Interpretación de variantes clínicas con el Integrative Genomics Viewer (IGV) para patólogos moleculares

Resumen

El software Integrative Genomics Viewer (IGV) ofrece una ventana rica e intuitiva a los datos subyacentes para la identificación clínica de variantes. Aquí presentamos cinco viñetas que demuestran cómo realizar una rápida diferenciación entre eventos patógenos genuinos y artefactos, reforzando así la confianza diagnóstica para los profesionales que realizan la validación molecular de ensayos de secuenciación de nueva generación.

Resumen

El visualizador genómico integrado (IGV) es una herramienta fundamental en la genómica clínica, que permite la visualización e interpretación de datos complejos de secuenciación. Combinar el conocimiento clínico con la evaluación visual de los resultados de secuenciación es el medio principal mediante el cual los patólogos moleculares y otros profesionales evalúan y concluyen los casos. Una variedad de herramientas de software pueden ayudar, pero debe comprenderse y aplicarse sistemáticamente su relación con los datos subyacentes. Este estudio incluye información básica esencial sobre los tipos de archivos de datos de secuenciación de nueva generación (NGS) (por ejemplo, FASTQ, BAM, VCF), con una discusión sobre su formato y propósito. Luego describimos las características de IGV que derivan matices de estos archivos. Utilizamos una serie de casos prácticos curados basados en viñetas clínicas mediante las cuales el lector interactuará con datos de secuenciación clínica NGS utilizando el software IGV para revisar varios tipos de variantes clínicamente relevantes en relación con el genoma de referencia humano. Estas viñetas clínicas han sido seleccionadas para describir ejemplos de algunas de las complejidades en la interpretación de datos genómicos, y cómo el uso de IGV como parte de un flujo de trabajo rutinario puede proporcionar información interpretativa adicional sobre las variantes, más allá de las llamadas de variantes generadas por algoritmos de software bioinformático rutinarios. La inspección visual de variantes genómicas utilizando las herramientas dentro de IGV puede revelar señales contextuales sutiles (es decir, frecuencia alélica de la variante, sesgo de cadena, contexto específico del tejido) que pueden influir en la interpretación de las variantes genómicas. Aunque este estudio se centra en el uso de IGV para la detección e interpretación de variantes somáticas, las aplicaciones proporcionadas pueden extrapolarse para su uso en el contexto de la línea germinal, incluyendo el análisis de variantes complejas y la detección de mosaicismo.

Introducción

La atención en oncología se ha transformado en los últimos años gracias al uso de tecnologías de secuenciación de nueva generación (NGS, por sus siglas en inglés) para orientar el diagnóstico, el pronóstico y la selección de terapias¹. Las pruebas con NGS se han convertido en el estándar de atención en múltiples tipos de tumores para 1) establecer un diagnóstico de un tumor definido molecularmente, 2) utilizar resultados de biomarcadores independientes del tipo de tumor para tomar decisiones terapéuticas, y 3) determinar la estratificación de riesgo para tipos específicos de tumores^2,3. Resultados precisos y oportunos de pruebas con NGS y otros biomarcadores se han vuelto un componente crítico para la atención y planificación del paciente en oncología.

Las pruebas de NGS generalmente se realizan en laboratorios de referencia grandes o en laboratorios hospitalarios o académicos, cuando las instituciones cuentan con experiencia y recursos suficientes para desarrollar y mantener dichas pruebas. La organización Genomics Organization for Academic Laboratories (GOAL) fue concebida como una red colaborativa centrada en el intercambio de conocimientos académicos y en la reducción de costos de reactivos⁴. Un esfuerzo importante del consorcio GOAL ha consistido en sesiones de capacitación sobre componentes críticos para la revisión y notificación de estudios clínicos. Estas sesiones se han desarrollado como talleres prácticos e incluyen un taller interactivo sobre el visor integrativo de genómica (IGV) para demostrar sus funciones básicas y avanzadas en medicina genómica.

IGV es una herramienta de visualización de datos diseñada para permitir a los usuarios revisar fácilmente datos de NGS y otros conjuntos de datos grandes, dado que la mayoría de los datos de NGS son extensos y difíciles de manejar sin una interfaz gráfica de usuario⁵. Inicialmente, IGV no fue diseñado para el análisis clínico de variantes. Sin embargo, debido a su facilidad de uso para todos los profesionales moleculares, independientemente de su nivel de experiencia en bioinformática, ha sido ampliamente adoptado por muchos laboratorios como parte del complejo flujo de trabajo de revisión de datos⁶. Este estudio se elaboró como un mecanismo para difundir esta información a la comunidad más amplia de profesionales de laboratorios genómicos.

La necesidad clínica de utilizar IGV como parte de un flujo de trabajo clínico incluye la detección de errores de secuenciación, el manejo de complejidades en la identificación de variantes genómicas y otras alteraciones recurrentes en las que una visualización adicional puede ayudar a una interpretación adecuada de los datos⁷. El uso de IGV requiere archivos bioinformáticos estándar procedentes de un estudio de NGS⁸. Las funciones principales del software IGV permiten la visualización de datos de secuenciación y requieren configurar un conjunto de preferencias y opciones para la interpretación clínica de variantes (Archivo Suplementario 1).

El flujo de trabajo de secuenciación de lecturas cortas se caracteriza por los formatos estándar de archivos FASTQ, mapa binario de alineamiento (BAM) y formato de llamado de variantes (VCF). La secuenciación de nueva generación (NGS) logra su alto rendimiento generando millones de lecturas cortas en paralelo. Aunque esta estrategia acelera enormemente la producción de datos, cada lectura es solo un fragmento del ADN o ARN original. Se fija a una posición determinada en la celda de flujo de NGS mediante su secuencia adaptadora. La información de secuencia y calidad de bases obtenida del procesamiento óptico se registra en archivos FASTQ. Estas lecturas crudas consisten en secuencias de nucleótidos junto con sus puntuaciones de calidad por base. Por lo tanto, un primer paso en el procesamiento de las lecturas crudas es alinear cada lectura a un genoma de referencia⁸. A medida que cada lectura se asigna a una ubicación específica en el genoma de referencia con la máxima probabilidad de alineamiento, las lecturas que corresponden a la misma posición "se acumulan" en cada locus, y dichos datos se almacenan en un archivo BAM siguiendo las especificaciones del formato de mapeo de alineación de secuencias (SAM) (disponibles en https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf; última verificación: 30/9/2025) (Figura 1A). Esta información puede inspeccionarse visualmente mediante un navegador genómico como IGV. Como se ilustra en la Figura 1B, la comparación entre las lecturas o entre estas y la secuencia de referencia puede revelar diferencias o discrepancias entre las secuencias de nucleótidos. Los resúmenes únicamente de estas posiciones "variantes" en todo el genoma se compilan en un archivo VCF, que por lo tanto puede ser mucho más pequeño que un archivo BAM, pero aún así contener gran parte de la información útil necesaria para revisar variantes. Por esta razón, el archivo VCF suele ser la salida final de las canalizaciones de llamado de variantes (Figura 1C). Así, mientras que los archivos FASTQ contienen los datos brutos de lecturas y calidad, el archivo BAM proporciona información sobre la confianza con que dichas lecturas se alinean al genoma, y el VCF representa las diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia de la muestra, ofreciendo una cantidad mucho más manejable de datos para su revisión y posible informe.

Los seis viñetas clínicas de este estudio ilustran escenarios analíticos comunes asociados con la detección de variantes somáticas en laboratorios moleculares, así como los problemas que complican la correcta comprensión e interpretación de los datos subyacentes. En general, estas viñetas se seleccionaron para ilustrar escenarios interpretativos de creciente complejidad y cómo el uso de funciones avanzadas en IGV puede describir mejor características genómicas integrales. Aunque este estudio se centra en la interpretación de variantes somáticas, estas funciones son aplicables al uso de IGV en la visualización e interpretación de alteraciones germinales⁶. Cabe señalar que los términos utilizados en este artículo se basan en la química de secuenciación por síntesis y, cuando corresponde, en otros términos o conceptos análogos para otras plataformas.

Cada viñeta clínica comienza con un contexto clínico muy breve, seguido de instrucciones sobre cómo investigar la variante o variantes y resolver la pregunta: cuál (si alguna) de las variantes presentes es real y cuál (si alguna) es un artefacto. El contexto clínico, junto con los detalles particulares de los datos de secuenciación, es importante para responder esa pregunta.

Protocolo

Los datos presentados aquí son una mezcla de datos simulados y reales de pacientes obtenidos mediante NGS. Sin embargo, todos los datos de pacientes se desidentifican mediante una combinación de eliminación de etiquetas y extracción de lecturas de un solo locus. Este protocolo sigue las directrices aplicables del comité de ética en investigación humana de todas las instituciones de los autores.

1. Descargar la instancia más reciente del Visualizador Integrado de Genómica (IGV)

NOTA: IGV es un programa gratuito que se puede descargar para visualizar diversos genomas, incluido el genoma humano (https://igv.org/doc/desktop/#DownloadPage/). IGV se actualiza periódicamente para incluir nuevas versiones de transcritos, características y pistas, siendo la versión más reciente la que generalmente aparece en la parte superior de la lista.

1. Descargue el archivo disponible desde el localizador uniforme de recursos (URL) anterior, denominado 'IGV para Windows, Java incluido', al escritorio, lo cual podría requerir credenciales administrativas, dependiendo de la institución.
2. Seleccione la versión del genoma humano que se planea analizar a partir de los informes (por ejemplo, hg19 o hg38), las cuales están alojadas dentro de IGV.
   NOTA: Este estudio utilizó IGV 2.19.7. En este protocolo, se descargó la versión para Windows con Java incluido. IGV se ejecutó con la asignación de memoria predeterminada de 8 Gb de RAM. La configuración recomendada en la pestaña de preferencias de IGV y otras secciones de IGV se anota en Archivo Suplementario 1.

2. Comprensión de los casos clínicos y descarga de los archivos necesarios

1. Navegue hasta el repositorio de GitHub: Todos los archivos están disponibles para su descarga en el repositorio de GitHub https://github.com/Eitan177/Demo_IGV.
   NOTA: Hay un archivo de sesión en el repositorio de GitHub para cada viñeta, y cargar este archivo de sesión elimina la necesidad de cargar los archivos por separado y navegar hasta el locus en cuestión, ya que el archivo de sesión realiza estos pasos.
2. Cargue un archivo de sesión a través del menú de archivo. Haga clic en Archivo > Abrir sesión y seleccione el archivo de sesiones adecuado.

3. Configuración de la pista de cobertura

NOTA: En IGV, la ventana principal incluye una "coverage track". En ciertos contextos, incluso una pequeña fracción de lecturas que contengan variantes específicas de cáncer puede ser clínicamente significativa. Debido a esto, es fundamental lograr una profundidad de lectura muy alta en las regiones del genoma que se analizan. Si solo el 2 % de las lecturas contiene una variante determinada, puede requerirse una profundidad de lectura de cientos o miles para identificar convincentemente la variante; de ahí el término "deep sequencing".

1. Asegúrese de que esté presente la pista de cobertura: En el menú superior, haga clic en Ver > Preferencias y seleccione la pestaña Alineamientos. En la parte superior de la pestaña, hay un cuadro etiquetado como 'Mostrar pista de cobertura'. Asegúrese de que esté marcado.
2. Asegúrese de establecer un umbral clínicamente significativo para variantes de bajo nivel: Diríjase a la pestaña Alineamientos como se detalló en el paso 3.1 y desplácese hacia abajo hasta que sea visible el cuadro etiquetado como Cobertura de fracción alélica. Establezca el valor numérico en el cuadro en 0.01 y haga clic en Guardar (la ventana de preferencias debería cerrarse al hacer clic en Guardar).

4. Configuración de lecturas con recorte blando

NOTA: Esta configuración es invaluable para detectar variantes estructurales más grandes, como reordenamientos genéticos, cambios en el número de copias o eventos combinados de inserción–deleción. Los viñetas avanzadas—como las que se centran en amplificaciones y deleciones de EGFR—demuestran cómo las lecturas con extremos suaves (soft-clipped) pueden corroborar la presencia de variantes estructurales que de otro modo podrían pasarse por alto mediante métodos estándar de llamado de variantes.

1. Habilitar clips suaves: Desde el menú superior, haga clic en Ver > Preferencias, y seleccione el Alineamientos Pestaña. Desplácese hacia abajo hasta el cuadro Mostrar bases con recorte suave y asegúrese de que esté marcada (Archivo Suplementario 1) para revelar lecturas parcialmente alineadas, es decir, aquellas cuyos extremos no se asignan limpiamente a la referencia y están "recortado" apagado.

5. Vignetas clínicas

1. Vigneta n.º 1: Distinguir un verdadero KRAS variante patógena del oncogén homólogo del virus del sarcoma de ratón de Kirsten de un artefacto de secuenciación
   NOTA: El caso A implica a un hombre de 65 años con un adenocarcinoma pulmonar recién diagnosticado, en el que la evaluación histológica estimó aproximadamente un 80 % de tumor. El perfilado mediante NGS identificó una KRAS NM_004985.5 c.34G>T variante (p.G12C), que es una mutación impulsora conocida en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP). La variante de sentido erróneo resultante KRAS c.34G>T (p.G12C) ocurre en aproximadamente el 13 % de los adenocarcinomas pulmonares y confiere elegibilidad para terapias dirigidas⁹. El caso B implica a una mujer de 54 años con un sarcoma conocido (aproximadamente 50 % de tejido tumoral y 50 % de tejido normal). El idéntico KRAS c.34G>la variante T (p.G12C) fue identificada en esta muestra. Sin embargo, debido a que KRAS c.34G>T (p.G12C) rara vez se informa en sarcoma; su presencia suscita sospecha de un posible artefacto de secuenciación. 
   1. Flujo de trabajo de IGV (archivo de sesión KRAS.xml)             
      1. Cargar datos: Seleccione Hg19 en el menú desplegable del genoma y cargue el archivo bam, kras2A_fixed_backbone_2A_new_final_sorted.bam, y navegue a chr12:25,398,281–25,403,833 para enfocarse en el KRAS región génica. Tenga en cuenta que el archivo de índices (mismo nombre que el archivo bam, pero con extensión .bai) debe estar en el mismo directorio que el archivo bam.  
      2. Investigar la cobertura y la frecuencia alélica de variante (VAF): Revisar el codón 12 en el exón 2 (NM_004985.5) y haga clic en la posición de la variante en la pista de cobertura para mostrar la profundidad de lectura en esa posición. Observe una sustitución G→T (evento de transversión), con una frecuencia alélica de variante (VAF) del 35% al 40%, altamente consistente con una mutación conductora clonal heterocigota (Figura 2A), particularmente en el contexto de una celularidad tumoral aproximada del 80 %.   
      3. Buscar sesgo de cadena: codificar por color según la cadena (ver Archivo Suplementario 1, paso 4) para revelar una distribución casi 50:50 hacia adelante (rojo): hacia atrás (azul) en la muestra pulmonar.  
      4. Repita los pasos 5.1.1.1–5.1.1.3 para el caso B, la muestra de sarcoma: cargue el archivo bam, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, y observe el <1% de FVA y apoyo casi exclusivo en la hebra directa, lo que indica un artefacto de PCR/alineamiento (Figura 2B).
2. Vigneta n.º 2: Resolver una clasificación errónea de una variante multinucleotídica (MNV).
   NOTA: Una mujer de 50 años con melanoma metastásico se somete a un perfilado tumoral basado en NGS. El análisis identifica un potencial BRAF (B-Raf protooncogén, quinasa serina/treonina) mutación c.1798_1799delinsAA. Mientras BRAF NM_004333.6: c.1799T>A (p.V600E) es más común en diversos tumores sólidos, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K) es relativamente específico para melanoma, ya que la luz ultravioleta puede inducir C > Transiciones T en dipyrimidinas¹⁰. Según las reglas de HGVS, dos variantes de un solo nucleótido (SNV) en cis debe denominarse como un único MNV. En muchos casos, una canalización bioinformática puede identificar incorrectamente esta variante compleja como dos SNV adyacentes en cis: BRAF c.1798G>A y BRAF c.1799T>A. Debido a que existen factores técnicos (es decir, relacionados con el llamador de variantes) y biológicos (cis frente a trans consideraciones), existe preocupación de que la mutación podría informarse incorrectamente al momento de la emisión del informe, a menos que se visualicen los datos durante la revisión clínica.      
   1. Flujo de trabajo de IGV (archivo de sesión BRAF.xml)           
      1. Cargar datos: Seleccione Hg38 en el menú desplegable del genoma y cargue el archivo bam, kras2B_fixed_backbone_2B_new_final_sorted.bam, y desplácese a chr7:140,453,136–140,753,336. Tenga en cuenta que el archivo índice (con el mismo nombre que el archivo bam, pero con extensión .bai) debe estar en el mismo directorio que el archivo bam.
      2. Acercarse al codón 600 de BRAF: Observar un cambio dinucleotídico GT→AA basado en las posiciones adyacentes de la pista de cobertura que son verdes y azules en lugar de grises, consistente con p.V600K. 
      3. Escanear dos SNV individuales para determinar si se encuentran en cis o trans: Tenga en cuenta que ambos SNV se asignan a las mismas lecturas y se encuentran en cis.  
      4. Investigar la hebra y la cobertura: codificar los lecturas con colores para mostrar un soporte aproximadamente equilibrado de hebra directa/inversa (ver Archivo Suplementario 1, paso 4) y un VAF superior al 50 %, compatible con un conductor clonal. Un umbral de cobertura del pista de 0,01 (véase Archivo Suplementario 1, Paso 3 para la configuración) asegura que los subclones parciales (si están presentes) permanecerán visibles (Figura 2C).  
      5. Tenga en cuenta el contexto y la nomenclatura de MNV: los dos cambios nucleotídicos son adyacentes entre sí. Según el consenso de expertos, se deben considerar como un solo evento las variantes de nucleótido simple (SNV) que se encuentran a una distancia de 50 pb y que se ubican en la misma lectura de secuencia "complejo" o "delins" variante¹¹. 
3. Vigneta n.º 3: Investigar un KIT (KIT protooncogén, tirosina quinasa receptora) inserción en el exón 9 en un tumor estromal gastrointestinal (GIST)
   NOTA: Un paciente masculino de 58 años con un tumor estromal gastrointestinal se somete a resección, y se solicita la prueba de secuenciación de nueva generación (NGS). Los resultados muestran una variante posible en KIT. KIT las mutaciones son un factor impulsor frecuente en los GIST, presentes en aproximadamente el 75 % de los casos, y son dianas terapéuticas. Después de las mutaciones activadoras en el exón 11, KIT las mutaciones activadoras en el exón 9 son los impulsores más comunes identificados, aunque los GIST con mutaciones en el exón 9 y los GIST con mutaciones en el exón 11 presentan un comportamiento diferente respecto a la sensibilidad a los inhibidores de tirosina quinasa¹². 
   1. Flujo de trabajo de IGV (archivo de sesión KIT.xml)
      1. Cargar datos: Seleccione el genoma Hg19 y cargue el archivo BAM, KITdupmod2.bam, asegurándose de que el archivo de índice (con el mismo nombre que el archivo BAM, pero con extensión .bai) se encuentre en el mismo directorio. Navegue hasta chr4:55,592,144-55,592,257, que corresponde a una porción del exón 9 del KIT gen
      2. Aplastar la vista: haga clic con el botón derecho en la pista de alineación y seleccione Aplastado para reducir la vistaFigura 3A).
      3. Localice el inserto: identifique el marcador de inserción, con forma de punta de flecha, inmediatamente por encima de la pista de cobertura, ubicado entre las posiciones 55.592.178 y 55.592.179, que indica un inserto cortoFigura 3B,C).
      4. Interactúe con la inserción: haga clic en la punta de flecha para ampliar la vista y luego haga clic en una de las lecturas con bases que llenan el hueco para ver los detalles en una ventana emergente. Compare la secuencia insertada con la secuencia de referencia para determinar si se trata de una duplicación (Figura 3D,E).
      5. Observe la cobertura: haga clic en la pista de cobertura inmediatamente adyacente a la punta de la flecha del inserto para mostrar el número de lecturas de apoyo, que puede compararse con el recuento total de lecturas para determinar la frecuencia aproximada del alelo de variante (VAF), en este caso ~28 %.
      6. Buscar sesgo de cadena: ordenar las lecturas por la cadena de la lectura y visualizar las bases recortadas suavemente (véase Archivo Suplementario 1, sección 3) para mostrar una región de interés adyacente a la inserción en las lecturas inversas (Figura 3F).
4. Vigneta n.º 4: Investigar un EGFR (deleción del exón 19 del receptor del factor de crecimiento epidérmico) en cáncer de pulmón de células no pequeñas (CP-CNP)
   NOTA: Una mujer de 70 años con diagnóstico reciente de CPNM se somete a resección quirúrgica del tumor. Se solicita NGS en una sección de tejido que contiene pureza tumoral suficiente, y los resultados muestran una variante posible en EGFR. Muchos EGFR las mutaciones son susceptibles a los inhibidores de tirosina quinasa, y esta variante puede tener un impacto en la terapia y el pronóstico del paciente¹³.
   1. Flujo de trabajo de IGV (archivo de sesión EGFR.xml)
      1. Cargar datos: Seleccione el genoma Hg19, cargue el archivo bam EGFRE746_A750delmod.bam y asegúrese de que el archivo de índice (mismo nombre que el archivo bam, pero con extensión .bai) se encuentre en el mismo directorio; luego, navegue a chr7:55,242,420-55,242,513, correspondiente a una porción del exón 19 de la EGFR gen
      2. Investigar la eliminación utilizando la pista de cobertura: revise la pista de cobertura para identificar una pequeña región de menor cobertura que no esté ubicada en los extremos de las lecturas (Figura 4A,B). El examen de la pista de cobertura muestra una cobertura menor en una pequeña porción del exón 19.
      3. Investigar la eliminación utilizando las lecturas: amplíe la vista de alineamiento para mostrar las lecturas con una brecha de alineamiento, representada como una línea negra dentro de la lectura (Figura 4C,D).
      4. Considere el contexto genómico: investigue la secuencia de nucleótidos de la referencia implicada y en la región inmediatamente adyacente a la deleción. Evalúe la llamada de deleción en el contexto de la posición dentro de la secuencia de referencia, ya que las deleciones en regiones homopoliméricas o repetitivas pueden representar un artefacto de secuenciación, particularmente cuando están presentes con una baja frecuencia alélica de variante. Véase el Visualización de una pequeña deleción porción de Archivo Suplementario 2 para una descripción detallada del flujo de trabajo.
5. Vigneta n.º 5: Investigar EGFR alteraciones en un paciente con glioblastoma.
   NOTA: Mujer de 77 años con IDH glioblastoma de tipo silvestre sometido a pruebas de secuenciación de próxima generación (NGS). Sus resultados indican un potencial EGFR ganancia del número de copias y un potencial EGFRvIII reordenamiento (deleción de los exones 2-7). Ambos los EGFR amplificación y el EGFRvIII alteraciones tienen importancia pronóstica y terapéutica en el glioblastoma. Además, estas dos alteraciones frecuentemente coocurren, lo que significa que la presencia de una puede respaldar la validez de la otra cuando se detectan a niveles bajos.
   1. Flujo de trabajo de IGV (archivo de sesión copynumber.xml):
      1. Cargar datos: Seleccione el genoma Hg38, cargue el archivo de segmentos, proband.seg, y las muestras comparadoras, c1.seg-c9.seg, arrastrándolos y soltándolos en la ventana de IGV. Navegue hasta el cromosoma 7.
         NOTA: Los archivos de segmentación generados a partir de CNVKit se proporcionan para su descarga. El flujo de trabajo completo para utilizar CNVKit y generar la cuantificación del número de copias queda fuera del alcance de este estudio. Sin embargo, brevemente, se utilizó la versión 0.9.9 de CNVKit (disponible para descarga en https://github.com/etal/cnvkit) con una referencia agrupada predeterminada compuesta por especímenes normales y euploides. La entrada consiste en un archivo bed que contiene 9.144 ubicaciones de sondas del armazón de CNV, distribuidas a lo largo del genoma. Una consideración importante aquí es que los detalles específicos de las entradas y parámetros de la canalización de número de copias son menos relevantes que el hecho de que las muestras se procesen utilizando una configuración idéntica para todas las muestras en un mismo análisis. Esto facilita el reconocimiento del sesgo sistemático.
      2. Evalúe el mapa de calor: Compare la intensidad relativa del color entre la muestra de interés (localice la fila del mapa de calor correspondiente a esta muestra, etiquetada proband) y otras muestras (c1-9) para distinguir cambios reales en el número de copias de artefactos.
         NOTA: La comparación visual vertical de un locus en todas las muestras es el método para identificar anomalías (diferencias cualitativas basadas en diferencias de color entre filas, y no diferencias cuantitativas) en un locus determinado en cada muestra respecto al fondo. Consulte Figura 5 y Visualización de cambios en el número de copias sección de Archivo Suplementario 2 para pasos detallados.
6. Vigneta n.º 6: Investigar EGFRvIII en un paciente con glioblastoma.
   NOTA: El mismo paciente también presenta evidencia de un EGFRvIII reordenamiento (deleción de los exones 2-7). Ambos los EGFR amplificación y el EGFRvIII alteraciones tienen importancia pronóstica y terapéutica en el glioblastoma. Además, estas dos alteraciones frecuentemente coocurren, lo que significa que la presencia de una puede respaldar la validez de la otra cuando se detectan a niveles bajos.
   1. Flujo de trabajo de IGV (archivo de sesión egfr_vIII.xml):
      1. Cargar datos: Seleccione el genoma Hg19, cargue el archivo bam del paciente, proband.bam, y asegúrese de que el archivo de índice (con el mismo nombre que el archivo bam, pero con extensión .bai) se encuentre en el mismo directorio, y navegue hasta el EGFR gen
      2. Visualizar puntos de ruptura de EGFRvIII: Ajustar la vista para examinar individualmente los puntos de interrupción candidatos (hacia arriba del exón 2 y hacia abajo del exón 7 para EGFRvIII) y realizar 'ordenar por base'  (o usar acceso directo Ctrl-s en Windows/Linux o Cmd-s en Mac) en los puntos de interrupción para visualizar acumulaciones de lecturas con recorte suave.
      3. BLAT alinea lecturas: haga clic con el botón derecho en una secuencia recortada parcialmente y seleccione Secuencia BLAT (IGV utiliza los valores predeterminados de UCSC; véase https://ucsc.crg.eu/FAQ/FAQblat.html para conocer los parámetros predeterminados de BLAT). Haga clic en la primera fila y observe la Pista de Blat que aparece en la parte inferior de la sección de pista de IGV.
         NOTA: Incluso una sola lectura que se alinee a la unión del exón 1/intrón 1 y a la unión del intrón 6/exón 7 puede ser evidencia suficiente de EGFRvIII, siempre que se descarte la contaminación cruzada proveniente de otra muestra como causa de esta lectura. Consulte Figura 6 y el Visualización del reordenamiento estructural sección de Archivo Suplementario 2 para pasos detallados.

Resultados

Cabe destacar que este estudio se centra en describir los matices del análisis de variantes en IGV para la elaboración de informes clínicos. El informe clínico final debe basarse en la tubería validada, los criterios de calidad y la política de informes de cada laboratorio individual. Una discusión completa de este tema importante queda fuera del alcance del presente estudio; sin embargo, el Colegio Estadounidense de Genética Médica y Genómica y la Asociación para la Patología Molecular han elaborado estándares y directrices recomendados⁷ que se implementan regularmente en laboratorios clínicos.

Interpretación del caso clínico n.º 1:

Dado el alto VAF, la distribución equilibrada entre las hebras y la incidencia conocida de KRAS c.34G>T (p.G12C) en el cáncer de pulmón (Figura 2A), la variante en el caso A puede conducir a una terapia dirigida y, por tanto, es fundamental informarla clínicamente. A pesar de un resultado positivo para la misma variante KRAS c.34 G>T en el segundo caso (sarcoma) (Figura 2B), existen múltiples señales de advertencia que indican un falso positivo: (1) la fracción alélica de la variante (VAF) reportada es de ~1%, considerablemente por debajo de lo esperado para un evento impulsor en un contexto de muestra con una celularidad tumoral estimada incluso baja (20%) y (2) las lecturas que respaldan esta variante muestran sesgo de hebra, apareciendo casi exclusivamente en la hebra directa. Junto con la falta de plausibilidad biológica para este tipo de cáncer, las evidencias sugieren que el hallazgo en el caso B es un artefacto.

Interpretación del caso clínico n.º 2:

Este recuadro ilustra varios errores diferentes sobre los que los clínicos deben estar informados. En primer lugar, los llamadores de variantes pueden identificar variantes genéticas adyacentes, adecuada o inadecuadamente, ya sea como dos SNV o como un único MNV (Figura 2C). Esto se debe a las diferencias en la implementación del algoritmo de llamado de variantes sensible al haplotipo en los llamadores de variantes somáticas. Solo unos pocos llamadores de variantes, publicados más recientemente, incorporan esta característica^14,15. En segundo lugar, variaciones técnicas y basadas en la nomenclatura como estas son introducidas en bases de datos externas por centros de secuenciación que utilizan diferentes tuberías bioinformáticas. Por lo tanto, dichas bases pueden contener múltiples descripciones distintas de lo que debería figurar como una única variante genética. A menos que se realice periódicamente la faseo de bases de datos, esto puede tener diversos efectos adversos en la interpretación clínica posterior. En conjunto, estas posibles fuentes de error pueden conspirar para llevar a un informe incorrecto del paciente. Este escenario complejo resalta el valor de la visualización de variantes mediante software de alta calidad, como IGV.

Interpretación del caso clínico n.º 3:

Dado el soporte multi-lectura para la duplicación y el mecanismo conocido de activación constitutiva de KIT con duplicaciones del exón 9 en GIST, podemos concluir que esto KIT la variante c.1504_1509dup (p.A502_Y503dup) es real y no un artefactoFigura 3). Las mutaciones en KIT son impulsores frecuentes en los GIST, presentes en aproximadamente el 90 % de los casos. La caracterización precisa de las variantes es fundamental aquí, ya que, aunque las mutaciones activadoras en el exón 11 son las más comunes, los GIST con mutaciones en el exón 9 presentan un comportamiento diferente respecto a la sensibilidad a los inhibidores de tirosina quinasa, lo que modifica el enfoque terapéutico. Dada la importancia clínica de KIT mutaciones en GIST, esta variante debe incluirse en el informe final.

Interpretación del caso clínico n.º 4:

Dado el seguimiento de cobertura, la apariencia estereotípica de una pequeña deleción, el respaldo de las lecturas y el mecanismo conocido de activación constitutiva de las deleciones del exón 19 de EGFR en el CCRP, podemos concluir que esta variante EGFR c.2235_2249del (p.E746_A750del) es real y no un artefacto (Figura 4). Muchas mutaciones de EGFR, incluida esta deleción bien conocida del exón 19, son altamente susceptibles a inhibidores de tirosina quinasa. Dada la importancia clínica de las mutaciones de EGFR en los CCRP, esta variante debería incluirse en el informe final.

Interpretación del caso clínico n.º 5 y del caso clínico n.º 6:

Las vistas del mapa de calor confirman la amplificación de EGFR y la unión del punto de rotura entre los exones 1 y 8, evaluada mediante BLAT, lo que corrobora ambos hallazgos en este paciente (Figura 5 y Figura 6). La amplificación de EGFR generalmente se considera un factor pronóstico de una enfermedad más agresiva, y la reorganización del gen EGFRvIII es un biomarcador específico del GBM y potencialmente diana terapéutica^16,17.

Se pueden reproducir flujos de trabajo seleccionados utilizando archivos guardados en la rama principal del repositorio de GitHub https://github.com/Eitan177/Demo_IGV (actualizado el 6/9/2026), que contiene seis archivos de sesión, uno para cada viñeta, cinco pares de archivos bam y bai, uno para cada viñeta que utiliza un archivo de alineamiento, y 10 archivos seg para la viñeta cinco, que utiliza archivos de segmentos en lugar de archivos de alineamiento.

Figura 1: Estándares de archivos de NGS y flujo de trabajo de secuenciación. (A) Las lecturas cortas generadas en una celda de flujo se rastrean mediante mediciones ópticas y se almacenan en formato FASTQ, que incluye tanto los datos de secuencia como las puntuaciones de calidad por base. Luego, estas lecturas se ordenan y alinean con un genoma de referencia, produciendo un archivo BAM en el que cada lectura se «apila» en su locus correspondiente. (B) Las discrepancias entre la referencia y las lecturas (por ejemplo, mutaciones puntuales, pequeñas inserciones/deleciones) se identifican mediante algoritmos de llamado de variantes. (C) Finalmente, estas variantes detectadas se compilan en un archivo VCF, que resume sus posiciones, bases de referencia/alternas y otros datos de anotación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Visualización basada en IGV de la variante KRAS c.34G>T (p.G12C) y BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K). (A) Visualización de una variante real (KRAS c.34G>T (p.G12C)) en IGV, que muestra una alta profundidad de lectura (miles de lecturas) y aproximadamente un 35–40 % de lecturas con el cambio G→T. Las lecturas directas (rojas) y reversas (azules) están equilibradas, lo que sugiere una mutación heterocigota verdadera. (B) Artefacto sospechoso en tejido no relevante que muestra una variante con escaso soporte de lecturas (1 % de VAF). La mayoría de las lecturas de la variante aparecen en la cadena directa (roja), lo que indica sesgo de cadena. (C) Una variante compleja, BRAF c.1798_1799delinsAA (p.V600K), observada en IGV, que revela una sustitución de dos pares de bases (GT→AA) en cis. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: Visualización de una pequeña inserción. (A) La vista «aplastada» del exón 9 de KIT en IGV ayuda a identificar la región de interés. (B) Región de interés (cuadro rojo) identificada mediante la visualización de la barra de inserción y las bases recortadas suavemente. (C) Configuración de la vista «expandida» en IGV para permitir la visualización de la inserción. (D) Al hacer clic en la barra de inserción (cuadro rojo) se muestra la secuencia insertada. (E) La secuencia insertada se compara con la secuencia de referencia para identificar las bases duplicadas. (F) Clasificación de las lecturas por cadena de lectura, lo que muestra que las bases recortadas suavemente corresponden a la inserción en las lecturas inversas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Visualización de una pequeña deleción. (A) Vista «comprimida» del exón 19 de EGFR que muestra la deleción presente en numerosas lecturas. (B) Uso de la pista de cobertura para revisar el número de lecturas en posiciones dentro y adyacentes a la deleción. (C) Vista «expandida» que muestra la deleción, identificando el número de bases eliminadas. (D) La comparación con la secuencia de referencia (cuadro rojo) identifica las bases eliminadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Visualización de una ganancia en el número de copias. (A) Un archivo seg contiene seis columnas: identificación de la muestra, cromosoma, inicio, final, marcadores en el segmento y media del segmento. (B) La carga directa de los archivos seg en IGV permite una visualización conveniente. (C) Visualización de los datos en una vista genoma-ancha. Cada muestra aparecerá como una fila de datos, con colores que indican valores: rojo para >0 y azul para <0, siendo los colores más intensos representativos de valores más alejados de 0. Tras abrir la muestra de interés y nueve muestras aleatorias del mismo ensayo, se obtiene un mapa de calor multimensual con diez filas. La muestra de interés se resalta en la parte inferior dentro de un cuadro rojo. (D) Al reducir la vista al locus de EGFR, se observa una barra roja en la muestra de interés en la parte inferior, mientras que en las muestras aleatorias se ven barras blancas o azules. Esta diferencia de color entre la muestra de interés y las muestras aleatorias en las otras filas demuestra que la llamada de amplificación en la muestra de interés es superior al fondo o ruido en este locus. (E) Al ampliar la vista al cromosoma 7, se observa un contraste entre el locus que contiene EGFR en nuestra muestra y su ausencia en las muestras aleatorias. La amplificación de EGFR aparece como una fina franja roja en la muestra inferior. (F) Al reducir la vista al locus de MET, la amplificación de MET se replica en diversos grados en las nueve muestras aleatorias junto con la muestra de interés, lo que sugiere que esta llamada de amplificación es un artefacto. Esto resalta la diferencia en la apariencia entre una llamada verdadera de número de copias en el locus EGFR y un artefacto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Visualización de una reordenación génica de EGFRvIII. Antes de analizar este caso, asegúrese de haber configurado la visualización de las bases recortadas suavemente (soft-clipped) (véase el Archivo Suplementario 1 para obtener más detalles). (A) Diríjase al primer punto de unión candidato y configure la vista de la pista de alineamiento en «Aplastado» («Squished»). (B) Muévase a lo largo del locus, aplicando iterativamente el atajo para ordenar por base, «control-s», hasta que se haga visible una acumulación (pileup) de lecturas recortadas suavemente y similares en la parte superior de la pista de alineamiento. Cuanto mayor sea la cantidad de lecturas recortadas suavemente y similares (cuadro rojo) en la acumulación, mayor será la confianza en la existencia de una reordenación estructural. (C) La herramienta BLAT recupera la secuencia de las bases recortadas suavemente e identifica dónde en el genoma está presente dicha secuencia, junto con una puntuación cuantitativa que mide cuán estrechamente se alinea la secuencia con una secuencia específica en una base de datos objetivo. La selección de una fila determinada desplazará la vista a esa ubicación. (D) Volver a utilizar la función de ordenar por base mediante «control-s» demuestra una acumulación de recortes suaves, esta vez en el lado opuesto de las lecturas. Para confirmar que no existen bases adicionales en la muestra respecto al genoma de referencia hg38, haga clic derecho sobre una lectura que contenga una secuencia de bases recortadas suavemente y vuelva a aplicar BLAT a dichas bases recortadas. La tabla resultante muestra el primer punto de ruptura del punto de unión, el locus visualizado inicialmente, correspondiente al punto de unión entre el exón 1 y el intrón 1. (E) La selección de la primera fila devuelve al primer punto de ruptura. Las bases en el punto de unión del alineamiento de referencia de BLAT son idénticas a las bases recortadas suavemente utilizadas como consulta, lo que indica que toda la secuencia de lecturas recortadas suavemente está contenida en el alineamiento de la secuencia de referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario 1: Configuración recomendada de IGV.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Flujos de trabajo resumidos.Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

La revisión precisa de variantes para informes clínicos depende de algoritmos bioinformáticos complejos y de la incorporación de la revisión visual de variantes complejas utilizando IGV^5,6. Este estudio fue diseñado para compilar un recurso conciso de configuraciones recomendadas para visualizar alteraciones genómicas simples y complejas en IGV (Archivo Suplementario 1). Este estudio se centra en las alteraciones somáticas comunes y en cómo revisarlas en IGV.

El protocolo comienza evaluando una mutación de sustitución simple (Figura 2A) y una mutación de sustitución compleja (Figura 2C), prestando especial atención a determinar si el hallazgo identificado es real o un artefacto. A continuación, se aborda una inserción simple (Figura 3) y una deleción simple (Figura 4), destacando cómo se ven estas alteraciones en IGV. Por último, se discuten alteraciones genómicas complejas, incluyendo alteraciones del número de copias (Figura 5) y reordenamientos estructurales (Figura 6). Los flujos de trabajo resumidos que destacan los pasos clave para cada una de estas características se resumen en el Archivo Suplementario 2. Este estudio tiene como objetivo familiarizar al lector con la forma en que diferentes alteraciones genómicas aparecen en IGV⁵.

Cabe destacar que IGV no se utiliza como una herramienta de canalización para detectar variantes de forma independiente. Aunque fuera del alcance de este manuscrito, se recomienda encarecidamente que los laboratorios de investigación, y se requiere para los laboratorios clínicos, que las políticas y procedimientos de laboratorio aborden las variantes informables según las limitaciones de la validación del ensayo para la fracción alélica de la variante y la profundidad de cobertura, si se requiere una confirmación ortogonal para variantes bajo ciertas circunstancias, las complejidades relacionadas con la versión del software de bioinformática y la variación entre observadores en la interpretación visual^1,7.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BLAT	Búsqueda de genoma con BLAT	https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat	Página web independiente de BLAT. La API de BLAT está disponible dentro de IGV, no se requiere instalación adicional
CNVKit	GitHub	https://github.com/etal/cnvkit	Repositorio público de GitHub con CNVKit disponible gratuitamente para descarga. Las instrucciones para descargar y ejecutar CNVKit también están disponibles aquí.
Archivo de segmentos comparador #1 para la viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c1.seg	Archivos de número de copia
Archivo de segmentos comparador #2 para la viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c2.seg	Archivos de número de copia
Archivo de segmentos comparador #3 para la viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c4.seg	Archivos de número de copia
Archivo de segmentos comparador #4 para la viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c5.seg	Archivos de número de copia
Archivo de segmentos comparador #5 para la viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c6.seg	Archivos de número de copia
Archivo de segmentos comparador #6 para la viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c7.seg	Archivos de número de copia
Archivo de segmentos comparador #7 para la viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c8.seg	Archivos de número de copia
Archivo de segmentos comparador #8 para la viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c9.seg	Archivos de número de copia
Archivo de segmentos comparador para la viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/c3.seg	Archivos de número de copia
Secuencia del genoma humano	Secuencia del genoma humano	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/latest/hg38.fa.gz	Archivo fasta descargable que contiene el ensamblaje del genoma humano Hg38.  Este está disponible dentro de IGV, no se requiere descarga adicional
Secuencia del genoma humano	Secuencia del genoma humano	https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/latest/hg19.fa.gz	Archivo fasta descargable que contiene el ensamblaje del genoma humano Hg19. Este está disponible dentro de IGV, no se requiere descarga adicional
Paquete de software IGV	Software IGV	https://data.broadinstitute.org/igv/projects/downloads/2.19/IGV_Win_2.19.7-WithJava-installer.exe	Versión 2.19.7 del software IGV con Java (JDK 21), gratuito para descarga. El enlace proporcionado es para Windows, aunque también hay enlaces disponibles para Linux y Mac.
Archivo de segmentos para el caso de la viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.seg	Archivos de número de copia
Repositorio tutorial de GitHub	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/tree/main	Repositorio público de GitHub con todos los archivos necesarios para reproducir las seis viñetas
Viñeta #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KRAS.xml	Archivos de sesión
Índice bai del caso A de la viñeta #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam.bai	Archivos de alineación
Archivo de alineación bam del caso A de la viñeta #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2A_fixed_backbone_ 2A_new_final_sorted.bam	Archivos de alineación
Índice bai del caso B de la viñeta #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam.bai	Archivos de alineación
Archivo de alineación bam del caso B de la viñeta #1	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/kras2B_fixed_backbone_ 2B_new_final_sorted.bam	Archivos de alineación
Viñeta #2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/BRAF.xml	Archivos de sesión
Índice bai de la viñeta #2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam.bai	Archivos de alineación
Archivo de alineación bam de la viñeta #2	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/fig2C_braf_v600k_2bp_ backbone_2CD_new_final_sorted.bam	Archivos de alineación
Viñeta #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KIT.xml	Archivos de sesión
Archivo de índice bai de la viñeta #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bai	Archivos de alineación
Archivo de alineación bam de la viñeta #3	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/KITdupmod2.bam	Archivos de alineación
Viñeta #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFR.xml	Archivos de sesión
Archivo de alineación de la viñeta #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bam	Archivos de alineación
Índice bai de la viñeta #4	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/EGFRE746_A750delmod.bai	Archivos de alineación
Viñeta #5	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/copynumber.xml	Archivos de sesión
Viñeta #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/egfr_vIII.xml	Archivos de sesión
Índice bai de la viñeta #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bai	Archivos de alineación
Archivo de alineación bam de la viñeta #6	GitHub	https://github.com/Eitan177/Demo_IGV/blob/main/proband.bam	Archivos de alineación