Un modelo de sobrecarga de hierro basado en citrato de amonio férrico con lecturas asociadas a la ferroptosis en mioblastos C2C12

Resumen

Aquí presentamos un modelo de sobrecarga de hierro a base de citrato de amonio férrico rápido en mioblastos de C2C12 que produce carga de hierro, cambios moleculares asociados a la ferroptosis y una pérdida temprana de viabilidad sensible a la ferrostatina.

Resumen

La ferroptosis es una forma de muerte celular regulada dependiente del hierro, implicada en el envejecimiento y las enfermedades degenerativas. Anteriormente descubrimos que las células madre musculares envejecidas acumulan hierro intracelular y sufren una muerte ferroptótica al activarse. Aquí describimos un modelo in vitro sencillo que utiliza citrato de amonio férrico para generar sobrecarga de hierro en mioblastos murinos de C2C12. El tratamiento con citrato de amonio férrico aumentó la carga intracelular de hierro, como lo demuestran los transcritos elevados de ferritina de cadena pesada y ligera, el aumento de la proteína ferritina y la señal aumentada de un colorante de hierro lábil de células vivas. La exposición al citrato de amonio férrico (FAC) también produjo cambios moleculares asociados a la ferroptosis, incluyendo un aumento de la expresión de Slc40a1 y Hmox1 y una reducción de la proteína peroxidasa 4 de glutation. La disminución asociada a la FAC en la glutatión peroxidasa 4 fue parcialmente revertida por la deferoxamina. A las 12 horas, el citrato de amonio férrico citotóxico redujo la viabilidad celular, y este efecto fue rescatado por la ferrostatina-1, consistente con un componente sensible a la ferroptosis de la muerte celular. En momentos posteriores, la mayor variabilidad y la reducción del rango dinámico del ensayo limitan la interpretabilidad de las mediciones de viabilidad. Así, este protocolo proporciona un modelo rápido y escalable de carga de hierro mediada por citrato de amonio férrico, que puede utilizarse para estudiar respuestas asociadas a la ferroptosis y probar intervenciones modificadoras del hierro o la ferroptosis en células musculares.

Introducción

La ferroptosis es una forma de muerte celular regulada (ECR), molecularmente distinta de otros RCD. Se descubrió por primera vez utilizando erastina, una molécula pequeña letal selectiva para el SRA (sarcoma de rata), que se encontró que causaba muerte celular no^{apoptótica 1}. En su obra fundamental, Dixon et al. describieron por primera vez su mecanismo como dependiente del hierro, acuñando así el término ferroptosis, que significa "caída (muerte) por hierro¹". Molecularmente, la ferroptosis se presenta como una acumulación excesiva de hierro, aumento de la peroxidación lipídica y una acumulación de especies reactivas de ogénio, lo que conduce a la muerte celular². Se distingue de forma única del estrés oxidativo y otras formas de RCD por su independencia de la activación de la caspasa, característica distintiva de la apoptosis, y la ausencia de la proteína quinasa interactuante con receptores fosforilados 3 (RIPK3) y pseudo quinasa de dominio de linaje mixto (MLKL), que solo se observan en la necroptosi³. Además, la ferroptosis también puede aliviarse con los antioxidantes lipídicos ferrostatina-1 y liproxstatina-1, y con el quelante de hierro^{deferoxamina.} Aunque la ferroptosis es similar a otros tipos de RCD en que todas acaban provocando la muerte de células, su presentación la hace mecánicamente distinta de otras formas de RCD.

El estudio de la ferroptosis ha ganado fuerza en la última década, principalmente debido a los continuos esfuerzos en el campo para identificar nuevas características y desarrollar nuevas herramientas para estudiar sus mecanismos subyacentes y su contribución a la enfermedad^{humana 5}. Un cuerpo reciente de evidencias sugiere que la sobrecarga de hierro y la ferroptosis son factores poco estudiados que contribuyen a la fragilidad y sarcopenia relacionadas con^{la edad 6,7,8}. Recientemente demostramos que las células madre musculares envejecidas (MuSCs) son especialmente susceptibles a la muerte ferroptótica resultante de la inflamación crónica que suprime un programa genético antioxidativo mediante el silenciamiento^{epigenético 9}. Descubrimos que los MuSC envejecidos acumulan un nivel aberrante de hierro elemental intracelular, aproximadamente 30 veces mayor que su homólogo adulto. Aunque la ferroptosis se ha relacionado con enfermedades en múltiples órganos y tejidos—principalmente aquellos relacionados con el envejecimiento—su papel fisiológico sigue siendo incierto y merece una investigación más profunda.

Aunque nuestro estudio previo mostró que los MuSC envejecidos se sensibilizan a la muerte ferroptótica al activarse, la contribución específica de la carga de hierro a ese fenotipo aún está por aclararse. Aquí establecemos un modelo sencillo de sobrecarga de hierro en mioblastos de C2C12 tratados con citrato de amonio férrico (FAC) y preguntamos si el exceso de hierro es suficiente para generar cambios moleculares asociados a la ferroptosis y pérdida de viabilidad sensible a la ferrostatina. Las células C2C12 proporcionan un sistema progenitor del músculo murino de bajo mantenimiento, escalable y fácilmente^{disponible 10}. Prevemos que este enfoque ofrecerá una plataforma práctica para estudiar las respuestas al estrés impulsadas por el hierro en las células musculares y para probar intervenciones que modifiquen fenotipos asociados a la ferroptosis.

Protocolo

1. Preparación de las células C2C12

1. Células de descongelación
   NOTA: Todos los pasos de cultivo celular deben realizarse en un gabinete de bioseguridad estéril.
   1. Prepara un tubo cónico que contenga 9 mL de medio completo y tibio (medio Eagle modificado de Dulbecco con glucosa alta y piruvato + 10% suero fetal bovino + 1% pen/estreptococo).
   2. Descongelar un vial de células congeladas de C2C12 (~1 millón) añadiendo 800 μL de medio completo precalentado al frasco desde el stock principal del medio. Haz pipet despacio.
   3. Una vez que el medio añadido al vial descongelante se enfríe, sácalo y agárdalo al tubo cónico. Sustituye por el mismo volumen de material caliente del tubo. Sigue pipeteando arriba y abajo y cambiando el medio hasta que las células congeladas estén resuspendidas.
   4. Pipeta el contenido del vial en el tubo cónico del medio. Invierte para mezclar y luego añade el contenido a un plato tratado con cultivo celular de 10 cm. Incubar a 37 °C durante 4 horas.
   5. Revisa las células bajo un microscopio para asegurarte de que se han adherido. Las celdas unidas parecerán alargadas, mientras que las celdas flotantes son circulares y se mueven cuando la placa se mueve.
      NOTA: Suponiendo que las células placadas estén sanas, la mayoría deberían estar adheridas.
   6. Aspira el medio para eliminar cualquier célula muerta y restos. Sustituye por 10 mL de medio completo y tibio y vuelve a la incubadora. Déjalo incubar durante la noche o hasta que la placa alcance el 80% de confluencia.
2. Siembra de células C2C12 para tratamiento con hierro
   1. Una vez alcanzada la confluencia deseada, aspira el medio celular. Añade 2 mL de PBS gota a gota a la placa, asegurando que toda la superficie esté cubierta; aspiración.
   2. Añade 2 mL de tripsina al 0,25% a las células. Incubar a 37 °C durante 5–10 minutos, o hasta que las células se desprendan. Una vez desprendidas, las células se mostrarán circulares bajo un microscopio, y la tripsina y la suspensión celular serán turbias y espesadas.
   3. Neutraliza la tripsina añadiendo 8 mL de DMEM completo y tibio. Utiliza una pipeta serológica para mezclar bien la solución y lavar la placa. Transfiere la suspensión de la celda a un tubo cónico.
   4. Invierte suavemente el tubo 3–5 veces. Elimina el volumen adecuado y cuenta las células usando el método preferido (contador celular, hemocitómetro, etc.).
   5. Haz una suspensión de células suficiente para sembrar el número deseado de pozos/placas para n = 3 para cada condición: placa de 10 cm (para western blot): 100.000 celdas/placa, placa de 6 pozos (para qPCR): 50.000 celdas/pozo, placa de 96 pozos (para hierro lábil y tinción por luminiscencia): 1.000 celdas/pozo. Deja que las células incuben a 37 °C durante la noche.
3. Aplicación de tratamiento con hierro a células sembradas
   1. El día del tratamiento, añadir citrato de amonio férrico (FAC; fórmula = C₆H₁₁FeNO₇⁺³; MW = 265 g/mol) para completar el DMEM en las siguientes concentraciones bajo condiciones estériles: Severo: 180 μM (0,0477 mg/mL), Citotóxico: 1.800 μM (0,477 mg/mL).
      NOTA: Considera añadir también controles, incluyendo, pero no limitado a vehículos, deferoxamina severa + 150 μM (un quelante de hierro), vehículo + 150 μM de deferoxamina y/o vehículo + RSL3 (un inductor de ferroptosis; control positivo. Además, cabe señalar que el DMEM puede contener una pequeña cantidad de nitrato de hierro (III) no ahidratado, una fuente de hierro férrico, en su estado inicial. El lector debe interpretar las concentraciones recomendadas de FAC como adicionales a cualquier hierro férrico ya presente en el medio de cultivo del vehículo.
   2. Invierte para mezclar hasta que el FAC se disuelva en un medio completo.
      NOTA: Dado que el FAC es soluble en agua, no se necesita DMSO ni disolvente adicional. La adición de FAC puede alterar el pH de la solución, por lo que si se observa un cambio drástico en el color del medio, se recomienda medir el pH para asegurar la viabilidad de las células cuando se añade el medio tratado al cultivo.
   3. Aspira medios de las células. Añade el mismo volumen de medios completos enriquecidos con hierro a las condiciones de tratamiento y medios completos sin tratar a los pozos/placas del vehículo. Incubar a 37 °C durante la duración deseada antes de proceder al ensayo elegido: ensayo de hierro lábilo: tratamiento FAC de 2 h, qPCR y western blot: 12–24 h de tratamiento FAC, ensayo de luminiscencia: tratamiento FAC de 12 h.

2. qPCR

1. Aislamiento de ARNm para qPCR
   PRECAUCIÓN: El reactivo de extracción de ARN y el cloroformo presentan riesgos respiratorios. Solo con un mango en una campana extractora usando el EPI adecuado (bata de laboratorio, guantes desechables resistentes a productos químicos y protección ocular).
   1. En el banco, aspira medios de las células. Lava las células dos veces con PBS estéril y aspira bien cualquier líquido que quede.
   2. En una campana extractora, añadir el reactivo de extracción de ARN a las células en los siguientes volúmenes: placa de 6 pozos: 250 μL/pozo, plato de 10 cm: 1 mL/placa.
   3. Trabajando sobre hielo en la campana extractora, usa un raspador de celdas para raspar suavemente las células lisadas. Procura raspar a fondo todas las partes de la placa para maximizar el rendimiento de ARN.
   4. Pipete el lisato en tubos microfuge estériles, preenfriados y libres de ARN. Déjalas reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   5. Por cada mL del reactivo de extracción, añade 200 μL de cloroformo DENTRO DE UNA CAMPANA EXTRACTORA. Agita las muestras vigorosamente durante al menos 30 segundos para combinar el reactivo de extracción y el cloroformo. Déjalas reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
      NOTA: Tras el transcurso del tiempo, se produce la separación de fases, con la fase acuosa clara (que contiene el ARN) en la parte superior.
   6. Centrifugar muestras durante 15 minutos a 12.000 × g a 4 °C. Mientras tanto, etiqueta los nuevos tubos autoclavados y añade 500 μL (por mL de reactivo de extracción) de isopropanol a los tubos sobre hielo.
   7. Transfiere solo la fase acuosa a cada tubo correspondiente. Mezcla suavemente por inversión y deja reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Si se espera un bajo rendimiento, añade 2 μL de GlycoBlue para visualizar el pellet.
   8. Centrifugar durante 15 minutos a 12.000 × g a 4 °C.
      NOTA: El ARN precipitado puede ser visible en la parte inferior del tubo.
   9. Vierte cuidadosamente el exceso de isopropanol en un vaso de desechos designado. Añade 1 mL de etanol de grado molecular, 100% gota a gota, al tubo, teniendo cuidado de no despegar el pellet. Centrifugar durante 5 minutos a 7.500 × g a 4 °C.
   10. Echa etanol. Inverte los tubos y deja la tapa abierta sobre una toalla de papel. Deja que el pellet se seque hasta que no tenga gotas (~15–30 min).
       NOTA: El pellet puede volverse translúcido si no se añade GlycoBlue.
   11. Resuspende el pellet en 25 μL de agua estéril y libre de ARNasa. Cuantifiquen la concentración de ARN mediante espectrofotometría UV-visible. Normalizar a una concentración uniforme entre las muestras que permita un máximo de 1 μg de ARN en 16 μL por muestra.
2. Síntesis de ADNcC para qPCR
   NOTA: Completar todos los pasos sobre hielo para maximizar el rendimiento de ARN/ADNc.
   1. Muestras de deshielo. Lava la zona de trabajo con un limpiador de RNAse.
   2. Añadir 1 μg de ARN de cada muestra a un tubo de tira PCR correspondiente.
   3. Añade 4 μL de la mezcla de ADNc a cada tubo. Si es necesario, añade agua estéril para alcanzar un volumen total de 20 μL. Procesa las mezclas bajo los siguientes parámetros del termociclador: 25 °C durante 5 minutos, 42 °C durante 30 minutos, 85 °C durante 5 minutos, 4 °C infinitamente.
3. Ejecutando qPCR
   1. Diluir el ADNc 1:10 en agua estéril antes de realizar más reacciones.
      NOTA: el ADNc puede congelarse a -20 °C durante 1 mes o a -80 °C durante 6 meses.
   2. Diluir los cebadores hasta una concentración de 10 μM con agua estéril. Incluye los controles y/o genes de mantenimiento adecuados (por ejemplo, B2M, TBP1).
   3. Haz mezclas maestras para cada gen de mantenimiento y gene de interés de modo que haya suficiente mezcla de reacción para analizar cada condición de ADN en triplicado. La receta de mezcla maestra (por reacción) es la siguiente: 2x mezcla PCR: 10 μL, cebador directo (10 μM): 1 μL, cebador inverso (10 μM): 1 μL, agua estéril: 8 μL.
   4. Coloca una placa de reacción qPCR en un bloque metálico refrigerado de 96 pozos. Añadir 5 μL de ADNc diluido a cada pozo de muestra y 20 μL de mezcla maestra de reacción a cada pozo. Inspecciona cada pozo para asegurarte de que todos reciben el mismo volumen, cubre la placa con un sellador de placa y utiliza una herramienta de borde plano para suavizar las burbujas.
   5. Centrifuga la placa a 1.000 × g y 4 °C durante 1 minuto. Coloca la placa en una máquina qPCR, asegurándote de que esté cargada en la orientación correcta.
   6. En el software qPCR, designa las identidades de muestra y genes de interés para cada pozo. Considera crear una plantilla si planeas ejecutar varias réplicas con la misma configuración.
   7. Ejecuta el programa qPCR (duración: ~1:36 h) mostrado en la Tabla 1.
   8. Exporta los resultados como un archivo . CSV o . Archivo XLSX. Si la máquina qPCR utilizada permite al usuario elegir qué valores exportar, comprueba que los valores CT estén incluidos en el archivo exportado.
   9. Utiliza los valores medios de CT para cada condición y gen de interés—en comparación con los valores CT de los genes de mantenimiento en la condición correspondiente—para calcular el cambio de pliegue de cada gen. Normaliza el cambio de pliegue de la condición del vehículo a 1,0.

3. Western blot

1. Aislamiento de proteínas para western blot
   NOTA: Realiza todos los pasos sobre hielo para maximizar el rendimiento de proteínas.
   1. En un gabinete de bioseguridad, aspira del medio de cultivo. Enjuaga las células con suficiente PBS frío para cubrir la parte inferior de la placa de cultivo. Aspirar y luego repetir.
   2. Añadir buffer RIPA suplementado con cócteles inhibidores de proteasas y inhibidores de fosfatasas para evitar la degradación de proteínas. Utiliza 75 μL de solución RIPA para el cultivo en una placa de 6 pozos, o 200 μL de solución RIPA en una placa de 10 cm.
   3. Trabajando sobre hielo, usa un raspador de celdas para aflojar suavemente las células lisadas de la placa. Ten especial cuidado al eliminar las células de todas las partes de la placa, incluidos los bordes. La solución parecerá clara y algo viscosa.
   4. Pipete la suspensión de la célula RIPA en tubos microfuge refrigerados. Centrifugar muestras durante 10 minutos a máxima velocidad de 4 °C. Transfiere el sobrenadante (el lisato de proteína) a un tubo preenfriado. Descarta la bola.
   5. Cuantifica la concentración de proteínas realizando un ensayo de Bradford o BCA. Normalizar las muestras a 1 μg/μL en agua pura enriquecida con cócteles con proteasas e inhibidores de fosfatasas sobre hielo.
   6. Diluir los lisados en el tampón de Laemmli, asegurando que las concentraciones finales de proteínas sean uniformes entre las muestras. Hierve lisando a 95 °C durante 10 minutos para desnaturalizar la proteína. Para obtener los mejores resultados, úsalo para el western blotting inmediatamente después de la preparación. De lo contrario, almacena proteínas en Laemmli a -20 °C a corto plazo (≤ 1 mes) o -80 °C a largo plazo.
2. Preparación de geles de acrilamida para SDS-PAGE
   PRECAUCIÓN: La acrilamida es una neurotoxina y solo debe manipularse mientras se lleva el equipo de protección adecuado (bata de laboratorio, guantes resistentes a productos químicos y protección ocular).
   1. Determina las proteínas de interés y el tamaño de estas proteínas consultando la página web de la empresa con el/los anticuerpo(s) que se van a utilizar. Utiliza el tamaño previsto de la(s) proteína(s) de interés para decidir qué porcentaje de acrilamida debe tener el(los) gel(es).
      NOTA: La acrilamida entre el 10% y el 15% funciona bien para la mayoría de los pesos moleculares.
   2. Monta el soporte y el marco de gel para la fundición según las indicaciones del fabricante.
   3. Para el gel de resolución, combina acrilamida, agua estéril, 1,5 M de tampón de Tris/HCl pH8.8 y dodecilo sulfato de sodio al 10% en un tubo cónico en los volúmenes adecuados para el número y porcentaje de acrilamida de los geles a preparar, según la Tabla 2, que enumera los componentes necesarios para 2 geles. Mezcla por inversión.
   4. Añade una solución de persulfato de amonio al 10% y TEMED a la mezcla. Invierte para mezclar.
   5. Inmediatamente añadir la solución al marco de colada en gel, rellenando hasta que el volumen de la solución en el marco de colada en gel sea justo inferior a la cantidad necesaria para llegar al fondo del peine, si se insertara el peine.
   6. Añade inmediatamente entre 100 y 200 μL de etanol puro gota a gota sobre el gel endurecedor. Si los lisados proteicos necesitan ser descongelados y/o desnaturalizados, complétalo durante este periodo de incubación. Descongelar proteínas sobre hielo.
      NOTA: Esto dispersará la solución para que el gel no se endurezca de forma desigual.
   7. Una vez endurecido, vierte el etanol. Para el gel apilante, combina acrilamida, agua estéril, 0,5 M Tris/HCl tampón pH6.8 y dodecilo sulfato de sodio al 10% en un tubo cónico en los volúmenes adecuados para el número y porcentaje de acrilamida de los geles a preparar, según la Tabla 2, que enumera los componentes necesarios para dos geles. Mezcla por inversión.
   8. Añade la solución de persulfato de amonio al 10% y TEMED a la mezcla. Mezcla por inversión.
   9. Añade inmediatamente la solución de apilamiento al marco de gel hasta que el volumen llegue a la parte superior. Añade el peine de gel inmediatamente después de verter el gel. Deje reposar ~ 1 hora o hasta que la forma de los pozos no cambie cuando el soporte de gel para colar se mece ligeramente.
3. Geles de carga
   1. Llena la(s) cámara(s) de electroforesis con el buffer de paso hasta la línea de relleno correspondiente para el número de geles a utilizar.
   2. Transfiere el armazón de gel con los peines aún dentro a la cámara de electroforesis. Añade más buffer de corrida en el espacio entre los geles hasta que ese depósito esté lleno. Saca suavemente los peines de los geles sumergidos.
   3. Pipete 5–10 μL de escalera en un pozo de cada gel.
   4. Píete 5–20 μL de proteínas extraídas y muestras de tampón de Laemmli en cada pozo. Añade 5–10 μL de 1x tampón de Laemmli a cualquier pozo vacío.
      NOTA: El volumen que añadas puede requerir optimización basada en la prevalencia de la(s) proteína(s) de interés y/o eficacia de la(s) anticuerpo(s).
4. Ejecutando SDS-PAGE
   1. Conecta la cámara de electroforesis a un paquete de alimentación. Configurado para funcionar a 150 V durante 45 minutos.
      NOTA: Dependiendo de la configuración, puede requerir más tiempo o un voltaje más alto para que la migración completa ocurra, así que ajusta según sea necesario.
   2. Una vez que la proteína ha migrado al extremo del gel (donde se encuentran el lanzador de gel y el marco del gel en la parte inferior del aparato), detiene la transmisión y apaga el paquete de energía.
5. Completando la transferencia de proteínas
   NOTA: Esta sección fue desarrollada utilizando un aparato de transferencia rápida de proteínas.
   1. Vierte el buffer de transferencia en una bandeja de gel. Añade una pila de transferencia, seguida de una membrana de nitrocelulosa y otra pila de transferencia al líquido para formar un sándwich con la membrana en el centro. Asegúrate de que la pila de sándwiches esté completamente inmersa en el buffer de transferencia.
   2. Enciende el aparato de transferencia rápida de proteínas y selecciona el protocolo adecuado según el número de geles y el tamaño de la(s) proteína(s) de interés.
      NOTA: Se ha comprobado que 1,3 A y 25 V durante 10 minutos funcionan bien, aunque puede ser necesario optimizarlo.
   3. Quita la pila de transferencia superior con pinzas y deja que el exceso de líquido entre en la bandeja de gel. Mueve la pila al aparato de transferencia de proteínas y colócala lo más plana y recta posible; Utiliza un rodillo o tubo cónico para suavizar cualquier arruga. Repite con la membrana.
   4. Utiliza una herramienta de extremo romo para separar suavemente la mitad superior e inferior del armazón de fundición. Transfiere el gel a la membrana del aparato de transferencia de proteínas.
   5. Usa pinzas para levantar el resto de la pila de transferencia de la bandeja de gel. Drena el exceso de líquido y luego colócala encima de la membrana y la otra pila. Cierra la caja de gel y ejecuta el programa.
6. Bloqueo y tinción con anticuerpos
   1. Abre la caja del gel y usa pinzas para quitar la pila superior, luego quita el gel. Confirma que hay bandas de la escalera en la membrana. Corta la membrana para incluir solo el rango de tamaño que te interesa.
   2. Transfiere la membrana a una caja de blot limpia. Añade 5 mL de buffer bloqueante, o suficiente para cubrir la membrana. Bloquea bajo agitación a temperatura ambiente durante 1 hora.
   3. Mientras tanto, prepárate para la tinción por anticuerpos añadiendo la concentración recomendada de anticuerpos primarios a 5 mL de albúmina sérica bovina al 2% en un tampón de lavado por membrana. Tinción también para proteína(s) doméstica(s) (es decir, GAPDH, β-actina).
   4. Retira de la agitación y vierte el buffer bloqueante. Añade 5 mL de la solución primaria de anticuerpos. Incubar en la oscuridad bajo agitación a 4 °C durante la noche (~12–16 h).
      NOTA: De cara al futuro, todos los pasos deben completarse en la oscuridad.
   5. Lava la membrana 3 x 5 minutos bajo agitación a temperatura ambiente con un tampón de lavado.
   6. Añade la concentración recomendada de anticuerpo secundario al 5% de BSA en el tampón de lavado. Prepara 5 mL de solución para cada membrana.
   7. Echa el exceso de buffer de lavado. Añade 5 mL de solución secundaria de anticuerpos a cada mancha. Incubar en la oscuridad bajo agitación a temperatura ambiente durante 1 hora.
   8. Lava la membrana 3 x 10 minutos bajo agitación a temperatura ambiente con buffer de lavado. Haz la imagen inmediatamente.
7. Detección y análisis de proteínas de interés
   1. Imagina proteínas usando la plataforma que prefieras.
   2. Utiliza ImageJ u otra plataforma para cuantificar la intensidad de cada banda de interés.

4. Ensayo de tinte de hierro lábil

1. Tinción de tinte de hierro lábil
   1. Completar toda la sección 1, siembra las celdas en una placa de 96 pozos bajo tratamiento de hierro durante 2 horas. Asegúrese de que haya al menos tres pozos para cada condición de tratamiento con hierro, así como controles negativos (vehículo; medio de cultivo + 150 μM del quelante de hierro deferoxamina) y positivos (medio de cultivo + 180 μM FAC + cotratamiento con colorante de hierro lábilo).
   2. Preparar una dilución suficiente a 1:200 de la solución stock de 1 mM de tinte de hierro lábil en medios sin suero para obtener 200 μL por cada pozo muestral.
   3. Aspira del medio de cultivo. Lava dos veces con PBS.
   4. Añade la solución de tinción a cada pozo e incuba durante 1 h a 37 °C.
   5. Lávate una vez con PBS. Sustituye por PBS.
   6. Obtén imágenes de las células usando el canal rojo lejaneo de un microscopio de fluorescencia (646/662 nm). Guarda y exporta las imágenes como . TIF.
2. Análisis de tinción
   1. Abre las imágenes en ImageJ.
   2. Abre la ventana de medición pulsando m. Dentro de la ventana de medición, en Resultados | Establece medidas, selecciona área, densidad integrada y valor medio gris. Selecciona OK.
   3. Usa la herramienta Polygon para dibujar alrededor de cada celda de la imagen. Pulsa m después de cada celda para añadir las mediciones a la ventana de medición.
   4. Una vez cuantificadas todas las celdas de la imagen, copia y pega todos los valores en una hoja de cálculo. Utiliza la herramienta círculo para tomar al menos tres mediciones de fondo en áreas no ocupadas por celdas.
   5. Utilice la siguiente fórmula para calcular la fluorescencia total de células corregida (CTCF) para cada célula:
      CTCF = densidad integrada – (área de la celda seleccionada x valor medio gris de las lecturas de fondo)
   6. Compara los valores CTCF de las celdas tratadas con hierro con los de las celdas del vehículo. El aumento del CTCF indica un aumento de los niveles de hierro lábil.

5. Ensayo de luminiscencia celular

1. Tratamiento de células para ensayo de luminiscencia
   1. Completa la sección 1, asegurándote de que el número de pozos corresponda a n = 3 para cada condición que desee incluir. Añade al menos tres pozos de control libres de celdas (solo medios completos). Se deben añadir 100 μL de celdas y medios en total a cada pozo.
   2. Tras incubar las células no tratadas durante la noche, aplica tratamientos y controles según se desee. Asegúrese de incluir una condición del vehículo (no tratada), condiciones con solo FAC, citotóxico + 10 μM ferrostatina-1 (un agente antiferroptótico), vehículo + 1 μM RSL3 y/o vehículo + 10 μM ferrostatina-1 + 1 μM RSL3. Incubar durante la duración deseada (12–24 horas para maximizar los efectos del tratamiento y prevenir la muerte celular excesiva).
2. Completando el ensayo de luminiscencia
   1. Al tratar las células, descongela los componentes del tampón de luminiscencia a temperatura ambiente. Combina los componentes necesarios y guárdalos en la oscuridad hasta que esté listo para usar. Consulta las instrucciones del kit para los requisitos de almacenamiento por temperatura.
   2. Una vez que las células hayan completado el tratamiento, sigue las instrucciones del kit para tratar las células.
      NOTA: Esto probablemente incluirá un equilibrio a temperatura ambiente, seguido de la adición del buffer de luminiscencia y un periodo final de incubación corto a temperatura ambiente. Una vez añadido el buffer de luminiscencia, todos los pasos deben realizarse en la oscuridad.
   3. Completa y registra la luminiscencia usando un lector de placas o instrumento similar.
      NOTA: Para este protocolo, se utilizó un tiempo de integración de 0,3 s.
   4. Normalizar los valores de luminiscencia de los pozos experimentales a la luminiscencia media de los pozos de control sin celdas.
      NOTA: Valores de luminiscencia más altos indican un mayor número de células vivas.

Resultados

Basándonos en trabajos previos nuestros y de otros, planteamos la hipótesis de que aumentar el hierro extracelular generaría sobrecarga intracelular de hierro en las células musculares murinas y nos permitiría monitorizar las respuestas asociadas a la ferroptosis aguas abajo. Por ello, desarrollamos el flujo de trabajo C2C12 descrito en la Figura 1, en el que las células estuvieron expuestas a concentraciones definidas de citrato de amonio férrico durante 2–24 horas, dependiendo del ensayo posterior.

El primer paso para validar nuestro modelo fue confirmar que el FAC podía entrar en las células. Utilizando los cebadores validados descritos en la Tabla 3, realizamos qPCR tanto para las cadenas pesadas como ligeras de ferritina y determinamos que el aumento en la entrada de hierro correlacionaba con niveles elevados de ARNm de ferritina (Figura 2A,B). A nivel de proteína, se observó un aumento similar en los niveles de ferritina con el aumento de la concentración de FAC, aunque esto no parecía dependiente de la dosis (Figura 2C). De manera similar, la tinción de células vivas tratadas con C2C12 con FAC mostró que aquellas tratadas con una dosis citotóxica de hierro —así como las tratadas con la dosis severa y la tinción lábil de hierro simultáneamente como control positivo— muestran visual y cuantitativamente un aumento en almacenamiento de hierro en comparación con las células no tratadas y aquellas expuestas solo al quelante de hierro deferoxamina (DFO; Figura 2D). En general, estos resultados sugieren que el hierro introducido mediante FAC en el medio celular está, de hecho, entrando en las células.

Una vez establecido que la FAC aumentaba la carga intracelular de hierro, buscamos determinar si la sobrecarga de hierro iba acompañada de cambios moleculares y funcionales asociados a la ferroptosis. El FAC aumentó la expresión de Slc40a1 (ferroportina) (Figura 3A) y elevó Hmox1 (Figura 3B). La FAC también disminuyó la proteína GPX4, y esta reducción fue parcialmente revertida por la deferoxamine (Figura 3C). El tratamiento con RSL3 produjo una reducción similar en GPX4, situando la respuesta FAC dentro de un contexto molecular más amplio asociado a la ferroptosis. Funcionalmente, una dosis citotóxica de FAC redujo la viabilidad basada en luminiscencia a las 12 horas, y esta pérdida temprana de viabilidad fue salvada por la ferrostatina-1 (Figura 3D). En cambio, a las 24 horas, la separación entre condiciones se vuelve menos pronunciada y más variable (Figura 3E). Aunque las muestras tratadas con ferrostatina-1 permanecen elevadas en relación con la FAC citotóxica por sí sola, el rango dinámico global del ensayo se reduce en este punto posterior. En conjunto, estos datos muestran que el tratamiento con FAC produce sobrecarga de hierro, cambios moleculares asociados a la ferroptosis y una reducción de la viabilidad sensible a la ferrostatina dependiente del tiempo en células C2C12.

Figura 1: Resumen gráfico del modelo de sobrecarga de hierro. En este modelo, las células C2C12 se siembran y se dejan incubar durante la noche antes del tratamiento con diversas dosis fisiológicamente significativas de medio de cultivo infundido con hierro y análisis molecular directo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Aumento del almacenamiento de hierro lábil y síntesis de ferritina tras la adición de citrato de amonio férrico. Los niveles de ARNm de (A) cadena pesada de ferritina y cadena ligera (B) de ferritina aumentan con la adición de citrato de amonio férrico al sistema. (C) Los niveles de proteína FTH1 aumentan con la adición de hierro férrico al sistema. (D) Los niveles de hierro lábil aumentan en las células C2C12 tratadas con hierro férrico antes y simultáneamente con la tinción con un colorante de hierro lábil de rojo extremo, en comparación con el control vehículo + deferoxamina. La condición de cotratamiento indica tratamiento simultáneo con medio de cultivo + 180 μM de FAC + tinte de hierro lábilo. Las barras de error son +/- SD. Abreviaturas: FTH1 = cadena pesada de ferritina; FTL1 = cadena ligera de ferritina; DFO = deferoxamina. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Cambios moleculares asociados a la ferroptosis y una reducción dependiente del tiempo en la viabilidad celular tras la adición de FAC. Los niveles de ARNm (A) ferroportina (Slc40a1) y (B) Hmox1 aumentan tras el tratamiento con FAC. (C) La proteína GPX4 disminuye tras el tratamiento con FAC y en presencia del control positivo RSL3; la deferoxamina revierte parcialmente la disminución asociada a la FAC en GPX4. (D) Luminiscencia de células C2C12 tras un tratamiento de 12 horas con FAC, RSL3 y/o ferrostatina-1, normalizada a pozos libres de células (solo medios). (E) Luminiscencia normalizada de células C2C12 tratadas tras un tratamiento de 24 horas con FAC, RSL3 y/o ferrostatina-1. Las barras de error son +/- SD. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Mantener el escenario
1	Sube a 50 °C a 1,6 °C/s, mantén la temperatura durante 2 minutos
2	Sube a 95 °C a 1,6 °C/s, mantén durante 10 minutos
Etapa de PCR (Run x 40)
1	Manténganse a 95 °C durante 15 s
2	Reduce a 60 °C a 1,6 °C/s, manténlo durante 1 min
Etapa de curva de fusión
1	Sube a 95 °C a 1,6 °C/s, mantén durante 15 s
2	Reduce a 60 °C a 1,6 °C/s, manténlo durante 1 min
3	Aumenta a 95 °C a 0,15 °C/s, mantén la temperatura durante 1 s

Tabla 1: programa qPCR (duración: ~1:36 h) en la sección 2 del protocolo.

	Gel de resolución			Gel apilante
Componente	10%	12.50%	15%
Acrilamida (mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
Agua estéril (mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
Tris/HCl, 1,5 M pH 8,8 (mL)	4.2			-
Tris/HCl, 0,5 M pH 6,8 (mL)	-			1.25
10% de dodecilo sulfato de sodio (μL)	166			50
0,1 g/mL Persulfato de amonio (μL)	80			25
TEMED	8.3			5

Tabla 2: Resumen de componentes y volúmenes necesarios para la configuración exitosa de los geles de resolución y apilamiento para western blot. Los volúmenes proporcionados son suficientes para dos geles y pueden escalarse en consecuencia. Los porcentajes indican la cantidad de acrilamida en la mezcla.  NOTA: APS y TEMED deben añadirse al final y solo cuando estén listos para colar, ya que activarán el proceso de polimerización en gel.

Objetivo Genético	Símbolo genético	Función	Especies	Secuencia de Avance	Secuencia inversa
Beta-2-microglobulina	B2M	Gen de limpieza	Mouse	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
Proteína de unión a cajas TATA	TBP	Gen de limpieza	Mouse	CAGATGTGC GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
Cadena pesada de ferritina	FTH1	Subunidad de la proteína de almacenamiento de hierro ferritina	Mouse	TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTCTTTA
Cadena ligera de ferritina	Ftl1	Subunidad de la proteína de almacenamiento de hierro ferritina	Mouse	AATGGGGTAAA ACCCAGGAGG	AGGAAGTCACA GAGATGAGGGT
Heme oxigenasa 1	Hmox1	Convierte la biliverdina en bilirrubina en presencia de hemo, CO2 y hierro; En la ferroptosis hay niveles altos	Mouse	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
Ferroportin 1	SLC40a1	Transporta el exceso de hierro fuera de las células	Mouse	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG CACACCATTGA

Tabla 3: Lista de cebadores qPCR validados para el transporte de hierro y genes de ferroptosis de interés. Los cebadores son específicos para ratones debido a su uso en ARNm originado en células C2C12.

Discusión

El objetivo de este estudio fue establecer un modelo práctico in vitro de la sobrecarga de hierro en progenitores musculares murinos y definir condiciones bajo las cuales se puedan detectar de forma fiable las respuestas asociadas a la ferroptosis. Utilizando este flujo de trabajo, demostramos que el tratamiento con citrato de amonio férrico conduce a una acumulación robusta de hierro intracelular, acompañada de un aumento de la expresión de ferritina y una señal elevada de hierro lábil. La carga de hierro se asocia además con cambios moleculares compatibles con el estrés relacionado con la ferroptosis, incluyendo un aumento de la expresión de Slc40a1 y Hmox1 y una disminución de la proteína GPX4. Funcionalmente, la exposición a FAC citotóxica induce una reducción en la viabilidad celular que es rescatada por la ferrostatina-1 en los primeros momentos, apoyando la presencia de un componente sensible a la ferroptosis que contribuye a la muerte celular observada.

La dosis de hierro y la duración del tratamiento son parámetros críticos que influyen directamente en la interpretabilidad de este sistema. En nuestras manos, los primeros momentos temporales (aproximadamente 12 horas) proporcionan la separación más clara entre condiciones, permitiendo que la ferrostatina-1 rescate la citotoxicidad inducida por la FAC de forma reproducible. En momentos posteriores (por ejemplo, 24 horas), la viabilidad general disminuye y la variabilidad aumenta según las condiciones, reduciendo el rango dinámico del ensayo. Esto es coherente con la pérdida y adaptación acumulativa de células de la población superviviente, como un aumento de la capacidad antioxidante o una alteración en el manejo del hierro.

La administración de hierro férrico (Fe³⁺) en lugar de hierro férrico (Fe²⁺), así como la concentración de hierro administrado y la duración del tratamiento, también son aspectos críticos del protocolo. El uso de hierro férrico es esencial porque el hierro férrico es fácilmente absorbido por la transferrina, el principal transportador responsable de la importación de hierro^{férrico 11}. Aunque el hierro ferroso puede ser absorbido por otros transportadores (especialmente el transportador metálico divalente DMT1), en este contexto, el hierro férrico pareció incorporarse de forma más eficaz que el hierro^{ferroso 12}. Las concentraciones de FAC elegidas para este protocolo se seleccionaron debido a su relevancia fisiológica y uso en modelos similares anteriores^13,14. La duración del tratamiento con hierro, que era de 24 horas, también se basaba en modelos similares de nosotros y otros. Sin embargo, en algunos contextos (concretamente en los ensayos de tinción lábil de hierro y luminiscencia celular), 24 horas resultaron una duración de tratamiento demasiado larga. En estos casos, un tratamiento de 24 horas resultó en una muerte celular tan significativa que no se pudieron sacar conclusiones debido a la destrucción del material celular. Por ejemplo, RSL3 es un agente de peroxidación lipídica tan potente que una duración de tratamiento de 12 horas fue suficiente para inducir la peroxidación lipídica y, al mismo tiempo, asegurar que los efectos de la sobrecarga de hierro fueran visibles simultáneamente (Figura 3C-E). Además, para el tinte de hierro lábilo, las células solo se trataron con FAC durante 2 horas antes de la tinción (tras intentar teñir tras tratamientos de hierro de 2, 4 y 24 horas) para capturar la respuesta inicial a la sobrecarga de hierro antes de que pudiera producirse una destrucción celular excesiva (Figura 2D). En general, parece que los cambios a nivel génico y proteico se midieron mejor tras 12–24 horas de tratamiento con hierro, probablemente porque estos cambios tardan más en actuar las células, mientras que la tinción era mejor realizada tras una duración de tratamiento más corta.

Otros han desarrollado modelos similares. Un grupo generó un modelo C2C12 tratado con hierro férrico para estudiar el papel del eje p53-Slc7a11 en la ferroptosis. Encontraron que el tratamiento con hierro férrico durante 48 horas aumentó la peroxidación lipídica y disminuyó los niveles de Slc7a11 , indicando^{ferroptosis 13}. Otro modelo similar—esta vez utilizando células C2C12 tratadas con sulfato ferroso para estudiar la relación entre la vía de la ligasa de ubiquitina Akt-FoxO3-E3 y la ferroptosis—implicó tratamiento con hierro durante 4 h¹⁴. Un hilo común entre estos es que implican el tratamiento con hierro de células C2C12 que se han diferenciado en miotubos, en lugar de permanecer en su estado más parecido a células madre. Esto hace que nuestro sistema sea especialmente relevante para la acumulación de hierro previamente observada en los MuSCs.

A pesar de ser una forma sencilla de estudiar los efectos de la sobrecarga de hierro en el músculo in vitro, el método presenta limitaciones ya que solo se ha utilizado en el contexto de células C2C12. Trabajos anteriores han demostrado que las células madre musculares son susceptibles a la sobrecarga de hierro durante el envejecimiento, lo que sugiere que un método similar podría ser válido en ese^{contexto 9}.

En conjunto, este modelo demuestra que la sobrecarga de hierro es suficiente para inducir un conjunto reproducible de cambios moleculares asociados a la ferroptosis y una reducción de la viabilidad sensible a la ferrostatina en células C2C12. Aunque ensayos ortogonales adicionales pueden refinar aún más la clasificación de la muerte celular en contextos específicos, las respuestas moleculares y farmacológicas combinadas observadas aquí son consistentes con el estrés celular asociado a la ferroptosis. Prevemos que este enfoque facilitará estudios mecanicistas sobre la desregulación del hierro en el envejecimiento muscular y las enfermedades.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	Almacenar a -20 °C. Descongelar sobre hielo.
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamide/Bisphosphate solution, 29:1, 500 mL size	Bio-Rad	1610156	Es una neurotoxina. Manipular solo cuando se usa PPE apropiado (bata de laboratorio, guantes, protección ocular).
5425 / 5425 R Microcentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri centrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammonium persulfate, 10 g	Bio-Rad	1610700	Agente polimerizante para el vertido de geles de acrilamida como una solución al 10% peso/volumen en agua estéril. El polvo es estable a temperatura ambiente, pero la solución debe almacenarse a largo plazo a -20 °C y a corto plazo a 4 °C.
Anti-GAPDH, mouse antibody, 100 µg size	Thermo Fisher Scientific	AM4300	Usar a una concentración de 1:2000 en 2% BSA + buffer de lavado. Corre a 37 kDa.
BCA Protein Assay Kit with Dilution-Free BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	Siga las instrucciones del fabricante para su uso. Tenga en cuenta que los patrones deben mantenerse a 4 °C después del primer uso.
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	Usar a una concentración de 1:1000 en 2% BSA + buffer de lavado. Corre a 42 kDa.
BioLite 6 Well Multidish Cell Culture-Treated Surface	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Black, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	Usar en la preparación del buffer Laemmli.
BSA, solid, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	Almacenar a 4 °C.
C2C12 cells	ATCC	CRL-1772	Almacenar en la fase de vapor del nitrógeno líquido.
cDNA Supermix QScript 500 reactions	Avantor/VWR	101414-108	Almacenar a -20 °C. Descongelar sobre hielo.
Cell lifter, 100pk	Fisher Scientific	8100240	Dado que son más grandes, usar para la extracción de células de platos de 10 cm y más.
Cell scrapers, 10 inch handle, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	Dado que tienen una cabeza pequeña, son los más adecuados para eliminar células de placas multipocillo.
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	Usar solo en una campana de extracción, y desechar los residuos en un contenedor separado.
COMPLETE EDTA-free protease inhibitor tabs	Sigma-Aldrich	4693132001	Disolver 1 tableta en 500 µL de agua estéril para crear una solución 100×.
CO2 100-120 V Incubator	Binder	9640-0002	Modelo versión CBS 170-120 V. Usar para cultivo celular.
Deferoxamine mesylate, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	El DFO es un quelante de hierro, por lo que agregarlo a las células disminuye el contenido de hierro. Disolver en agua para una concentración de stock de 1 M.
Dimethyl sulfoxide, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Usar en tinción de hierro lábil y reconstitución.
DMEM, high glucose, pyruvate, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 conjugated Goat anti-Rabbit IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Añadir a 5% BSA en el buffer de lavado en una proporción de 1:5000.
DyLight 800 4× PEG conjugate Goat anti-Mouse IgG (H&L) Secondary Antibody	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Añadir a 5% BSA en el buffer de lavado en una proporción de 1:5000.
Easypet 3 1-channel pipet aid	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	Preparar la solución madre añadiendo 50 µL de DMSO a un alicuota a temperatura ambiente. Sensible a la luz. Concentración de stock: 1 mM
Ferric Ammonium Citrate, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Secuestra los subproductos de la peroxidación lipídica, inhibiendo la ferroptosis in vitro. Disolver en DMSO para una concentración de stock de 10 mM.
Fetal Bovine Serum, Premium Plus, bottle, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	Usar para complementar el DMEM para el cultivo celular C2C12. Agregado al 10% en volumen.
Flex-Tube 1.5 mL PCR clean, colorless, 500 pcs.	Eppendorf	22364120
FTH1 (D1D4) Rabbit mAb 100 µL	Cell Signaling Technology	4393	Usar a una concentración de 1:1000 en 2% BSA + buffer de lavado. Corre a ~20 kDa.
Glycerol, ultrapure	Thermo Fisher Scientific	15514011	Usar en la preparación del buffer Laemmli 6x.
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL), 300 μL	Thermo Fisher Scientific	AM9515	Usar para visualizar el sedimento durante la purificación de ARN.
Image-iT Lipid Peroxidation Kit	Thermo Fisher Scientific	C10445	Listo para usar. Sensible a la luz. Concentración de stock: 10 mM
ImageJ software	National Institutes of Health	N/A	Usar para cuantificar la intensidad de las bandas del western blot y la fluorescencia celular total corregida a partir de