
SMART (Tecnología de Reconstrucción Automatizada Shuimu)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Plataforma de flujo de trabajo cryo-EM integrada
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Marco de aprendizaje profundo subyacente a ModelSmart
Leginon	Recurso Nacional para Microscopía Molecular Automatizada (NRAMM)	RRID:SCR_016731	Software automatizado de adquisición de datos cryo-EM
SerialEM	Universidad de Colorado	RRID:SCR_017293	Software automatizado de adquisición TEM/cryo-EM
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	Software automatizado de recopilación de datos cryo-EM
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	Adquisición cryo-EM automatizada de múltiples cuadrículas
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	Software de adquisición de microscopía electrónica
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	Sistema automatizado de adquisición cryo-EM
Auto-EMation	Universidad de Tsinghua	N/A	Software automatizado de adquisición cryo-EM
RELION	Laboratorio MRC de Biología Molecular	RRID:SCR_016274	Software de reconstrucción cryo-EM bayesiana
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Procesamiento de imágenes y reconstrucción cryo-EM
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Suite de procesamiento de imágenes cryo-EM
CTFFIND4	Laboratorio MRC de Biología Molecular	RRID:SCR_016732	Software de estimación CTF
Gctf	Laboratorio MRC de Biología Molecular	RRID:SCR_016500	Estimación CTF acelerada por GPU
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	Software de corrección de movimiento
DeepEMhancer	Centro Nacional Español para la Biotecnología (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	Mejora de mapas cryo-EM basada en aprendizaje profundo
Topaz	Universidad de California Berkeley	RRID:SCR_018037	Selección de partículas basada en aprendizaje profundo
UCSF ChimeraX	Universidad de California San Francisco	RRID:SCR_015872	Software de visualización molecular
CTFFIND4	Laboratorio Grigorieff	RRID:SCR_016732	Ajuste CTF utilizado en el flujo de trabajo CryoSmart
EMDB-8840	Banco de Datos de Microscopía Electrónica	Accesion: EMD-8840	Mapa de referencia TRPML1 humano
EMPIAR-10204	Archivo de Imágenes Públicas de Microscopía Electrónica	Accesion: EMPIAR-10204	Conjunto de datos de referencia de β-galactosidasa
Microscopio de Transmisión de Electrones (TEM)	No especificado	N/A	Utilizado para la adquisición de datos cryo-EM
Microscopio Electrónico Tecnai de FEI	FEI (ahora Thermo Fisher Scientific)	No especificado	Mencionado en el flujo de trabajo citado
Filtro de Energía	No especificado	N/A	Utilizado durante la recopilación automatizada
Nodo de Computación GPU	No especificado	N/A	Utilizado para cálculos ModelSmart