Un método de chiIRP basado en UV para la identificación verificable de proteínas que interactúan directamente con el ARNnc: desde células cultivadas hasta testículo de ratón

Resumen

Un método ChIRP basado en UV para identificar interacciones directas entre ARNN y proteína.

Resumen

Los ARN largos no codificantes (lncRNA) han surgido como reguladores importantes de diversos procesos biológicos. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a las funciones de la mayoría de los ARNnc siguen siendo poco comprendidos. Identificar proteínas que interactúan, especialmente las proteínas que se unen al ARN (RBPs), es una estrategia clave para esclarecer la función del ARNnc. Entre los enfoques disponibles, la identificación completa de proteínas que se unen al ARN (ChIRP) junto con espectrometría de masas es ampliamente utilizada debido a su diseño sencillo de la sonda y su flujo de trabajo sencillo. El ChIRP convencional se basa en el entrecruzamiento de paraformaldehído (PFA), que captura tanto los contactos directos ARN-proteína como las interacciones indirectas mediadas por factores puente. En cambio, la reticulación UV combinada con condiciones de lavado estrictas preserva preferentemente las interacciones directas ARN-proteína. Utilizando el lncRNA Tug1 como modelo, se compararon el reticulo cruzado UV y el reticulado PFA dentro del marco ChIRP en células cultivadas, demostrando que el ChIRP basado en UV enriquece interacciones directas entre ARNn y proteína. Este flujo de trabajo basado en UV se extendió posteriormente a testículos de ratón, en los que los tejidos se disociaban en suspensiones unicelulares antes de la entrecruz UV, permitiendo la identificación de proteínas de unión a Tug1 en un contexto tisular nativo. La comparación con interactomas derivados de líneas celulares reveló tanto interactores compartidos como específicos de tejido. Dos interacciones directas compartidas fueron validadas de forma independiente mediante una inmunoprecipitación de reticulación mejorada (eCLIP). Este enfoque ChIRP basado en UV se denomina cPDiRT (captura de proteínas que interactúan directamente con un objetivo de ARN). En conjunto, cPDiRT permite la identificación de proteínas que se unen a lncRNA tanto en células cultivadas como en tejidos nativos. La combinación de disociación tisular y entrecruzamiento UV proporciona una estrategia ampliamente aplicable para estudiar las interacciones directas entre ARNlnc y proteínas en diversos sistemas orgánicos.

Introducción

Recientes estudios transcriptómicos de alto rendimiento han descubierto miles de ARN largos no codificantes (lncRNA) que participan en diversos procesos biológicos, que van desde la organización de la cromatina hasta la señalización^{celular 1,2}. A pesar de su expresión generalizada e importancia funcional, los mecanismos moleculares de la mayoría de los lncARN siguen estando poco definidos. Un obstáculo importante es la identificación de sus socios proteicos físicos, especialmente las proteínas que se unen al ARN (^RBPs)3,4,5.

Los métodos actuales centrados en ARN se basan principalmente en la reticulación química, que captura tanto las interacciones directas como indirectas ARN-proteína. Como resultado, estos enfoques son más adecuados para el mapeo global de interactomas que para identificar contactos directos^{auténticos 6}. La identificación exhaustiva de proteínas que se unen al ARN seguida de espectrometría de masas (ChIRP-MS) es una técnica ampliamente utilizada para mapear las interacciones lncRNA-RBP debido a su diseño sencillo de la sonda y su flujo de trabajo^{eficiente 7,8}. El ChIRP-MS convencional utiliza reticulación con paraformaldehído (PFA), que captura tanto contactos directos ARN-proteína como asociaciones indirectas mediadas por factores de puente ^9,10.

En cambio, la reticulación UV a 254 nm ofrece una ventaja crítica. Conecta covalentemente ARN y proteínas solo cuando están en contacto cercano a distancia cero (típicamente <1 Å)¹¹. Este proceso convierte enlaces de hidrógeno en enlaces covalentes estables y permite condiciones estrictas de lavado con alto contenido de sal que eliminan interactores indirectos no ligados covalentemente. En consecuencia, los enfoques basados en UV proporcionan mayor especificidad para las interacciones directas ARN-proteína que los métodos de entrecruzamiento^{químico 12,13}. No obstante, los enfoques basados en UV siguen estando infrautilizados en estudios de interactomas de ARNlnc derivados de tejidos, principalmente debido a preocupaciones sobre la eficiencia de la reticulación y la limitada penetración UV.

Para investigar las interacciones directas entre ARNlnc y proteína en un contexto fisiológicamente relevante, se seleccionó el ARNlnc Tug1 como sistema modelo. Tug1 representa un referente ideal para validar un flujo de trabajo de interacción directa compatible con los tejidos debido a su severo fenotipo knockout y su alto enriquecimiento en el testículo. La ablación genética de Tug1 resulta en esterilidad masculina completa, espermatogénesis alterada y morfología anormal^{del espermatozoide 14}. Además, Tug1 apoya la función de las células de Sertoli y la integridad de la barrera hemato-testicular en ratones dietéticos^{ricos en grasa 15}. A pesar de estos fenotipos bien establecidos, los socios proteicos directos que median la función de Tug1 en el testículo—un órgano que expresa un gran número de RBPs que recientemente han sido perfilados^{experimentalmente 16}—siguen siendo desconocidos. Esta brecha de conocimiento refleja en gran medida el hecho de que la mayoría de los métodos de mapeo de interacción ARNNn-proteína se han desarrollado para sistemas celulares cultivados.

Para abordar esta limitación, el marco de ChIRP se modificó reemplazando la reticulación con PFA por la reticulación UV para capturar proteínas que interactúan directamente con Tug1. Las interacciones candidatas fueron validadas de forma independiente mediante inmunoprecipitación mejorada por reticulación seguida de secuenciación profunda (eCLIP-seq⁾¹⁷. El flujo de trabajo se amplió aún más a aplicaciones tisulares disociando tejido testicular fresco de ratón en células individuales antes de la reticulación UV. Este enfoque optimizado fue designado cPDiRT (captura de proteínas que interactúan directamente con un objetivo de ARN).

La aplicación de cPDiRT a Tug1 en el testis del ratón permitió el mapeo de interacción directa en un contexto tisular nativo. Los experimentos paralelos en células cultivadas proporcionaron una comparación lado a lado entre perfiles de interacción basados en PFA y basados en UV. Combinado con la validación independiente de eCLIP, este enfoque generó un conjunto de socios moleculares de alta confianza que pueden contribuir a la función de Tug1 durante la espermatogénesis. El protocolo presentado aquí permite capturar proteínas que interactúan directamente con un ARNnc objetivo tanto en células cultivadas como en tejidos nativos. Al definir el interactoma directo de Tug1 en el testículo, este método avanza en los estudios mecanicistas de un ARNnc esencial para la fertilidad y proporciona una plataforma generalizable para investigar las interacciones entre ARNlnc y proteínas en tejidos reproductivos y otros tejidos complejos.

Protocolo

Todas las soluciones se prepararon utilizando agua ultrapura y reactivos libres de nucleasas y proteasas. Todos los reactivos y equipos están listados en la Tabla de Materiales.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Nankín (Nº de Aprobación: IACUC-1812003-4) y se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Consejo Nacional de Investigación, 8ª edición). Mantener a los ratones machos C57BL/6 ratones (4 semanas) bajo un ciclo de 12 horas luz y 12 horas oscuro con acceso ad libitum a comida y agua. Minimizar el sufrimiento animal utilizando el menor número posible de animales necesarios para lograr la significación estadística. Eutanasiar ratones mediante inhalación de CO₂ seguida de luxación cervical según los protocolos institucionales aprobados.

1. Preparar los tampones

1. Preparar el tampón de lisis celular
   1. Preparar un tampón de lisis celular que contenga 50 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM de EDTA y 1% de SDS.
   2. Inmediatamente antes de usar, añade 1 mM de PMSF, un cóctel inhibidor de proteasas y un inhibidor especializado de RNasa.
      PRECAUCIÓN: El SDS es un irritante para la piel y los ojos. Evita inhalar polvo o aerosoles. El PMSF es altamente tóxico, actúa como inhibidor de la colinesterasa y es inestable en solución acuosa. Prepara el PMSF inmediatamente antes de usarla. Usa guantes y gafas de seguridad al manipular estos reactivos. Maneja el PMSF en una campana extractora química.
2. Preparar el buffer de hibridación
   1. Preparar un tampón de hibridación que contenga 750 mM de NaCl, 1% de SDS, 50 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM de EDTA y 15% de formamida.
   2. Inmediatamente antes de usar, añade 1 mM de PMSF, un cóctel inhibidor de proteasas y un inhibidor especializado de RNasa.
      NOTA: Guarda formamida a 4 °C, protegida de la luz.
      PRECAUCIÓN: La formamida es un teratogénico y un riesgo reproductivo. Manipula formamida en una campana extractora química mientras llevas guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad. Evita inhalar y el contacto con la piel.
3. Preparar el buffer de lavado
   1. Prepare un tampón de lavado que contenga 50 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 1 M NaCl, 1 mM de EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS y 0,5% desoxicolato de sodio.
   2. Protege el buffer de lavado de la luz durante el almacenamiento.
4. Preparar el tampón de la proteinasa K (PK)
   1. Prepara un tampón PK que contenga 100 mM de NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM de EDTA y 0,5% de SDS.
   2. Añadir la proteinasa K a una concentración final del 5% justo antes de su uso.

2. Diseñar y preparar sondas

1. Diseño de sondas antisentido
   1. Diseña sondas oligonucleótidas antisentido usando el diseñador de sondas online disponible a^{partir del 18} de singlemoleculefish.com.
2. Obtener sondas biotiniladas
   1. Ordena sondas de ADN antisentido que contengan una modificación 3'-BiotinTEG.
3. Prepara el pozo de sondas
   1. Diluir cada sonda individualmente a 100 μM.
   2. Mezcla volúmenes iguales de todas las sondas para generar un pool de sondas. Mantener una concentración final combinada de oligonucleótidos de 100 μM.
   3. Guarda el pool de la sonda a -20 °C.
      NOTA: Los parámetros recomendados de diseño de la sonda son los siguientes: (i) una sonda por cada 100 pb de ARN objetivo, (ii) contenido de GC objetivo del 45%, (iii) longitud de la sonda de 20 nt y (iv) espaciamiento de 60–80 nt entre sondas.
      NOTA: Si el ARN supera el límite de tamaño aceptado por el diseñador de la sonda, se divide la secuencia en segmentos más pequeños antes del diseño. Excluye regiones repetitivas y regiones con homología de secuencias extensa.

3. Realizar extracción celular, disociación de tejidos y reticulación UV

1. Prepara controles sin UV
   1. Preparar muestras de control en paralelo con muestras experimentales.
   2. Omite el paso de reticulación UV en las muestras de control.
   3. Realizar todos los procedimientos posteriores, incluyendo sonicación, extracción de ARN-proteína, extracción de ARN y extracción de proteínas, de forma idéntica para ambos grupos.
      NOTA: Utiliza el control sin UV para distinguir las interacciones ARN-proteína dependientes de UV de la unión de fondo no específica.
2. Cosechar celdas y realizar reticulación UV
   1. Células cultivadas por lavado
      1. Lava las células tres veces con PBS para eliminar el medio de cultivo residual.
   2. Celdas de enlace cruzado
      1. Distribuye 3 mL de PBS de forma uniforme sobre un plato de cultivo de 15 cm.
      2. Irradiar células en un reticulador UV de 254 nm a una dosis de 4000 mJ/^cm2.
   3. Recoger celdas reticuladas
      1. Recoge las células en PBS tras la reticulación.
      2. Centrifuga la suspensión y descarta el sobrenadante.
      3. Pesa el pellet y confirma una masa mínima de pellet de 500 mg por muestra.
3. Disociar tejido testicular y realizar reticulación UV
   1. Prepara los testículos
      1. Descapsula testículos.
      2. Lava el pañuelo dos veces con DMEM.
   2. Realizar digestión con colagenasa
      1. Incubar tejido en DMEM que contenga 1 mg/mL de colagenosa IV a 37 °C durante 5–15 minutos.
      2. Continúa la digestión hasta que se liberen los túbulos seminíferos.
         NOTA: No excedas los 15 minutos de digestión.
   3. Lava los túbulos seminíferos
      1. Centrifuga la suspensión a 1000 × g durante 1 minuto a 4 °C.
      2. Quita el sobrenadante.
      3. Lava el pellet con 5–10 mL de DMEM.
      4. Centrifugar de nuevo bajo las mismas condiciones.
   4. Realizar la digestión de tripsina
      1. Resuspende el pellet en tripsina al 0,25% que contiene 1 mg/mL de DNasa I.
      2. Incuba a 37 °C durante 5–15 minutos.
         NOTA: No excedas los 15 minutos de digestión.
   5. Detener la digestión enzimática
      1. Añade un volumen igual de DMEM complementado con un 10% de FBS.
   6. Genera una suspensión de celda única
      1. Filtra la suspensión a través de un colador de celda de 70 μm.
   7. Celdas de lavado
      1. Centrifugar las celdas a 2000 × g durante 5 minutos a 4 °C.
      2. Descarta el sobrenadante.
      3. Lava el pellet con 5–10 mL de PBS.
      4. Centrifugar de nuevo bajo las mismas condiciones.
   8. Células testiculares de reticulación cruzada
      1. Vuelve a suspender la suspensión de célula única en PBS.
      2. Distribuye la suspensión de forma uniforme sobre una base de cultivo de 15 cm.
      3. Irradiar células en un reticulador UV de 254 nm a una dosis de 4000 mJ/^cm2.
   9. Recoger celdas reticuladas
      1. Para controles sin UV, omite la irradiación.
      2. Recoge células en PBS.
      3. Centrifuga la suspensión y descarta el sobrenadante.
      4. Pesa el pellet y confirma una masa mínima de pellet de 500 mg por muestra.
         NOTA: El número de ratones necesarios para obtener aproximadamente 500 mg de pellet celular depende de la edad y del rendimiento del tejido. En este estudio se utilizaron aproximadamente 10–12 ratones de cuatro semanas.

4. Realizar la sonicación

1. Preparar lisados
   1. Resuspende los pellets celulares en el buffer de lisis celular a una proporción de 100 mg pellet por cada 1 mL buffer.
   2. Mezcla bien para obtener una suspensión homogénea.
2. Muestras sonicadas
   1. Sonica lisados usando un sonicador de baño maria o un ultrasonicador enfocado.
   2. Continúa la sonicación hasta que el lisado quede visualmente claro.
      NOTA: Verificar la fragmentación del ADN mediante electroforesis en gel de agarosa. Continúa la sonicación hasta que la mayoría de los fragmentos de ADN estén entre 1 kb y 2 kb.

5. Realizar pull-down de ARN-proteína

1. Recoger muestras de entrada
   1. Quita las alicuotas de lisato para los controles de entrada.
   2. Reserva aproximadamente 10 μL para análisis de ARN y 10 μL para análisis de proteínas.
   3. Mantener las muestras de entrada a 37 °C durante los procedimientos de hibridación y lavado.
2. Lisados preclear
   1. Añade 30 μL de perlas magnéticas prelavadas a cada muestra.
   2. Incubar muestras a 37 °C durante 30 minutos con una mezcla suave en un horno de hibridación.
      NOTA: Lava las cuentas magnéticas antes de usarlas. Coloca las alicuotas de las cuentas sobre un soporte magnético durante 1 minuto o hasta que la solución se despeje. Elimina completamente la solución de almacenamiento. Lava las perlas dos veces con 500 μL de tampón de lisis celular.
3. Quita las cuentas de prelimpieza
   1. Coloca las muestras en un soporte magnético.
   2. Transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo.
   3. Repite la transferencia una vez para asegurar la eliminación completa de las cuentas residuales.
4. Hibridar sondas
   1. Añade dos volúmenes de buffer de hibridación a cada muestra.
   2. Añadir sondas en una proporción de 1 μL de stock de sonda de 100 μM por cada 1 mL de lisato (Tabla suplementaria 1).
5. Reacciones de hibridación por incubación
   1. Incubar muestras a 37 °C con rotación de extremo a extremo durante 12–16 horas en un horno de hibridación.
6. Preparar cuentas de captura
   1. Lava 100 μL de perlas magnéticas tres veces con tampón de lisis celular inmediatamente antes del final de la hibridación.
   2. Elimina todo el tampón residual tras el lavado final.
7. Complejos de captura delimitados por sondas
   1. Brevemente reacciones de hibridación por centrifugadora.
   2. Resuspende las perlas lavadas en 1 mL de muestra hibridada.
8. Unir complejos a cuentas
   1. Devuelve la suspensión de talón al tubo original.
   2. Incubar a 37 °C mezclando durante 30–40 minutos.
9. Recuperar cuentas
   1. Unas muestras de centrifugación breve.
   2. Coloca los tubos sobre un soporte magnético durante 1–2 minutos o hasta que la solución se despeje.
   3. Descarta el sobrenadante.
   4. Elimina el líquido residual usando una punta de pipeta.
      NOTA: Evita molestar la perla magnética durante la extracción de líquidos.
10. Complejos capturados por lavado
    1. Añade 1 mL de buffer de lavado.
    2. Lava las perlas a 37 °C con mezcla continua durante 5 minutos.
    3. Repite el procedimiento de lavado cinco veces.
       NOTA: El tampón de lavado contiene 1 M NaCl, que interrumpe las interacciones proteína-proteína no covalente y proteína-ARN mientras preserva las enlaces cruzados covalentes inducidas por los rayos UV. Estas condiciones estrictas eliminan interactores indirectos y fondos inespecíficos, enriqueciendo así a los socios proteicos^{directos 19}.
11. Material de reserva para el análisis de ARN
    1. Transfiere entre el 1% y el 10% de las perlas lavadas a un tubo nuevo para el análisis de ARN.
    2. Usa las perlas restantes inmediatamente para extraer proteínas o guárdalas a -80 °C.
       NOTA: Pausa el protocolo aquí si es necesario. Almacena las muestras de las cuentas a -80 °C hasta la extracción de proteínas.
12. Proteínas elutas
    1. Añade buffer de muestra SDS a las cuentas.
    2. Hervir muestras a 95 °C durante 30 minutos para eluir proteínas e invertir las conexiones cruzadas.
    3. Proceda al análisis de espectrometría de masas.

6. Extraer ARN

1. Proteínas digestivas
   1. Resuspende muestras de ARN unidas a las perlas en 100 μL de buffer PK.
   2. Ajusta las muestras de entrada de ARN a un volumen final de 100 μL usando el buffer PK.
2. Incubar con la proteinasa K
   1. Incubar muestras a 50 °C durante 45 minutos con mezcla continua.
3. Inactivar la proteinasa K
   1. Calienta muestras a 95 °C durante 10 minutos.
4. Añadir reactivo de TRIzol
   1. Añade 500 μL de reactivo TRIzol a cada muestra.
   2. Vórtice a fondo.
   3. Incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: El reactivo de trizol contiene fenol y guanidina tiocianato. Maneja el reactivo en una campana de humos química mientras llevas guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad. Evita inhalar y el contacto con la piel. Si hay contacto con la piel, lava inmediatamente con agua y jabón.
5. Realizar la separación de fases
   1. Añade 100 μL de cloroformo a cada muestra.
   2. Vórtice a fondo.
   3. Incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente.
6. Recuperar la fase acuosa
   1. Centrifugar muestras a 4 °C durante 15 minutos.
   2. Transfiere la fase acuosa superior a un tubo nuevo.
7. Unir ARN a columnas de purificación
   1. Añade un volumen igual de 100% de etanol a la fase acuosa.
   2. Mezcla bien.
   3. Carga muestras en columnas de purificación de ARN.
8. Purificar ARN
   1. Realiza la limpieza de ARN según las instrucciones del fabricante.
   2. ARN eluto en 30 μL de agua libre de nucleasa.
9. Verificar el enriquecimiento de ARN mediante qRT-PCR
   1. Utiliza 1 μL de ARN eluído por reacción para la PCR cuantitativa de transcripción inversa (qRT-PCR).
   2. Evalúa el enriquecimiento de ARN objetivo en relación con los controles.

7. Realizar análisis LC-MS/MS

1. Separar proteínas por SDS-PAGE
   1. Mezcla proteínas obtenidas en el Paso 5.12 con 4× tampón de muestra LDS.
   2. Separar proteínas en un gel Bis-Tris al 4%–12%.
   3. Tiñe el gel usando un kit de tinción plateado.
   4. Elimina toda la vía de proteínas como una sola banda.
2. Piezas de gel de impuestos especiales
   1. Elimina la banda proteica con un bisturí limpio.
   2. Minimiza la cantidad de gel en exceso.
   3. Corta el gel en aproximadamente 1^{mm y 3} piezas.
   4. Transfiere piezas de gel a un tubo de 0,5 mL.
3. Destain las piezas de gel
   1. Añade 100 μL de solución desmanchante.
   2. Vórtice durante 10 minutos.
   3. Centrifugar a 14.000 × g durante 1 minuto.
   4. Quita el sobrenadante.
   5. Repite el procedimiento de destinción hasta que las piezas de gel se vuelvan transparentes.
4. Reducir proteínas
   1. Añade 100 μL de solución reductora.
   2. Incubar a 56 °C durante 30 minutos.
   3. Muestras frías a temperatura ambiente.
   4. Centrifuga brevemente y quita el sobrenadante.
5. Proteínas alquilatas
   1. Añade 100 μL de solución alquilante.
   2. Incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.
   3. Quita el sobrenadante.
   4. Lava las piezas de gel con 100 μL de buffer digestivo durante 5 minutos.
6. Proteínas digestivas
   1. Añade suficiente solución de tripsina para cubrir completamente las piezas de gel.
   2. Incubar a 37 °C durante 16–18 horas.
7. Péptidos extractados
   1. Añade 30 μL de solución de extracción.
   2. Sonicate durante 15 minutos o vórtice durante 30 minutos.
   3. Centrifugar a 14.000 × g durante 1 minuto.
   4. Transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo.
   5. Repite el procedimiento de extracción dos veces.
   6. Agrupa todos los extractos.
   7. Extractos secos agrupados en un concentrador de vacío durante aproximadamente 1 hora.
8. Limpia péptidos usando un StageTip
   1. Resuspende los péptidos secos en 20 μL de ácido fórmico (FA) al 0,1%.
   2. Carga muestras en un StageTip C18.
   3. Centrifuga a 1.000 × g durante 2 minutos.
   4. Lava el StageTip con 20 μL de 0,1% de FA.
   5. Péptidos elutos con 20 μL de 60% acetonitrilo/0,1% de FA en un vial de LC-MS.
   6. Seca el eluate.
   7. Resuspende péptidos en 10 μL de 0,1% de FA.
      NOTA: Pausa el protocolo aquí si es necesario. Almacenar los péptidos purificados a -80 °C antes del análisis LC-MS/MS.
9. Adquisición de datos LC-MS/MS
   1. Reconstituir péptidos en ácido fórmico al 0,1%.
   2. Separar péptidos sobre una columna analítica de 75 μm × 250 mm C18 a un caudal de 300 nL/min.
   3. Aplicar el siguiente gradiente B del disolvente (0,1% de ácido fórmico en acetonitrilo):
      2%–25% B durante 0–40 min
      25%–40% B en 40–48 min
      40%–99% B en 50–57 min
      Mantén el 99% B durante 3 minutos
   4. Operar el espectrómetro de masas en modo de adquisición dependiente de datos.
   5. Adquiere espectros MS de barrido completo en un rango m/z de 350–1200 con una resolución de 70.000.
   6. Obtén quince escaneos secuenciales de disociación colisional de mayor energía (HCD) MS/MS con una resolución de 17.500.
   7. Graba un microescaneo por cada escaneo.
   8. Establece la exclusión dinámica a 30 s.
10. Datos de espectrometría de masas de procesos
    1. Procesar datos en bruto usando MaxQuant (v2.1.0.0).
    2. Buscar espectros frente a secuencias de proteínas de ratón descargadas desde UniProt.
    3. Especifica la tripsina como enzima digestiva.
    4. Permitir un máximo de dos escotes que se ofenden.
    5. Especifica la oxidación de metionina como una modificación variable.
    6. Especifica la carbamidometilación de cisteína como una modificación fija.
    7. Establezca las tolerancias de masa de precursores y fragmentos a 15 ppm y 20 ppm, respectivamente.
    8. Controla la tasa de falsos descubrimientos en un 1% tanto en el nivel de péptido como en proteína.
    9. Estima la abundancia de proteínas usando cuantificación sin etiquetas basada en iBAQ.

8. Realizar análisis de enriquecimiento de ontologías génicas

1. Analizar el enriquecimiento funcional
   1. Realizar análisis de enriquecimiento Gene Ontology (GO) utilizando el paquete clusterProfiler R (v4.6.0).
   2. Utiliza la base de datos GO (v2024-09-20) como fuente de anotación de referencia.
   3. Aplica la corrección de Benjamini-Hochberg para múltiples pruebas.
   4. Defina la significación estadística como un valor P ajustado (FDR) < 0,05.

9. Realizar la validación eCLIP-seq

1. Prepara muestras de eCLIP
   1. Realizar inmunoprecipitación de reticulación mejorada (eCLIP) como se ha descrito^{anteriormente 17}.
   2. Preparar muestras celulares reticuladas por rayos UV para la inmunoprecipitación de PABPC1 y CCT3.
   3. Muestras de lisis usando el búfer de lisis eCLIP.
2. Complejos ARN-proteína inmunoprecipitados
   1. Añade 10 μg de anticuerpo a cada muestra.
   2. Capturar complejos ARN-proteína en perlas magnéticas.
   3. Recoge muestras de entrada antes de la inmunoprecipitación.
3. Preparar bibliotecas de ARN
   1. Desfosforilar ARN unidos a proteínas.
   2. Liga un adaptador de ARN de 3' al ARN recuperado.
   3. Lavar inmunoprecipitado y introducir muestras bajo condiciones estrictas.
   4. Elute se agrupa hirviendo las cuentas.
   5. Resuelve las muestras en un gel de gradiente Bis-Tris al 4%–12%.
   6. Transfiere los complejos separados a una membrana de nitrocelulosa.
4. Recuperar ARN
   1. Eliminar una región de membrana de tamaño similar.
   2. Digiere proteínas usando urea y proteinasa K.
   3. Recuperar ARN de la membrana.
5. Generar bibliotecas de secuenciación
   1. La transcripción inversa recuperó ARN en ADNc.
   2. Purificar cDNA usando una mezcla de exonucleasa I y fosfatasa alcalina de gambas.
   3. Liga un adaptador de ADN en el extremo 3' del ADN c, usando ligasa de ARN T4.
   4. Amplificar bibliotecas usando una ADN polimerasa de alta fidelidad.
   5. Bibliotecas amplificadas separadas sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 3%.
   6. Purifica las librerías seleccionadas por tamaño usando un kit de extracción en gel.
   7. Bibliotecas de secuencias en una plataforma Illumina.
6. Analizar datos eCLIP-seq
   1. Analizar los datos de secuenciación utilizando la tubería ENCODE^{eCLIP 20}.
   2. Adaptadores de trim y dimeros adaptadores de 3' usando cutadapt (v1.14).
   3. Align reads a UCSC repeat elements usando STAR (v2.7.6a).
   4. Elimina la correspondencia de lecturas a elementos repetitivos.
   5. Alinear las lecturas restantes con el genoma de referencia mm10 (GENCODE vM23).
   6. Elimina los duplicados de PCR.
   7. Identificar sitios de unión enriquecidos usando CLIPPER.
   8. Defina picos significativos como aquellos con enriquecimiento de pliegue ≥ 8 y P ajustado ≤ 0,001.
   9. Identificar picos reproducibles usando un umbral de tasa de descubrimiento irreproducible (IDR) de 0,01.

Resultados

Para identificar proteínas que se unen a Tug1, se incorporó la reticulación UV en el flujo de trabajo de ChIRP, estableciendo un método designado cPDiRT (Figura 1). La ChIRP convencional se realizó por primera vez en células GC2 para enriquecer proteínas que interactuan con Tug1 (Figuras 2A, B). El análisis por espectrometría de masas identificó más de 190 proteínas enriquecidas en relación con...

Discusión

cPDiRT se desarrolló como un protocolo modificado basado en ChIRP que reemplaza la reticulación con paraformaldehído (PFA) por la reticulación UV para capturar selectivamente las interacciones directas entre ARNN y proteína. Al combinar la disociación enzimática de tejido testicular fresco en células individuales con reticulación UV, se extendió el mapeo de interacción directa desde líneas celulares cultivadas hasta tejidos nativos. Los experimentos paralelos en células cultivadas permit...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25200056	para disociación de tejidos y preparación de suspensión de células únicas
100% Etanol	Sigma-Aldrich	459844	para limpieza de ARN
AffinityScript Reverse Transcriptase	Agilent	600107	para síntesis de ADNc de eCLIP
Anti-CCT3 Antibody	Abcam	Ab225878	anticuerpo para eCLIP
Anti-PABPC1 Antibody	Abcam	Ab312314	anticuerpo para eCLIP
Cloroformo	Sigma-Aldrich	C2432	para extracción de ARN
Colagenasa Tipo IV	Sigma-Aldrich	C5138	para disociación enzimática de tejido testicular
Reactivos de desfosforilación (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	para desfosforilación de ARN de eCLIP
Medio DMEM de glucosa alta	Gibco	11965092	para cultivo celular y tampón de disociación de tejido
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetic Beads	Thermo Fisher Scientific	65001	para la captura de complejos sonda-ARN-proteína biotinilados
DynaMag-15 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12301D	para separación de cuentas magnéticas
DynaMag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	para separación de cuentas magnéticas
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	para quelado de cationes divalentes en los tampones de lisis y lavado
Exonucleasa I	New England Biolabs	M0293S	para purificación de ADNc de eCLIP
Suero bovino fetal (FBS)	Gibco	10099141C	para detener la digestión de tripsina
Formamida	Thermo Fisher Scientific	AM9342	para la preparación del tampón de hibridación
Horno de hibridación	TUOHE	LF-I	para la hibridación de sondas y el lavado de cuentas
Agarosa de baja temperatura de fusión	Sigma-Aldrich	A9414	para la selección del tamaño de la biblioteca eCLIP
MinElute Gel Extraction Kit	Qiagen	28604	para la selección del tamaño de la biblioteca eCLIP
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	para la purificación de ARN
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	para la preparación del tampón de lavado con alto contenido en sal
Membrana de nitrocelulosa	GE Healthcare / Amersham	10600002	para la transferencia de western blot de eCLIP
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	para el detergente del tampón de lavado
Agua libre de nucleasa y proteasa	Thermo Fisher Scientific	10977035	para la preparación de soluciones libres de nucleasa
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	para la selección del tamaño de eCLIP
NuPAGE Bis-Tris Precast Gels	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	para la separación de proteínas por SDS-PAGE
PBS (pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	para el lavado celular y la resuspendación
Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	inhibidor de proteasa serina para el tampón de lisis celular; se agrega fresco antes de su uso
Cóctel inhibidor de proteasa	Roche	4693132001	inhibidor de proteasa de amplio espectro para el tampón de lisis celular; se agrega fresco antes de su uso
Proteinasa K	Sigma-Aldrich	P4850	para la digestión de proteínas en la extracción de ARN
qRT-PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	11704044	para la RT-PCR cuantitativa para confirmar el enriquecimiento de ARN
Solución de RNase/Protease-Free DNase I	Thermo Fisher Scientific	EN0521	para la disociación de tejidos
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	para la purificación de ARN
Tambón de carga de muestras para SDS-PAGE	Beyotime	P0286	para la preparación de muestras de proteínas
Fosfatasa alcalina de langosta	New England Biolabs	M0371S	para la purificación de ADNc de eCLIP
Kit de tinción plateada	Beyotime	P00175	para la visualización de proteínas en geles de SDS-PAGE
Docilsulfato de sodio	Sigma-Aldrich	D6750	para el detergente del tampón de lavado
Dodecilsulfato de sodio (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	para la lisis celular y la desnaturalización de proteínas
Superase-in RNase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	AM2694	inhibidor de RNase especializado; se agrega fresco antes de su uso
T4 RNA Ligase	New England Biolabs	M0204	para la ligación del adaptador eCLIP
Tris-HCl (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	T5941	para la preparación de tampones de lisis, hibridación y lavado
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	para la extracción de ARN
Triturador celular ultrasónico	ATPIO	ATPIO-650D	para la lisis celular y la fragmentación del ADN
Cruzador de ultravioleta	Analytik Jena	UVP CL-1000	para la unión por UV de las interacciones ARN-proteína
Urea	Sigma-Aldrich	U5128	para la degradación de proteínas de eCLIP en la membrana