Este protocolo integra conjuntos de datos transcriptómicos públicos y la validación de células epiteliales del colon para identificar S100P como un biomarcador compartido asociado con enfermedad inflamatoria intestinal, cáncer colorrectal y adenocarcinoma pancreático.
Artículo de investigación
S100P como biomarcador compartido en enfermedades inflamatorias intestinales, cáncer colorrectal y adenocarcinoma pancreático: un análisis transcriptómico integrado
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) se asocia con un mayor riesgo de cáncer colorrectal (CCR) y adenocarcinoma pancreático (PAAD), aunque las características moleculares compartidas entre estas enfermedades siguen siendo incompletamente comprendidas. Este estudio tenía como objetivo identificar genes comunes y vías biológicas asociadas con EII, CRC y PAAD mediante análisis transcriptómico integrado y validación experimental. Los conjuntos de datos de expresión génica para EII, CRC y PAAD se obtuvieron de las bases de datos The Cancer Genome Atlas y Gene Expression Omnibus. Se realizaron análisis ponderados de redes de coexpresiones génicas y análisis de expresión diferencial para identificar genes asociados a la enfermedad y compartidos. Ontología de genes y Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (se utilizaron análisis para explorar funciones y vías biológicas enriquecidas. La infiltración de células inmunitarias se evaluó mediante la identificación de tipos celulares mediante la estimación de subconjuntos relativos de transcritos de ARN. Se realizó un análisis de características operativas del receptor para evaluar el rendimiento diagnóstico de genes comunes. Se realizó un análisis de secuenciación de ARN unicelular para examinar la distribución celular de S100P. Además, se evaluaron los efectos de la regulación a la baja de S100P en células epiteliales del colon estimuladas con lipopolisacáridos (LPS). Se identificaron un total de 162 genes asociados a la enfermedad y cuatro genes comunes. Los análisis de enriquecimiento funcional indicaron un enriquecimiento significativo de las vías relacionadas con el sistema inmunitario e inflamatorio, incluida la vía de señalización de la interleucina-17. El análisis de infiltración inmune reveló tendencias similares en varias poblaciones de células inmunitarias en EII, CRC y PAAD. El análisis de células individuales mostró una expresión elevada de S100P en células epiteliales de las tres enfermedades. La regulación a la baja de S100P restauró la capacidad proliferativa de las células epiteliales del colon estimuladas por LPS y redujo la expresión de citocinas inflamatorias. El análisis transcriptómico integrado identificó S100P como biomarcador asociado con EII, CRC y PAAD, y destacó características inmunitarias compartidas en estas enfermedades.
Introducción
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) representa un espectro de trastornos inmunológicos que afectan al tracto gastrointestinal, incluyendo la colitis ulcerosa y la enfermedad deCrohn 1. La etiología de la EII es muy compleja, implicando anomalías inmunitarias mucosas, disbiosis y susceptibilidadgenética 2. La EII es una preocupación global de salud con tasas de incidencia crecientes y cargas económicas considerables, y su creciente prevalencia ha atraído considerableatención 1. Es importante destacar que los pacientes con EII tienen un riesgo significativamente mayor de desarrollar cáncer colorrectal (CRC)3 y adenocarcinoma pancreático (PAAD)4. Aunque esta asociación está bien documentada, la interacción genética entre EII, CRC y PAAD sigue siendo incompletamente comprendida.
Estudios previos sugieren firmemente que la EII, la CCR y la PAAD comparten procesos patógenos comunes; sin embargo, siguen faltando biomarcadores diagnósticos específicos y sensibles, y los mecanismos patógenos compartidos no se han elucidado completamente. Afortunadamente, con el rápido avance y la amplia disponibilidad de tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (TI), numerosos conjuntos de datos transcriptómicos de pacientes con EII, CCR y PAAD se han hecho públicos y permiten una investigación sistemática de las interconexiones moleculares entre estasenfermedades 2,5,6.
Este estudio empleó datos de secuenciación de alto rendimiento de pacientes con EII, CCR y PAAD para identificar genes asociados a la enfermedad y compartidos mediante análisis ponderado de redes de coexpresión génica (WGCNA) y análisis de expresión diferencial. Estos genes se investigaron más a fondo para identificar posibles vías de señalización compartida entre EII, CRC y PAAD. Además, evaluamos el valor diagnóstico de estos genes comunes. El análisis de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) demostró que el gen clave S100P se expresaba predominantemente en células epiteliales. Finalmente, investigamos el papel biológico de S100P en la EII.
En conclusión, este estudio tuvo como objetivo identificar biomarcadores diagnósticos comunes y vías biológicas asociadas con la EII, la CRC y la PAAD, proporcionando así valiosos conocimientos clínicos sobre la prevención y tratamiento compartidos de estas enfermedades.
Protocolo
Este estudio utilizó conjuntos de datos públicos y desidentificados del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) y el Gene Expression Omnibus (GEO), así como líneas celulares comerciales establecidas. No participaron participantes humanos recién reclutados, ni información identificable del paciente ni muestras derivadas de ellos. Todos los análisis se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales pertinentes y los términos de uso de las bases de datos públicas. Por lo tanto, no se requirió una aprobación ética institucional adicional ni consentimiento informado para este estudio.
Fuente de datos
Los datos RNA-seq para las cohortes IBD (GSE179285; plataforma: GPL6480 y GSE24287; plataforma: GPL6480), cohortes CRC (TCGA-CRC; plataforma: Illumina HiSeq 2000 y GSE87211; plataforma: GPL13497) y cohortes PAAD (GSE128735; plataforma: GPL20301 y GSE62452; plataforma: GPL6244) se descargaron de TCGA y la GEO. Todos los conjuntos de datos fueron consultados el 5 de diciembre de 2025.
Para cada conjunto de datos, las muestras se dividieron estrictamente en dos subgrupos, siendo los tejidos de la lesión/tumor de la enfermedad el grupo de caso y los tejidos normales no lesionados correspondientes como grupo de control. Concretamente, la cohorte de EII contenía 297 muestras de mucosa intestinal de pacientes con EII y 56 muestras de mucosa intestinal normal de individuos sanos; la cohorte de CRC incluyó 841 tejidos tumorales colorrectales primarios y 211 tejidos epiteliales colorectales normales adyacentes compatibles; y la cohorte de PAAD consistía en 114 tejidos tumorales de PAAD y 106 tejidos parenquimatosos pancreáticos normales.
Todos los conjuntos de datos dentro de la misma categoría de enfermedad se integraron de forma uniforme. La función normalizeBetweenArrays del paquete limma se aplicó para realizar la normalización de cuantiles entre muestras, eliminando efectivamente los efectos de lotes entre plataformas y estandarizando los valores de expresión génica entre diferentes conjuntos de datos para análisis de expresión diferencial posteriores.
Cribado de genes relacionados con EII, CRC y PAAD, así como genes comunes
Primero, se analizaron genes diferencialmente expresados (DEGs) de las cohortes IBD, CRC y PAAD utilizando el paquete limma, y los valores originales de P se corrigieron mediante el método de tasa de falsos descubrimientos (FDR) de Benjamini-Hochberg. En las cohortes IBD, CRC y PAAD, los criterios de cribado se establecieron en |logFC| > 0,4 y P < 0,05. Además, se realizó WGCNA en todos los genes, con un umbral mínimo de módulo de 100 (potencia de umbral suave = 0,90; tipo de red = firmado). En consecuencia, se identificaron DEGs comunes y genes de módulo en las tres cohortes. Los genes identificados consistentemente por ambos métodos se definieron como genes comunes, mientras que los genes restantes se categorizaron como genes relacionados.
IBP y Análisis de Enriquecimiento Funcional
Estos análisis se realizaron sobre los genes asociados a la enfermedad. El análisis de interacción proteína-proteína (IBP) se realizó utilizando la base de datos STRING (puntuación de interacción > 0,40). El análisis de enriquecimiento funcional incluyó análisis de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), que se realizaron utilizando clusterProfiler, enrichplot y org. Hs.eg.db paquetes (P < 0,05 y valor q ajustado FDR [método Benjamini–Hochberg] < 0,05).
Perfilado del microambiente inmune
CIBERSORT es un algoritmo fiable para estimar los niveles de infiltración de células inmunitarias a partir de datos de expresión génica utilizando la matriz de firma por defecto deLM22 7. En este estudio, se utilizó el algoritmo CIBERSORT para estimar el grado de infiltración de células inmunitarias en muestras de las cohortes IBD, CRC y PAAD, con el fin de explorar las características compartidas del microambiente inmune entre las tres enfermedades. El análisis se realizó con 1.000 permutaciones para calcular valores P para cada muestra, y se aplicó la normalización cuantilística (QN = TRUE) al archivo de expresión de mezcla. Solo se conservaron muestras con un valor CIBERSORT P < 0,05 para análisis posteriores, asegurando la fiabilidad de los resultados de la deconvolución.
Evaluación del valor diagnóstico de los genes comunes
El valor diagnóstico de los genes comunes en las cohortes IBD, CRC y PAAD se evaluó mediante análisis de características de operación del receptor (ROC) con el paquete pROC en R. El equilibrio óptimo entre sensibilidad y especificidad se visualizó utilizando curvas ROC.
qRT-PCR, transfección celular y ensayo de formación de colonias
Según estudios previos se realizaron qRT-PCR y transfección celular 8,9,10. La transfección transitoria se realizó utilizando el reactivo de transfección jetPRIME (Polyplus, China) según las instrucciones del fabricante. Las células se incubaban con la mezcla de transfección durante 6 horas, tras lo cual el medio se reemplazaba por DMEM completo. Los experimentos posteriores se realizaron 48 horas después de la transfección.
En resumen, se extrajo ARN celular total utilizando reactivo TRIzol. El ARN se transcribió inversamente en ADNc usando PrimeScript RT Master Mix. La PCR cuantitativa se realizó utilizando la qPCR TB Green. La β-actina se utilizó como gen de referencia interno para la normalización de la expresión. Se realizaron experimentos biológicos en triplicado. Las secuencias de cebadores y la secuencia siS100P pueden encontrarse en un estudio anterior 11.
Se obtuvieron las celdas NCM460, FHC, HCT116, SW116, PANC1 y BXPC2 según la lista de la Tabla de Materiales. Todas las líneas celulares fueron identificadas y analizadas por micoplasmas.
Durante los experimentos, todas las células pasaron durante 3–5 generaciones. Todas las células se cultivaron en DMEM completo que contenía un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina.
El ensayo de formación de colonias se realizó tal y como se describió en un estudioanterior 12. Brevemente, se sembraron 1.000 células en cada pozo de una placa de 6 pozos y se cultivaron durante 10 días antes de que el experimento terminara. Las células se fijaron con un 4% de paraformaldehído, se teñieron con 0,1% de violeta cristalino y se contaron las colonias usando ImageJ.
Análisis de genes comunes basados en datos de scRNA-seq
Los datos de scRNA-seq del conjunto de datos IBD (GSE214695), CRC dataset (GSE166555) y PAAD dataset (GSE154778) fueron preprocesados como se describió en estudiosprevios 8,13. Las matrices de recuento en bruto se colapsaron mediante la expresión media para símbolos génicos duplicados usando limma::avereps. El filtrado inicial retuvo genes detectados en al menos tres células y células que contenían al menos 50 transcritos únicos. Se eliminaron células con una fracción de transcrito mitocondrial >5% o menos de 50 genes detectados. La normalización logarítmica se realizó con un factor de escala de 10.000, seguida de una transformación estabilizadora de varianzas para identificar los 1.500 genes más variables que fueron estandarizados con puntuación Z antes del análisis de componentes principales (PCA). Los genes marcadores definidores de conglomerados se filtraron usandologarítmic 2 (cambio de multiplicación) > 0,5, una fracción de detección ≥0,25 en los grupos objetivo y un valor P ajustado <0,05.
Brevemente, el preprocesamiento de datos se realizó usando el paquete Serat, y la anotación por tipo de celda se realizó usando el paquete SingleR (versión 2.6.0). El agrupamiento de celdas se realizó en Seurat usando construcción de grafos k-vecinos más cercanos y incrustación t-SNE basada en las dimensiones PCA 1–20. A continuación, se examinaron la distribución y los niveles de expresión de los genes comunes entre diferentes tipos celulares.
Construcción del modelo IBD
Según estudiosprevios, 14 lipopolisacáridos (LPS) se utilizaron para inducir inflamación en células epiteliales del colon humano normal (FHC y NCM460), generando así un modelo de EII que imita la inflamación. Se realizaron experimentos biológicos en triplicado. Las células se cultivaban rutinariamente en una incubadora humidificada a 37°C con un 5% deCO2. Cuando la confluencia celular alcanzó aproximadamente el 50%–70%, el medio de cultivo se reemplazó por medio fresco y completo, y las células se trataron con 10 ng/mL LPS durante 12 horas. Se utilizó un volumen igual de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) como control del vehículo. El volumen de cultivo era de 2 mL por pozo en placas de 6 pozos. Tras el tratamiento, se retiró el medio, se lavaron dos veces las células con PBS estéril preenfriado y se recogieron para análisis posteriores.
Análisis estadístico
Todos los análisis bioinformáticos se realizaron utilizando el software R (versión 4.1.2). Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando el test t de Student, mientras que las comparaciones entre varios grupos se realizaron mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA). El análisis de correlación se realizó utilizando el método Spearman. Todos los experimentos celulares se repitieron al menos tres veces, y los datos se presentan como la media ± desviación estándar (DS). Un valor P o FDR < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. NS, no significativo; P < 0,05 (*), P < 0,01 (**) y P < 0,001 (***).
Resultados
DEGs en IBD, CRC y PAAD
En primer lugar, se integraron las cohortes de EII (GSE179285 y GSE24287), las cohortes de CRC (TCGA-CRC y GSE87211) y las cohortes de PAAD (GSE128735 y GSE62452), y la integración se evaluó utilizando gráficos de densidad de expresión génica y PCA. Los resultados mostraron que los efectos de lote entre los diferentes conjuntos de datos se eliminaron efectivamente tras la integración (Figura 1A–F).
Figura 1. Normalización de las cohortes de enfermedad inflamatoria intestinal (EII), cáncer colorrectal (CCR) y adenocarcinoma pancreático (PAAD). (A) El análisis de componentes principales (PCA) traza gráficos antes y después de la normalización de las cohortes de EII (GSE179285 y GSE24287). (B) Gráficos de distribución de la expresión génica antes y después de la normalización de las cohortes de EII. (C) Gráficos de PCA antes y después de la normalización de las cohortes de CRC (TCGA-CRC y GSE87211). (D) Gráficos de distribución de expresión génica antes y después de la normalización de las cohortes de CRC. (E) Gráficos de PCA antes y después de la normalización de las cohortes PAAD (GSE62452 y GSE128735). (F) Gráficos de distribución de expresión génica antes y después de la normalización de las cohortes PAAD. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Tras la integración del conjunto de datos y la corrección del efecto por lotes, se realizó un análisis diferencial de expresión en las cohortes IBD, CRC y PAAD. Dentro de cada cohorte, se compararon tejidos de lesiones o tumores de enfermedad con tejidos normales emparejados para identificar DEGs. En la cohorte de EII, se identificaron 183 DEGs, incluyendo 64 genes regulados a la baja y 119 genes regulados al alza (Figura 2A). En la cohorte de CRC, se identificaron 5.064 DEG, incluyendo 2.477 genes con regulación a la baja y 2.587 genes con regulación alza (Figura 2B). En la cohorte PAAD, se identificaron 2.293 DEGs, incluyendo 901 genes regulados a la baja y 1.392 genes regulados al alza (Figura 2C). En total, se identificaron 40 DEGs superpuestas entre las cohortes de EII, CRC y PAAD (Figura 2D).
Figura 2. Análisis diferencial de expresión de cohortes de EII, CCR y PAAD. (A) Mapa de calor y gráfico volcánico de genes diferencialmente expresados (DEGs) en la cohorte de EII. (B) Mapa de calor y gráfico volcánico de los DEGs en la cohorte CRC. (C) Mapa de calor y gráfico volcánico de los DEGs en la cohorte PAAD. (D) Diagrama de Venn que muestra los solapamientos de DEG entre las cohortes IBD, CRC y PAAD. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
WGCNA en IBD, CRC y PAAD
La WGCNA se realizó en las cohortes de EII, CRC y PAAD. En la cohorte de EII, se identificaron tres módulos estrechamente asociados con rasgos clínicos, siendo los módulos MEbrown y MEturquoise los que mostraron las correlaciones más fuertes (Figura 3A). De manera similar, en la cohorte de CRC, se identificaron ocho módulos estrechamente asociados con rasgos clínicos, siendo los módulos MEbrown y MEturquoise los que mostraron las correlaciones más fuertes (Figura 3B). En la cohorte PAAD, se identificó un módulo estrechamente asociado con rasgos clínicos, siendo los módulos MEblack y MEbrown las que mostraron las correlaciones más fuertes (Figura 3C).
Figura 3. Análisis ponderado de la red de coexpresión génica (WGCNA) de las cohortes de EII, CRC y PAAD. (A) Mapa de calor que muestra correlaciones entre los módulos de coexpresión génica y los rasgos clínicos en la cohorte de EII. (B) Mapa de calor que muestra correlaciones entre módulos de coexpresión génica y rasgos clínicos en la cohorte de CRC. (C) Mapa de calor que muestra correlaciones entre los módulos de coexpresión génica y los rasgos clínicos en la cohorte PAAD. (D) Diagrama de Venn que muestra genes superpuestos identificados a partir de módulos clave de coexpresión en las cohortes IBD, CRC y PAAD. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
A partir de genes de módulos significativamente correlacionados con rasgos clínicos, se identificaron 434 genes asociados a módulos potencialmente implicados en EII, CRC y PAAD (Figura 3D).
Análisis de enriquecimiento funcional de genes comunes en EII, CRC y PAAD
Combinando los resultados del análisis de expresión diferencial y el WGCNA, se identificaron 40 DEG comunes y 122 genes asociados a módulos comunes. Para investigar las características moleculares compartidas de la EII, la CRC y la PAAD, estos genes se integraron para un análisis posterior, resultando en 158 genes asociados a la enfermedad.
Primero, los 158 genes se analizaron utilizando la base de datos STRING para construir una red PPI (Figura 4A). Posteriormente, se realizaron análisis de enriquecimiento GO y KEGG. El análisis GO reveló un enriquecimiento significativo en procesos biológicos, incluido el proceso metabólico hormonal (Figuras 4B,C), mientras que el análisis KEGG mostró enriquecimiento en vías como la vía de señalización de la interleucina-17 (IL-17) y la vía de señalización del receptor activado por proliferadores de peroxisomas (PPAR) (Figuras 4D,E).
Figura 4. Análisis de enriquecimiento funcional de genes asociados a enfermedades identificados en EII, CRC y PAAD. (A) Red de genes asociados a enfermedades de interacción proteína-proteína (PPI). (B) Análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) presentado como un gráfico de puntos de procesos biológicos enriquecidos, componentes celulares y términos de función molecular. (C) Red gen–concepto de GO que muestra las relaciones entre términos GO enriquecidos y genes asociados. (D) Análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) presentado como un gráfico de puntos. (E) Red gen–vía KEGG que muestra las relaciones entre las vías enriquecidas y los genes asociados. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Análisis de correlación de genes comunes con infiltración celular inmunitaria en EII, CRC y PAAD
CIBERSORT se utilizó para estimar los niveles de infiltración de células inmunitarias en las cohortes de EII, CRC y PAAD. En la cohorte de EII, se observaron diferencias en los niveles de infiltración de células inmunitarias entre muestras normales y de EII (Figura 5A), y se evaluaron correlaciones entre genes comunes y poblaciones de células inmunitarias (Figura 5B). De manera similar, se observaron diferencias en los niveles de infiltración de células inmunitarias entre muestras normales y de CRC en la cohorte de CRC (Figura 5C), y se evaluaron correlaciones entre genes comunes y poblaciones de células inmunitarias (Figura 5D). En la cohorte PAAD, también se observaron diferencias en los niveles de infiltración de células inmunitarias entre muestras normales y PAAD (Figura 5E), y se evaluaron correlaciones entre genes comunes y poblaciones de células inmunitarias (Figura 5F).
Figura 5. Análisis de infiltración de células inmunitarias en cohortes de EII, CRC y PAAD. (A) Gráficos de violín que muestran las proporciones estimadas de poblaciones de células inmunitarias en la cohorte de EII. (B) Análisis de correlación entre genes comunes y poblaciones de células inmunitarias en la cohorte de EII, incluyendo el mapa de calor de correlación de células inmunitarias y la red de asociación gen-célula inmune. (C) Gráficos de violín que muestran las proporciones estimadas de poblaciones de células inmunitarias en la cohorte de CRC. (D) Análisis de correlación entre genes comunes y poblaciones de células inmunitarias en la cohorte CRC, incluyendo el mapa de calor de correlación de células inmunitarias y la red de asociación gen-célula inmune. (E) Gráficos de violín que muestran las proporciones estimadas de poblaciones de células inmunitarias en la cohorte PAAD. (F) Análisis de correlación entre genes comunes y poblaciones de células inmunitarias en la cohorte PAAD, incluyendo el mapa de calor de correlación de células inmunitarias y la red de asociación gen-célula inmune. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Evaluación del valor potencial de genes comunes en EII, CRC y PAAD
Los patrones de expresión de los genes comunes se evaluaron más a fondo en las cohortes de EII, CRC y PAAD. S100P se sobreexpresó consistentemente en las tres cohortes (Figura 6A, D, G). Además, se evaluó el rendimiento diagnóstico de los genes comunes mediante análisis ROC.
Figura 6. Rendimiento diagnóstico de genes comunes en cohortes de EII, CRC y PAAD. (A) Niveles de expresión de FXYD3, S100P, PLA2G2A y MUC1 en la cohorte de EII. (B) Curvas de características de funcionamiento del receptor (ROC) que muestran el rendimiento diagnóstico de genes comunes individuales en la cohorte de EII. (C) Curva ROC que muestra el rendimiento diagnóstico del modelo diagnóstico combinado en la cohorte de EII. (D) Niveles de expresión de FXYD3, S100P, PLA2G2A y MUC1 en la cohorte CRC. (E) Curvas ROC que muestran el rendimiento diagnóstico de genes comunes individuales en la cohorte de CRC. (F) Curva ROC que muestra el rendimiento diagnóstico del modelo diagnóstico combinado en la cohorte de CRC. (G) Niveles de expresión de FXYD3, S100P, PLA2G2A y MUC1 en la cohorte PAAD. (H) Curvas ROC que muestran el rendimiento diagnóstico de genes comunes individuales en la cohorte PAAD. (I) Curva ROC que muestra el rendimiento diagnóstico del modelo diagnóstico combinado en la cohorte PAAD. Se muestran los valores de área bajo la curva (AUC) y los correspondientes intervalos de confianza del 95% cuando corresponde. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
En la cohorte IBD, los valores del área bajo la curva (AUC) fueron 0,626 para FXYD3, 0,597 para S100P, 0,670 para PLA2G2A y 0,697 para MUC1, mientras que el modelo diagnóstico combinado arrojó un AUC de 0,815 (Figura 6B,C). De manera similar, en la cohorte de CRC, los valores de AUC fueron 0,839 para FXYD3, 0,738 para S100P, 0,716 para PLA2G2A y 0,672 para MUC1, mientras que el modelo diagnóstico combinado arrojó un AUC de 0,925 (Figura 6E,F). En la cohorte PAAD, los valores de AUC fueron 0,852 para FXYD3, 0,896 para S100P, 0,637 para PLA2G2A y 0,733 para MUC1, mientras que el modelo diagnóstico combinado arrojó un AUC de 0,901 (Figura 6H,I).
Análisis de scRNA-seq basado en genes comunes
Tras el preprocesamiento de los datos scRNA-seq del conjunto de datos de EII, se identificaron 17 clústeres celulares y 8 tipos celulares. A continuación, se evaluó la distribución de los genes comunes entre diferentes poblaciones celulares, y se encontró que los genes comunes se expresaban predominantemente en células epiteliales (Figura 7A). De manera similar, el preprocesamiento del conjunto de datos CRC identificó 20 clústeres celulares y 8 tipos celulares, con los genes comunes también predominantemente expresados en células epiteliales (Figura 7B). Finalmente, el preprocesamiento del conjunto de datos PAAD identificó 19 grupos celulares y 7 tipos celulares, y los genes comunes también se expresaron predominantemente en células epiteliales (Figura 7C).
Figura 7. Análisis de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) de genes comunes en TEJIs de EII, CRC y PAAD. (A) Visualización de aproximación y proyección uniforme de variedades (UMAP) de los clústeres celulares en el conjunto de datos IBD (GSE214695), anotaciones correspondientes por tipo celular y gráficos de características que muestran la expresión de FXYD3, S100P, PLA2G2A y MUC1 entre poblaciones celulares. (B) Visualización UMAP de los clústeres celulares en el conjunto de datos CRC (GSE166555), anotaciones correspondientes por tipos celulares y gráficos de características que muestran la expresión de FXYD3, S100P, PLA2G2A y MUC1 entre poblaciones celulares. (C) Visualización UMAP de los grupos celulares en el conjunto de datos PAAD (GSE154778), anotaciones correspondientes por tipos celulares y gráficos de características que muestran la expresión de FXYD3, S100P, PLA2G2A y MUC1 entre poblaciones celulares. Las escalas de color indican los niveles relativos de expresión génica. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Función biológica de S100P en la EII
Dada la sobreexpresión constante de S100P en las cohortes de EII, CRC y PAAD, junto con informes previos que describían su papel en la CRC yPAAD 15,16, este estudio investigó más a fondo la función biológica de S100P en la EII.
En primer lugar, la expresión de S100P aumentó significativamente en el modelo de EII inducida por LPS, y se confirmó la eficiencia de reducción de siS100P (Figura 8A,B). Además, el tratamiento con LPS redujo la proliferación celular, mientras que la inhibición de la expresión de S100P restauró parcialmente la proliferación celular (Figura 8C). Además, el knockdown de S100P redujo significativamente la expresión de IL-1β, IL-6 y TNF-α en las líneas celulares modelo de EII FHC y NCM460 (Figuras 8D,E). Finalmente, la regulación a la baja de S100P redujo la expresión de IL17RA en células epiteliales del colon, células CRC y células PAAD (Figura 8F).
Figura 8. La regulación a la baja de S100P atenúa las respuestas inflamatorias inducidas por lipopolisacáridos (LPS) en células epiteliales del colon. (A) Expresión relativa de ARNm de S100P en células FHC tras la estimulación de LPS y el knockdown de S100P. (B) Expresión relativa de ARNm de S100P en células NCM460 tras estimulación LPS y knockdown de S100P. (C) Imágenes representativas de formación de colonias y cuantificación de la proliferación celular en células FHC y NCM460 tras estimulación LPS y knockdown de S100P. (D) Medición ELISA de los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α en células FHC tras la estimulación LPS y el knockdown de S100P. (E) Medición ELISA de los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α en células NCM460 tras estimulación LPS y knockdown de S100P. (F) Expresión relativa de ARNm de IL-17RA tras el knockdown de S100P en células FHC, NCM460, HCT116, SW1116, PANC-1 y BxPC-3. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Disponibilidad de datos
Los conjuntos de datos analizados durante el estudio actual están disponibles públicamente en TCGA y en el repositorio GEO bajo los números de acceso TCGA-CRC, GSE179285, GSE24287, GSE87211, GSE128735, GSE62452, GSE214695, GSE166555 y GSE154778. No se generaron nuevos conjuntos de datos de secuenciación durante este estudio.
Discusión
Estudios previos han destacado la asociación de la EII, un trastorno gastrointestinal relacionado con el sistema inmunológico, con varias enfermedades, incluyendo enfermedadesneurodegenerativas 17, esclerosismúltiple 18, esclerosis lateralamiotrófica 19, endometriosis20, artritis reumatoide2, linfomade Hodgkin 21, CRC22 y PAAD23. La EII se considera generalmente que aumenta el riesgo de desarrollar tanto CRC24 comoPAAD 23. Aunque se han reportado asociaciones epidemiológicas entre estas enfermedades, sus características moleculares compartidas siguen siendo incompletamente comprendidas. En este estudio, integramos conjuntos de datos transcriptómicos a granel, datos de scRNA-seq y experimentos funcionales celulares para investigar características moleculares compartidas entre EII, CRC y PAAD. Nuestros hallazgos aportan una visión adicional sobre las posibles características moleculares e inmunológicas compartidas en estos contextos de enfermedad.
En este estudio, identificamos 158 genes asociados a la enfermedad mediante análisis de expresión diferencial y WGCNA, que comprenden 40 DEG comunes y 122 genes asociados a módulos comunes. El análisis de enriquecimiento funcional demostró un enriquecimiento significativo de vías, incluida la vía de señalización IL-17. Estudios previos han reportado papeles importantes de la señalización de IL-17 en la progresión de EII, CRC yPAAD 25,26,27. Estas observaciones sugieren que los procesos relacionados con la IL-17 pueden representar una característica biológica común en estas enfermedades. Sin embargo, el presente estudio no investigó directamente la relación mecanicista entre la señalización de S100P e IL-17, y se necesitan estudios funcionales adicionales para aclarar esta asociación. Se identificaron cuatro genes comunes (FXYD3, S100P, PLA2G2A y MUC1) en los conjuntos de datos analizados. Estudios previos han demostrado que FXYD3 regula el crecimiento de célulasPAAD 28, S100P ha estado implicado en la progresión de CRC yPAAD 15,16, y MUC1 participa en la progresión de EII, CRC yPAAD 29,30,31. En cambio, PLA2G2A ha sido menos investigado en ambas tres enfermedades. El análisis ROC demostró que cada uno de los cuatro genes mostró un rendimiento diagnóstico medible, mientras que el modelo diagnóstico combinado alcanzó un rendimiento diagnóstico superior al de los genes individuales. Por tanto, nuestros hallazgos amplían observaciones previas al identificar estos genes como características moleculares compartidas en EII, CRC y PAAD.
El análisis de infiltración de células inmunitarias demostró patrones de infiltración similares para células B naïf, células natural killer (NK) en reposo y macrófagos M0 en las cohortes de EII, CRC y PAAD. Además, el análisis scRNA-seq mostró que FXYD3, S100P, PLA2G2A y MUC1 se expresaban predominantemente en células epiteliales. Estos hallazgos aportan información adicional sobre la distribución celular de los genes identificados y su posible asociación con características relacionadas con el sistema inmunológico. Sin embargo, los análisis actuales no establecen interacciones directas entre las células epiteliales y el microambiente inmunitario, por lo que se requieren estudios mecanicistas adicionales.
Finalmente, investigamos el papel biológico de S100P en un modelo de EII inducida por LPS que imita inflamación. La expresión de S100P aumentó significativamente tras la estimulación LPS, y el knockdown mediado por siRNA redujo eficazmente su expresión. Bajo las condiciones experimentales examinadas, el knockdown de S100P restauró parcialmente la proliferación celular y redujo la expresión de las citocinas inflamatorias IL-1β, IL-6 y TNF-α. Además, la regulación a la baja de S100P se asoció con una reducción de la expresión de IL17RA. Estos hallazgos apoyan la investigación adicional de S100P en respuestas celulares relacionadas con la inflamación.
Este estudio tiene varias limitaciones. Primero, solo se realizaron experimentos de pérdida de función, y no se realizaron experimentos de sobreexpresión o rescate; por lo tanto, no se puede establecer un papel causal directo de S100P. En segundo lugar, la expresión de S100P se evaluó principalmente a nivel de ARNm, y no se realizó la validación a nivel de proteína. En tercer lugar, los experimentos funcionales se limitaron a un modelo celular que imita la inflamación, mientras que los modelos de CRC y PAAD no se investigaron experimentalmente. Finalmente, aunque los análisis multiómicos reforzaron la identificación de características moleculares compartidas, se requieren estudios mecanicistas adicionales y validación in vivo para clarificar aún más los roles biológicos de S100P y los otros genes compartidos.
En conclusión, este estudio identificó características moleculares compartidas, vías biológicas y características relacionadas con el sistema inmunológico en EII, CCR y PAAD. Cuatro genes comunes (FXYD3, S100P, PLA2G2A y MUC1) demostraron potencial diagnóstico en los conjuntos de datos analizados, y S100P fue investigado más a fondo en un modelo de EII que imita inflamación. Estos hallazgos proporcionan una base para futuros estudios que investiguen los mecanismos moleculares compartidos que vinculan la EII, la CRC y la PAAD.
Divulgaciones
Conflicto de intereses:
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
Los autores reconocen el apoyo financiero del Plan Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (Subvención nº 2023YFB3210400).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BXPC2 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| CIBERSORT | N/A | N/A | Immune cell infiltration analysis |
| clusterProfiler package | Bioconductor | v4.8.0 | Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analyses |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Cell culture medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | A5256701 | Cell culture supplement |
| FHC cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| GEO dataset (GSE128735) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE154778) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE166555) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for colorectal cancer |
| GEO dataset (GSE179285) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE214695) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public single-cell RNA sequencing dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE24287) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for inflammatory bowel disease |
| GEO dataset (GSE62452) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for pancreatic adenocarcinoma |
| GEO dataset (GSE87211) | Gene Expression Omnibus (GEO) | N/A | Public gene expression dataset for colorectal cancer |
| ggplot2 package | CRAN | v3.4.2 | Data visualization |
| HCT116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | v1.8.0 | Colony counting |
| jetPRIME Transfection Reagent | Polyplus | 101000046 | Cell transfection |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Beyotime Co., Ltd | S1735 | Induction of an inflammation-mimicking IBD cell model |
| limma package | Bioconductor | v3.54.0 | Differential expression analysis |
| NCM460 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human normal colonic epithelial cell line |
| org.Hs.eg.db package | Bioconductor | v3.23.1 | Gene annotation for enrichment analysis |
| PANC1 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human pancreatic adenocarcinoma cell line |
| Penicillin–streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic supplement for cell culture |
| pheatmap package | CRAN | v1.0.12 | Heatmap visualization |
| pROC package | CRAN | v1.19.0.1 | Receiver operating characteristic (ROC) analysis |
| PrimeScript RT Master Mix | Takara Bio | RR036A | Reverse transcription of RNA into cDNA |
| Primer sets for qRT-PCR | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Primer sequences reported in Reference 11 |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | v4.1.2 | Statistical and bioinformatics analyses |
| Seurat package | CRAN | v4.0 | Single-cell RNA sequencing data preprocessing and analysis |
| siS100P | Tsingke Biotech Co., Ltd | N/A | Small interfering RNA targeting S100P |
| SingleR package | Bioconductor | v2.6.0 | Cell type annotation for single-cell RNA sequencing |
| STRING database | STRING Consortium | N/A | Protein-protein interaction analysis |
| SW1116 cell line | Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences | N/A | Human colorectal cancer cell line |
| TB Green qPCR Mix | Takara Bio | RR430B | Quantitative real-time PCR |
| TCGA-CRC dataset | The Cancer Genome Atlas (TCGA) | N/A | Public colorectal cancer transcriptomic dataset |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596-026 | Total RNA extraction |
| WGCNA package | CRAN | v1.73 | Weighted gene co-expression network analysis |
Referencias
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