Este protocolo describe el establecimiento de un modelo murino de asma alérgico (AA) inducido por ovoalbúmina (OVA) para evaluar los mecanismos terapéuticos de la Terapia de Aplicación en el Punto de Acupuntura Kechuanting (KAST) sobre la inflamación tipo 2 en las vías respiratorias, mediante la modulación de las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2s) pulmonares a través de la vía del péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP)/proteína modificadora de la actividad del receptor 1 (RAMP1).
Artículo de investigación
La terapia de adherencia de puntos de acupuntura Kechuanting alivia la inflamación de las vías respiratorias de tipo 2 en ratones con asma alérgica mediante la modulación del número de ILC2
* These authors contributed equally
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Resumen
Resumen
Se ha demostrado que la terapia con aplicación de parches en el punto de acupuntura Kechuanting (KAST) mejora eficazmente la inflamación de las vías respiratorias en pacientes con asma alérgico (AA); sin embargo, sus mecanismos subyacentes permanecen poco claros. Este estudio tuvo como objetivo investigar los mecanismos terapéuticos de KAST en un modelo murino de AA desde una perspectiva neuro-inmune. Se estableció un modelo murino de asma alérgico inducido por ovalbúmina (OVA), y los ratones fueron tratados con KAST. Los efectos de KAST sobre las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2s) en pulmón y la inflamación tipo 2 de las vías respiratorias se evaluaron mediante citometría de flujo, tinción con hematoxilina-eosina (HE) e inmunohistoquímica. Se utilizó inmunotransferencia (WB) y ELISA para evaluar los niveles de proteína del péptido relacionado con el gen de calcitonina (CGRP) en tejidos pulmonares. Se realizó la administración intranasal de CGRP o del inhibidor del receptor de CGRP BIBN-4096 en ratones con asma alérgico para investigar el papel regulador de la vía CGRP/proteína modificadora de la actividad del receptor 1 (RAMP1) sobre las ILC2s y la inflamación tipo 2 de las vías respiratorias. KAST redujo el número de ILC2s y alivió la inflamación tipo 2 de las vías respiratorias, acompañado de una disminución en la expresión de CGRP en los tejidos pulmonares. La administración intranasal de CGRP incrementó las ILC2s RAMP1+ y el número total de ILC2s en los pulmones y exacerbó la inflamación tipo 2 de las vías respiratorias. Por el contrario, la administración intranasal de BIBN-4096 redujo las ILC2s pulmonares y mitigó la inflamación tipo 2 de las vías respiratorias. KAST reduce la inflamación de las vías respiratorias en el asma alérgico, lo cual está estrechamente asociado con la regulación negativa de la vía CGRP/RAMP1 y la consiguiente supresión de las ILC2s pulmonares, tal como lo demuestra la inhibición farmacológica.
Introducción
El asma alérgica (AA) es el fenotipo de asma más común, que representa entre el 60 y el 80 % de todos los casos de asma en China1. Se caracteriza por una alta prevalencia y un control deficiente de la enfermedad que afecta gravemente la calidad de vida de los pacientes y genera una carga económica significativa2,3,4,5. Aunque los corticosteroides inhalados (CSI) siguen siendo el pilar del tratamiento clínico6, algunos pacientes presentan una respuesta limitada, y el uso a largo plazo suele asociarse con efectos adversos y la incapacidad de detener la progresión de la enfermedad7. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias terapéuticas novedosas seguras y eficaces sigue siendo una prioridad tanto en entornos clínicos como de investigación. La terapia con aplicación tópica en el punto de acupuntura Kechuanting (KAST), una aplicación externa de la medicina tradicional china, libera compuestos activos por vía transdérmica, lo que potencialmente evita el efecto de primer paso hepático y minimiza las reacciones adversas sistémicas8,9. Estudios clínicos han demostrado que KAST puede aliviar los síntomas del asma, restaurar parcialmente la función pulmonar y mejorar la calidad de vida de los pacientes10,11,12. Al mismo tiempo, estudios de metabolómica sérica, farmacología de redes y modelos animales de asma sugieren que KAST atenúa la inflamación de las vías respiratorias al reducir los niveles séricos y en el lavado broncoalveolar (LBA) de mediadores inflamatorios, incluyendo la regulación a la baja de la expresión de IgE, IL-4 e IL-139,13,14. En conjunto, estos hallazgos proporcionan evidencia de apoyo sobre la eficacia terapéutica de KAST en el asma. Sin embargo, sus mecanismos de acción precisos aún no están claros.
Un mecanismo patológico central que impulsa la recurrencia de la AA es la inflamación de las vías respiratorias de tipo 2, en la cual las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2) desempeñan un papel clave15. Tras la estimulación con alérgenos, las ILC2 secretan citocinas como IL-5 e IL-13, promoviendo así la inflamación de las vías respiratorias16,17. Estudios han demostrado que la eliminación de las ILC2 alivia significativamente la inflamación de las vías respiratorias en ratones asmáticos, destacando su papel central en la progresión de la enfermedad18. Cabe señalar que la activación y función de las ILC2 están reguladas estrechamente por múltiples mecanismos, siendo las interacciones neuroinmunitarias un aspecto que ha recibido creciente atención en los últimos años. Evidencia reciente indica que el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) puede unirse a la proteína modificadora de la actividad del receptor 1 (RAMP1) en la superficie de las ILC2, induciendo su activación y la posterior liberación de citocinas de tipo 2, lo que agrava la inflamación de las vías respiratorias en la AA19,20,21. En el presente estudio, nuestro cribado de alto rendimiento mediante secuenciación de ARN (RNA-seq) identificó al CGRP como un neuropéptido críticamente sensible, fuertemente modulado por la intervención con KAST. Por tanto, centrándonos en la vía CGRP/RAMP1, empleamos KAST como intervención en ratones con AA para investigar sus posibles mecanismos en la modulación de la actividad de las ILC2 y en la reducción de la inflamación de las vías respiratorias de tipo 2.
Protocolo
Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicada por las Academias Nacionales de Ciencias. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética Animal del Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Nanjing (número de aprobación: 2023DW-059-01). Una lista completa de todos los materiales, reactivos, herramientas y software utilizados en este estudio se detalla en la Tabla de materiales.
Animales experimentales y agrupación
Se obtuvieron ratones hembra sanos BALB/c (calidad SPF, de 8 a 10 semanas de edad) del Centro de Animales de Experimentación de la Universidad de Medicina China de Nanjing (licencia n.º SYXK (Su) 2018-0049). Los animales se mantuvieron en condiciones estándar con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a 24–26 °C. Se proporcionó alimento y agua estériles ad libitum, el lecho se reemplazó regularmente y las jaulas se limpiaron rutinariamente. Después de 7 días de adaptación, los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos (n = 7 por grupo): grupo normal, grupo modelo, grupo CGRP, grupo BIBN-4096, grupo KAST y grupo KAST + CGRP. La asignación de los animales a los grupos se realizó mediante una tabla de números aleatorios generada por computadora. La asignación de los grupos se mantuvo oculta para los investigadores hasta que se asignaron las intervenciones. Para optimizar el uso del tejido, las muestras de pulmón de la cohorte aleatorizada (n = 7 por grupo) se asignaron sistemáticamente a diferentes vías de procesamiento, indicándose explícitamente en las leyendas de las figuras correspondientes los tamaños exactos de las muestras analizadas (n = 5, 4 o 3) para ensayos histológicos y moleculares específicos. Ningún dato fue excluido del análisis.
Preparación de la formulación KAST
La formulación fue preparada por el Departamento de Farmacia del Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Nanjing22. Se utilizaron nueve hierbas medicinales chinas tradicionales: Semen Brassicae (2 partes), Rhizoma Corydalis (2 partes), Radix Kansui procesada con vinagre (1 parte), Asarum (1 parte), Ephedra (1 parte), Semen Lepidii (1 parte), Clavo (1 parte), Corteza de canela (1 parte) y Gleditsia sinensis (1 parte). Cada hierba se molió hasta obtener un polvo fino y se tamizó mediante un tamiz de 80 mallas. Por cada 100 g de polvo mezclado, se agregaron 70 mL de jugo fresco de jengibre y 30 mL de parafina líquida, se mezcló bien y se procesó para obtener parches de 0,3 g ± 5 % con un diámetro de 0,5 cm. En concreto, todos los ingredientes herbales y el jengibre fresco fueron autentificados por el farmacéutico jefe Lin-gang Zhao y almacenados a 4 °C en un ambiente oscuro y seco antes de su uso9. Para garantizar la reproducibilidad de la intervención y la estabilidad entre lotes, se implementó un riguroso estándar de control de calidad basado en los métodos UPLC-Q-TOF-MS y HPLC establecidos por nuestro equipo, confirmando la presencia constante de marcadores activos principales como el tiocianato de sinapina23. En la práctica, los parches de 0,5 cm se fijaron utilizando cinta adhesiva médica transpirable e hipoalergénica de 2,5 cm × 5,5 cm para asegurar una óptima administración transdérmica.
Establecimiento del modelo de ratón AA
El modelo de AA se indujo según un protocolo establecido en la literatura, utilizando sensibilización con OVA y desafío intranasal24. Excepto para el grupo Normal, todos los ratones se sensibilizaron mediante inyección intraperitoneal de 200 µL de solución salina que contenía 100 µg de OVA y 2 mg de hidróxido de aluminio en los días 0 y 12. De los días 18 al 23, los ratones fueron desafiados intranasalmente una vez al día con 50 µg de OVA en 50 µL de solución salina. Del día 24 al 53, se administró OVA intranasalmente cada dos días. El día 54, tras pesar a los ratones, se realizó la eutanasia mediante dislocación cervical y se recolectaron los tejidos. Posteriormente, el coeficiente pulmonar se determinó dividiendo el peso total de los pulmones entre el peso corporal.
Intervenciones
De los días 40 al 53, se afeitó a los ratones del grupo KAST y del grupo KAST + CGRP en un área dorsal de 3 cm × 6 cm. Se aplicaron parches sobre los puntos de acupuntura bilaterales Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) y Shenshu (BL23), fijados con cinta adhesiva durante 1,5 h una vez al día durante 14 días consecutivos. Los ratones de los grupos CGRP y KAST + CGRP recibieron administración intranasal de 10 µL de solución de calcitonina/CALCA (1 pg/µL) cada dos días desde el día 40 hasta el 53. Los ratones del grupo BIBN-4096 recibieron administración intranasal de 10 µL de solución de BIBN-4096 (0,3 mg/mL, antagonista del receptor de CGRP) cada dos días. Los grupos normal y modelo recibieron alimentación estándar sin intervención. KAST se administró desde el día 40 hasta el día 53, tras el establecimiento de la inflamación aérea alérgica (a partir del día 40, es decir, 22 días después del primer desafío con OVA el día 18). Por lo tanto, en este estudio KAST actuó como una intervención terapéutica y no como una intervención profiláctica.
Para la preparación de la piel, se realizó la eliminación del vello en la región dorsal designada utilizando una máquina cortapelos eléctrica. La localización de los puntos de acupuntura siguió estrictamente la nomenclatura y ubicación estándar de puntos de acupuntura para animales de laboratorio – Parte 3: Ratones (T/CAAM 0002-2020), emitida por la Sociedad China de Acupuntura y Moxibustión. Los cuatro pares de sitios dorsales bilaterales fueron marcados con precisión y definidos como sigue: Feishu (BL13: entre los espacios intercostales por debajo del proceso espinoso de la 3.ª vértebra torácica, a 3 mm lateral a la línea media posterior), Geshu (BL17: por debajo del proceso espinoso de la 7.ª vértebra torácica, a 3 mm lateral a la línea media), Pishu (BL20: por debajo del proceso espinoso de la 12.ª vértebra torácica, a 3 mm lateral a la línea media) y Shenshu (BL23: por debajo del proceso espinoso de la 2.ª vértebra lumbar, a 3 mm lateral a la línea media). La cinta 3M fue envuelta firmemente para lograr una adhesión estable, asegurando que no hubiera desplazamiento del parche ni erosión cutánea secundaria durante el período de retención de 1,5 h.
Las dosis de CGRP/CALCA (1 pg/µL, 10 µL por ratón) y BIBN-4096 (0,3 mg/mL, 10 µL por ratón) se seleccionaron según estudios publicados25. Específicamente, para la intervención con CGRP, se preparó una solución de BSA al 0,1 % disolviendo 1 mg de BSA en 1 mL de ddH2O, seguido de vortex para obtener una concentración final de 1 mg/mL. Antes de la reconstitución, el polvo liofilizado de proteína Calcitonina/CALCA se centrifugó a 12.000 × g durante 30 s a 4 °C. Luego, se añadieron 20 µL de la solución de BSA al 0,1 % preparada para obtener una solución stock de 1 µg/µL. El vial se invirtió suavemente varias veces (sin vortex), se centrifugó brevemente y se dejó a temperatura ambiente durante varios minutos para asegurar la reconstitución completa de la proteína. Para preparar la solución de trabajo de 1 pg/µL sin generar un volumen excesivamente grande en un solo paso, se realizó una dilución seriada estándar en dos pasos: 1 µL de la solución stock de 1 µg/µL se diluyó primero en 999 µL de solución salina estéril para formular una solución intermedia de 1 ng/µL, y luego 1 µL de esta solución intermedia se mezcló adicionalmente con otros 999 µL de solución salina estéril para obtener la solución de trabajo final de 1 pg/µL. La solución de trabajo se mantuvo a 4 °C, mientras que las alícuotas restantes se almacenaron a -20 °C durante un máximo de 2–3 meses. Para el grupo de BIBN-4096, 1 mg de polvo de BIBN-4096 se disolvió en 333 µL de ddH2O para obtener una solución stock de 3 mg/mL, que se dividió en alícuotas de 50 µL por vial y se almacenó a -80 °C. Para preparar la solución de trabajo de 0,3 mg/mL, cada alícuota de 50 µL de la solución stock se mezcló completamente con 450 µL de solución salina estéril. Desde el día 40 hasta el 53, se administró por vía intranasal a cada ratón un volumen de 10 µL de la solución de CGRP a 1 pg/µL o de la solución de BIBN-4096 a 0,3 mg/mL cada dos días, bajo contención suave y sin anestesia.
Medidas de resultado y métodos de detección
Pruebas conductuales
El día 53, tras el último desafío intranasal, se monitorearon y registraron las frecuencias de episodios de frotamiento nasal y estornudos mediante un sistema de video digital durante un período de 10 min. Las frecuencias de comportamiento en los videos fueron contadas independientemente por dos investigadores de manera doble ciega. En casos de discrepancia significativa entre sus conteos, un tercer investigador volvió a evaluar el video, y los datos con mayor consistencia fueron seleccionados finalmente para el análisis estadístico.
Prueba de provocación bronquial
En un plazo de 24 h después del último desafío, se evaluó la respuesta de las vías respiratorias utilizando acetilcolina (ACh) nebulizada en concentraciones de 0, 5, 10, 20 y 40 mg/mL (300 µL por concentración, nebulizados durante 1 min). Se registraron los valores de pausa mejorada (Penh), un índice adimensional utilizado empíricamente para indicar la constricción de las vías respiratorias y evaluar la hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR), durante 5 min después de cada nebulización, mediante una plestimografía corporal total no invasiva. Los ratones se aclimataron a la cámara durante 10 min antes del registro. El valor de Penh se calculó automáticamente mediante el software del sistema integrado de almacenamiento/transmisión en vivo, según la fórmula empírica que equilibra el tiempo espiratorio/inspiratorio y los flujos máximos.
Histopatología (tinción HE)
Los tejidos pulmonares fijados en paraformaldehído al 4% fueron deshidratados mediante una serie de alcohol graduado, aclarados en xileno e incluidos en bloques de parafina utilizando un procesador automatizado. Los bloques fueron seccionados a un grosor de 4 µm, flotados en un baño de agua a 42 °C y montados sobre portaobjetos de vidrio. Los portaobjetos fueron incubados a 80 °C durante 2 h y secados durante la noche antes de enfriarlos a temperatura ambiente. Para la tinción, las secciones fueron desparafinadas en xileno (I y II, 20 min cada uno), rehidratadas mediante una serie de etanol graduado (100% I/II y 75%, 5 min cada uno) y enjuagadas con agua del grifo. Los portaobjetos fueron teñidos con hematoxilina durante 3–5 min, diferenciados con alcohol ácido al 1%, y azulados en una solución de azulado. Tras lavarlos, las secciones fueron deshidratadas mediante etanol al 85% y al 95% (5 min cada uno) y contrateñidas con eosina durante 5 min. Finalmente, los portaobjetos fueron deshidratados en etanol absoluto (I, II y III, 5 min cada uno), aclarados en xileno (I y II, 5 min cada uno), montados con bálsamo neutro y secados al aire. Las imágenes se capturaron de campos aleatorios a un aumento de 200× utilizando un microscopio óptico y el sistema CaseViewer. La inflamación pulmonar y el engrosamiento epitelial se calificaron de forma ciega en una escala de 0 a 4: 0, sin inflamación; 1, células inflamatorias ocasionales; 2, pocos focos inflamatorios (<3); 3, múltiples focos inflamatorios (≥3); 4, infiltración difusa en todo el pulmón. El engrosamiento epitelial se puntuó como: 0, normal; 1, engrosamiento visible; 2, engrosamiento parcial de la vía aérea; 3, obstrucción casi completa; 4, ausencia de estructura normal. Para cada grupo experimental, se obtuvieron imágenes y se evaluaron un total de 20 campos microscópicos aleatorios para obtener las puntuaciones histopatológicas brutas. Los datos de cada cuatro campos se promediaron para obtener un único punto de datos independiente, resultando en un tamaño final de muestra de n = 5 réplicas por grupo para el análisis estadístico. La calificación se realizó de forma ciega.
Secuenciación de ARN
Se extrajo ARN total de tejidos pulmonares de ratón utilizando el reactivo TRIzol según el protocolo del fabricante. Se evaluó la pureza, concentración e integridad del ARN utilizando un espectrofotómetro y una plataforma basada en microfluídica. Se construyeron bibliotecas del transcriptoma utilizando un kit comercial de preparación de bibliotecas y se secuenciaron en una plataforma de secuenciación de alto rendimiento para generar lecturas apareadas de 150 pb. Los datos brutos se controlaron en cuanto a calidad utilizando un software de filtrado adecuado para obtener lecturas limpias, las cuales se alinearon al genoma de referencia utilizando una herramienta de alineación sensible a empalmes. Los niveles de expresión génica se calcularon como FPKM, y se compilaron los conteos de lecturas mediante una utilidad de conteo de lecturas. Se realizó el análisis de expresión diferencial utilizando un paquete estadístico especializado, con umbrales establecidos en |cambio de la razón de aumento log2| ≥ 1 y p ajustado < 0,05.
ELISA
Los tejidos pulmonares frescos de ratón se pesaron con precisión y se homogenizaron en tampón PBS en una proporción estricta de 20 mg de tejido por 200 µL de tampón. Los homogenatos se centrifugaron aproximadamente a 13.400 × g durante 10 min a 4 °C para recolectar los sobrenadantes proteicos. Para la normalización, el contenido proteico bruto de los sobrenadantes se calibró utilizando el método de BCA. El procedimiento de ELISA se realizó por triplicado técnico utilizando kits comerciales según el protocolo del fabricante. Brevemente, se añadieron 50 µL de diluciones patrón o 50 µL de muestras previamente diluidas (10 µL de muestra proteica mezclados con 40 µL de diluyente de muestra, logrando una dilución final de 5 veces) a placas de 96 pocillos recubiertas con anticuerpo. Las placas se sellaron e incubaron a 37 °C durante 30 min. Después de lavar cinco veces con un tampón de lavado diluido 1:30, se añadieron 50 µL de reactivo conjugado marcado enzimáticamente a cada pocillo (excepto a los pocillos en blanco), y la mezcla se incubó a 37 °C durante 30 min. Tras otros cinco lavados, se añadieron 50 µL de la solución cromógena A y 50 µL de la solución cromógena B a cada pocillo, y la placa se incubó a oscuras a 37 °C durante 10 min. La reacción se detuvo añadiendo 50 µL de la solución de parada, lo que provocó un cambio de color de azul a amarillo. La absorbancia (valor de OD) de cada pocillo se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas dentro de los 15 min posteriores. Se trazaron curvas patrón utilizando un modelo de regresión logística de cuatro parámetros o lineal (asegurando un valor de R2 > 0,99), a partir del cual se calcularon las concentraciones de la proteína diana en los homogenados de tejido pulmonar.
Citometría de flujo
Los tejidos pulmonares se resecaron, picaron y digirieron en 5 mL de RPMI-1640 que contenía 10 % de FBS, 50 µL de Liberase TM y 5 µL de DNasa I a 37 °C durante 45 min con agitación a 80 rpm. La suspensión digerida se filtró a través de un filtro celular de 400 mallas y se centrifugó a 300 × g durante 10 min a 4 °C. El sedimento se resuspendió en 2 mL de tampón de lisis de eritrocitos durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras un lavado, las células se resuspendieron y marcaron con Ghost Dye Red 780 (1,25 µL por muestra) durante 20 min a 4 °C en la oscuridad para excluir células muertas. Después de un lavado, las células se bloquearon con 10 µL de reactivo bloqueador de FcR durante 10 min a 4 °C. Luego, las células se marcaron en superficie con los siguientes anticuerpos conjugados con fluorocromos durante 30 min a 4 °C: FITC anti-murino CD45 (0,5 µL), PE anti-murino/humano KLRG1 (1,25 µL), BB700 ratón anti-murino CD90.2 (0,5 µL) y una mezcla de linaje biotinilada que contenía anti-murino CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (todos 0,5 µL cada uno) y anti-murino CD19 (2 µL). Tras el lavado, las células se incubaron con Streptavidina Brilliant Violet 605 (2 µL) durante 30 min a 4 °C. Los datos se adquirieron en una plataforma de citometría de flujo BD y se analizaron mediante el software FlowJo. Las matrices de compensación del derrame de fluorescencia se monitorearon y ajustaron automáticamente mediante el software calibrado del instrumento. La estrategia jerárquica de selección para identificar ILC2 pulmonares se implementó secuencialmente de la siguiente manera: primero se aislaron los linfocitos totales mediante la morfología de dispersión hacia adelante/lateral (FSC-A/SSC-A), seguido de la discriminación de dobletes mediante la selección de células simples (FSC-H/FSC-A). Posteriormente, se identificaron las células viables mediante la exclusión de células muertas (Ghost Dye-) y luego se aplicaron progresivamente compuertas estándar para seleccionar las poblaciones CD45+ y Lineage-. Dentro de la ventana de selección viable CD45+ Lineage-, los ILC2 pulmonares se definieron y cuantificaron explícitamente en función de las siguientes compuertas en cascada secuenciales positivas: grupos CD90.2+ y KLRG1+.
Inmunofluorescencia (IF)
Los cortes congelados de pulmón se descongelaron a temperatura ambiente durante 15–30 min y se lavaron tres veces con PBST (PBS que contiene 0,05 % de Tween-20), durante 6 min cada vez, para eliminar el compuesto OCT. Después de secar el exceso de líquido, se trazó una barrera hidrofóbica alrededor del tejido utilizando un bolígrafo para inmunohistoquímica. Los cortes se incubaron en un tampón de bloqueo y permeabilización que contenía 0,3 % de Triton X-100 y 5 % de suero de cabra a 37 °C durante 100 min, seguido de una incubación nocturna (16–20 h) a 4 °C con el anticuerpo primario. Al día siguiente, los cortes se equilibraron a temperatura ambiente durante 30 min, se lavaron tres veces con PBST y se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo, de especie coincidente, a 37 °C en la oscuridad durante 60–90 min. Tras tres lavados adicionales con PBST, los núcleos se contratiñeron con DAPI (diluido 1:1 o 2:1 en PBS) durante 8 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de una última ronda de lavados con PBST (3 × 6 min), los cortes se montaron con un medio de montaje antidesvanecimiento, se sellaron para evitar la formación de burbujas y se almacenaron en la oscuridad. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio confocal con un aumento de 400×. El número de células positivas por campo se contó manualmente utilizando el software Leica LAS X. Para cada grupo experimental, se obtuvieron imágenes de un total de 15 campos microscópicos aleatorios para obtener los recuentos brutos de células. Los datos de cada tres campos se promediaron para obtener un único punto de datos independiente, lo que resultó en un tamaño final de muestra de n = 5 réplicas por grupo para el análisis estadístico. El conteo se realizó de manera ciega.
Inmunohistoquímica (IHC)
Los cortes de parafina se desparafinizaron en tres cambios de xileno (15 min cada uno), se rehidrataron mediante una serie graduada de etanol (100 % dos veces, 85 % y 75 %; 5 min cada uno) y se enjuagaron con agua destilada. La recuperación de antígenos se realizó en tampón citrato (pH 6,0) utilizando una olla a presión (3 min a alta presión tras hervir), seguido de enfriamiento y tres lavados de 5 min en PBS (pH 7,4). La peroxidasa endógena se bloqueó con H2O2 al 3 % durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras el lavado, los cortes se rodearon con un bolígrafo hidrófobo y se bloquearon con suero de cabra al 3 % durante 30 min. A continuación, los cortes se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios diluidos en PBS: anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300) o anti-IL-13 (1:150). Al día siguiente, los cortes se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (anti-murino para IL-4; anti-conejo para IL-5 e IL-13) durante 50 min a temperatura ambiente. Las señales se visualizaron utilizando una solución de DAB recién preparada bajo control microscópico y se detuvieron con agua del grifo. Finalmente, los cortes se contratinjeron con hematoxilina, se diferenciaron, se azularon, se deshidrataron mediante alcoholes y xileno graduados, y se montaron con bálsamo neutro para su examen microscópico. La densidad óptica media (IOD/Área) se cuantificó mediante una plataforma de software de análisis de imágenes a un aumento de 200×. Para cada grupo experimental, se obtuvieron imágenes de un total de 15 campos microscópicos aleatorios para obtener los valores brutos. Los datos de cada tres campos se promediaron para obtener un único punto de datos independiente, lo que dio como resultado un tamaño muestral final de n = 5 réplicas por grupo para el análisis estadístico. La puntuación fue realizada por dos observadores ciegos.
Transferencia Western (WB)
Para la preparación de muestras, los tejidos pulmonares de ratón (aproximadamente 30 mg) se picaron finamente y se homogenizaron en 300 µL de tampón de lisis RIPA preenfriado suplementado con 1 % de una mezcla de inhibidores de proteasas/fosfatasas. La homogenización se realizó utilizando un homogenizador de tejidos a 60 Hz durante cuatro ciclos (60 s por ciclo). Los lisados se centrifugaron luego a aproximadamente 13 400 × g durante 15 min a 4 °C para recolectar el sobrenadante. Las concentraciones totales de proteína se determinaron mediante un kit estándar de ensayo de proteína BCA. Las muestras se normalizaron, mezclaron con tampón de carga 5x en una proporción volumétrica de 4:1 y se desnaturalizaron a 95 °C durante 7 min. Para la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), se cargaron muestras de proteína (20 µg por pozo) junto con un marcador de peso molecular de proteína precargado, se separaron a un voltaje constante de 80 V durante 20 min y luego se ajustó a 120 V durante 70 min. Las proteínas se transfirieron por transferencia húmeda a membranas de PVDF de 0,22 µm bajo una corriente constante de 300 mA durante 120 min en un baño de hielo. Las membranas se bloquearon con BSA al 5 % en TBST durante 1 h a temperatura ambiente e incubarón durante la noche (hasta 18 h) a 4 °C con anticuerpos primarios contra CGRP (1:500) y GAPDH (1:2000). Después de lavar tres veces con TBST (10 min cada vez), las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:10 000) durante 1–2 h a temperatura ambiente. Tras otros tres lavados, las bandas proteicas se visualizaron utilizando un sustrato quimioluminiscente mejorado (ECL) en un sistema de imagen VILBER Fusion FX. Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante ImageJ 1.8, y la expresión de la proteína diana se normalizó respecto al control interno GAPDH.
Análisis estadístico
Todos los datos experimentales se expresan como media ± desviación estándar (DE). El análisis de datos y la elaboración de gráficos estadísticos se realizaron utilizando una plataforma especializada de software estadístico. Antes de las comparaciones entre grupos, los conjuntos de datos fueron sometidos sistemáticamente a pruebas de normalidad. Para datos con distribución normal y varianzas homogéneas, se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional u bidireccional ordinario, seguido de pruebas post hoc de Tukey, Šídák, Holm-Šídák o LSD de Fisher para comparaciones múltiples por pares. Al comparar múltiples grupos frente a un único grupo control, se utilizó la prueba de Dunnett. Para conjuntos de datos con varianzas heterogéneas, se empleó el ANOVA de Brown-Forsythe, seguido de la prueba post hoc T3 de Dunnett. Para conjuntos de datos que no cumplían con la normalidad, se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis, seguida de la prueba post hoc de Dunn para comparaciones múltiples. Se consideró que un valor de *P* < 0,05 indicaba diferencias estadísticamente significativas. Los distintos niveles de significancia se indican dinámicamente como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 y ****p < 0,0001. Todas las evaluaciones de los resultados experimentales, incluyendo la puntuación histológica, el análisis de citometría de flujo y la cuantificación de imágenes, se realizaron de manera estrictamente enmascarada.
Resultados
KAST reduce las ILC2 pulmonares y alivia la inflamación de las vías respiratorias de tipo 2
Para investigar los efectos terapéuticos de KAST, se estableció un modelo de ratón con asma alérgica inducida por OVA y se trató con parches aplicados en los puntos de acupuntura Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) y Shenshu (BL23) (Figura 1A). Después del modelado, los ratones con asma alérgica mostraron una disminución del peso corporal, mientras que los ratones tratados con KAST exhibieron un aumento significativo del peso corporal en comparación con el grupo modelo (Figura 1B). El coeficiente pulmonar, un indicador de inflamación pulmonar, se elevó en los ratones con asma alérgica, pero se redujo notablemente tras el tratamiento con KAST (Figura 1C). Las evaluaciones conductuales revelaron un aumento en el rascado nasal y estornudos en los ratones con asma alérgica, los cuales se aliviaron significativamente con KAST (Figura 1D–E). La pletismografía de cuerpo entero demostró que los valores de Penh, indicativos de hiperreactividad de las vías respiratorias, aumentaron en los ratones con asma alérgica, pero disminuyeron tras el tratamiento, lo que sugiere una mejora de la función pulmonar (Figura 1F). El análisis histopatológico con tinción HE reveló infiltración de células inflamatorias peribronquiales y perialveolares en el grupo modelo en comparación con los controles normales. En contraste, la infiltración inflamatoria se redujo en el grupo tratado con KAST (Figura 2A–B). La inmunohistoquímica mostró que IL-4, IL-5 e IL-13 se localizaron principalmente en el citoplasma de las células inflamatorias infiltrantes y en algunas células epiteliales, con posible acumulación en los espacios intersticiales. En comparación con los controles normales, el grupo modelo mostró señales positivas y valores de densidad óptica media notablemente aumentados, los cuales se redujeron significativamente en el grupo tratado con KAST (Figura 2C–H). La citometría de flujo demostró además que el número de ILC2 aumentó significativamente en los pulmones de los ratones con asma alérgica en comparación con los controles normales, mientras que KAST redujo marcadamente los recuentos de ILC2 (Figura 2I–J).
KAST alivia la inflamación de tipo 2 en las vías respiratorias mediante la supresión del eje CGRP/RAMP1
La hiperactivación de las ILC2 está regulada por múltiples factores. El análisis de RNA-seq reveló que la expresión de CGRP se encontraba significativamente aumentada en ratones con AA, y que KAST redujo notablemente los niveles pulmonares de CGRP (Figura 3A). El inmunotransferencia (Western blot) y el ELISA confirmaron niveles elevados de la proteína CGRP en el grupo modelo en comparación con los controles, los cuales disminuyeron tras la administración de KAST (Figura 3B–D). Estos resultados sugieren que KAST atenúa la expresión de CGRP en los pulmones de ratones con AA, modulando así las respuestas inmunitarias de las ILC2. En conjunto, estas variaciones observadas en el secuenciamiento de alto rendimiento y en el cribado proteico indican una fuerte asociación entre la intervención terapéutica con KAST y la reducción de los niveles pulmonares de CGRP en ratones con AA.
Para explorar más a fondo el papel del CGRP, ratones AA fueron tratados con CGRP exógeno, el antagonista del receptor de CGRP BIBN-4096, o KAST combinado con CGRP. Los resultados de ELISA mostraron niveles de proteína de CGRP significativamente reducidos en los grupos KAST y BIBN-4096, niveles elevados en el grupo de CGRP, y niveles más altos en el grupo KAST + CGRP en comparación con KAST solo (Figura 4A). La citometría de flujo reveló que el número de ILC2 se redujo en los grupos KAST y BIBN-4096, pero aumentó en los grupos de CGRP y KAST + CGRP en relación con el grupo modelo (Figura 4B–C). La tinción con H&E mostró una infiltración reducida de células inflamatorias alrededor de las vías aéreas y los alvéolos en los grupos KAST y BIBN-4096, mientras que la infiltración se agravó en los grupos de CGRP y KAST + CGRP (Figura 4D–E). ELISA confirmó además una disminución en los niveles de IL-4, IL-5 e IL-13 en los grupos KAST y BIBN-4096, pero un aumento en los niveles en los grupos de CGRP y KAST + CGRP (Figura 4F–H).
El número de ILC2s pulmonares RAMP1+ en diferentes grupos se evaluó mediante tinción de inmunofluorescencia multicolor. Los resultados demostraron que, en comparación con el grupo control normal, el número de ILC2s RAMP1+ totales en los tejidos pulmonares del grupo modelo aumentó significativamente. En comparación con el grupo modelo, el número de ILC2s pulmonares RAMP1+ aumentó aún más de forma significativa en el grupo CGRP, mientras que disminuyó notablemente en ambos grupos BIBN-4096 y KAST. Es destacable que, en comparación con el grupo KAST, el grupo KAST + CGRP mostró un aumento significativo en los conteos de ILC2s pulmonares RAMP1+, lo que indica que la reposición exógena de CGRP revirtió con éxito los efectos inhibidores de KAST sobre las poblaciones de ILC2s RAMP1+ totales (Figura 5A–B).
DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS:
Los conjuntos completos de datos brutos generados y analizados durante el presente estudio se han depositado en un repositorio de acceso público. Específicamente, estos materiales integrales incluyen todas las imágenes completas y originales de membranas para los ensayos de inmunotransferencia (WB), todas las imágenes microscópicas completas, crudas y de alta resolución para los ensayos de histología (HE e IHC) e inmunofluorescencia (IF), así como los conjuntos de datos de réplicas individuales y las hojas de cuantificación en Excel. Todos los datos brutos están disponibles públicamente en el siguiente DOI persistente: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. El orden de selección de poblaciones en citometría de flujo se proporciona en la Figura Suplementaria 1. Dos imágenes completas de inmunotransferencia se presentan como Figuras Suplementarias 2–3, y los datos cuantitativos se incluyen en la Tabla Suplementaria 1.
Figura 1: Efectos de KAST sobre los síntomas y la función pulmonar en ratones AA. (A) Protocolo para inducir asma alérgico mediante OVA. (B) Estadísticas del peso corporal de los ratones en cada grupo, n = 5. (C) Coeficiente pulmonar de los ratones en cada grupo, n = 5. (D) Número de frotamientos nasales en los 10 minutos posteriores al último desafío, n = 5. (E) Frecuencia de estornudos en los 10 minutos posteriores al último desafío, n = 5. (F) Valores de Penh de los ratones en cada grupo tras la estimulación con diferentes concentraciones de acetilcolina, n = 5. Los datos se presentan como media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional o bidireccional, seguidas por una prueba post hoc de comparaciones múltiples cuando correspondía. n = réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Regulación del número de ILC2 y de la inflamación de vías respiratorias de tipo 2 por KAST en ratones AA. (A) Cambios morfológicos de los pulmones examinados mediante tinción con HE. Barra de escala = 50 µm. Aumento: 200×. La puntuación de inflamación se evaluó de forma ciega. (B) Análisis estadístico de las puntuaciones de inflamación entre diferentes grupos, n = 5. (C–H) Imágenes representativas de inmunohistoquímica y valores promedio de densidad óptica de la expresión proteica de IL-4 (C, D), IL-5 (E, F) e IL-13 (G, H) en tejidos pulmonares de diferentes grupos, n = 5. Barra de escala = 50 µm. Aumento: 200×. (I) Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la estrategia final de selección de ILC2 pulmonares en los grupos Normal, Modelo y KAST. Las células únicas y viables se seleccionaron secuencialmente como CD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19), seguidas por CD90.2+, y los ILC2 pulmonares se identificaron finalmente por la expresión positiva de KLRG1+. Los datos se obtuvieron en una plataforma de citometría de flujo de alto rendimiento y se analizaron utilizando un paquete especializado de software para análisis de citometría de flujo. (J) Análisis de ILC2 expresado como porcentaje de células CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ entre las células vivas, n = 5. Los datos se presentan como media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de las pruebas post hoc adecuadas para comparaciones múltiples. n = réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.
Figura 3: KAST inhibe la expresión de CGRP en los tejidos pulmonares de ratones AA. (A) Mapa de calor de la expresión génica entre diferentes grupos, n = 4. (B) Imágenes representativas de WB de la expresión de CGRP (10 kDa) y GAPDH (37 kDa) en tejidos pulmonares de cada grupo. (C) Análisis por WB de la expresión proteica de CGRP en tejidos pulmonares, expresado como expresión relativa de CGRP (relación CGRP/GAPDH), n = 3. (D) Análisis por ELISA de la expresión proteica de CGRP en tejidos pulmonares, n = 4. Los datos se presentan como media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de una prueba post hoc de comparaciones múltiples. n = réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Efectos de KAST sobre los números de ILC2 y la inflamación de tipo 2 en las vías respiratorias mediante CGRP en ratones con AA. (A) Análisis por ELISA de la expresión proteica de CGRP en tejidos pulmonares de diferentes grupos, n = 4. (B) Gráficos representativos de citometría de flujo de ILC2 (CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) en cada grupo. (C) Análisis de ILC2 indicado por el porcentaje de células CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ entre las células viables, n = 5. (D) Cambios morfológicos de los pulmones examinados mediante tinción con HE. Barra de escala = 50 µm. Aumento: 200×. (E) Análisis estadístico de los puntajes de inflamación entre diferentes grupos, n = 5. (F–H) Análisis por ELISA de la expresión proteica de IL-4 (F), IL-5 (G) e IL-13 (H) en tejidos pulmonares de diferentes grupos, n = 4. Los datos se presentan como media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA de un factor seguido de las pruebas post hoc adecuadas para comparaciones múltiples. n = réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Efectos de KAST sobre el número de ILC2 en tejidos pulmonares mediante la vía CGRP/RAMP1. (A) Recuentos celulares de ILC2 RAMP1⁺ (definidos como células triple positivas KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) por campo de 400× en tejidos pulmonares, n = 5. (B) Tinción de fluorescencia representativa en tejidos pulmonares. Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul) y se realizó inmunotinción para KLRG1 (púrpura), GATA3 (rojo) y RAMP1 (verde). Barra de escala = 50 µm. Cuantificación: recuento manual de ILC2 RAMP1⁺ (células KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺) de forma ciega utilizando una plataforma especializada de análisis de imágenes. Los datos se presentan como media ± DE. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de una prueba post hoc de comparaciones múltiples. n = réplicas biológicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Gráficos representativos de citometría de flujo que muestran la estrategia de selección secuencial para el aislamiento de ILC2 pulmonares. Primero, se seleccionaron los eventos totales utilizando la dispersión directa (FSC-A) y la dispersión lateral (SSC-A). Se excluyeron los dobletes mediante FSC-A frente a FSC-H para obtener células individuales. Las células vivas se identificaron como negativas para Ghost Dye Red 780⁻ con el fin de eliminar las poblaciones de células muertas. Luego, se seleccionaron los leucocitos positivos para CD45⁺, seguido por la selección de células negativas para linaje (Lin⁻). Dentro del subconjunto CD45⁺ Lin⁻, las células se seleccionaron además según la expresión positiva de CD90.2⁺, y finalmente los ILC2 pulmonares se definieron por la expresión positiva de KLRG1 (KLRG1⁺).Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 2: Imagen representativa de un inmunotransferencia tipo Western de la referencia interna GAPDH (37 kDa) a partir de muestras de tejido pulmonar de ratón. La densidad óptica integrada de las bandas se cuantificó mediante el software ImageJ para su posterior normalización.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura suplementaria 3: Imagen representativa de un inmunotransferencia Western de la proteína diana CGRP (10 kDa) a partir de muestras de tejido pulmonar de ratón. La expresión relativa de CGRP se calculó dividiendo la densidad óptica integrada de las bandas de CGRP entre los valores correspondientes de densidad óptica integrada de GAPDH.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 1: Valores de datos brutos. Valores de datos brutos que se utilizaron para trazar las gráficas.Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discusión
El tratamiento de la AA enfrenta varias limitaciones, incluidos los efectos secundarios asociados con el uso prolongado de medicamentos, el control incompleto de los síntomas y las recaídas frecuentes. Aunque la farmacoterapia convencional es eficaz, a menudo se acompaña de resultados adversos como la dependencia de esteroides26,27. En contraste, el KAST ofrece una alternativa segura, económica y conveniente para el manejo de la AA. La evidencia clínica ha demostrado que el KAST puede aliviar eficazmente los síntomas del asma mediante la modulación de la función inmunitaria pulmonar28. En este estudio, demostramos además que el KAST atenúa la inflamación de la vía aérea de tipo 2 en ratones con AA al suprimir la vía CGRP/RAMP1 y reducir el número de ILC2s.
La inmunidad innata, particularmente las ILC2, desempeña un papel indispensable en la iniciación, amplificación y mantenimiento de la inflamación de vías respiratorias de tipo 2 en la AA29. Tras la exposición al alérgeno, las ILC2 responden rápidamente a las alarminas derivadas del epitelio, secretando grandes cantidades de IL-5 e IL-13 en cuestión de horas, desencadenando así respuestas inflamatorias de tipo 230,31. Además, las ILC2 promueven la diferenciación de linfocitos Th2 y la síntesis de IgE, amplificando aún más las respuestas inmunitarias adaptativas y exacerbando la inflamación de las vías respiratorias32. Estudios han demostrado que la ablación genética de las ILC2 acorta significativamente la duración de la inflamación de las vías respiratorias en modelos de AA, destacando su papel central en la sostenibilidad de la inflamación de tipo 218. Las ILC2 están reguladas por citocinas (por ejemplo, IL-25, IL-33, TSLP), mediadores inflamatorios (por ejemplo, leucotrienos) y neuropéptidos (por ejemplo, CGRP, VIP, NMU)33. Entre ellos, los neuropéptidos desempeñan funciones esenciales en la regulación inmunitaria innata. La neuromedina U (NMU) potencia directamente la actividad de las ILC2, induciendo rápidamente la liberación de IL-5 e IL-1334. El péptido intestinal vasoactivo (VIP) contribuye a la ingesta de nutrientes y a la regulación circadiana, promoviendo la producción de IL-5 por parte de las ILC2 y manteniendo la homeostasis de los eosinófilos33. El CGRP aumenta notablemente la liberación de IL-5 por las ILC2, promoviendo así la inflamación de las vías respiratorias en la AA. Es importante destacar que RAMP1, la subunidad receptora del CGRP, se expresa en niveles mucho más altos en las ILC2 en comparación con los receptores de otros neuropéptidos, lo que sugiere que el CGRP es el ligando más potente para la activación de las ILC235. En este estudio, el análisis transcriptómico identificó al CGRP como uno de los neuropéptidos con mayor diferencia en la expresión en ratones con AA, y ensayos a nivel proteico confirmaron su sobreexpresión en los tejidos pulmonares. La administración exógena de CGRP incrementó aún más el número de ILC2 y la liberación de citoquinas de tipo 2, agravando la inflamación de las vías respiratorias.
Mecánicamente, el CGRP se une a RAMP1 en las ILC2 para regular sus respuestas inmunitarias descendentes. Aunque algunas publicaciones existentes caracterizan al CGRP como un regulador negativo que limita la expansión de las ILC2 para proteger contra la hiperinflamación20,21, evidencias contrarias indican que el CGRP puede colaborar con alarminas para provocar de forma robusta la inmunidad innata del grupo 2 dentro de microentornos patológicos específicos. Nuestros puntos finales experimentales se alinean específicamente con esta última cascada, demostrando una regulación positiva inducida por CGRP en la infiltración pulmonar de ILC2 en el microentorno alérgico inducido por OVA. Por el contrario, el bloqueo de la vía del CGRP con el antagonista del receptor BIBN-4096 mejora significativamente la inflamación de las vías respiratorias mediada por ILC2. En lugar de proporcionar evidencia directa mediante ablación genética, nuestros hallazgos aprovechan variaciones transcriptómicas asociativas y experimentos paralelos de intervención farmacológica (utilizando CGRP exógeno y el antagonista BIBN-4096) para demostrar que la protección terapéutica de KAST está estrechamente correlacionada con la supresión de los grupos de señalización CGRP/RAMP1 en las ILC2.
A pesar de estos hallazgos prometedores, deben reconocerse varias limitaciones inherentes. En primer lugar, aunque el modelo murino inducido por OVA proporciona información mecanicista valiosa, podría no recapitular completamente el complejo panorama fisiopatológico e inmunológico del asma alérgico humano debido a diferencias entre especies. En segundo lugar, el tamaño relativamente pequeño de la muestra en ciertos ensayos exploratorios indica que se requieren cohortes más grandes para lograr una generalización estadística más amplia. En tercer lugar, este estudio priorizó principalmente el eje de señalización CGRP/RAMP1/ILC2, lo que significa que otras vías potencialmente relevantes de interacción neuro-inmunitaria y redes de citoquinas superpuestas merecen una exploración más profunda en el futuro. Especialmente destacable es una importante limitación técnica: la ausencia de un grupo control con punto falso (sham) que utilice parches no medicados o ubicaciones fuera de los puntos de acupuntura. En consecuencia, factores de confusión no específicos—como el estrés mecánico provocado por el afeitado, la manipulación experimental y la estimulación adhesiva del propio parche—no pueden aislarse por completo de las propiedades terapéuticas específicas del KAST. Para resolver estas limitaciones, nuestras futuras líneas de investigación incorporarán rigurosamente controles falsos (sham) cuidadosamente diseñados y validaciones de múltiples vías, con el fin de consolidar aún más la especificidad y la reproducibilidad de estos hallazgos. En cuanto a la reducción observada en los niveles de proteína CGRP tras la intervención con BIBN-4096, es fundamental aclarar que, si bien BIBN-4096 funciona principalmente como un antagonista competitivo dirigido al complejo receptor RAMP1/CRLR y no como un inhibidor directo de la síntesis de CGRP, su administración in vivo puede reducir la acumulación local del ligando en los tejidos. Este fenómeno secundario probablemente esté mediado por la interrupción del bucle de retroalimentación positiva neuro-inmunitario. Al bloquear RAMP1 en células inmunitarias diana, como las ILC2, BIBN-4096 suprime la liberación posterior de citoquinas efectoras, lo que a su vez disminuye la activación inflamatoria retrógrada de las terminaciones nerviosas sensoriales y de las células neuroendocrinas pulmonares (PNEC), reduciendo así indirectamente la síntesis y retención tisular de CGRP.
En resumen, nuestros hallazgos empíricos demuestran que KAST remodela eficazmente el microambiente inmune innato pulmonar al dirigirse al eje neural CGRP/RAMP1. Aunque reconocemos que la extrapolación clínica directa requiere una optimización cuidadosa debido a las diferencias biológicas entre roedores y humanos, estos resultados proporcionan una base mecanicista crítica y previamente ausente que sustenta la teoría tradicional de «Fei Wai He Pi Mao» (el pulmón se combina con la piel y el pelo). Al ofrecer una perspectiva neuroinmune refinada, este protocolo establece una base científica confiable para guiar y apoyar futuras traducciones clínicas prospectivas y multicéntricas de las terapias tradicionales de aplicación de hierbas en puntos de acupuntura para el manejo del asma alérgico.
Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n.º 82274632), el Proyecto de Cultivo de Líderes en la Provincia de Jiangsu para la Medicina Tradicional China (n.º SLJ0309), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (n.º BK20231381), el Proyecto del Plan de Desarrollo Científico y Tecnológico de la Medicina Tradicional China de la Provincia de Jiangsu (n.º ZT202205), y el Laboratorio Clave de Investigación de Acupuntura y Medicina del Ministerio de Educación en la Universidad de Medicina China de Nanjing (n.º AML202304).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cinta transpirable médica 3M | 3M, EE. UU. | 1530C | Fijación del parche |
| Cloruro de acetilcolina | Sigma-Aldrich, EE. UU. | A6625 | Provoque bronquial |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, EE. UU. | G2939BA | Evaluación de la calidad e integridad del ARN |
| Alexa Fluor 488 anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (H+L) | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | (pedido personalizado) | Inmunofluorescencia (secundaria) |
| Hidróxido de aluminio | Sigma-Aldrich, EE. UU. | 239186 | Adyuvante |
| anticuerpo anti-CGRP (conejo) | Abcam, Reino Unido | ab81887 | Western blot / IF |
| Ratón BALB/c (hembra, SPF, 8–10 semanas, 18–22 g) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | modelo animal |
| BB700 de ratón anti-murino CD90.2 (clon 53-2.1) | BD Biosciences, EE. UU. | 566465 | Citometría de flujo |
| Citómetro de flujo BD FACSCanto II | BD Biosciences, EE. UU. | FACSCanto II | Citometría de flujo |
| BIBN-4096 (clorhidrato de olcegepant) | MedChemExpress LLC, EE. UU. | HY-10095A | antagonista del receptor CGRP |
| Cóctel de linaje con biotina | BD Biosciences, EE. UU. | (Personalizado, clones según se describe) | Citometría de flujo |
| Brilliant Violet 605 Estreptavidina | BD Biosciences, EE. UU. | 563260 | Citometría de flujo |
| Albúmina BSA Fracción V | BioFroxx (neoFroxx GmbH), Alemania | 4240GR100 | Bloqueo |
| Proteína calcitonina/CALCA | MedChemExpress LLC, EE. UU. | HY-P77587 | Intervención con CGRP |
| anticuerpo CD11c/ITGAX (conejo) | Abmart, Shanghái, China | MU115408S | Inmunofluorescencia |
| Buffer de recuperación de antígenos con citrato | Boster, China | AR0024 | Inmunohistoquímica |
| Solución de tinción con DAPI | Beyotime, Shanghái, China | C1006 | Tinción nuclear |
| ddH2O (agua doblemente destilada) | Sigma-Aldrich, EE. UU. | 10977015 | Reconstitución de proteínas y disolución de polvos |
| DESeq2 | Bioconductor (paquete de R) | Versión 1.42.0 | Software de análisis de expresión diferencial |
| DNasa I | Roche Diagnostics, Alemania | 10104159001 | Digestión del tejido pulmonar |
| IgG H de Asno Anti-Ratón&L (Alexa Fluor 555) | Abcam, Reino Unido | ab150106 | Inmunofluorescencia (secundaria) |
| Sustrato ECL (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech, China | – | Quimioluminiscencia en inmunotransferencia por Western blot |
| Kit de ensayo proteico BCA mejorado | Beyotime, Shanghái, China | P0010 | Cuantificación de proteínas |
| Solución de colorante Eosina Y | Sigma-Aldrich, EE. UU. | HT110216 | Histología (tinción HE) |
| Etanol (absoluto, grado analítico) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10009218 | Deshidratación de tejidos e histología |
| anticuerpo F4/80 (ratón, clon C-7) | Santa Cruz Biotechnology, EE. UU. | sc-377009 | Inmunofluorescencia |
| fastp | Código abierto (GitHub) | Versión 0.23.4 | Software de control de calidad de datos brutos de RNA-seq |
| FITC anti-murino CD45 (clon 30-F11) | BD Biosciences, EE. UU. | 553080 | Citometría de flujo |
| FlowJo | BD Biosciences, EE. UU. | 10 | Análisis de citometría de flujo |
| anticuerpo monoclonal GAPDH (ratón) | Proteintech, Wuhan, China | 60004-1-Ig | Western blot |
| anticuerpo GATA3 (ratón, clon L50-823) | Santa Cruz Biotechnology, EE. UU. | sc-268 | Inmunofluorescencia |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, EE. UU. | 13-0865-T100 | Exclusión de células muertas |
| Anticuerpo secundario de cabra anti-IgG de conejo (H+L) cruz-adsorbido | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | A11008 | Inmunofluorescencia (secundaria) |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, EE. UU. | 10.1.2 | Análisis estadístico |
| Solución de hematoxilina (Harris) | Sigma-Aldrich, EE. UU. | HHS16 | Histología (tinción HE) |
| HISAT2 | Universidad Johns Hopkins (código abierto) | Versión 2.2.1 | Software de alineación al genoma de referencia para RNA-seq |
| IgG de cabra anti-ratón (H+L) conjugada con HRP | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-1 | inmunotransferencia (secundario) |
| IgG (H+L) de cabra anti-conejo conjugada con HRP | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-2 | Western blot (secundario) |
| HTSeq-count | EMBL (utilidad Python) | Versión 2.0.3 | Utilidad de conteo de lecturas de características genómicas en RNA-seq |
| Peróxido de hidrógeno (H2O2, solución al 3 %) | Sigma-Aldrich, EE. UU. | H1009 | Bloqueo de peroxidasa endógena |
| iFluor™ Anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo conjugado a 488 | Huabio, China | HA1121 | Inmunofluorescencia (secundaria) |
| anticuerpo monoclonal IL-4 | Proteintech, Wuhan, China | 66142-1-Ig | Western blot |
| Anticuerpo IL13 | Affinity Biosciences, EE. UU. | DF6813 | Western blot |
| Anticuerpo IL5 | Affinity Biosciences, EE. UU. | AF5123 | Western blot |
| Illumina Novaseq 6000 | Illumina, EE. UU. | – | Secuenciación de ARN |
| ImageJ | NIH, EE. UU. | 1.8 | Cuantificación de inmunotransferencia por Western blot |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, EE. UU. | Versión 6.0 | Cuantificación de la densidad óptica de la imagen |
| Formulación herbal KAST | Departamento de Farmacia, Hospital Afiliado de la Universidad de Medicina China de Nanjing | – | Intervención |
| Anticuerpo monoclonal KLRG1 (2F1) | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | 58-5893-82 | Inmunofluorescencia |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, Alemania | 4.5 | Cuantificación de inmunofluorescencia |
| Microscopio confocal Leica STELLARIS 8 DIVE | Leica Microsystems, Alemania | STELLARIS 8 | Imagen de inmunofluorescencia |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Alemania | 5401119001 | Digestión del tejido pulmonar |
| Marcador (Escalera de proteínas preteñidas) | NCM Biotech, Suzhou, China | P9001 | Western blot |
| Kit de ELISA para CGRP de ratón | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF2491-A | ELISA |
| Kit ELISA de IL-13 de ratón | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02456M1 | ELISA |
| Kit ELISA de IL-4 de ratón | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02448M1 | ELISA |
| Kit ELISA para IL-5 de ratón | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-11729M1 | ELISA |
| Medio de montaje con bálsamo neutro | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10014061 | Montaje de portaobjetos de histología |
| Suero de cabra normal (para bloqueo) | Abcam, Reino Unido | ab7481 | Bloqueo para inmunohistoquímica/inmunofluorescencia |
| Compuesto de inclusión OCT | Sakura, EE. UU. | 4583 | Incrustación para microtomía criogénica |
| Kit de preparación rápida de geles PAGE en un solo paso | Vazyme, Nanjing, China | E303-01 | Preparación del gel de electroforesis SDS-PAGE |
| Ovalbúmina (OVA) | Sigma-Aldrich, EE. UU. | A5503 | Sensibilización/desafío |
| Paraformaldehído (4% en PBS) | Biosharp, China | BL539A | Fijación de tejidos |
| PE anti-murino/humano KLRG1 (clon 2F1) | BD Biosciences, EE. UU. | 564022 | Citometría de flujo |
| Cocktel de inhibidores de fosfatasas (50×) | Beyotime, Shanghái, China | P1092 | Extracción de proteínas |
| Solución de poli-L-lisina | Boster, China | AR0003 | Recubrimiento de portaobjetos para histología |
| Inhibidor de proteinasas y fosfatasas | NCM Biotech, Suzhou, China | P002 | Extracción de proteínas |
| membrana de PVDF (0.22 μm) | Merck Millipore, EE. UU. | ISEQ00010 | Western blot |
| anticuerpo policlonal RAMP1 (conejo) | Proteintech, Wuhan, China | 10327-1-AP | Inmunofluorescencia |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos (GR) | Beyotime, Shanghái, China | C3702 | Preparación de muestras para citometría de flujo |
| Tampón de lisis RIPA (fuerte) | Beyotime, Shanghái, China | P0013B | Extracción de proteínas |
| medio RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | 11875093 | Base para la digestión de células de tejido |
| SuperKine™ Medio de montaje con refuerzo antidesvanecimiento | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | Montaje para inmunofluorescencia |
| Tritón X-100 (detergente) | Sigma-Aldrich, EE. UU. | T8787 | Permeabilización para inmunofluorescencia |
| Reactivo TRIzol | Thermo Fisher Scientific, EE. UU. | 15596026 | Extracción de ARN |
| Kit de preparación de bibliotecas VAHTS Universal V10 para RNA-seq | Vazyme, Nanjing, China | NR605-01 | Construcción de bibliotecas para RNA-seq |
| Sistema de pletismografía de cuerpo entero | Guangyuanda, Pekín, China | WBP-4 | Función pulmonar (Penh) |
| Xileno (grado analítico) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10023418 | Desparafinización y clarificación |
Referencias
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