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Artículo de investigación
* These authors contributed equally
Este protocolo integra conjuntos de datos transcriptómicos públicos y la validación de células epiteliales del colon para identificar S100P como un biomarcador compartido asociado con enfermedad inflamatoria intestinal, cáncer colorrectal y adenocarcinoma pancreático.
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se asocia con un mayor riesgo de cáncer colorrectal (CCR) y adenocarcinoma pancreático (PAAD), aunque las características moleculares compartidas entre estas enfermedades siguen siendo incompletamente comprendidas. Este estudio tenía como objetivo identificar genes comunes y vías biológicas asociadas con EII, CRC y PAAD mediante análisis transcriptómico integrado y validación experimental. Los conjuntos de datos de expresión génica para EII, CRC y PAAD se obtuvieron de las bases de datos The Cancer Genome Atlas y Gene Expression Omnibus. Se realizaron análisis ponderados de redes de coexpresiones génicas y análisis de expresión diferencial para identificar genes asociados a la enfermedad y compartidos. Ontología de genes y Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (se utilizaron análisis para explorar funciones y vías biológicas enriquecidas. La infiltración de células inmunitarias se evaluó mediante la identificación de tipos celulares mediante la estimación de subconjuntos relativos de transcritos de ARN. Se realizó un análisis de características operativas del receptor para evaluar el rendimiento diagnóstico de genes comunes. Se realizó un análisis de secuenciación de ARN unicelular para examinar la distribución celular de S100P. Además, se evaluaron los efectos de la regulación a la baja de S100P en células epiteliales del colon estimuladas con lipopolisacáridos (LPS). Se identificaron un total de 162 genes asociados a la enfermedad y cuatro genes comunes. Los análisis de enriquecimiento funcional indicaron un enriquecimiento significativo de las vías relacionadas con el sistema inmunitario e inflamatorio, incluida la vía de señalización de la interleucina-17. El análisis de infiltración inmune reveló tendencias similares en varias poblaciones de células inmunitarias en EII, CRC y PAAD. El análisis de células individuales mostró una expresión elevada de S100P en células epiteliales de las tres enfermedades. La regulación a la baja de S100P restauró la capacidad proliferativa de las células epiteliales del colon estimuladas por LPS y redujo la expresión de citocinas inflamatorias. El análisis transcriptómico integrado identificó S100P como biomarcador asociado con EII, CRC y PAAD, y destacó características inmunitarias compartidas en estas enfermedades.
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) representa un espectro de trastornos inmunológicos que afectan al tracto gastrointestinal, incluyendo la colitis ulcerosa y la enfermedad deCrohn 1. La etiología de la EII es muy compleja, implicando anomalías inmunitarias mucosas, disbiosis y susceptibilidadgenética 2. La EII es una preocupación global de salud con tasas de incidencia crecientes y cargas económicas considerables, y su creciente prevalencia ha atraído considerableatención 1. Es importante destacar que los pacientes con EII tienen un riesgo significativamente mayor de desarrollar cáncer colorrectal (CRC)3 y adenocarcinoma pancreático (PAAD)4. Aunque esta asociación está bien documentada, la interacción genética entre EII, CRC y PAAD sigue siendo incompletamente comprendida.
Estudios previos sugieren firmemente que la EII, la CCR y la PAAD comparten procesos patógenos comunes; sin embargo, siguen faltando biomarcadores diagnósticos específicos y sensibles, y los mecanismos patógenos compartidos no se han elucidado completamente. Afortunadamente, con el rápido avance y la amplia disponibilidad de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (TI), numerosos conjuntos de datos transcriptómicos de pacientes con EII, CCR y PAAD se han hecho públicos y permiten una investigación sistemática de las interconexiones moleculares entre estasenfermedades 2,5,6.
Este estudio empleó datos de secuenciación de alto rendimiento de pacientes con EII, CCR y PAAD para identificar genes asociados a la enfermedad y compartidos mediante análisis ponderado de redes de coexpresión génica (WGCNA) y análisis de expresión diferencial. Estos genes se investigaron más a fondo para identificar posibles vías de señalización compartida entre EII, CRC y PAAD. Además, evaluamos el valor diagnóstico de estos genes comunes. El análisis de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) demostró que el gen clave S100P se expresaba predominantemente en células epiteliales. Finalmente, investigamos el papel biológico de S100P en la EII.
En conclusión, este estudio tuvo como objetivo identificar biomarcadores diagnósticos comunes y vías biológicas asociadas con la EII, la CRC y la PAAD, proporcionando así valiosos conocimientos clínicos sobre la prevención y tratamiento compartidos de estas enfermedades.
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Este estudio utilizó conjuntos de datos públicos y desidentificados del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) y el Gene Expression Omnibus (GEO), así como líneas celulares comerciales establecidas. No participaron participantes humanos recién reclutados, ni información identificable del paciente ni muestras derivadas de ellos. Todos los análisis se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales pertinentes y los términos de uso de las bases de datos públicas. Por lo tanto, no se requirió una aprobación ética institucional adicional ni consentimiento informado para este estudio.
Fuente de datos
Los datos RNA-seq para las cohortes IBD (GSE179285; plataforma: GPL6480 y GSE24287; plataforma: GPL6480), cohortes CRC (TCGA-CRC; plataforma: Illumina HiSeq 2000 y GSE87211; plataforma: GPL13497) y cohortes PAAD (GSE128735; plataforma: GPL20301 y GSE62452; plataforma: GPL6244) se descargaron de TCGA y la GEO. Todos los conjuntos de datos fueron consultados el 5 de diciembre de 2025.
Para cada conjunto de datos, las muestras se dividieron estrictamente en dos subgrupos, siendo los tejidos de la lesión/tumor de la enfermedad el grupo de caso y los tejidos normales no lesionados correspondientes como grupo de control. Concretamente, la cohorte de EII contenía 297 muestras de mucosa intestinal de pacientes con EII y 56 muestras de mucosa intestinal normal de individuos sanos; la cohorte de CRC incluyó 841 tejidos tumorales colorrectales primarios y 211 tejidos epiteliales colorectales normales adyacentes compatibles; y la cohorte de PAAD consistía en 114 tejidos tumorales de PAAD y 106 tejidos parenquimatosos pancreáticos normales.
Todos los conjuntos de datos dentro de la misma categoría de enfermedad se integraron de forma uniforme. La función normalizeBetweenArrays del paquete limma se aplicó para realizar la normalización de cuantiles entre muestras, eliminando efectivamente los efectos de lotes entre plataformas y estandarizando los valores de expresión génica entre diferentes conjuntos de datos para análisis de expresión diferencial posteriores.
Cribado de genes relacionados con EII, CRC y PAAD, así como genes comunes
Primero, se analizaron genes diferencialmente expresados (DEGs) de las cohortes IBD, CRC y PAAD utilizando el paquete limma, y los valores originales de P se corrigieron mediante el método de tasa de falsos descubrimientos (FDR) de Benjamini-Hochberg. En las cohortes IBD, CRC y PAAD, los criterios de cribado se establecieron en |logFC| > 0,4 y P < 0,05. Además, se realizó WGCNA en todos los genes, con un umbral mínimo de módulo de 100 (potencia de umbral suave = 0,90; tipo de red = firmado). En consecuencia, se identificaron DEGs comunes y genes de módulo en las tres cohortes. Los genes identificados consistentemente por ambos métodos se definieron como genes comunes, mientras que los genes restantes se categorizaron como genes relacionados.
IBP y Análisis de Enriquecimiento Funcional
Estos análisis se realizaron sobre los genes asociados a la enfermedad. El análisis de interacción proteína-proteína (IBP) se realizó utilizando la base de datos STRING (puntuación de interacción > 0,40). El análisis de enriquecimiento funcional incluyó análisis de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), que se realizaron utilizando clusterProfiler, enrichplot y org. Hs.eg.db paquetes (P < 0,05 y valor q ajustado FDR [método Benjamini–Hochberg] < 0,05).
Perfilado del microambiente inmune
CIBERSORT es un algoritmo fiable para estimar los niveles de infiltración de células inmunitarias a partir de datos de expresión génica utilizando la matriz de firma por defecto deLM22 7. En este estudio, se utilizó el algoritmo CIBERSORT para estimar el grado de infiltración de células inmunitarias en muestras de las cohortes IBD, CRC y PAAD, con el fin de explorar las características compartidas del microambiente inmune entre las tres enfermedades. El análisis se realizó con 1.000 permutaciones para calcular valores P para cada muestra, y se aplicó la normalización cuantilística (QN = TRUE) al archivo de expresión de mezcla. Solo se conservaron muestras con un valor CIBERSORT P < 0,05 para análisis posteriores, asegurando la fiabilidad de los resultados de la deconvolución.
Evaluación del valor diagnóstico de los genes comunes
El valor diagnóstico de los genes comunes en las cohortes IBD, CRC y PAAD se evaluó mediante análisis de características de operación del receptor (ROC) con el paquete pROC en R. El equilibrio óptimo entre sensibilidad y especificidad se visualizó utilizando curvas ROC.
qRT-PCR, transfección celular y ensayo de formación de colonias
Según estudios previos se realizaron qRT-PCR y transfección celular 8,9,10. La transfección transitoria se realizó utilizando el reactivo de transfección jetPRIME (Polyplus, China) según las instrucciones del fabricante. Las células se incubaban con la mezcla de transfección durante 6 horas, tras lo cual el medio se reemplazaba por DMEM completo. Los experimentos posteriores se realizaron 48 horas después de la transfección.
En resumen, se extrajo ARN celular total utilizando reactivo TRIzol. El ARN se transcribió inversamente en ADNc usando PrimeScript RT Master Mix. La PCR cuantitativa se realizó utilizando la qPCR TB Green. La β-actina se utilizó como gen de referencia interno para la normalización de la expresión. Se realizaron experimentos biológicos en triplicado. Las secuencias de cebadores y la secuencia siS100P pueden encontrarse en un estudio anterior 11.
Se obtuvieron las celdas NCM460, FHC, HCT116, SW116, PANC1 y BXPC2 según la lista de la Tabla de Materiales. Todas las líneas celulares fueron identificadas y analizadas por micoplasmas.
Durante los experimentos, todas las células pasaron durante 3–5 generaciones. Todas las células se cultivaron en DMEM completo que contenía un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina.
El ensayo de formación de colonias se realizó tal y como se describió en un estudioanterior 12. Brevemente, se sembraron 1.000 células en cada pozo de una placa de 6 pozos y se cultivaron durante 10 días antes de que el experimento terminara. Las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído, se teñieron con 0,1% de violeta cristalino y se contaron las colonias usando ImageJ.
Análisis de genes comunes basados en datos de scRNA-seq
Los datos de scRNA-seq del conjunto de datos IBD (GSE214695), CRC dataset (GSE166555) y PAAD dataset (GSE154778) fueron preprocesados como se describió en estudiosprevios 8,13. Las matrices de recuento en bruto se colapsaron mediante la expresión media para símbolos génicos duplicados usando limma::avereps. El filtrado inicial retuvo genes detectados en al menos tres células y células que contenían al menos 50 transcritos únicos. Se eliminaron células con una fracción de transcrito mitocondrial >5% o menos de 50 genes detectados. La normalización logarítmica se realizó con un factor de escala de 10.000, seguida de una transformación estabilizadora de varianzas para identificar los 1.500 genes más variables que fueron estandarizados con puntuación Z antes del análisis de componentes principales (PCA). Los genes marcadores definidores de conglomerados se filtraron usandologarítmic 2 (cambio de multiplicación) > 0,5, una fracción de detección ≥0,25 en los grupos objetivo y un valor P ajustado <0,05.
Brevemente, el preprocesamiento de datos se realizó usando el paquete Serat, y la anotación por tipo de celda se realizó usando el paquete SingleR (versión 2.6.0). El agrupamiento de celdas se realizó en Seurat usando construcción de grafos k-vecinos más cercanos y incrustación t-SNE basada en las dimensiones PCA 1–20. A continuación, se examinaron la distribución y los niveles de expresión de los genes comunes entre diferentes tipos celulares.
Construcción del modelo IBD
Según estudiosprevios, 14 lipopolisacáridos (LPS) se utilizaron para inducir inflamación en células epiteliales del colon humano normal (FHC y NCM460), generando así un modelo de EII que imita la inflamación. Se realizaron experimentos biológicos en triplicado. Las células se cultivaban rutinariamente en una incubadora humidificada a 37°C con un 5% deCO2. Cuando la confluencia celular alcanzó aproximadamente el 50%–70%, el medio de cultivo se reemplazó por medio fresco y completo, y las células se trataron con 10 ng/mL LPS durante 12 horas. Se utilizó un volumen igual de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) como control del vehículo. El volumen de cultivo era de 2 mL por pozo en placas de 6 pozos. Tras el tratamiento, se retiró el medio, se lavaron dos veces las células con PBS estéril preenfriado y se recogieron para análisis posteriores.
Análisis estadístico
Todos los análisis bioinformáticos se realizaron utilizando el software R (versión 4.1.2). Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando el test t de Student, mientras que las comparaciones entre varios grupos se realizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). El análisis de correlación se realizó utilizando el método Spearman. Todos los experimentos celulares se repitieron al menos tres veces, y los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DS). Un valor P o FDR < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. NS, no significativo; P < 0,05 (*), P < 0,01 (**) y P < 0,001 (***).
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DEGs en IBD, CRC y PAAD
En primer lugar, se integraron las cohortes de EII (GSE179285 y GSE24287), las cohortes de CRC (TCGA-CRC y GSE87211) y las cohortes de PAAD (GSE128735 y GSE62452), y la integración se evaluó utilizando gráficos de densidad de expresión génica y PCA. Los resultados mostraron que los efectos de lote entre los diferentes conjuntos de datos se eliminaron efectivamente tras la integración (Figura 1A–F)....
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Estudios previos han destacado la asociación de la EII, un trastorno gastrointestinal relacionado con el sistema inmunológico, con varias enfermedades, incluyendo enfermedadesneurodegenerativas 17, esclerosismúltiple 18, esclerosis lateralamiotrófica 19, endometriosis20, artritis reumatoide2, linfomade Hodgkin 21, CRC22 y ...
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Conflicto de intereses:
Los autores no declaran intereses en competencia.
Los autores reconocen el apoyo financiero del Plan Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Subvención nº 2023YFB3210400).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BXPC2 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| CIBERSORT | N/A | N/A | Immune cell infiltration analysis |
| clusterProfiler package | Bioconductor | v4.8.0 | Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | Cell culture supplement |
| FHC cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| GEO dataset (GSE128735) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE154778) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE166555) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for colorectal cancer |
| GEO dataset (GSE179285) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE214695) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE24287) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE62452) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE87211) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for colorectal cancer |
| ggplot2 package | CRAN | v3.4.2 | Data visualization |
| HCT116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | v1.8.0 | Colony counting |
| jetPRIME Transfection Reagent | Polyplus | 101000046 | Cell transfection |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Beyotime Co., Ltd | S1735 | Induction of an inflammation-mimicking IBD cell model |
| limma package | Bioconductor | v3.54.0 | Differential expression analysis |
| NCM460 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| org.Hs.eg.db package | Bioconductor | v3.23.1 | Gene annotation for enrichment analysis |
| PANC1 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| Penicillin–streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic supplement for cell culture |
| pheatmap package | CRAN | v1.0.12 | Heatmap visualization |
| pROC package | CRAN | v1.19.0.1 | Receiver operating characteristic (ROC) analysis |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | RR036A | Reverse transcription of RNA into cDNA |
| Primer sets for qRT-PCR | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Primer sequences reported in Reference 11 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.1.2 | Statistical and bioinformatics analyses |
| Seurat package | CRAN | v4.0 | Single-cell RNA sequencing data preprocessing and analysis |
| siS100P | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Small interfering RNA targeting S100P |
| SingleR package | Bioconductor | v2.6.0 | Cell type annotation for single-cell RNA sequencing |
| STRING database | STRING Consortium | N/A | Protein-protein interaction analysis |
| SW1116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| TB Green qPCR Mix | Takara Bio | RR430B | Quantitative real-time PCR |
| TCGA-CRC dataset | The Cancer Genome Atlas (TCGA) | N/A | Public colorectal cancer transcriptomic dataset |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA extraction |
| WGCNA package | CRAN | v1.73 | Weighted gene co-expression network analysis |
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