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Artículo de método

Fabricación y caracterización de parches de microagujas disolubles cargados con 3BDO para el crecimiento del cabello en ratones C57BL/6

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DOI:

10.3791/71814

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25 de agosto de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Stomatology, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la fabricación, caracterización y aplicación de parches de microagujas disolubles cargados con 3BDO para la administración transdérmica de fármacos en un modelo de regeneración del vello en ratón.

Resumen

Los tratamientos convencionales para la alopecia androgénica (AA) presentan limitaciones, lo que impulsa el desarrollo de enfoques alternativos de administración. Este protocolo describe la fabricación, caracterización y aplicación de parches de microagujas disolubles cargadas con 3BDO y compuestos de ácido hialurónico/citosano (HA/CS) en un modelo de regeneración capilar en ratones C57BL/6. El método utiliza un proceso de moldeo en dos etapas en un molde de polidimetilsiloxano (PDMS) para concentrar el 3BDO en las puntas de las microagujas, a la vez que forma una capa de soporte de HA/CS sin fármaco. El parche se caracteriza mediante imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM), pruebas mecánicas, pruebas de inserción y disolución en piel, ensayos de liberación in vitro, ensayos antibacterianos, pruebas de citotoxicidad y evaluación in vivo de regeneración capilar. Tras la inserción, las puntas de las microagujas se disuelven, liberando localmente el 3BDO. La evaluación in vivo mostró que el grupo tratado con microagujas cargadas con 3BDO presentó una regeneración capilar más uniforme que los grupos tratados con inyección subcutánea y el grupo control. Este protocolo también permite evaluar la morfología del parche, el rendimiento de inserción y la biocompatibilidad local. Este método proporciona un flujo de trabajo preclínico para evaluar la administración mediada por microagujas de 3BDO en aplicaciones de regeneración capilar.

Introducción

La alopecia androgénica (AGA) es uno de los trastornos clínicos de alopecia más comunes, caracterizado principalmente por el adelgazamiento progresivo y la pérdida de cabello en el cuero cabelludo. Su prevalencia a lo largo de la vida sigue siendo persistentemente alta entre los hombres, lo que la convierte en un problema de salud crítico que requiere una solución urgente1,2. Actualmente, los tratamientos clínicos para la AGA se clasifican principalmente en intervenciones farmacológicas y trasplantes quirúrgicos, ambos con desventajas significativas. Los fármacos terapéuticos de primera línea, como la finasterida y la minoxidil, muestran ciertos efectos terapéuticos, pero se asocian con reacciones adversas definidas, como disfunción sexual, prurito del cuero cabelludo y sequedad del cuero cabelludo1,3. Aunque el trasplante capilar puede lograr regeneración local del cabello, se ve limitado por los altos costos del tratamiento, la cantidad insuficiente de cabello en las áreas donantes y las tasas variables de supervivencia del injerto, lo que dificulta su difusión generalizada en la práctica clínica1. Dadas estas limitaciones, existe la necesidad de nuevas estrategias terapéuticas que combinen eficacia, seguridad y cumplimiento por parte del paciente.

El 3BDO es un activador de mTOR de molécula pequeña que compite con la rapamicina4. Se ha utilizado ampliamente como inhibidor de la autofagia en diversos sistemas5,6,7. Por ejemplo, el tratamiento prolongado con 3BDO podría mejorar la función de la memoria al reducir el número de autofagosomas8. Además, hay evidencia creciente de que el 3BDO podría actuar independientemente como activador de mTOR. Por ejemplo, el 3BDO impidió la muerte celular endotelial y el desarrollo de aterosclerosis en ratones, independientemente de la actividad de mTOR9. Sin embargo, su posible papel en el crecimiento del folículo piloso no ha sido descrito. Cabe destacar que, en nuestros estudios preliminares, se encontró que el 3BDO promueve el crecimiento del cabello. No obstante, los métodos tradicionales de administración tópica de fármacos presentan limitaciones evidentes. La capa córnea de la piel limita la eficiencia transdérmica, dificultando la entrega del fármaco al sitio diana en el folículo piloso dentro de la dermis. Aunque los geles transdérmicos pueden prolongar el tiempo de retención del fármaco, podrían dejar residuos indeseables. La eficacia clínica de ambas estrategias de tratamiento mencionadas anteriormente sigue siendo subóptima10,11.

Las microagujas (MA) son una tecnología novedosa y indolora para la administración de fármacos cuya ventaja principal radica en su capacidad para penetrar fácilmente la capa córnea y entregar con precisión fármacos al microentorno perifolicular en la unión entre la epidermis y la dermis. Además, las MA destacan por su uso conveniente, invasividad mínima y costo razonable12,13,14. Para abordar el cuello de botella en la administración transdérmica del 3BDO tópico, se desarrolló un parche de MA utilizando ácido hialurónico (HA) como matriz y quitosano (CS) como componente funcional. La incorporación de CS tiene como objetivo proporcionar un componente funcional con potencial antibacteriano. Asimismo, la aplicación de HA en piel de ratón alopécica podría estimular significativamente el desarrollo del folículo piloso15. Por lo tanto, este protocolo describe la fabricación y caracterización de un sistema de microagujas disolubles cargadas con 3BDO, así como su aplicación en un modelo de regeneración capilar en ratones C57BL/6 depilados. Este modelo es útil para evaluar las respuestas de regeneración capilar tras la depilación, pero por sí solo no establece la eficacia clínica para la AAG.

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Protocolo

El estudio fue aprobado por el comité de ética animal de la Shandong First Medical University & Academia de Ciencias Médicas de Shandong (W202112030345). Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes.

1. Fabricación de parches 3BDO@MN

  1. Preparación de la formulación de CS/HA
    1. Pese 1 g de polvo de CS (grado de desacetilación ≥ 95 %) y añádalo a 20 mL de agua destilada, seguido de agitación a temperatura ambiente (TA) durante 10 min.
    2. Añada continuamente 0,4 mL de solución de ácido acético al 2 % (v/v) (peso molecular 60,05) y continúe agitando durante 2 h.
      ADVERTENCIA: El ácido acético concentrado es corrosivo. Realice la dilución y manipulación en una campana extractora y use guantes desechables y gafas para evitar el contacto con la piel y las membranas mucosas.
    3. Continúe añadiendo 2 g de polvo de HA y luego centrifugue la formulación mezclada a 1.207 × g (aproximadamente 3.000 rpm) durante 5 min para asegurar la disolución completa.
      ​NOTA: La formulación de CS/HA debe prepararse fresca y puede conservarse en un refrigerador a 4 °C durante no más de 24 h.
  2. Preparación de la formulación de CS/HA cargada con 3BDO
    1. Añada la solución predisolvida de 3BDO (2 mg/mL) en dimetilsulfóxido (DMSO)
      ADVERTENCIA: El DMSO es permeable a la piel. Use guantes durante la manipulación para evitar el contacto directo con la piel y añádalo a la formulación de CS/HA. Mezcle bien para asegurar la disolución completa.
    2. Centrifugue la formulación mezclada a 1.207 × g durante 5 min para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada.
      ​NOTA: Si persisten burbujas tras la centrifugación, deje reposar la formulación durante 5 min y luego vuelva a centrifugar.
  3. Fabricación de parches de MN con 3BDO@MN
    1. Utilice un molde de microagujas de polidimetilsiloxano (PDMS), que presenta una matriz de 20 × 20 puntas cónicas con una altura de 600 µm, un diámetro de base de 250 µm y un paso de 550 µm.
    2. Trate la superficie del molde de PDMS utilizando un limpiador de plasma para hacerla completamente hidrofílica.
    3. Añada 1 mL de la formulación de 3BDO@CS/HA al molde de PDMS. Coloque el molde en una cámara de vacío y aplique vacío durante 10 min para facilitar la infiltración de la formulación viscosa en las microcavidades.
    4. Centrifugue el molde a 134 × g durante 5 min a TA para asegurar que la formulación llene todas las cavidades. Use un raspador metálico estéril para eliminar cuidadosamente el exceso de formulación de la superficie del molde, dejando un plano perfectamente plano.
    5. Dispense la mezcla de matriz de CS/HA sin 3BDO sobre la superficie del molde. Centrifugue a 134 × g durante 5 min a TA para formar una capa de respaldo uniforme.
    6. Coloque el molde en un horno a 36 °C y 37 % de humedad y séquelo durante la noche (aproximadamente 12–16 h).
    7. Despegue el parche de MN completamente seco del molde después de que el molde se enfríe a TA.
      NOTA: Mantenga los parches de 3BDO@MN fabricados almacenados en un refrigerador a 4 °C hasta que estén listos para su uso.

2. Caracterización de los parches 3BDO@MN

  1. Monte el parche 3BDO@MN preparado sobre un soporte utilizando cinta de carbono conductora adhesiva de doble cara.
    1. Recubra por pulverización catódica la muestra montada con una capa delgada de oro (o platino) para mejorar la conductividad eléctrica.
    2. Cargue el soporte de la muestra en la cámara de vacío de un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FE-SEM).
    3. Ajuste el voltaje de aceleración y la distancia de trabajo para obtener imágenes de alta resolución. Observe la morfología general del arreglo y la topografía superficial fina de las MN individuales.
    4. Obtenga micrografías representativas de SEM. Mida la longitud de las MN y el diámetro de la punta.
  2. Prueba de resistencia mecánica
    1. Coloque el parche de MN plano sobre la plataforma de prueba del analizador de textura. Asegúrese de que el sustrato esté perfectamente plano y de que las puntas de las agujas estén orientadas directamente hacia arriba.
    2. Sujete firmemente una sonda cilíndrica plana (25 mm de diámetro) al transductor de carga del instrumento.
    3. Baje la sonda verticalmente hasta que quede posicionada justo encima de las puntas de las MN. Evite cualquier contacto físico entre la sonda y las puntas antes de la prueba.
    4. Establezca los parámetros específicos de prueba en el software: fije la velocidad de descenso a 0,05 mm/s y la distancia de desplazamiento objetivo a 0,7 mm.
  3. Prueba de disolución
    1. Extienda la piel dorsal de rata sobre la mesa de disección y seque la superficie de la piel con papel absorbente. Mantenga la piel plana y sin arrugas.
    2. Coloque los parches de MN secos con las puntas de las agujas hacia abajo sobre la superficie de la piel y aplique presión vertical uniforme para asegurar la inserción de las MN en la piel.
    3. Retire los parches de la piel en intervalos de tiempo predeterminados (5, 10, 30 y 60 s) y séquelos durante 5 min.
    4. Observe la morfología residual mediante SEM en las mismas condiciones de imagen.
  4. Ensayos de liberación de fármaco in vitro
    1. Añada 500 µL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Coloque las MN cargadas con 3BDO en cada pocillo para que entren en contacto con el PBS.
    2. Incube las placas a temperatura ambiente (RT). En cada punto temporal, recolecte 500 µL de PBS para cuantificar la concentración de 3BDO.
    3. Reponga inmediatamente cada pocillo con 500 µL de PBS fresco para mantener condiciones de sumidero (sink conditions).
    4. Calcule el porcentaje acumulativo de 3BDO liberado en función de la carga total de fármaco inicial en las MN.
  5. Ensayos antibacterianos
    1. Retire los cultivos bacterianos (E. coli y Staphylococcus aureus) del almacenamiento a -80 °C y añada 10 µL de cada cultivo bacteriano a 5 mL de medio LB.
    2. Incube el medio inoculado en un agitador-incubadora a 37 °C y 250 rpm durante aproximadamente 16 h (durante la noche).
    3. Ajuste el cultivo bacteriano con medio LB a una OD620 inicial de 0,01.
    4. Diluya la solución stock de CS con agua estéril para preparar soluciones de CS en seis concentraciones (1, 5, 10, 50, 100 y 500 mg/mL), con tres réplicas para cada concentración.
    5. Divida las muestras en tres grupos: grupo en blanco, grupo control y grupo CS. Para el grupo en blanco, añada 200 µL de LB. Para el grupo control, añada 180 µL de solución bacteriana y 20 µL de agua estéril. Para el grupo CS, añada 180 µL de solución bacteriana y 20 µL de la concentración correspondiente de solución de CS.
    6. Incube a 37 °C durante 20 h.
    7. Mida y registre la OD620 de cada pocillo de la placa de 96 pocillos en un lector de placas de absorbancia a las 0 h y 20 h.
  6. Evaluaciones de citotoxicidad
    1. Siembre 100 µL de suspensión celular epidérmica o dérmica en una placa de 96 pocillos (2 × 103 células por pocillo).
    2. Añada 10 µL de los tratamientos respectivos a los pocillos designados para establecer cuatro grupos: un grupo control (medio de cultivo), un grupo 3BDO (concentración final de 1 µM), un grupo de extracto de MN y un grupo 3BDO+extracto de MN, con tres réplicas para cada grupo.
    3. Incube a 37 °C, 5 % CO₂ durante 24 h.
    4. Añada 10 µL de la solución de trabajo del kit de conteo celular-8 (CCK-8) a cada pocillo.
      NOTA: Evite la formación de burbujas en los pocillos, ya que podrían afectar las lecturas de absorbancia.
    5. Incube a 37 °C, 5 % CO₂ durante 2 h.
    6. Lea la absorbancia a 450 nm de todos los pocillos utilizando un espectrofotómetro de microplaca.
    7. Analice los datos y calcule el porcentaje de supervivencia celular.

3. Experimentos con animales

  1. Preparación y tratamiento del animal experimental
    1. Anestesiar ratones macho C57BL/6 de 7 semanas de edad con isoflurano y proporcionar termorregulación durante la anestesia.
      ADVERTENCIA: El isoflurano es un anestésico volátil. Trabajar en un ambiente bien ventilado para evitar inhalación excesiva.
    2. Aplicar un lubricante oftálmico en los ojos de los ratones para protegerlos de la desecación.
    3. Afeitar el pelo de la zona dorsal de los ratones utilizando una maquinilla eléctrica, con un área afeitada de aproximadamente 2 × 2 cm2.
    4. Aplicar la crema depilatoria, esperar entre 5 y 10 s, luego retirarla. Limpiar la piel con un hisopo con solución salina para eliminar cualquier residuo de crema depilatoria y pelo.
    5. Recortar los parches de microagujas (MN) y reservarlos.
    6. Dividir aleatoriamente los ratones afeitados en cinco grupos (n = 5 por grupo) y tratarlos de la siguiente manera:
      1. Grupo control sin tratamiento: solo afeitar el pelo sin aplicar ningún tratamiento adicional.
      2. Grupo con parche MN vacío: tratar la piel afeitada con parches MN sin 3BDO, siguiendo el mismo esquema que el grupo 3BDO@MN.
      3. Grupo con parche 3BDO@MN: tratar la piel afeitada con parches 3BDO@MN los días 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13.
      4. Grupo con inyección subcutánea de PBS: administrar una inyección subcutánea de solución PBS en la zona dorsal afeitada de los ratones diariamente.
      5. Grupo con inyección subcutánea de 3BDO: administrar una inyección subcutánea de solución 3BDO en la zona dorsal afeitada de los ratones diariamente.
    7. Colocar los parches 3BDO@MN sobre la piel afeitada y aplicar presión vertical uniforme para asegurar la inserción de las microagujas en la piel. Fijar los parches 3BDO@MN con una venda elástica y utilizar una pinza recta para mantener la venda en su lugar.
      ​NOTA: Los diferentes esquemas de dosificación se seleccionaron según las características distintas de liberación de cada estrategia: el parche 3BDO@MN proporciona una liberación sostenida localizada, mientras que la inyección subcutánea administra 3BDO como una dosis en bolo.
    8. Observar a los ratones durante todo el experimento para asegurarse de que recuperen completamente la conciencia tras la anestesia.
  2. Recolección de muestras y evaluación del crecimiento del pelo
    1. Fotografiar la piel dorsal de los ratones cada día para registrar el crecimiento del pelo.
    2. Evaluar el crecimiento del pelo midiendo el diámetro del tallo piloso, la cobertura capilar y la densidad del pelo el día 15. Cuantificar el porcentaje de cobertura capilar en el área tratada utilizando el software ImageJ.

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Resultados

Este protocolo presenta la fabricación y caracterización del parche 3BDO@MN. Figura 1 muestra el esquema del proceso de fabricación del parche 3BDO@MN. Se mezcló 3BDO en la formulación de CS/HA, y luego la mezcla de matriz se añadió al molde de MN de PDMS y se centrifugó para llenar las puntas de las agujas. La mezcla de matriz de CS/HA sin 3BDO se añadió sobre la superficie del molde y se centrifugó para llenar la capa de soporte. Tras un secado completo, los parches se des...

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Discusión

Actualmente, los tratamientos clínicos para la AAG se clasifican principalmente en intervenciones farmacológicas y trasplantes quirúrgicos. En este estudio, las MN cargadas con 3BDO promovieron el crecimiento del cabello en un modelo de ratón C57BL/6. Sin embargo, los métodos convencionales de administración de fármacos presentan limitaciones, como la distribución desigual del fármaco. El protocolo clave de este estudio es un método de dos pasos para fabricar MN cargadas con 3BDO. El AH y el CS son los componentes princi...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82273554), el Proyecto de Desarrollo Científico y Tecnológico en Medicina y Salud de la Provincia de Shandong (n.º 202304030716), el Programa Nacional de Formación en Innovación y Emprendimiento para Estudiantes Universitarios de China (n.º 202410439001) y el Proyecto de Desarrollo de Innovación Científica y Tecnológica de Tai’an (n.º 2023NS232).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
3BDOYuanye Bio-Technology Co., Shanghai, China890405-51-3Preparación de formulación CS/HA cargada con 3BDO
Placa de 6 pocillosCorning Incorporated, USAREF 3516Ensayo antibacteriano y ensayo de liberación de fármaco in vitro
Etileno al 75%Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.1202050004Desinfección
Placa de 96 pocillosCorning Incorporated, USAREF3599Evaluaciones de citotoxicidad celular y ensayo antibacteriano
Ratones C57BL/6Charles River Laboratories7 semanasExperimentos con animales
Kit de conteo celular-8 (CCK-8)Dojindo, JapónCK04Evaluaciones de citotoxicidad
CentrífugaThermo Fisher Scientific75007204Centrifugado de formulación
Quitosano (CS) Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd9012-76-4Preparación de formulación CS/HA
Cremas depilatoriasVeet3059944023307Depilación
Dimetilsulfóxido (DMSO)Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd67-68-5Preparación de formulación CS/HA cargada con 3BDO
Balance electrónicoRadwagAS 220.R2Pesado de polvo
Escherichia coli (E. coli)ATCC/Ensayo antibacteriano
Ácido hialurónico (HA) en polvoBloomage Biotechnology Co. China9067-32-7Preparación de formulación CS/HA
Software ImageJNational Institutes of Health/Análisis estadístico
Agitador incubadorThermo Scientific  50163013Incubación bacteriana
Vaporizador de isofluranoGene&IAMSAnestesia animal
Medio LBSigma Life ScienceL3022Ensayo antibacteriano
Agitador magnéticoHangzhou MiuLab Instrument Co., Ltd.SP-16Agitación de formulación
Espectrofotómetro microplaca Multiskan SkyHighThermo Fisher Scientific/Medición de OD
HornoShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,LtdDHG-9260ASecado de micropuntas
Parafilm MAmcor PM-996Sellado de micropuntas
Solución tampón fosfato (PBS)BiosharpBL302AEnsayo de liberación de fármaco in vitro
Staphylococcus aureus (S. aureus)ATCC/Ensayo antibacteriano
Analizador de textura Universal TAShanghai Tengba Instrument Technology Co., Ltd/Prueba de resistencia mecánica
Cámara de vacíoShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,LtdDZF-6050Secado al vacío

Referencias

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  20. Xiao T et al. Microneedle assisted delivery of epidermal and dermal stem cells to promote hair growth. J Mater Sci. 2024;59(19):8427-40.

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