Generación de neuronas GABAérgicas a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos utilizando la expresión de ASCL1/DLX2 inducible por doxiciclina en AAVS1

Resumen

Este protocolo describe un método para generar neuronas GABAérgicas a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos mediante la integración de transgenes inducibles por doxiciclina en el locus de puerto seguro AAVS1 . La expresión estable y homogénea del transgénico proporciona un enfoque eficiente para la diferenciación directa en neuronas GABAérgicas, limitando al mismo tiempo el silenciamiento del transgénico, un problema común en los enfoques lentivirales.

Resumen

Las células madre pluripotentes inducidas en humanos (hiPSC) ofrecen una oportunidad sin precedentes para modelar enfermedades neurológicas humanas in vitro. La generación fiable de poblaciones neuronales definidas, como las neuronas del ácido gamma-aminobutírico (GABAérgica), es esencial para estos estudios. Este protocolo detalla un método robusto para diferenciar las hiPSCs en neuronas gabaérgicas utilizando un sistema inducible por doxiciclina. El enfoque se basa en la integración estable de transgenes que codifican los factores de transcripción ASCL1 y DLX2 en el locus de integración viral adenoasociada de puerto seguro 1 (AAVS1.) mediante knock-in mediado por CRISPR/Cas9. Esta integración dirigida evita el silenciamiento del transgénico que se observa a menudo con la integración lentiviral aleatoria. El protocolo abarca el mantenimiento de los hiPSC, el proceso de nucleofección para la integración de transgenes, la selección de puromicina para enriquecer células diseñadas con éxito y el procedimiento de diferenciación paso a paso. Tras la inducción con doxiciclina, los hiPSCs modificados salen rápidamente del ciclo celular, adquieren morfología neuronal y expresan marcadores de línea GABAérgica en un plazo de 21 días. Los pasos clave incluyen la neuroinducción y la posterior maduración utilizando factores de crecimiento específicos, así como posibles enfoques para mejorar la adhesión celular durante la maduración. Este método estandarizado produce poblaciones enriquecidas de neuronas inducidas que expresan marcadores de línea GABAérgica, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación en neurociencia y la modelización celular.

Introducción

Las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs) proporcionan una plataforma única para modelar enfermedades neurológicas humanas in vitro. y para investigar los complejos mecanismos moleculares que impulsan el desarrollo y la degeneración¹. Esta tecnología permite la generación de modelos celulares específicos para cada paciente para investigar una amplia variedad de condiciones, que van desde anomalías neurodesarrollativas tempranas en ciliopatías^{sindrómicas 2} hasta sutiles alteraciones epigenómicas observadas en la enfermedad de^{Alzheimer esporádica 3}. En consecuencia, la diferenciación dirigida de los hiPSC se ha convertido en una piedra angular de la neurociencia molecular moderna.

Para captar eficazmente las sutilezas de los procesos neurológicos humanos, es esencial generar subtipos neuronales altamente específicos y puros. Por ejemplo, se requieren poblaciones neuronales definidas para esclarecer los roles transcripcionales específicos de proteínas como MECP2 en las neuronas^{humanas 4}, o para evaluar las vulnerabilidades dirigidas de neuronas sensoriales periféricas a infecciones virales, como SARS-CoV-2⁵. Además, construir microentornos complejos y fisiológicamente relevantes, como incorporar microglía funcional en organoides cerebrales 3D, se basa fundamentalmente en la generación robusta y predecible de linajes neuronales y gliales^{distintos 6}. Entre estos subtipos, las neuronas GABAérgicas son de particular interés debido a su papel inhibidor crucial en el sistema nervioso central y su implicación en diversos trastornos neurológicos y^{psiquiátricos 7}. El objetivo general de este método es proporcionar un protocolo fiable, eficiente y reproducible para la diferenciación dirigida de hiPSCs en neuronas inducidas que expresen marcadores de linaje GABAérgico. Los protocolos tradicionales de diferenciación dirigida para neuronas GABAérgicas, que dependen de moléculas de señalización extrínseca, pueden ser lentos, muy variables y resultar en poblaciones celulares^{heterogéneas 8}.

Para superar estas limitaciones, la programación directa mediada por factores de transcripción ha surgido como una alternativa poderosa⁹. Este protocolo utiliza un sistema de expresión inducible por doxiciclina para impulsar la expresión de los factores de transcripción proneural ASCL1 y DLX2¹⁰. Al dirigir estos transgenes al locus de puerto seguro del sitio de integración viral asociado a adeno-asociado 1 (AAVS1.) usando CRISPR/Cas9, este método evita el problema común del silenciamiento de transgenes asociado a la integración lentiviral^{aleatoria 10}. El constructo del donante incluye un reportero fluorescente, como mCherry, para monitorizar las células transpositivas tras la selección. Esta estrategia pretende soportar una expresión transgénea más homogénea que los enfoques de integración aleatoria, aunque la estabilidad de la expresión y la reproducibilidad de diferenciación deben validarse para cada línea ingenierizada. Este método estandarizado genera poblaciones enriquecidas de neuronas inducidas que expresan marcadores de linaje GABAérgico en aproximadamente 21 días, un periodo más corto que el de los enfoques tradicionales de moléculas^{pequeñas 8,10}. Este protocolo es muy adecuado para investigadores que requieren poblaciones neuronales escalables y consistentes para aplicaciones posteriores como microscopía de alto contenido, transcriptómica de células individuales o ensayos fisiológicos funcionales.

Protocolo

PRECAUCIÓN: Los cultivos humanos de hiPSC deben manipularse como material potencialmente biopeligroso bajo los procedimientos institucionales de bioseguridad. Realizar todos los procedimientos de cultivo de hiPSC en humanos en un gabinete de seguridad biológica certificado Clase II utilizando técnica estéril. Todos los residuos que contengan células humanas, medios expuestos a células humanas y material plasmídico CRISPR/Cas9 deben ser descontaminados conforme a las directrices locales de bioseguridad antes de su eliminación. La doxiciclina, la puromicina, el DMSO y otros reactivos químicos deben manipularse con guantes y protección adecuada para ojos y piel, y los residuos deben desecharse según los procedimientos institucionales relacionados con residuos químicos. El extracto de membrana basal (EMB) debe manipularse mediante técnica estéril y almacenarse en hielo antes de su uso para evitar una polimerización prematura. El almacenamiento de nitrógeno líquido y la manipulación criovial deben realizarse con guantes criogénicos adecuados, protección facial y precaución para evitar quemaduras por frío o explosiones de vial durante el descongelamiento.

NOTA: Antes de la edición mediada por CRISPR/Cas9 y la diferenciación neuronal, los cultivos de hiPSC deben cumplir criterios predefinidos de control de calidad. Las células deben ser confirmadas negativas para micoplasma, mostrar un cariotipo normal o un perfil de integridad genómica aceptable, y mantener una expresión robusta de marcadores de pluripotencia, incluyendo OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 y/o SSEA4. Los cultivos deben mostrar la morfología típica compacta de colonias hiPSC, con una alta proporción nuclear-citoplasmático, bordes definidos de la colonia y una diferenciación espontánea mínima. Solo se deben utilizar cultivos que proliferen activamente dentro del rango recomendado de paso, y las células no deben superar el número máximo de pasos definido por el laboratorio, normalmente por debajo del paso 40, salvo que se valide lo contrario. Los cultivos que presenten morfología anormal, diferenciación espontánea excesiva, crecimiento pobre, contaminación confirmada o evidencia de inestabilidad genómica deben excluirse de los experimentos de edición y diferenciación. Todos los materiales necesarios para este protocolo, incluidas las recetas de medios, se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de reactivos y placas de cultivo

1. Prepara el medio congelante combinando 40 mL de suero de reemplazo knock-out (KOSR) y 10 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) en un tubo cónico de 50 mL.
2. Homogeneiza el medio congelante pipeteando arriba y abajo 10 veces. Guarda la solución a 4 °C durante hasta 1 mes.
3. Diluye el extracto de membrana basal (BME) en el medio Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) de Dulbecco a una concentración final de 80 μg/mL.
   NOTA: Antes de diluirla, verifique la concentración de la solución BME recibida utilizando el número de lote en la web del vendedor.
4. Añade 1 mL de BME diluido por pozo a una placa de 6 pozos. Devuelve inmediatamente el BME de la acción a 4 °C durante hasta 1 mes.
5. Inclina la placa para distribuir la solución de manera uniforme a lo largo de toda la superficie de los pozos. Asegúrate de que no haya zonas sin recubrir.
6. Incuba la placa durante un mínimo de 30 minutos a 37 °C antes de usarla.
   NOTA: No hay un tiempo máximo de incubación. Si incuba durante más de un día, asegúrese de que el DMEM/F-12 no se evapore. La solución BME utilizada para un pozo solo puede reutilizarse una vez para recubrir un segundo pozo. La manipulación de la EMB a temperatura ambiente debe ser breve debido a su rápida polimerización.

2. Mantenimiento y paso de hiPSC

NOTA: En este protocolo, medio de mantenimiento hiPSC se refiere a mTeSR plus. mTeSR plus es el medio recomendado para el mantenimiento rutinario, el paso, la recuperación tras la nucleofección y la selección de puromicina.

1. Realiza el paso hiPSC aproximadamente cada 4–6 días cuando las células alcanzan el 60% de confluencia.
2. Aspira el medio de cultivo de los pozos usando una pipeta aspiradora.
3. Añade 1 mL de ReLeSR al pozo e incuba durante 30 s a temperatura ambiente.
4. Aspira el reactivo de disociación e incuba la placa durante 8 minutos a 37 °C.
5. Añade suavemente 1 mL de medio de mantenimiento hiPSC usando una pipeta de 5 mL. Recoge la suspensión de la celda en un tubo de 50 mL.
6. Mezcla 10 μL de la suspensión de la celda con 10 μL de azul de tripán en un tubo de microcentrífuga. Carga 10 μL de la mezcla sobre una lámina de la celda para determinar la concentración viable de la celda.
7. Aspira el recubrimiento BME de un pozo previamente preparado. Añadir 2 mL de medio de mantenimiento hiPSC suplementado con inhibidor de la quinasa de bobina enrollada asociada a Rho (ROCK) (Y-27632; 10 μM final).
8. Siembra 100.000 hiPSCs en el pozo, con el objetivo de una viabilidad del >90%. Mueve la placa en un movimiento en forma de ocho para asegurar una distribución homogénea de las células.
9. Incubar las células a 37 °C con un 5% de CO₂.
10. Tras 24 horas, sustituye el medio por 2 mL de mTeSR fresco más medio sin inhibidor de ROCK.
    NOTA: Se espera un cambio transitorio en la morfología celular (elongación celular) en presencia del inhibidor de ROCK. Verifica que las células recuperen su morfología característica tras su extracción.

3. Nucleofección de hiPSCs

1. Pasa las células cuando la confluencia alcance alrededor del 60%.
   NOTA: En este protocolo, aproximadamente el 60% de confluencia corresponde a colonias de hiPSC en crecimiento activo que cubren algo más de la mitad de la superficie del pozo, con espacio visible entre colonias y una diferenciación espontánea mínima. Las colonias no deben estar sobrecubiertas, fusionarse extensamente ni mostrar centros densos y multicapas en el momento de la nucleofección.
2. Asegúrese de que el dispositivo de nucleofección esté encendido y que el suplemento de nucleofección se añada a la solución de nucleofección P3. Prepara un cubo de hielo.
3. Añadir 110 μL de la solución nucleofección P3 a un tubo microcentrífuga colocado sobre hielo.
4. Añadir 1 μg del plásmido CRISPR/Cas9 y 1 μg del plásmido donante que contiene el casete inducible por doxiciclina ASCL1-P2A-DLX2. Casete, reportero fluorescente y casete de resistencia a puromicina al tubo. Mezcla suavemente sin añadir burbujas.
5. Prepara la placa de destino aspirando la BME desde dos pozos recubiertos. Añadir 2 mL de medio de mantenimiento hiPSC que contenga un inhibidor de ROCK a cada pozo e incubar la placa a 37 °C.
6. Disociar hiPSCs en una confluencia del 60% de un pozo de una placa de 6 pozos, como se describe en los pasos 2.2 a 2.5. Transfiere la suspensión a un tubo estéril y centrifuga durante 5 minutos a 500 x g a temperatura ambiente.
7. Descarta el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet celular en los 110 μL de la solución nucleofeccional P3 que contiene los plásmidos. Pipetea suavemente para evitar la formación de burbujas.
8. Transfiere 100 μL de la suspensión celular a una cubeta de nucleofección colocada sobre hielo.
9. Inserta la cubetas en el dispositivo nucleofector y ejecuta el programa CB-150 para hiPSCs.
10. Recupera inmediatamente las células usando una pipeta Pasteur de plástico. Transfiere volúmenes iguales de la suspensión de celda a los dos pozos previamente preparados.
11. Distribuye las células mediante un movimiento en forma de ocho e incuba a 37 °C.
12. Después de 24 horas, reemplaza el medio por mTeSR más un inhibidor de ROCK sin medio. Verifica la eficiencia de la nucleofección observando la fluorescencia si es aplicable.

4. Selección de antibióticos

PRECAUCIÓN: La puromicina es tóxica. Manejar con el equipo de protección individual adecuado y desechar los residuos conforme a las directrices institucionales.

NOTA: Antes de seleccionar hiPSCs editados, determina la concentración óptima de puromicina para cada línea de hiPSC. Sembrar hiPSCs sin editar a 100.000 células por pozo en una placa de 6 pozos recubierta con BME en medio de mantenimiento de hiPSC suplementado con inhibidor de ROCK. Tras 24 horas, sustituye el medio por un medio de mantenimiento hiPSC fresco que contenga puromicina a 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 y 1,5 μg/mL. Sustituir diariamente el medio que contiene puromicina y monitorizar la morfología celular y la supervivencia mediante microscopía de campo brillante durante 5 días. La concentración seleccionada debería eliminar todos los hiPSC sin editar en un plazo de 3–5 días, minimizando la toxicidad excesiva. En este protocolo, la concentración óptima de puromicina suele ser de 0,4–0,6 μg/mL.

1. Esperar 3 pasajes tras la nucleofección, normalmente aproximadamente 1–2 semanas dependiendo de la recuperación y la tasa de crecimiento, para permitir la pérdida de plásmidos no integrados antes de iniciar la selección.
2. Realiza un paso celular y sembra 100.000 células por pozo.
3. Después de 24 horas, añadir puromicina a la concentración determinada por la curva de eliminación, típicamente 0,4–0,6 μg/mL.
4. Mantén la selección de puromicina durante el tiempo predeterminado, generalmente unos 5 días.
5. Validar la población seleccionada mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo para estimar la proporción de células reporteras positivas.
   NOTA: Proceder solo con poblaciones agrupadas que muestren una expresión reportera homogénea en general, idealmente > 80–90% de células reporteras positivas. Si la expresión del reportero permanece en mosaico, amplía la selección, repite el enriquecimiento o considera el aislamiento clonal antes de la diferenciación.
6. Confirma la correcta dirección de AAVS1 mediante PCR de unión antes de iniciar la diferenciación neuronal.
7. Cuando se requiera una validación rigurosa, verificar los productos PCR mediante secuenciación Sanger y evaluar el número de copias del transgen mediante qPCR, ddPCR u otro ensayo de número de copia apropiado.
8. Evalúa la integración aleatoria usando ensayos basados en PCR para secuencias de columna vertebral de plásmidos o análisis de integración genómica más amplia, dependiendo de la aplicación posterior prevista.
9. Confirmar que la población seleccionada de hiPSC sigue siendo mico-negativa, conserva la morfología típica de la colonia de hiPSC y mantiene un crecimiento robusto tras la selección de puromicina.
10. Reevalúa la integridad genómica mediante cariotipado, matriz SNP u otro ensayo validado, especialmente cuando se usen células editadas para modelado de enfermedades, ensayos funcionales o estudios a largo plazo.
11. Evaluar los posibles efectos fuera de objetivo de CRISPR/Cas9 mediante la secuenciación dirigida de sitios fuera de objetivo predichos o, cuando sea necesario, enfoques genómicos más amplios.
    NOTA: No utilice cultivos para diferenciación si presentan morfología anormal, recuperación deficiente tras la selección, expresión persistente de los reporteros en mosaico, anomalías genómicas confirmadas o fallida integración de AAVS1 . En este protocolo, se utilizan hiPSC seleccionados diseñados como población agrupada y pueden ser criopreservados antes de la inducción de doxiciclina, una vez validada la expresión del reportero, la localización, morfología y crecimiento de AAVS1 . La criopreservación tras la inducción de doxiciclina o durante la maduración neuronal no forma parte del flujo de trabajo estándar y debe validarse empíricamente antes de su uso.

5. Diferenciación en neuronas gabaérgicas

1. Prepara el número necesario de pozos recubiertos de BME. Ten en cuenta que una bien sembrada en el Día 0 producirá un pozo de neuronas GABAérgicas.
2. Preparar 6,9 mL de medio de neuroinducción por pozo, suplementándolo con doxiciclina (1 μg/mL). Incluye un volumen de exceso del 15% para compensar errores de evaporación o pipeteo.
   NOTA: La doxiciclina se utiliza a una concentración final de 1 μg/mL, a partir del día 0, y se mantiene durante la diferenciación y maduración. Se prepara un medio fresco que contiene doxiciclina en cada cambio de medio para mantener una inducción consistente del transgénico. Esta dosis se seleccionó porque producía una expresión robusta de reporteros y una conversión neuronal eficiente en nuestras manos. No se realizó una dosis-respuesta formal de doxiciclina en este protocolo; por lo tanto, los laboratorios que adoptan el método pueden probar empíricamente 0,1–2 μg/mL de doxiciclina si la inducción por transgénio resulta subóptima.
3. En el día 0, disociar los hiPSCs modificados y sembrar 200.000 células en los pozos preparados recubiertos de BME. Incubar a 37 °C.
4. En los días 1, 2 y 3, aspira el medio y añade 2 mL de medio de neuroinducción fresco que contenga doxiciclina.
   NOTA: Para el tercer día, la expansión celular debería disminuir notablemente y pueden empezar a aparecer estructuras similares a dendríticas. Si se requiere confirmación experimental de la salida del ciclo celular, se puede realizar inmunotinción con Ki-67 o incorporación de EdU/BrdU en los días 3–4.
5. En el día 4, preparar un medio de neuromaduración que contiene el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), el factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) y la neurotrofina-3 (NT-3), cada uno a una concentración final de 10 ng/mL, doxiciclina a 1 μg/mL y PluriSln a 20 μM.
6. Aspira el medio de neuroinducción. Añade cuidadosamente 2 mL del medio de neuromaduración gota a gota a lo largo de la pared del pozo para evitar perturbar las neuronas recién formadas.
7. En el día 7, aspirar el medio y añadir suavemente 2 mL de medio de neuro-maduración que contenga las neurotrofinas y la doxiciclina, pero omitiendo el inhibidor de la supervivencia de células pluripotentes.
8. Para un mantenimiento a largo plazo, se reemplaza completamente el medio de neuromaduración cada 3 a 4 días, adaptando la frecuencia según la densidad celular.
   NOTA: El día 21 es el punto final estándar para evaluar la identidad neuronal gabaérgica. Para el día 21, las células deberían mostrar características neuronales GABAérgicas, incluyendo DLX1.y continúan madurando sus redes axonales. Se seleccionó empíricamente una densidad de siembra de 200.000 células/pozo para producir colonias bien espaciadas, evitando el hacinamiento y la muerte celular asociada a la maduración. Densidades de 150.000–300.000 celdas por pozo son compatibles, con densidades más bajas preferidas para morfología y densidades más altas para la recuperación de materiales. Para reducir el desprendimiento, realiza cambios más frecuentes de medio a medio medio usando una pipeta de 1.000 μL a bajo caudal sin inclinar la placa. Si es necesario, las células pueden ser replacadas una vez después de la inducción de doxiciclina de 3 días, antes de añadir el medio de maduración, utilizando recubrimientos mejorados como poli-L-lisina/laminina o laminina-521. Se debe evitar el paso adicional tras el inicio de la maduración.
9. Los cultivos pueden mantenerse más allá del día 21 para una maduración prolongada si las redes permanecen adheridas, viables y libres de colonias proliferantes similares a hiPSC. Después del día 21, realiza cambios de medio medio cada 3–4 días con un medio fresco de neuromaduración que contenga doxiciclina y factores neurotróficos.
   NOTA: Utilizar cultivos para ensayos posteriores una vez que la morfología neuronal y las redes neuríticas estén estables, el desprendimiento sea mínimo y no se vean colonias indiferenciadas. En nuestras manos, los cultivos suelen usarse entre el día 21 y el día 35.

Resultados

La aplicación exitosa de este protocolo da como resultado una población enriquecida de neuronas inducidas con características moleculares GABAérgicas. La estrategia se basa en la inserción dirigida de un casete ASCL1-P2A-DLX2 inducible por doxiciclina en el locus AAVS1 (Figura 1A). Tras la selección de hiPSCs modificados, se utiliza la inducción de doxiciclina para impulsar la diferenciación neuronal GABAérgica, como se describe en...

Discusión

La generación exitosa de neuronas GABAérgicas depende en gran medida de varios pasos críticos dentro de este protocolo. Mantener hiPSCs de alta calidad e indiferenciados es fundamental; La diferenciación espontánea antes de la nucleofección reduce drásticamente la eficiencia de integración y la pureza neuronal^{posterior 8}. Además, es esencial determinar con precisión la curva de eliminación de puromicina para garantizar la eliminación completa de células no integra...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4D-Nucleofector™ Core Unit	Lonza	AAF-1002B	Para electroporación/nucleofección de hiPSCs.
Platos de cultivo de 6 pocillos	Sarstedt	83.3920300	Platos tratados para cultivo de tejidos para mantenimiento y diferenciación de hiPSCs.
BDNF (Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro)	STEMCELL Technologies	78005	Proteína humana recombinante para maduración neuronal; preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante y usar a una concentración final de 10 ng/mL.
Contador de células (Countess)	Thermo Fisher Scientific	C10283	Usado para contar células.
Centrífuga	VWR	76468-134	Para pelletización de células.
Incubadora de CO2	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i o equivalente	Incubadora de cultivo celular que mantiene 37 °C, atmósfera humedecida y 5% CO2.
Cryotubes	Thermo Fisher Scientific	5000-0020	Viales criogénicos estériles para congelar hiPSCs; pueden usarse viales criogénicos externos equivalentes de rosca de 1,8–2,0 mL.
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	Bio-Techne	BME001-05	Matriz de recubrimiento BME estándar usada en el protocolo. Verificar la concentración de stock específica del lote del certificado de análisis de Bio-Techne y diluir en DMEM/F-12 a una concentración de trabajo de 80 µg/mL.
DMEM/F-12	Wisent	319-090-CL	Medio basal usado para diluir BME.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma-Aldrich	D2650	Crioprotector usado en la preparación del medio de congelación.
Plásmido donador: cassette de diana ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 inducible	Plásmido personalizado	Número de acceso de Addgene pendiente	Plásmido donador AAVS1 personalizado que contiene la casete ASCL1-P2A-DLX2 inducible por doxiciclina y elementos de selección/reporte. Proporcione el mapa del plásmido y la secuencia completa como archivo complementario o bajo solicitud.
Doxiciclina hiclato	Sigma-Aldrich	D9891	Usado para inducir la expresión de ASCL1-P2A-DLX2. Prepare solución de stock estéril, haga alícuotas, proteja de la luz, almacene congelado y use a una concentración final de 1 µg/mL.
Etanol (70%)	Commercial Alcohols / Greenfield Global	P016EAAN	Para esterilización dentro del gabinete de seguridad biológica; use etanol 70% aprobado institucionalmente o equivalente.
Microscopio de fluorescencia	ECHO	Revolve R4	Microscopio usado para imágenes de contraste de fase y fluorescencia de la expresión del reporte y la morfología neuronal.
GDNF (Factor Neurotrófico Derivado de la Glia)	STEMCELL Technologies	78058	Proteína humana recombinante para maduración neuronal; preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante y usar a una concentración final de 10 ng/mL.
Línea de hiPSC PGP1	EditCo Bio	Línea de hiPSC humana PGP1	Línea de hiPSC humana de consentimiento abierto comercialmente disponible usada en este protocolo; registre el número de pasaje y el estado de QC antes de la edición y diferenciación.
Software de análisis de imágenes	ImageJ/Fiji	Fuente abierta; se debe informar la versión utilizada	Para cuantificación de fluorescencia y procesamiento de imágenes representativas.
Sustitución de Suero KnockOut™ (KOSR)	Thermo Fisher Scientific	10828028	Usado en la preparación del medio de congelación.
Laminina-521	STEMCELL Technologies	200-0117	Reactivo opcional de solución de problemas. No es parte del protocolo de recubrimiento estándar; puede usarse como matriz alternativa o de doble recubrimiento si persiste la desprendimiento neuronal.
Dewar de nitrógeno líquido	Thermo Fisher Scientific	Locator 6 Plus o equivalente	Almacenamiento a largo plazo de hiPSCs congeladas en fase de vapor o nitrógeno líquido de acuerdo con los procedimientos de seguridad criogénica institucionales.
Contenedor de congelación Mr. Frosty™	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Para congelación de células a una tasa controlada a -80 °C.
mTeSR™ Plus	STEMCELL Technologies	100-0276	Medio de mantenimiento libre de células nodrizas para hiPSCs.
Medio de neuroinducción	STEMCELL Technologies	08582	Medio comercial de neuroinducción usado para inducción neuronal temprana.
Medio base de maduración neuronal (BrainPhys™ Medio Neuronal)	STEMCELL Technologies	05790	Medio base para maduración neuronal; suplementar con BDNF, GDNF, NT-3, doxiciclina y PluriSln-1 como se describe en el protocolo.
NT-3 (Factor Neurotrófico 3)	STEMCELL Technologies	78074	Proteína humana recombinante para maduración neuronal; preparar de acuerdo a las instrucciones del fabricante y usar a una concentración final de 10 ng/mL.
Kit P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X	Lonza	V4XP-3024	Kit que contiene la Solución P3 y cubetas para nucleofección de hiPSCs.
Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiótico opcional para reducir el riesgo de contaminación bacteriana.
Plasmocin™ profiláctico	InvivoGen	ant-mpp	Antibiótico opcional para prevenir la contaminación por micoplasma.
PluriSIn-1	STEMCELL Technologies	72822	Inhibidor de supervivencia de células pluripotentes para eliminar hiPSCs no diferenciadas; prepare el stock de acuerdo a las instrucciones del fabricante y use a una concentración final de 20 µM.
Dihidrocloruro de Puromicina	Thermo Fisher Scientific	A1113803	Antibiótico usado para selección; prepare solución de stock estéril, haga alícuotas, almacene congelado y determine la concentración final de trabajo por curva de muerte, típicamente 0,4–0,6 µg/mL.
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA plásmido	Addgene	85802	Plasmid CRISPR/Cas9 usado para la diana AAVS1; incluya la secuencia de gRNA AAVS1 en el mapa del plásmido o información complementaria.
Software de análisis qPCR	Applied Biosystems / Thermo Fisher Scientific	Software de Diseño y Análisis QuantStudio o equivalente	Para extracción de Ct y análisis de RT-qPCR; reporte la versión del software utilizada.
Master mix qPCR	Thermo Fisher Scientific	PowerUp SYBR Green Master Mix, A25742	Para cuantificación por RT-qPCR de marcadores neuronales y GABAérgicos.
Primers qPCR: DLX1	Oligonucleótidos personalizados	Secuencia