Este protocolo describe una laminectomía lumbar L5 estandarizada en ratones C57BL/6J de edad avanzada para establecer un modelo de disfunción cognitiva posoperatoria mientras se minimiza el deterioro locomotor, apoyando así estudios conductuales, histológicos y mecanicistas de los trastornos neurocognitivos peroperatorios.
Artículo de método
Laminectomía lumbar L5 en ratones C57BL/6J envejecidos para modelar la disfunción cognitiva posoperatoria
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Resumen
Resumen
La disfunción cognitiva posoperatoria (POCD) es una complicación neurológica común tras la cirugía y la anestesia, especialmente en adultos mayores, y se asocia con una recuperación tardía, hospitalización prolongada y una calidad de vida reducida. Se sabe que los procedimientos ortopédicos y espinales conllevan un riesgo relativamente alto de POCD; sin embargo, los modelos preclínicos que reflejan fielmente las características perioperatorias de la cirugía espinal siguen siendo limitados. Los modelos comúnmente utilizados, como la laparotomía y la fractura de tibia, pueden provocar una alteración locomotora persistente y una inflamación periférica prolongada que pueden dificultar la interpretación de los resultados conductuales cognitivos. Aquí se describe un protocolo estandarizado y de bajo costo para modelar la POCD mediante una laminectomía lumbar L5 bajo anestesia con sevoflurano en ratones macho C57BL/6J de 18 meses de edad. El procedimiento se realiza utilizando instrumentos quirúrgicos de uso habitual y produce una lesión quirúrgica controlada, minimizando al mismo tiempo los déficits motores persistentes. La función cognitiva se evalúa mediante la prueba de reconocimiento de objetos novedosos, el laberinto en Y de brazo nuevo y el laberinto de Barnes, mientras que la lesión neuronal del hipocampo y los cambios neuroinflamatorios se evalúan mediante tinción de Nissl e inmunofluorescencia para Iba1, respectivamente. Los resultados representativos demuestran actividad locomotora preservada, deterioro del rendimiento cognitivo, reducción de la integridad neuronal del hipocampo y aumento de la neuroinflamación en el hipocampo tras la cirugía. Este modelo estandarizado y accesible proporciona una plataforma clínicamente relevante para investigar los mecanismos subyacentes a la disfunción cognitiva asociada a la cirugía de columna y para evaluar posibles intervenciones neuroprotectoras perioperatorias.
Introducción
La disfunción cognitiva posoperatoria (POCD) se define como una disminución en el aprendizaje y la memoria, la atención, la velocidad de procesamiento y la función ejecutiva tras la anestesia y la cirugía1, afectando predominantemente a pacientes ancianos, y su incidencia reportada parece variar según el contexto quirúrgico y la población de pacientes2,3. Se ha informado que la POCD ocurre con frecuencia entre adultos mayores sometidos a cirugía ortopédica electiva4. Clínicamente, la POCD puede persistir desde semanas hasta meses después de la cirugía y se ha asociado con hospitalización prolongada y mayor mortalidad5,6,7. Con el envejecimiento continuo de la población y el aumento del volumen quirúrgico en todo el mundo, la POCD se ha convertido en un problema importante de salud pública y de atención perioperatoria.
Desde el punto de vista fisiopatológico, se considera que el deterioro cognoscitivo postoperatorio (POCD) es un síndrome multifactorial desencadenado por el trauma quirúrgico y la exposición a anestésicos, siendo la neuroinflamación, el estrés oxidativo, la disregulación de la autofagia y la disfunción sináptica algunos de los mecanismos propuestos que subyacen a la disfunción neuronal en regiones relevantes para la cognición, como el hipocampo8. Para desentrañar estos mecanismos y evaluar intervenciones candidatas, se han desarrollado diversos modelos preclínicos de POCD. Estos modelos preclínicos incluyen aquellos basados únicamente en anestesia, modelos basados en cirugía abdominal y modelos de lesión ortopédica, como la fractura de tibia9. Aunque estos modelos han impulsado el avance del campo, podrían no reproducir completamente las características perioperatorias relevantes para la cirugía de columna, y algunos podrían introducir factores de confusión, como déficits locomotores sostenidos e inflamación tisular prolongada, que complican la interpretación de los resultados cognitivos y de los mecanismos subyacentes.
Entre las estrategias quirúrgicas disponibles, seleccionamos un modelo de laminectomía lumbar L5 para investigar el deterioro cognitivo precoz posoperatorio en un contexto quirúrgico estandarizado y específico de la columna vertebral. Este procedimiento proporciona una lesión quirúrgica controlada y localizada bajo anestesia inhalatoria, lo que permite estudiar las respuestas neuroinflamatorias posoperatorias y la disfunción cognitiva sin provocar un deterioro evidente de la locomoción. Con la optimización de pasos quirúrgicos clave, este protocolo ofrece un método estandarizado, práctico y rentable para investigar el deterioro cognitivo asociado a la cirugía de columna y evaluar estrategias neuroprotectoras perioperatorias.
Protocolo
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Zhejiang (número de aprobación ética: ZJU20260153).
1. Preparación preoperatoria
- Animales experimentales, asignación a grupos, analgesia y enmascaramiento
- Utilice ratones machos C57BL/6J de 18 meses de edad que pesen entre 30 y 34 g. Mantenga a los ratones bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso libre a alimento y agua.
- Permita que los ratones se aclimaten a las condiciones de alojamiento durante al menos 7 días antes de la cirugía. Asigne aleatoriamente a los ratones al grupo de laminectomía lumbar L5 o al grupo control tras la aclimatación.
- Asigne a cada ratón un número de identificación codificado antes de los procedimientos experimentales. Mantenga el código de asignación de grupo para que las evaluaciones conductuales se puedan realizar sin conocimiento del tratamiento.
- Someta a los ratones del grupo de laminectomía L5 a anestesia con sevoflurano seguida de laminectomía lumbar L5. No exponga a los ratones del grupo control a anestesia con sevoflurano, preparación del sitio quirúrgico ni intervención quirúrgica.
- Administre meloxicam por vía subcutánea a una dosis de 2 mg/kg a los ratones de ambos grupos. Administre la primera dosis tras la inducción de la anestesia en el grupo de laminectomía L5 y en el momento correspondiente al final de la cirugía en el grupo control.
- Administre dosis posteriores de meloxicam por vía subcutánea a 2 mg/kg cada 24 h durante 48 h a los ratones de ambos grupos. Mantenga, maneje y supervise a ambos grupos bajo las mismas condiciones durante todo el período experimental.
- Realice todas las evaluaciones conductuales según el mismo programa experimental para ambos grupos. Asegúrese de que el investigador que realiza las evaluaciones conductuales permanezca enmascarado respecto a la asignación de grupo.
- Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos y desinfecte el área de trabajo quirúrgico. Precaliente una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal durante la anestesia. Prepare el meloxicam para su administración perioperatoria.
- Encienda la máquina de anestesia gaseosa y coloque al ratón en una cámara de inducción. Induzca la anestesia general con sevoflurano al 3–5% durante 3–5 min, manteniendo un flujo de oxígeno de 1 L/min.
- Transfiera al ratón anestesiado a la plataforma quirúrgica. Mantenga la anestesia con sevoflurano al 1.5–3% administrado a través de una máscara de anestesia con un flujo de oxígeno de 0.5–0.8 L/min. Administre meloxicam por vía subcutánea a 2 mg/kg. La duración total de la anestesia, medida desde el inicio de la inducción con sevoflurano, es de aproximadamente 4 h. Ajuste la concentración de sevoflurano según sea necesario para mantener un plano quirúrgico estable de anestesia.
- Coloque al ratón en posición prona con la columna lumbar orientada hacia arriba. Sujete suavemente las extremidades anteriores con cinta adhesiva para estabilizar al animal y obtener acceso libre al campo quirúrgico L5.
- Confirme una profundidad adecuada de anestesia verificando la ausencia del reflejo de retirada plantar. Aplique una pomada oftálmica para prevenir el secado corneal.
- Elimine el vello de la región lumbar media (aproximadamente L3–S1) utilizando una máquina cortapelos para pequeños animales. Desinfecte la piel expuesta con etanol al 75%, seguido de povidona-yodo, repitiendo el procedimiento 2–3 veces para asegurar condiciones asépticas.
2. Cirugía de laminectomía lumbar L5
NOTA: En el presente protocolo, todos los pasos quirúrgicos se realizaron bajo visualización directa sin utilizar un estereomicroscopio ni lupas de aumento.
- Coloque el ratón anestesiado en posición prona sobre una plataforma quirúrgica precalentada. Sujete las extremidades anteriores con cinta adhesiva para estabilizar el cuerpo y exponer completamente la región lumbar (Figura 1).
- Identifique el nivel vertebral L5 utilizando puntos de referencia superficiales. Palpe las crestas ilíacas bilaterales y trace una línea transversal imaginaria que conecte sus puntos más altos.
- Utilice la línea transversal como punto de referencia aproximado para el espacio intervertebral L5–L6. Centre la incisión cutánea planeada ligeramente craneal a esta línea para dirigirse a la lámina L5.
- Desinfecte el sitio quirúrgico. Realice una incisión longitudinal en la línea media de aproximadamente 1,5–2,0 cm de longitud sobre el nivel L5 predeterminado para exponer la región L4–L6.
- Retraiga los bordes de la piel con pinzas estériles. Exponga la fascia dorsal e identifique la línea media de la aponeurosis fascial.
- Confirme el nivel vertebral tras exponer la columna vertebral. Identifique la unión lumbosacra y la vértebra lumbar más caudal.
- Identifique L5 como la vértebra inmediatamente craneal a L6, ya que los ratones C57BL/6 suelen poseer seis vértebras lumbares. Confirme el nivel contando dos vértebras en dirección craneal desde la unión lumbosacra.
- Realice una pequeña abertura a lo largo de la línea media de la aponeurosis fascial. Retraiga los músculos paravertebrales bilateralmente bajo visualización directa.
- Seccione los músculos adyacentes al proceso espinoso L5 para exponer la lámina subyacente. Extienda la exposición cranealmente hasta el proceso espinoso L4 y caudalmente hasta el proceso espinoso L6, hasta que los tres procesos espinosos sean claramente visibles.
- Realice principalmente una disección roma adyacente al hueso utilizando bastoncillos de algodón o pinzas finas. Utilice la disección afilada solo cuando sea necesario para liberar adherencias fasciales y minimizar el sangrado.
- Mantenga la retracción lateral con bastoncillos de algodón para exponer completamente la lámina L5 y el espacio interlaminar L5–L6. Vuelva a confirmar el nivel vertebral antes de continuar.
- Agarre suavemente el proceso espinoso L5 con pinzas y eleve el proceso espinoso y la columna lumbar adyacente hasta un ángulo de aproximadamente 30° respecto a la plataforma quirúrgica, para ampliar el espacio interlaminar L5–L6.
- Introduzca las puntas cerradas de las tijeras oftálmicas en el espacio interlaminar L5–L6 bajo visualización directa. Avance las tijeras a lo largo de un plano superficial inmediatamente por debajo del borde caudal de la lámina L5.
- Abra ligeramente las tijeras para crear la abertura ósea inicial. Agrandar la ventana de laminectomía eliminando fragmentos óseos pequeños de forma secuencial a lo largo de los márgenes laminares. Restrinja la eliminación ósea a la lámina dorsal L5 y evite extender la ventana ósea lateralmente hacia las articulaciones facetarias bilaterales.
- Evite una profundidad excesiva de inserción y una fuerza excesiva de corte para prevenir lesiones durales.
- Continúe eliminando la lámina de forma progresiva hasta que la duramadre sea claramente visible a través de la ventana ósea.
- Inspeccione cuidadosamente el campo quirúrgico. Confirme la ausencia de sangrado activo y verifique que la duramadre permanezca intacta.
- Lave el sitio quirúrgico con solución salina estéril tibia. Logre la hemostasia mediante compresión suave.
- Cierre la herida por capas. Cierre la piel con suturas de nylon 6-0 y desinfecte el sitio de la incisión.
- Tras el cierre de la herida, continúe con la anestesia con sevoflurano hasta que la duración total de la anestesia alcance aproximadamente 4 h. Luego suspenda la administración de sevoflurano y proceda al cuidado posoperatorio.
3. Cuidados posoperatorios
- En el momento correspondiente al final de la cirugía en el grupo de laminectomía, administre meloxicam por vía subcutánea a 2 mg/kg a los ratones del grupo control. Coloque cada ratón del grupo de laminectomía sobre una almohadilla calefactora con temperatura controlada y mantenga la temperatura corporal hasta que el ratón recupere la conciencia y presente respiración espontánea y actividad motora estables.
- Devuelva cada ratón del grupo de laminectomía a su jaula original tras la recuperación completa de la anestesia. A continuación, supervise al animal hasta observar una deambulación normal. Administre dosis posteriores de meloxicam por vía subcutánea a 2 mg/kg cada 24 h durante 48 h a los ratones de ambos grupos.
- Inspeccione diariamente la incisión quirúrgica y la integridad de los puntos de sutura hasta el tercer día posoperatorio. Vuelva a anestesiar al ratón y reemplace cualquier sutura suelta o rota si es necesario.
- Examine diariamente la incisión en busca de hinchazón, sangrado, secreción o signos de inflamación local.
- Supervise el peso corporal, el comportamiento de aseo, la actividad espontánea y la ingesta de alimento y agua durante todo el período posoperatorio.
- Eutanalice humanamente a cualquier ratón antes del punto final experimental programado si se cumple alguno de los siguientes criterios predefinidos de punto final ético: una pérdida de ≥20% del peso corporal previo a la cirugía; anorexia completa durante 24 h o ingesta de alimento inferior al 50% de la cantidad normal durante 3 días consecutivos; incapacidad o marcada reticencia para mantenerse en pie o acceder al alimento o agua que persista durante 24 h tras la recuperación de la anestesia; o un estado moribundo caracterizado por marcada depresión acompañada de una temperatura corporal inferior a 37 °C.
4. Evaluación conductual del DCPO
- Prueba del campo abierto (control locomotor; día postoperatorio 3)
- Realice la prueba del campo abierto en una arena de 45 cm × 45 cm con paredes de 40 cm de altura bajo un nivel de iluminación de 20 lux. Coloque la cámara de video directamente encima del centro de la arena de modo que toda el área de prueba quede dentro del campo de visión.
- Coloque al ratón en el centro de la arena e inicie el seguimiento por video inmediatamente después de colocarlo. Permita que el ratón explore libremente durante 5 min. Analice toda la sesión de 5 min y calcule la distancia total recorrida y la velocidad media de movimiento utilizando el sistema de seguimiento por video.
- Análisis de la marcha
- Realice el análisis de la marcha el día postoperatorio 3 utilizando un sistema automatizado de análisis de la marcha.
- Coloque a cada ratón en un extremo del pasillo y permita que lo recorra libremente. Registre las huellas de las patas durante la locomoción utilizando la cámara de alta velocidad integrada en el sistema de análisis de la marcha.
- Registre ensayos de la marcha para cada ratón y obtenga tres recorridos válidos con movimiento continuo hacia adelante a lo largo del pasillo para su posterior análisis.
- Analice los datos de las huellas registradas utilizando el software de análisis de la marcha. Revise las huellas de las patas identificadas automáticamente y corrija manualmente la clasificación de la pata delantera derecha, pata delantera izquierda, pata trasera derecha y pata trasera izquierda cuando sea necesario antes de extraer los parámetros de la marcha.
- Cuantifique la longitud de la zancada, el tiempo de apoyo, la velocidad de oscilación y el área de la huella, y calcule el valor medio a partir de los tres recorridos válidos para cada ratón para el análisis estadístico.
- Laberinto de Barnes (aprendizaje y memoria espacial; días postoperatorios 4–6)
NOTA: Realice la prueba del laberinto de Barnes una vez al día durante tres días consecutivos a partir del día postoperatorio 4. Lleve a cabo las pruebas dentro del mismo intervalo horario diario para minimizar la variabilidad circadiana.- Coloque la caja de escape debajo del orificio objetivo designado. Mantenga la misma ubicación objetivo durante todo el experimento.
- Coloque al ratón en el centro del laberinto para comenzar cada ensayo. Permita que el ratón busque la caja de escape durante un máximo de 3 min. Finalice el ensayo cuando el ratón entre en la caja de escape.
- Guíe suavemente al ratón hacia el orificio objetivo si no logra localizar la caja de escape dentro de los 3 min. Permita que el ratón permanezca brevemente en la caja de escape para reforzar el aprendizaje de la tarea.
- Registre la latencia de escape y la distancia recorrida utilizando el sistema de seguimiento por video. Para los ensayos en los que el ratón no entra en la caja de escape dentro de los 3 min, asigne una latencia de escape de 180 s. Incluya únicamente la latencia de escape y la distancia recorrida registradas durante la sesión final del día 3 en el análisis estadístico.
- Reconocimiento de objeto novedoso (memoria de reconocimiento; días postoperatorios 3–4)
NOTA: Utilice la misma arena y el mismo sistema de seguimiento por video descritos para la prueba del campo abierto. Utilice la sesión del campo abierto del día postoperatorio 3 para habituar a los ratones al área de prueba antes del entrenamiento en el reconocimiento de objeto novedoso.- Coloque dos objetos cilíndricos idénticos en posiciones simétricas dentro de la arena durante la sesión de entrenamiento. Permita que el ratón explore libremente durante 5 min.
- Tras un intervalo de retención de 1 h, reemplace uno de los objetos cilíndricos familiares por un objeto nuevo con forma de cubo. Equilibre la posición del objeto novedoso entre los ratones para minimizar posibles preferencias laterales. Permita que el ratón explore durante 5 min.
- Registre el tiempo de exploración de los objetos familiar y novedoso utilizando el sistema de seguimiento por video. Incluya únicamente a los ratones con un tiempo total de exploración de objetos de al menos 3 s en el análisis.
- Calcule el índice de preferencia (PI) como:
Defina Tnovel y Tfamiliar como los tiempos dedicados a explorar los objetos novedoso y familiar, respectivamente, durante la sesión de prueba.
- Laberinto en Y con brazo novedoso (memoria de reconocimiento espacial; día postoperatorio 5)
- Realice la prueba en un laberinto en forma de Y compuesto por tres brazos idénticos separados por 120°. Bloquee aleatoriamente uno de los brazos con una puerta opaca y designe a este brazo como el brazo novedoso.
- Seleccione aleatoriamente uno de los dos brazos abiertos como brazo de inicio. Designe el brazo abierto restante como brazo familiar. Coloque al ratón al final del brazo de inicio y permita que explore libremente los dos brazos accesibles durante 5 min.
- Tras un intervalo interensayo de 1 h, retire la puerta opaca y devuelva al ratón al final del mismo brazo de inicio.
- Permita que el ratón explore los tres brazos libremente durante 5 min.
- Defina una entrada a un brazo como el ingreso del centro del cuerpo rastreado a una zona predefinida del brazo desde la zona central. Registre el número de entradas y el tiempo pasado en cada brazo utilizando el sistema de seguimiento por video.
- Calcule el índice de preferencia por el brazo novedoso basado en el tiempo como:
Defina Tnovel, Tstart y Tfamiliar como el tiempo pasado en los brazos novedoso, de inicio y familiar, respectivamente. - Calcule el índice de preferencia basado en el número de entradas como:
Defina Enovel como el número de entradas al brazo novedoso y Etotal como el número total de entradas a los tres brazos durante el ensayo de prueba.
5. Procesamiento del tejido, tinción de Nissl y tinción de inmunofluorescencia
- Procesamiento del tejido
- En el punto final experimental designado, anestesie profundamente al ratón con sevoflurano al 3 % administrado a un flujo de oxígeno de 2 L/min.
- Confirme una profundidad adecuada de anestesia mediante la ausencia del reflejo de retirada del pie. Manteniendo la anestesia profunda y antes del paro cardíaco, realice una perfusión transcardíaca con 20 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre intravascular.
- Perfunda inmediatamente al ratón con 20 mL de paraformaldehído al 4 % (PFA).
- Extraiga cuidadosamente todo el cerebro. Sumerja el cerebro en PFA al 4 % durante 24 h a 4 °C para la postfijación.
- Transfiera el cerebro a sacarosa al 30 % hasta que el tejido se hunda completamente.
- Incruste el cerebro en compuesto de temperatura óptima para corte (OCT).
- Congele rápidamente el tejido incrustado y almacénelo a −80 °C hasta su corte en criostato.
- Tinción de Nissl
- Lleve cortes criostáticos de 16 µm a temperatura ambiente. Deje secar las laminillas al aire durante 20 min.
- Lave las laminillas con PBS durante 2 min.
NOTA: Asegúrese de que las secciones de tejido permanezcan firmemente adheridas a las laminillas antes de la tinción. - Cubra completamente las secciones con solución de azul de toluidina. Incube durante 30 min a 55 °C.
NOTA: Optimice empíricamente el tiempo de tinción para secciones de 16 µm para evitar una tinción excesiva. - Lave brevemente las laminillas con agua destilada durante 10–30 s.
- Diferencie las secciones secuencialmente en etanol al 95 %, 85 % y 75 % durante 2 min cada uno.
NOTA: Ajuste el tiempo de diferenciación si es necesario para optimizar la intensidad de la tinción. - Limpie las laminillas dos veces con xileno fresco durante 5 min cada vez.
NOTA: Realice todos los pasos con xileno en una campana extractora de gases. - Monte las secciones con bálsamo neutro. Coloque suavemente una cubreobjetos sobre cada sección.
- Obtenga imágenes de las secciones teñidas utilizando un microscopio de luz con objetivo de 20×. Identifique la región CA1 en función de su característica capa compacta de células piramidales en la sección coronal del hipocampo. Para cada ratón, analice una sección coronal y obtenga dos campos no superpuestos de la región CA1 de cada hemisferio hipocampal.
- Recuente manualmente las neuronas Nissl-positivas morfológicamente intactas y los cuerpos de Nissl utilizando el complemento de conteo celular del software de análisis de imágenes. Identifique las neuronas intactas por un soma intacto, un núcleo redondo con nucleolo visible y sustancia de Nissl citoplasmática abundante; identifique los cuerpos de Nissl como estructuras granulares o agrupadas intensamente basófilas dentro del citoplasma neuronal.
- Promedie los valores obtenidos de todos los campos analizados para generar un único valor por animal. Asegúrese de que el observador que realiza los conteos permanezca ciego respecto a la asignación de grupos.
- Tinción de inmunofluorescencia para Iba1
- Permita que las secciones cerebrales alcancen la temperatura ambiente antes de la tinción.
- Sumerja las laminillas en solución de recuperación de antígenos de citrato sódico y realice la recuperación de antígenos en un baño de agua a 80 °C durante 25 min. Tras la recuperación de antígenos, permita que las laminillas y la solución se enfríen naturalmente a temperatura ambiente.
- Lave las secciones tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 3 min cada vez.
- Permeabilice las secciones con Triton X-100 al 0,2 % en PBS durante 30 min a temperatura ambiente, seguido de tres lavados con PBS durante 3 min cada uno.
- Bloquee la unión no específica incubando las secciones con albúmina sérica bovina (BSA) al 3 % en PBS durante 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
- Lave las secciones tres veces con PBS durante 3 min cada vez.
- Diluya el anticuerpo primario contra la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (Iba1; 1:100) en solución de bloqueo (BSA al 3 % en PBS) e incube las secciones con el anticuerpo primario diluido durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada.
- Lave las secciones tres veces con PBS durante 3 min cada vez.
- Incube las secciones con IgG de cabra anti-conejo conjugado con 488 (H+L) (1:1000) durante 90 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Lave las secciones tres veces con PBS durante 3 min cada vez en la oscuridad.
- Contratiña los núcleos con DAPI (1:8000) durante 5 min en la oscuridad.
- Lave las secciones tres veces con PBS durante 3 min cada vez en la oscuridad.
- Monte las secciones con medio de montaje antifade, coloque cubreobjetos y proteja las secciones de la luz hasta la obtención de imágenes.
- Adquiera imágenes de fluorescencia de la región CA1 del hipocampo utilizando un microscopio de fluorescencia confocal con objetivo de 20×. Utilice configuraciones idénticas de adquisición de imágenes para todas las secciones incluidas en comparaciones cuantitativas. Para cada ratón, analice una sección coronal y obtenga dos campos no superpuestos de la región CA1 de cada hemisferio hipocampal.
- Cuantifique la intensidad media de fluorescencia de Iba1 en la región CA1 del hipocampo utilizando configuraciones de umbral idénticas en todas las imágenes. Promedie los valores de todos los campos para obtener un único valor por animal.
6. Análisis estadístico
- Realice todos los análisis estadísticos utilizando software de análisis estadístico. Presente los datos como media ± desviación estándar (DE).
- Evalue la normalidad de los datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Evalúe la igualdad de varianzas utilizando la prueba F.
- Compare los grupos control y de laminectomía L5 utilizando una prueba t de Student no apareada de dos colas cuando se cumpla el supuesto de varianza. Utilice la prueba t de Welch cuando el supuesto de varianza no se cumpla.
- Defina n como el número de animales incluidos en cada análisis. Considere un valor de P < 0,05 estadísticamente significativo.
Resultados
Todos los ratones sobrevivieron hasta el punto final del experimento programado, ninguno cumplió los criterios predefinidos del punto final ético y todos se incluyeron en los análisis finales. La función motora se evaluó el día 3 después de la cirugía mediante análisis de campo abierto y de la marcha. Ni la distancia total recorrida ni la velocidad promedio en la prueba de campo abierto difirieron entre los grupos, lo que indica una actividad locomotora espontánea comparable (Figura 2A). Del mismo modo, el análisis de la marcha no mostró diferencias significativas entre los grupos en la longitud de la zancada, el tiempo de apoyo, la velocidad del balanceo o el área de la huella (Figura 2B). En conjunto, estos hallazgos indican que el procedimiento de laminectomía L5 no produjo una alteración motora evidente suficiente para explicar las diferencias posteriores en el rendimiento cognitivo-comportamental.
El rendimiento cognitivo se evaluó mediante la prueba de reconocimiento de objeto novedoso (NOR), el laberinto en Y con brazo novedoso y el laberinto de Barnes. En la prueba NOR, el grupo con laminectomía L5 mostró un índice de preferencia por el objeto novedoso (PI) significativamente menor que el grupo control (Figura 3A). En el laberinto en Y con brazo novedoso, el grupo con laminectomía L5 mostró PIs significativamente más bajos tanto para el tiempo pasado como para las entradas al brazo novedoso (Figura 3B). En el laberinto de Barnes, el grupo con laminectomía L5 mostró una mayor latencia de escape y una mayor distancia recorrida en el día 3 del test del laberinto de Barnes (Figura 3C). En conjunto, estos hallazgos conductuales indican un deterioro del rendimiento cognitivo postoperatorio tras la laminectomía L5.
En la región CA1 del hipocampo, el grupo con laminectomía en L5 mostró significativamente menos neuronas positivas para Nissl y significativamente menos cuerpos de Nissl que el grupo control, lo que indica daño estructural neuronal (Figura 4A, B). Además, la intensidad media de fluorescencia de Iba1 aumentó significativamente en el grupo con laminectomía en L5, lo que es consistente con una mayor activación de microglía (Figura 4C, D).
Figura 1: El procedimiento de laminectomía lumbar L5 para la modelización de la disfunción cognitiva postoperatoria (POCD) en ratones. (A) Ilustración del sitio quirúrgico en la lámina L5 y el rango de exposición que abarca los niveles vertebrales adyacentes (L4–L6). (B) Imágenes intraoperatorias que ilustran los pasos clave del procedimiento de laminectomía lumbar L5. (a) La región lumbar tras el afeitado, con la línea media espinal identificada; las flechas indican la dirección de la incisión cutánea planeada. (b) Incisión cutánea en la línea media sobre la columna lumbar. (c) Incisión de la fascia con separación progresiva de los músculos paravertebrales para exponer los procesos espinosos y despejar adicionalmente el tejido alrededor del proceso espinoso y la lámina L5 con el fin de exponer completamente la lámina L5. (d) Laminectomía L5 tras la eliminación de la lámina L5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación de la actividad locomotora y la marcha tras laminectomía lumbar L5. (A) Prueba de campo abierto que muestra la distancia total recorrida y la velocidad promedio (n = 10). (B) Análisis de la marcha que muestra la longitud de la zancada, el tiempo de apoyo, la velocidad de balanceo y el área de la huella (n = 6). Los datos representan la media ± DE. La significancia estadística se indica como ns, no significativa. Abreviaturas: Control = grupo control; Laminectomía = grupo con laminectomía L5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluaciones cognitivo-conductuales tras laminectomía lumbar L5. (A) Prueba de reconocimiento de objeto novedoso (n = 10). (B) Prueba del laberinto en Y con brazo novedoso (n = 10). (C) Prueba del laberinto de Barnes (n = 10). Los datos representan la media ± DE. La significancia estadística se indica como *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. Abreviaturas: Control = grupo control; Laminectomía = grupo con laminectomía L5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación histológica de la región CA1 del hipocampo tras laminectomía lumbar L5. (A) Imágenes representativas de la tinción de Nissl en la región CA1 del hipocampo. (B) Cuantificación de neuronas positivas para Nissl (izquierda) y cuerpos de Nissl (derecha) (n = 5). (C) Imágenes representativas de inmunofluorescencia de Iba1 en la región CA1 del hipocampo. Barra de escala = 100 µm. (D) Cuantificación de la intensidad media de fluorescencia de Iba1 (n = 6). Los datos representan la media ± DE. La significancia estadística se indica como **P < 0,01 y ***P < 0,001. Abreviaturas: Control = grupo control; Laminectomía = grupo con laminectomía L5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Se ha informado de disfunción cognitiva posoperatoria en adultos mayores sometidos a cirugía espinal10. Evidencia experimental indica además que el envejecimiento incrementa la susceptibilidad al deterioro cognitivo asociado a la cirugía y a las respuestas neuroinflamatorias11,12. El presente protocolo combina aproximadamente 4 h de anestesia con sevoflurano con laminectomía L5 en ratones de edad avanzada para modelar el deterioro cognitivo temprano posoperatorio. Su valor metodológico principal radica en proporcionar un procedimiento práctico y accesible para investigar cambios conductuales e histológicos en el hipocampo tras una cirugía espinal.
Los modelos preclínicos de DCP incluyen la exposición únicamente a anestesia, cirugía abdominal y paradigmas de lesión ortopédica13. Los paradigmas con anestesia exclusiva permiten evaluar los efectos de los anestésicos en ausencia de trauma quirúrgico14, pero no reproducen la exposición combinada a anestesia y lesión tisular. Los modelos de cirugía abdominal y fractura de tibia incorporan lesión quirúrgica y se han utilizado para investigar el deterioro cognitivo asociado a la cirugía15,16. Sin embargo, sus sitios operatorios y patrones de lesión tisular difieren de los procedimientos espinales. Dado que el tipo e intensidad del trauma quirúrgico pueden afectar los resultados cognitivos postoperatorios y las respuestas inflamatorias centrales9, debe considerarse el contexto quirúrgico al seleccionar un modelo preclínico. Por lo tanto, el presente protocolo de laminectomía L5 proporciona un paradigma experimental relacionado con cirugía de columna para examinar el deterioro cognitivo temprano postoperatorio en ratones ancianos.
El desafío técnico principal de este protocolo consiste en eliminar suficiente hueso de la lámina L5 para exponer claramente la duramadre, evitando al mismo tiempo lesiones en esta última. Durante una laminectomía con visualización directa, es necesario controlar cuidadosamente la profundidad del instrumento, la fuerza de corte y el ángulo de inserción de las tijeras oftálmicas. El hueso debe eliminarse progresivamente mediante cortes pequeños y controlados a lo largo de los márgenes de la lámina. Agarrar el proceso espinoso L5 con pinzas y elevar el segmento lumbar operatorio hasta un ángulo de aproximadamente 30° con respecto a la plataforma quirúrgica amplía el espacio interlaminar L5-L6. Esta maniobra permite una inserción superficial de las puntas de las tijeras por debajo del borde óseo y reduce el riesgo de contacto con la duramadre. La eliminación incompleta del hueso puede limitar la exposición quirúrgica, mientras que un corte excesivamente agresivo o una profundidad de inserción excesiva podrían provocar lesión de la duramadre. Una hemorragia descontrolada puede dificultar la visibilidad del campo operatorio, comprometer la recuperación postoperatoria y aumentar la variabilidad en los resultados conductuales. Cuando el espacio interlaminar no es suficiente para la inserción segura de las puntas de las tijeras, se debe reajustar la posición y el ángulo de elevación del segmento lumbar operatorio en lugar de aumentar la profundidad de inserción. Si la hemorragia dificulta la visibilidad del campo operatorio, debe suspenderse temporalmente la eliminación del hueso hasta que se recupere una visualización adecuada, tras lo cual cualquier hueso restante debe retirarse de forma incremental.
La separación del músculo paravertebral y la laminectomía L5 pueden contribuir a un dolor postoperatorio transitorio, y se ha documentado hipersensibilidad mecánica tras laminectomía experimental en ratones17. Se administró meloxicam según un régimen analgésico predeterminado. Se ha informado que las expresiones faciales relacionadas con el dolor postoperatorio en ratones persisten aproximadamente entre 36 y 48 horas18. El régimen analgésico de 48 horas tuvo como objetivo cubrir este período postoperatorio temprano, y la evaluación cognitivo-conductual se inició el día 3 postoperatorio, tras la finalización del régimen analgésico, con el fin de reducir la posible influencia del dolor inmediato postoperatorio. La prueba del campo abierto se ha utilizado en estudios experimentales de DCP postoperatorio para evaluar la actividad locomotora espontánea y determinar si una locomoción reducida podría confundir el desempeño cognitivo-conductual19,20. Por consiguiente, la prueba del campo abierto y el análisis de la marcha se realizaron el día 3 postoperatorio, antes de la evaluación cognitiva. No se observaron diferencias significativas entre grupos en la actividad locomotora en el campo abierto ni en los parámetros de la marcha, lo que sugiere que las diferencias cognitivo-conductuales posteriores probablemente no se explicaron principalmente por una alteración motora evidente. Sin embargo, dado que el dolor espontáneo postoperatorio y la molestia por la herida no se evaluaron directamente, sus efectos residuales sobre el desempeño conductual no pueden descartarse por completo. Estudios futuros podrían incorporar evaluaciones directas del dolor espontáneo postoperatorio.
En general, este protocolo proporciona un enfoque experimental práctico para investigar el deterioro cognitivo postoperatorio temprano en ratones ancianos tras una laminectomía L5. Puede utilizarse para estudiar los resultados conductuales y los mecanismos subyacentes del deterioro cognitivo asociado a la cirugía de columna, así como para evaluar intervenciones destinadas a prevenir o reducir el deterioro cognitivo postoperatorio. La validación en cohortes más grandes y en laboratorios independientes ayudaría aún más a establecer la estabilidad y reproducibilidad del modelo.
Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
Agradecimientos
Agradecemos a Sanhua Fang de la plataforma de instalaciones centrales de la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang, a Yanhong Chen y a Xuliang Zhang del centro de animales de la Universidad de Zhejiang por su apoyo técnico. Este estudio fue financiado por las siguientes fuentes: Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (N.ºs 82575196, 82074535 y U23A20508).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J machos | Suzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd. | SYXK2023-0005 | Modelo animal |
| Software de seguimiento y análisis de video ANY-maze | Stoelting Co., USA | 6000 | Seguimiento y análisis de comportamiento mediante video |
| Pomada oftálmica de eritromicina | Beijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd. | H11021270 | Prevenir la sequedad ocular |
| Pinzas finas | NA | NA | Cortar la piel |
| Almohadilla calefactora | NA | NA | Controlada por temperatura |
| Anticuerpo monoclonal de conejo Iba1/AIF-1 (E4O4W) | Cell Signaling Technology | 17198 | Tinción de inmunofluorescencia para Iba1 |
| Equipo de anestesia inhalatoria | RWD Life Science Co., Ltd. | R581S | Anestesia |
| MGT-PR | Anhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., China | MJY2025112704 | Análisis de la marcha |
| Tijeras microoftálmicas | NA | NA | Eliminación de hueso |
| Solución de tinción de Nissl | Haoke Biotechnology Co., Ltd. | HK2033 | Tinción de Nissl |
| Tijeras | Shang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,Corp | Y00030 | Incisión de la piel |
| Sevoflurano | Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd. | 25062331 | Anestesia |
| Campos quirúrgicos de un solo uso | Jiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd. | 20212140221 | Plataforma para cirugía |
| Afeitadora para animales pequeños | Yiwu Leiben Trading Co., Ltd. | 2504KFZB3592-03310 | Depilación |
| Agujas quirúrgicas con hilo | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD. | F603 | Sutura de la piel |
| Cremas depilatorias Veet | RECKITT BENCKISER (India) Ltd | NA | Depilación |
Referencias
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