Un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos tridimensionales que recapitulan la morfogénesis mamaria

Summary

Este protocolo describe un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos que recapitulan características clave de la morfogénesis mamaria en un sistema de cultivo tridimensional controlado.

Abstract

El desarrollo de sistemas modelo humanos fisiológicamente relevantes que recapitulen la arquitectura tisular y la dinámica del estado celular sigue siendo un gran desafío en el estudio del desarrollo mamario y los primeros eventos en la carcinogénesis. Los cultivos bidimensionales convencionales y muchos sistemas tridimensionales no logran captar la organización estructural y las señales microambientales que definen la glándula mamaria humana. Aquí describimos un método reproducible para generar organoides mamarios humanos tridimensionales a partir de células epiteliales primarias incrustadas en una matriz hidrogel definida compuesta por colágeno tipo I, laminina, fibronectina y ácido hialurónico. Este sistema apoya la progresión de células individuales a través de etapas clave de la morfogénesis mamaria, incluyendo la expansión de los progenitores, el patrón epitelial y la formación de estructuras terminales en forma de unidad lobular ductal, así como la aparición de un compartimento similar a mesénquima, durante un periodo de cultivo de 21 días. Ofrecemos un protocolo paso a paso para la preparación de hidrogel, la siembra celular y las condiciones de cultivo. El método es compatible con imágenes de alto contenido y análisis cuantitativo del número de organoides, la distribución de tamaño y la complejidad arquitectónica. Esta plataforma permite estudios mecanicistas de la plasticidad epitelial y las perturbaciones ambientales, proporcionando un sistema escalable y biológicamente relevante para investigar los cambios tempranos a nivel de tejido asociados al riesgo de cáncer de mama.

Introduction

Comprender el desarrollo de las glándulas mamarias humanas y los primeros eventos que predisponen el tejido a la transformación maligna requiere sistemas experimentales que recapitulen fielmente la arquitectura tisular, la jerarquía celular y la señalización microambiental. Aunque las culturas epiteliales bidimensionales han proporcionado importantes conocimientos mecanicistas, carecen del contexto estructural necesario para modelar la organización epitelial y la^{morfogénesis 1}. Los sistemas de cultivo tridimensionales existentes, incluidos los basados en extractos de membrana basal, han avanzado en el campo pero siguen limitados por la composición variable, el control incompleto sobre los componentes de la matriz extracelular y el soporte inconsistente de la arquitectura tisular^{de orden superior.} Además, muchos sistemas organoides basados en extractos de membrana basal están limitados por su incapacidad para soportar consistentemente la aparición de una organización similar a tejido¹. En particular, muchos sistemas dependen de componentes estromales exógenos en lugar de permitir el desarrollo endógeno de microambientes de soporte, limitando así su capacidad para modelar las interacciones epitelial-mesenquimales, que son centrales para el desarrollo tisular y la enfermedad. Estas limitaciones restringen el estudio reproducible de los procesos del desarrollo, la plasticidad epitelial y los efectos de perturbaciones ambientales o moleculares en la organización tisular.

Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un modelo tridimensional definido de organoides mamarios humanos basado en hidrogel que permite a las células epiteliales primarias generar estructuras organizadas dentro de una matriz extracelular^definida 2,3,4,5,8. El hidrogel está compuesto por colágeno tipo I, laminina, fibronectina y ácido hialurónico, componentes seleccionados según sus roles establecidos en el desarrollo de las glándulas mamarias y la morfogénesis epitelial. Estas moléculas de la matriz extracelular interactúan con receptores celulares distintos, incluyendo integrinas, receptores de dominio discoidin, CD44 y RHAMM, y se sabe que regulan la polaridad epitelial, la morfogénesis ramificada, el mantenimiento de células madre, la mecanotransducción y la organización tisular en la glándula mamaria ^6,7. Estudios previos que describían este sistema hidrogel demostraron que la incorporación de estos componentes de la matriz extracelular mejoró notablemente la morfogénesis ductal-lobular y la maduración epitelial en comparación con condiciones basadas solo en colágeno o basadas en^matrigeles. Además, las propiedades físicas de esta formulación de hidrogel se caracterizaban previamente por microscopía de fuerza atómica, demostrando que el hidrogel de matriz extracelular compuesta presentaba menor rigidez y aumento de la hinchazón en comparación con los geles solo de colágeno (módulo de Young: 256,7 ± 20,0 Pa frente a 559,2 ± 204,0 Pa, respectivamente), consistente con un entorno de matriz más blando e^{hidratado 8}.

Es importante destacar que este modelo apoya la aparición de un compartimento similar a un mesenquima que surge junto a las estructuras epiteliales, proporcionando un soporte estructural y de señalización endógeno que refleja más de cerca la organización tisular^{nativa 3}. La relevancia fisiológica de este sistema hidrogel ha sido evaluada mediante comparaciones directas con cultivos organoides convencionales basados en matrigel, utilizando análisis morfológicos y transcriptómicos. Estudios anteriores demostraron que los cultivos de hidrogel apoyaban una formación de tejido ductal-lobular más organizada y una diferenciación multilineal que los cultivos basados en Matrigel, al tiempo que preservaban la respuesta^{hormonal 8}. Más recientemente, análisis integrados de secuenciación de ARN unicelular comparando organoides derivados de hidrogel, organoides cultivados en Matrigel y tejido mamario humano primario demostraron que los organoides cultivados en hidrogel recapitulan con mayor fidelidad la jerarquía epitelial, la diversidad celular y las interacciones epitelio-mesenquimales presentes en el tejido mamario humano^{nativo 3}. En contraste, los organoides cultivados en Matrigel se enriquecieron para estados basales híbridos proliferativos y carecieron de poblaciones similares a estromas, lo cual era compatible con el autoensamblaje epitelial en lugar de la organogénesis dirigida.

El protocolo descrito aquí proporciona un método reproducible y escalable para generar organoides a partir de tejido humano primario, con pasos opcionales para la depleción y disociación de fibroblastos a células individuales. Debido a que esta plataforma es compatible con imágenes en vivo, imágenes de alto contenido, análisis morfométrico cuantitativo, seguimiento celular y estudios de perturbación genética, puede integrarse con enfoques posteriores que evalúan el número de organoides, tamaño, arquitectura y dinámica de crecimiento. Por tanto, esta plataforma proporciona un sistema biológicamente relevante para estudiar el desarrollo mamario humano, la plasticidad epitelial, las interacciones epitelial-microambiente y las respuestas a nivel tisular ante perturbaciones del desarrollo, moleculares o ambientales.

En la Figura 1 se ofrece una visión esquemática del flujo de trabajo, incluyendo procesamiento de tejidos, preparación de hidrogeles, cultivo de organoides, progresión del desarrollo y análisis posteriores, mientras que las morfologías organoides representativas generadas con esta plataforma se muestran en la Figura 2.

Figura 1. Visión general del flujo de trabajo de generación de organoides a base de hidrogel. (A) Diagrama de flujo que resume el flujo de trabajo del protocolo, incluyendo recogida de tejidos, procesamiento de tejidos, criopreservación, recuperación y preparación celular opcional, preparación de hidrogel, cultivo de organoides, desarrollo de organoides y aplicaciones analíticas posteriores. (B) Esquema visual que representa las principales etapas del protocolo de generación de organoides a base de hidrogel, incluyendo procesamiento y preparación de tejidos, recuperación y preparación opcional de células, preparación de hidrogel y siembra de organoides. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2. Morfologías organoides representativas generadas en el sistema hidrogel definido. Imágenes representativas en campo claro de organoides derivadas de diferentes tejidos humanos cultivados en la matriz de hidrogel definida. Los organoides mamarios generados a partir de células epiteliales individuales derivadas de la mamoplastia reductora fueron fotografiados en el día 21 de cultivo. Los organoides xenoinjertos derivados del paciente generados a partir de fragmentos tumorales se imaginaron en el día 16 de cultivo. Los organoides de las glándulas salivales generados a partir de fragmentos epiteliales se imarjaron en el tercer día de cultivo. Los organoides renales generados a partir de fragmentos epiteliales se imagaron en el día 17 de cultivo. Barras de escala = 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocol

Los tejidos primarios que de otro modo se habrían descartado como residuos médicos tras la cirugía se obtuvieron cumpliendo con todas las leyes pertinentes, utilizando protocolos aprobados por los comités de revisión institucional del Maine Medical Center y del Tufts Medical Center. Todos los tejidos fueron anonimizados antes de la transferencia y no se pudieron rastrear hasta pacientes específicos. Por esta razón, esta investigación obtuvo el estatus de exención por parte del Comité sobre el Uso de Humanos como Sujetos Experimentales del Instituto Tecnológico de Massachusetts y de Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Todos los pacientes inscritos en este estudio firmaron un formulario de consentimiento informado aceptando participar en el estudio y la publicación de los resultados.

1. Procesamiento y preparación de tejidos

NOTA: Realizar todos los procedimientos relacionados con tejido humano de acuerdo con las directrices institucionales de bioseguridad y ética. Consulte los esquemas del flujo de trabajo mostrados en las Figuras 1A y 1B para una visión visual de los pasos del protocolo y del flujo de trabajo de preparación del organoide antes de comenzar el procedimiento.

1. Preparar MEGM utilizando medio basal epitelial mamario suplementado con extracto de hipófisis bovina de 52 μg/mL, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico humano, 5 μg/mL de insulina, 500 ng/mL de hidrocortisona, 1% (v/v) de GlutaMAX y 1% (v/v) antibiótico-antimicótico (100X).
2. Prepara el medio de disociación añadiendo 1,5 mg/mL de colagenasa A (almacenada a −20°C) y 100 U/mL de hialuronidasa (almacenada a 4°C) al medio epitelial mamario (MEGM).
3. Recibir tejido mamario humano obtenido de mastectomías profilácticas y mamoplastias de reducción dentro de las 24 horas posteriores a la extirpación, no fijado en solución salina con fosfato tamponado (PBS) y mantenido a 4°C. Pesa el tejido con una balanza de precisión para determinar el peso total del tejido.
4. Coloca el tejido en un armario de bioseguridad estéril. Pica mecánicamente el tejido en fragmentos de 3–5^mm 3 usando bisturí estéril. Transfiere aproximadamente 2–3 g de tejido picado a un tubo cónico de 15 mL. Añade 10 mL de medio de disociación a cada tubo.
5. Incubar los tubos a 37°C en un rotador orbital a 8 rpm durante 12–18 horas para digerir enzimáticamente el tejido. Considera la digestión completa cuando no quedan grandes fragmentos de tejido y se puede ver una suspensión homogénea de material fragmentado uniformemente en todo el medio.
6. Deja que los fragmentos epiteliales se asienten por gravedad durante 5 minutos. Confirma que no quedan fragmentos visibles suspendidos en el medio y que hay un pellet distinto presente. Decanta cuidadosamente y desecha el sobrenadante sin mover la bola.
   NOTA: El sobrenadante contiene células estromales y componentes de la matriz, y puede lavarse y utilizarse o preservarse para otros estudios.
7. Resuspende el pellet en un medio de lavado de 10 mL que contiene un 5% de suero fetal bovino (FBS) en PBS. Centrifuga a 250 × g durante 5 minutos en una centrífuga oscilante a temperatura ambiente.
8. Repite el paso de lavado tres veces más o hasta que el sobrenadante esté limpio y libre de restos visibles.
9. Resuspende el pellet final en un medio congelante que contiene 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) en MEGM a un volumen de 1 mL por gramo de peso tisular inicial.
   PRECAUCIÓN: El DMSO es perjudicial al contacto o inhalación. Manejar el uso de equipos de protección individual adecuados y trabajar con una capucha de seguridad química si lo requieren las directrices institucionales.
10. Alicuota 1 mL de la suspensión en cada criovial. Coloque los crioviales a −80°C en un recipiente congelante antes de almacenarlos a largo plazo en nitrógeno líquido.
    NOTA: Este paso representa un punto de pausa. Almacenar muestras a −80°C antes de transferirlas a condiciones de almacenamiento a largo plazo.

2. Recuperación y preparación celular opcional

1. Deshielo y recuperación inicial
   1. Retira el tejido criopreservado del almacenamiento a −80°C tras congelarlo durante al menos 24 horas, o del nitrógeno líquido almacenado a largo plazo. Sumerge inmediatamente el cryovial hasta la tapa en un baño de maria a 37°C y descongela rápidamente durante 1 minuto para minimizar la muerte celular.
      NOTA: Agita suavemente el cryovial durante el descongelamiento para asegurar un calentamiento uniforme.
   2. Una vez completamente descongelado, transfiere inmediatamente el contenido del criovial a un tubo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de MEGM. Centrifuga a 250 × g durante 5 minutos.
2. Agotamiento opcional de fibroblastos
   NOTA: La depleción de fibroblastos por pre-placado es un paso opcional de enriquecimiento utilizado para reducir poblaciones de estromas o fibroblastos que se adheren rápidamente cuando se desea una población inicial más enriquecida en epitelial. Este paso no es necesario para la formación del organoide y puede ajustarse según el objetivo experimental.
   1. Resuspende el pellet con 10 mL de MEGM.
   2. Transfiere el tejido resuspendido a una placa de cultivo celular de 10 cm. Incubar a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ durante 90 minutos para permitir la inserción de fibroblastos.
      NOTA: No molestar el plato de cultivo durante la incubación para asegurar una adherencia eficiente de los fibroblastos.
   3. Recoge las células no adherentes que contienen sobrenadante usando una pipeta serológica de 10 mL mientras inclinas suavemente el plato de cultivo aproximadamente a 45°. Enjuaga suavemente el plato con 5 mL de PBS y combina el enjuague con el sobrenadante recogido.
   4. Centrifugar la suspensión combinada a 250 × g durante 5 minutos para recuperar material enriquecido epitelialmente.
      NOTA: Las células adheridas a la placa se enriquecen para fibroblastos de las glándulas mamarias y pueden propagarse por separado añadiendo un medio compuesto por DMEM + 10% FBS y antibióticos.
3. Disociación opcional a células individuales
   1. Resuspende el pellet en 500 μL de solución enzimática de disociación precalentada (37°C) que contiene un 0,25% de tripsina. Los reactivos alternativos de disociación pueden requerir optimización. Transfiere la suspensión a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Tritura la muestra 20 veces usando una pipeta P1000 para promover la disociación.
      PRECAUCIÓN: Los reactivos enzimáticos de disociación pueden ser perjudiciales. Manipula el uso de un equipo de protección personal adecuado y evita el contacto visual con la piel o los ojos.
   2. Incuba el tubo a 37°C durante 3-5 minutos. Disociar mecánicamente la muestra inmediatamente después de la incubación triturando 20 veces con una pipeta P1000.
   3. Añade 1 mL de medio de lavado que contenga suero para neutralizar la reacción enzimática. Centrifuga a 500 × g durante 5 minutos.
   4. Resuspende el pellet en una solución de dispasa de 300 μL (5 U/mL) y una solución de DNasa de 30 μL (1 mg/mL). Incuba a 37°C durante 3–5 minutos.
   5. Disocia mecánicamente la muestra pipeteando 15–20 veces. Añade 700 μL de medio de lavado que contiene sérum a la suspensión.
   6. Filtra la suspensión de la celda a través de un colador de celda de 40 μm hasta un tubo limpio. Se puede utilizar un colador estándar de celda de 40 μm o un colador con punta de pipeta Flowmi. Los coladores Flowmi pueden reducir la pérdida de muestras cuando trabajan con números celulares limitados.
   7. Determinar el número de células viables usando la exclusión de azul de tripán. Mezclar 10 μL de la suspensión de celdas con azul de tripán en una proporción 1:1 y cargar 10 μL de la mezcla en una cámara de conteo o portaobjetos de conteo. Determinar la viabilidad celular utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro.
   8. Centrifuga la suspensión a 500 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   9. Resuspende la pelota celular en MEGM a la concentración deseada para la siembra de hidrogel.
      NOTA: Para experimentos de siembra de célula única, las entradas típicas oscilan entre aproximadamente 1.000 y 5.000 células por hidrogel de 200 μL, dependiendo del objetivo experimental y de las características de la muestra donante. Las densidades de siembra más bajas se utilizan generalmente para estudios de imagen en vivo y morfogénesis para facilitar el seguimiento del desarrollo individual de organoides, mientras que las densidades más altas se emplean habitualmente para análisis moleculares de puntos finales, incluyendo la recogida de ARN y proteínas.

3. Preparación de hidrogel y siembra de organoides

1. Preparación de stock y cálculos de volumen
   1. Colocar la solución de laminina (1,18 mg/mL), la solución de ácido hialurónico (1 mg/mL en agua estéril), la solución de fibronectina (2 mg/mL en agua estéril) y la PBS 1× sobre hielo antes de su uso. Almacenar alicuotas de laminina y fibronectina a −80°C y almacenar la solución de ácido hialurónico a 4°C. Descongelar los componentes congelados lentamente sobre hielo a 0°C–4°C antes de su uso.
   2. Prepara una solución de suplemento extracelular matriz al 25×. Para preparar 1 mL, combinar 425 μL de laminina, 250 μL de ácido hialurónico, 250 μL de fibronectina y 75 μL de PBS en un tubo mantenido sobre hielo. Mezcla suavemente invirtiendo el tubo 3–4 veces. Guarda la solución a 4°C hasta un mes.
   3. Determina el volumen y la composición final de hidrogel deseados antes de la preparación. Prepara al menos un 20% de volumen excedente para compensar la pérdida de material durante el pipeteo y la transferencia.
      NOTA: La formulación hidrogel consiste en colágeno I, una concentración final de 1× de suplementos de matriz extracelular (de un stock del 25×) y 12,5% (v/v) de hidróxido de sodio de 0,1 N en relación con el volumen de colágeno I para neutralización del pH y polimerización.
      NOTA: Las concentraciones finales de hidrogel son 1,7 mg/mL de colágeno I, 20 μg/mL de laminina, 20 μg/mL de fibronectina y 10 μg/mL de ácido hialurónico.
   4. Calcula el volumen requerido de colágeno I (_colágeno V) usando la siguiente fórmula:
      
      Aquí, C_final  = 1,7 mg/mL, V_total es el volumen final deseado de hidrogel, y C_stock es la concentración de la solución de colágeno. Utiliza concentraciones de colágeno entre 2 y 12 mg/mL.
      NOTA: La concentración de stock de colágeno puede variar entre lotes. Concentraciones más altas aumentan la viscosidad y deben filetearse lentamente.
   5. Calcula el volumen de hidróxido de sodio (V_NaOH) de 0,1 N usando la siguiente fórmula:
      V_NaOH = 0,125 x _{V colágeno}
      Prepara una solución de trabajo de hidróxido de sodio de 0,1 N diluyendo hidróxido de sodio de 1 N en agua estéril.
   6. Calcular el volumen del suplemento de matriz extracelular (V_ES) usando la siguiente fórmula:
      
   7. Calcular el volumen restante que se va a llenar con medio de crecimiento usando la siguiente fórmula:
      _{Medio de crecimiento} V = _{V total} - (_Colágeno V + _{V NaOH} + _{V ES} + _{células V/tejido})
      NOTA: Determinar el volumen de células o fragmentos de tejido para cada experimento individualmente. Utiliza un rango típico de 10–100 μL dentro del volumen permitido. No se realiza un recuento preciso de fragmentos porque el tamaño y la composición del fragmento varían sustancialmente entre preparaciones. Estandarizar la siembra mediante una evaluación visual de la abundancia y distribución de fragmentos.
2. Preparación de la mezcla maestra de hidrogel
   1. Colocar colágeno I, suplemento de matriz extracelular, hidróxido de sodio (0,1 N) y medio de crecimiento sobre hielo a 0°C–4°C. Mantén todos los componentes a baja temperatura para evitar la polimerización prematura.
   2. Añade el volumen calculado de colágeno I a un tubo de microcentrífuga refrigerado.
   3. Añade el volumen calculado del medio de crecimiento preenfriado a la solución de colágeno.
   4. Añade el volumen calculado de 0,1 hidróxido de sodio de N para neutralizar la solución.
      NOTA: La optimización previa estableció que estas condiciones producen el pH adecuado del gel; por lo tanto, no es necesario realizar pruebas rutinarias de pH de la mezcla de hidrogel.
      NOTA: Realizar todos los pasos posteriores rápidamente para evitar la polimerización prematura del colágeno.
   5. Mezcla la solución agitando el tubo vigorosamente a un ritmo aproximado de una agitación por segundo durante al menos 6 agitaciones.
   6. Añade el volumen calculado del suplemento de matriz extracelular a la mezcla.
   7. Añade el volumen calculado de células individuales o fragmentos de tejido usando una pipeta P1000 o una punta de pipeta de gran calibre. Mezcla inmediatamente agitando como se describe en el Paso 3.2.5 y pasa inmediatamente al siguiente paso.
3. Deposición de hidrogel
   1. Pipetear la mezcla de hidrogel en recipientes de cultivo al volumen deseado por pozo. Utilizar 200 μL de hidrogel por pozo para portaobjetos de cámara de 4 pozos, 100 μL por pozo para portaobjetos de cámara de 8 pozos y 20 μL por pozo para placas de 96 pozos.
   2. Extiende el hidrogel en una almohadilla fina sobre la superficie cuando uses las láminas de la cámara. Coloca la punta de la pipeta en el borde central superior del pozo de la cámara y arrastra la punta por la superficie mientras dispensas el gel para crear una almohadilla uniforme. Para placas de 96 pozos, coloca la punta de la pipeta en el centro del pozo manteniendo el contacto con la superficie y dispensa el gel en el centro para mantener una estructura de cúpula. Evita pipetear aire en el gel, ya que esto creará burbujas.
   3. Incubar los recipientes de cultivo a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 durante 60 minutos para permitir la polimerización completa.
      NOTA: Las condiciones de polimerización descritas aquí fueron optimizadas para los formatos de cultivo utilizados en este estudio. Pueden ser necesarios pequeños ajustes en el tiempo de polimerización dependiendo de la geometría del vaso de cultivo, el volumen de hidrogel y las condiciones de incubación.
4. Cultura y mantenimiento
   1. Añade MEGM precalentado a cada pozo. Ajusta el volumen según el formato de cultura utilizado.
   2. Desprende suavemente el hidrogel de la superficie del cultivo usando una punta de pipeta para permitir que el gel flote. Desliza la punta de la pipeta alrededor del perímetro del gel y levanta suavemente por debajo del hidrogel polimerizado para liberarlo de la superficie.
   3. Sustituye el MEGM dos veces por semana por medio fresco y precalentado. Mantener los cultivos en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ durante aproximadamente 3–4 semanas y terminar los cultivos antes de que ocurra el colapso total del hidrogel. Identificar hidrogeles colapsados por la aparición de estructuras densas, opacas y similares a tapones, resultantes de un extenso crecimiento celular dentro del gel (véanse ejemplos representativos en la Figura Suplementaria 1).

Results

La ejecución exitosa de este protocolo da lugar a la formación de estructuras organoides tridimensionales que exhiben morfología epitelial organizada y características arquitectónicas específicas de cada tejido. Los organoides comienzan a formarse entre 3 y 7 días tras la siembra y continúan desarrollándose durante todo el periodo de cultivo. La caracterización previa de este sistema organoide hidrogel demostró la formación reproducible de organoides en múltiples donantes humanos primarios^{independientes 3}. En ese estudio, se evaluaron células epiteliales primarias aisladas de 12 donantes de mamoplastia reductora libre de enfermedad, y 11 de 12 muestras de donantes generaron con éxito organoides bajo las condiciones de cultivo descritas. Entre los donantes, el número medio de estructuras organoides formadas por cada 100 células sembradas fue de 1,775 (IC 95%: 0,45–4,10). Aunque se observó una variabilidad significativa entre donantes en la eficiencia de formación de organoides y la dinámica del crecimiento, se generaron de forma reproducible morfologías ductal-lobular y acinar entre donantes.

Los organoides mamarios derivados de células epiteliales individuales muestran morfogénesis progresiva, formando estructuras ramificadas al día 21 de cultivo (Figura 2). Estas estructuras se caracterizan por proyecciones alargadas y organización multicelular. Los organoides mostraron áreas proyectadas que iban de 10.000 a 90.000^{μm 2} para el día 18, con valores de circularidad inferiores a 0,3, calculados como 4π × (Área/Perímetro²)^3,9. Los organoides derivados de fragmentos tisulares suelen formar estructuras superiores a 90.000^μm2 al día 18, mientras que los organoides derivados de fragmentos tumorales formaron estructuras más densas e irregulares con una organización reducida y proyecciones radiales aumentadas, consistentes con un comportamiento de crecimiento alterado.

Los organoides derivados de fragmentos epiteliales de glándulas salivales y riñones también presentan morfologías distintas bajo las mismas condiciones de hidrogel (Figura 2). Los organoides de las glándulas salivales forman estructuras compactas en los primeros momentos (día 3), mientras que los organoides renales desarrollan morfologías alargadas y asimétricas al día 17. Estas observaciones se incluyen para demostrar la mayor adaptabilidad del sistema organoide basado en hidrogel más allá del tejido mamario e ilustrar su capacidad para apoyar la formación de organoides a partir de múltiples fuentes de tejido epitelial.

La inmunotinción y los análisis moleculares realizados^{previamente 3,5,8} demostraron la presencia de marcadores de linaje epitelial, incluyendo los marcadores luminales KRT8, KRT18, KRT19, E-cadherina, GATA3, JAG1, Notch1 y MUC1, así como los marcadores basales o mioepiteliales KRT5, KRT14, Slug, SOX9 y TP63, indicando la preservación de la heterogeneidad epitelial dentro de los organoides. Las características estructurales consistentes con la organización de unidades similares a las de lóbulo ductal terminal fueron observadas mediante microscopía confocal y reconstrucción tridimensional, y se definieron como estructuras que contenían regiones ductales alargadas conectadas a gemmas terminales similares a lóbulos o alveolares que se asemejan a la organización de las unidades lobulares terminales lobulares terminales humanas nativas. Estas estructuras también exhibieron organización epitelial estratificada con patrones celulares luminales y basales consistentes con análisis previamente publicados de esta plataforma³.

Se observó un compartimento similar a mesénquimo asociado y entre estructuras epiteliales y se caracterizó por comportamiento migratorio y expresión de marcadores como VIM, SNAI1, ZEB1, S100A, CD90 y FAPα. Junto con los análisis de microscopía en lapso de tiempo, estas observaciones apoyan la aparición de un microentorno de apoyo dentro del sistema de^{cultivo 3}.

Es importante destacar que este protocolo pretende proporcionar un marco metodológico ampliamente adaptable en lugar de establecer un único referente biológico fijo. Los resultados cuantitativos, incluyendo la eficiencia de formación de organoides, tamaño, complejidad de ramificación y composición celular, pueden variar según la fuente donante, el estado menopáusico, el material de partida (por ejemplo, fragmentos de tejido frente a células individuales) y condiciones experimentales.

Los resultados subóptimos incluyen una reducción en la eficiencia de formación de organoides (<1 organoide por cada 500 células sembradas), exceso de residuos celulares, fallo en la polimerización del colágeno o falta de establecimiento de estructuras organizadas. Estos resultados suelen asociarse con baja viabilidad celular, disociación incompleta del tejido, composición incorrecta del hidrogel o neutralización inadecuada del pH.

El análisis cuantitativo del desarrollo de organoides puede realizarse utilizando imágenes en vivo y enfoques de alto contenido para medir el número de organoides, la distribución de tamaño, el comportamiento de ramificación, la complejidad estructural y la dinámica celular. Estudios previos que utilizaron esta plataforma realizaron imágenes longitudinales en vivo, seguimiento celular, análisis morfométrico y estudios de perturbaciones genéticas para cuantificar la dinámica del crecimiento de los organoides y el comportamiento del linaje a lo largo del^{tiempo 3,5}. La imagen se realizó mediante microscopía confocal y el análisis de imagen con el software NIS-Elements.

Figura suplementaria 1. Ejemplo representativo de un hidrogel colapsado durante un cultivo organoide a largo plazo en el día 18. Los hidrogeles colapsados aparecen como estructuras densas, opacas y similares a tapones, resultado de un extenso crecimiento celular y contracción de la matriz. Estas características morfológicas se utilizaron como criterios para terminar los cultivos antes del colapso completo del hidrogel. Barra de escala = 500 μm. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El protocolo descrito aquí permite la generación reproducible de organoides mamarios humanos tridimensionales dentro de un microambiente de hidrogel definido que apoya características clave de la morfogénesis^{mamaria 3}. Varios pasos son fundamentales para el éxito de este método. En primer lugar, el procesamiento tisular y la disociación enzimática deben controlarse cuidadosamente para preservar la viabilidad epitelial minimizando la sobredigestión, lo que puede reducir el rendimiento celular y perjudicar la morfogénesis^{posterior 10}. En particular, tratamientos enzimáticos breves y secuenciales, combinados con una disociación mecánica suave, son esenciales para mantener poblaciones epiteliales funcionales. En segundo lugar, la preparación de hidrogel requiere un control preciso de la concentración de colágeno, el pH y el tiempo¹¹. La neutralización del colágeno inicia la polimerización; Por lo tanto, todos los pasos posteriores a la adición de hidróxido de sodio deben realizarse rápidamente y sobre hielo para asegurar una formación constante del gel. La polimerización incompleta o retardada puede dar lugar a hidrogeles mal estructurados o colapsados que no favorecen el desarrollo de organoides. Finalmente, la densidad de siembra debe optimizarse empíricamente para cada muestra donante, ya que una carga excesiva de tejido o célula puede provocar una contracción rápida del gel y pérdida de integridad^{estructural 12}.

Varias consideraciones de solución de problemas pueden mejorar la reproducibilidad. La formación deficiente de organoides puede deberse a baja viabilidad celular, composición hidroóptima de hidrogel o manipulación inadecuada del gel durante la deposición¹³. Garantizar que las reservas de colágeno se mantengan a 4°C y no hayan sufrido una polimerización prematura es esencial para una calidad constante^{del gel 11}. Además, el desprendimiento exitoso de hidrogeles de la superficie de cultivo tras la polimerización sirve como indicador de la correcta formación del gel; El fallo en el desprendimiento suele reflejar una polimerización incompleta o condiciones superficiales^{inapropiadas 14}. Se espera variabilidad en el tamaño y morfología del organoide entre muestras de donantes y refleja heterogeneidad biológica más que fallo técnico. Estudios previos que utilizaron esta plataforma demostraron la formación reproducible de organoides en un amplio conjunto de donantes humanos primarios independientes a pesar de la considerable variabilidad entre donantes en la eficiencia de formación de organoides y la^{morfogénesis 3}.

Este método tiene varias limitaciones. Aunque el modelo apoya la aparición de un compartimento similar a un mesenquima junto a estructuras epiteliales, no recapitula completamente la complejidad del microambiente estromal, inmune y vascular in vivo. La composición del hidrogel, aunque definida, representa una matriz extracelular simplificada y puede no captar todas las señales biomecánicas o bioquímicas presentes en el tejido^{nativo 15,16}. Además, la variabilidad de donante a donante puede influir en la dinámica y morfología del crecimiento de los organoides, lo que requiere optimización empírica para aplicaciones específicas. A pesar de estas limitaciones, la capacidad de este sistema para apoyar la autoorganización y las interacciones endógenas epitelial-mesenquimalesa representa un avance significativo respecto a muchos modelos de cultivo^existentes.

En comparación con los sistemas basados en extractos de membrana basal comúnmente utilizados, este enfoque proporciona un mayor control sobre la composición de la matriz extracelular y reduce la variabilidad asociada a materiales^{indefinidos 17}. Estudios previos que compararon directamente esta plataforma de hidrogel con sistemas organoides basados en Matrigel demostraron diferencias sustanciales en la organización tisular y la composición^{celular 3,8}. Los organoides cultivados en hidrogel se parecían más al tejido mamario humano nativo tanto a nivel morfológico como transcriptómico, preservando poblaciones epiteliales multilineales, incluyendo compartimentos luminales, basales, progenitores y mesenquimales, mientras que los organoides cultivados en Matrigel estaban dominados por estados híbridos proliferativos similares a la basal y carecían de poblaciones estromales. Además, a diferencia de los sistemas de cocultivo que dependen de la adición de células estromales exógenas, este modelo permite la aparición intrínseca de un compartimento tipo mesénquima de soporte, lo que permite estudiar las interacciones epitelial-microambiente en un contexto más relevante fisiológicamente y menos artificialmente diseñado. Las poblaciones emergentes de tipo mesenquimatose dentro de los hidrogeles fueron previamente validadas mediante imágenes en vivo complementarias, inmunotinción y análisis transcriptómicos^{unicelulares.} Estos estudios demostraron la aparición de células estromales altamente móviles que expresan marcadores mesenquimales y asociados a la transición epitelio-mesenquimal, incluyendo Vimentin, THY1/CD90, FAP, S100A4, ZEB1 y Snail, junto con interacciones recíprocas de señalización epitelial-mesenquimal, identificadas mediante análisis ligando-receptor. Estas características hacen que el sistema sea especialmente adecuado para investigar procesos que dependen de la arquitectura tisular y la comunicación célula-célula, incluyendo la morfogénesis, la plasticidad epitelial y la remodelación temprana de^{tejidos 4,5}.

La plataforma descrita tiene amplias aplicaciones en la investigación básica y traslacional. Puede utilizarse para estudiar el desarrollo mamario humano, modelar eventos tempranos en el inicio de la enfermedad y evaluar los efectos de perturbaciones moleculares o ambientales en la organización del tejido. Estudios previos que utilizaron esta plataforma demostraron que la perturbación funcional de reguladores del desarrollo como DDR1 y RUNX1 altera la diferenciación de linaje, la organización epitelial y la morfogénesis ductal-lobular en la cultura^{tridimensional 5,18}. La compatibilidad con la imagen cuantitativa y el análisis de alto contenido permite además una investigación sistemática de los resultados fenotípicos, incluyendo cambios en el tamaño, estructura y complejidad del organoide. Por ello, este método proporciona una plataforma escalable y biológicamente relevante para estudiar la organización de tejidos humanos y su interrupción en contextos relacionados con enfermedades.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos cónicos de 15 mL	VWR	89039-664	Tubos estériles para procesamiento de tejidos y centrifugación
40 & mu; Colador de células M	VWR	732-2757	Dispositivo de filtración para la preparación de la suspensión de una sola célula
40 & mu; Colador de células M para volúmenes bajos	Bel-Art	136800040	Dispositivo de filtración para la preparación de la suspensión de una sola célula
Contador automático de celdas	Bio-Rad	1450102	Dispositivo utilizado para contar celdas y determinar la viabilidad
Extracto de la hipófisis bovina	Termo Científica	13028014	Suplemento para medios celulares epiteliales
Diapositivas de conteo de células	Bio-Rad	145-0011	Portaobjetos de doble cámara usados para el recuento de células
Centrifugadora	N/A	N/A	Las centrifugadoras de sobremesa deben tener al menos una capacidad de velocidad de 500 x g y capacidad para tubos de 15 mL y 1,5 mL.
Colágeno I	Millipore Sigma	08-115	Proteína de matriz extracelular utilizada para la formación de hidrogel
Colagenasa A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzima utilizada para la disociación tisular
Crioviales	Corning	976171	Viales estériles para almacenamiento criogénico de muestras
Vasos de cultivo (por ejemplo, portaobjetos de cámara, placas multipozo)	Corning	354104 354108 3603	Plataformas para la deposición de hidrogel y el cultivo de organoides.
Dimetilsulfóxido	Millipore Sigma	317275	Crioprotector utilizado en medio congelante
Dispasa II	Roche	4942078001	Enzima utilizada para la disociación secundaria de tejidos
DNasa I	Roche	10104159001	Enzima utilizada durante la disociación celular.
Suero fetal bovino	Gibco	10437	Suplemento sérico utilizado en medios de lavado y neutralización
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F2006	Componente proteico de matriz extracelular
GlutaMAX	Termo Científica	35050061	Suplemento para medios celulares epiteliales
Factor de crecimiento epidérmico humano	Sigma-Aldrich	E9644	Suplemento para medios celulares epiteliales
Hidrocortisona	Sigma-Aldrich	H0888	Suplemento para medios celulares epiteliales
Ácido hialurónico	Millipore Sigma	385908	Componente de matriz extracelular para formulación de hidrogel
Hialuronidasa	Sigma-Aldrich	H3506	Enzima utilizada para la disociación tisular
Incubadora	Termo Científica	3598	Dispositivo utilizado para incubación de cultivos de tejidos
Insulina	Sigma-Aldrich	I9278	Suplemento para medios celulares epiteliales
Laminina	Gibco	23017-015	Componente proteico de matriz extracelular
Medio basal epitelial mamario	Termo Científica	M171500	Medio de crecimiento para células epiteliales
Tubos microcentrífugas (1,5 mL)	Termo Científica	3451	Tubos utilizados para reacciones de pequeño volumen
Rotador orbital	Termo Científica	400110	Rotador utilizado para la dispersión tisular durante la disociación enzimática
Pipeta P1000	Gilson	P1000	Dispositivo utilizado para mezclar y transferir volúmenes de hasta 1.000 y mu; L
Penicilina-estreptomicina	Termo Científica	15140122	Suplemento antibiótico para medios celulares epiteliales
Solución salina tamponada con fosfato	Gibco	20012-027	Solución tampón utilizada para lavar y enjuagar
Equilibrio de precisión	Mettler Toledo	ML303E	Balanza utilizada para pesar tejidos
Pipeta serológica	Nunc	170356N	Pipeta utilizada para la extracción de células epiteliales no adherentes
Hidróxido de sodio (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reactivo utilizado para la neutralización del colágeno
Bisturís estériles	Bard-Parker	372615	Herramientas utilizadas para la picada mecánica de tejidos
Solución azul de tripán	Gibco	15250061	Colorante utilizado para la evaluación de la viabilidad celular
Tripsina (0,25%)	Gibco	25200056	Reactivo enzimático utilizado para la disociación celular
Baños de agua (37 y grados; C)	VWR	10LA	Dispositivo utilizado para el descongelamiento controlado de muestras