Un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos tridimensionales que recapitulan la morfogénesis mamaria

Resumen

Este protocolo describe un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos que recapitulan características clave de la morfogénesis mamaria en un sistema de cultivo tridimensional controlado.

Resumen

El desarrollo de sistemas modelo humanos fisiológicamente relevantes que recapitulen la arquitectura tisular y la dinámica del estado celular sigue siendo un gran desafío en el estudio del desarrollo mamario y los primeros eventos en la carcinogénesis. Los cultivos bidimensionales convencionales y muchos sistemas tridimensionales no logran captar la organización estructural y las señales microambientales que definen la glándula mamaria humana. Aquí describimos un método reproducible para generar organoides mamarios humanos tridimensionales a partir de células epiteliales primarias incrustadas en una matriz hidrogel definida compuesta por colágeno tipo I, laminina, fibronectina y ácido hialurónico. Este sistema apoya la progresión de células individuales a través de etapas clave de la morfogénesis mamaria, incluyendo la expansión de los progenitores, el patrón epitelial y la formación de estructuras terminales en forma de unidad lobular ductal, así como la aparición de un compartimento similar a mesénquima, durante un periodo de cultivo de 21 días. Ofrecemos un protocolo paso a paso para la preparación de hidrogel, la siembra celular y las condiciones de cultivo. El método es compatible con imágenes de alto contenido y análisis cuantitativo del número de organoides, la distribución de tamaño y la complejidad arquitectónica. Esta plataforma permite estudios mecanicistas de la plasticidad epitelial y las perturbaciones ambientales, proporcionando un sistema escalable y biológicamente relevante para investigar los cambios tempranos a nivel de tejido asociados al riesgo de cáncer de mama.

Introducción

Comprender el desarrollo de las glándulas mamarias humanas y los primeros eventos que predisponen el tejido a la transformación maligna requiere sistemas experimentales que recapitulen fielmente la arquitectura tisular, la jerarquía celular y la señalización microambiental. Aunque las culturas epiteliales bidimensionales han proporcionado importantes conocimientos mecanicistas, carecen del contexto estructural necesario para modelar la organización epitelial y la^{morfogénesis 1}. Los sistemas de cultivo tridimensionales existentes, incluidos los basados en extractos de membrana basal, han avanzado en el campo pero siguen limitados por la composición variable, el control incompleto sobre los componentes de la matriz extracelular y el soporte inconsistente de la arquitectura tisular^{de orden superior.} Además, muchos sistemas organoides basados en extractos de membrana basal están limitados por su incapacidad para soportar consistentemente la aparición de una organización similar a tejido¹. En particular, muchos sistemas dependen de componentes estromales exógenos en lugar de permitir el desarrollo endógeno de microambientes de soporte, limitando así su capacidad para modelar las interacciones epitelial-mesenquimales, que son centrales para el desarrollo tisular y la enfermedad. Estas limitaciones restringen el estudio reproducible de los procesos del desarrollo, la plasticidad epitelial y los efectos de perturbaciones ambientales o moleculares en la organización tisular.

Para abordar estas limitaciones, desarrollamos un modelo tridimensional definido de organoides mamarios humanos basado en hidrogel que permite a las células epiteliales primarias generar estructuras organizadas dentro de una matriz extracelular^definida 2,3,4,5,8. El hidrogel está compuesto por colágeno tipo I, laminina, fibronectina y ácido hialurónico, componentes seleccionados según sus roles establecidos en el desarrollo de las glándulas mamarias y la morfogénesis epitelial. Estas moléculas de la matriz extracelular interactúan con receptores celulares distintos, incluyendo integrinas, receptores de dominio discoidin, CD44 y RHAMM, y se sabe que regulan la polaridad epitelial, la morfogénesis ramificada, el mantenimiento de células madre, la mecanotransducción y la organización tisular en la glándula mamaria ^6,7. Estudios previos que describían este sistema hidrogel demostraron que la incorporación de estos componentes de la matriz extracelular mejoró notablemente la morfogénesis ductal-lobular y la maduración epitelial en comparación con condiciones basadas solo en colágeno o basadas en^matrigeles. Además, las propiedades físicas de esta formulación de hidrogel se caracterizaban previamente por microscopía de fuerza atómica, demostrando que el hidrogel de matriz extracelular compuesta presentaba menor rigidez y aumento de la hinchazón en comparación con los geles solo de colágeno (módulo de Young: 256,7 ± 20,0 Pa frente a 559,2 ± 204,0 Pa, respectivamente), consistente con un entorno de matriz más blando e^{hidratado 8}.

Es importante destacar que este modelo apoya la aparición de un compartimento similar a un mesenquima que surge junto a las estructuras epiteliales, proporcionando un soporte estructural y de señalización endógeno que refleja más de cerca la organización tisular^{nativa 3}. La relevancia fisiológica de este sistema hidrogel ha sido evaluada mediante comparaciones directas con cultivos organoides convencionales basados en matrigel, utilizando análisis morfológicos y transcriptómicos. Estudios anteriores demostraron que los cultivos de hidrogel apoyaban una formación de tejido ductal-lobular más organizada y una diferenciación multilineal que los cultivos basados en Matrigel, al tiempo que preservaban la respuesta^{hormonal 8}. Más recientemente, análisis integrados de secuenciación de ARN unicelular comparando organoides derivados de hidrogel, organoides cultivados en Matrigel y tejido mamario humano primario demostraron que los organoides cultivados en hidrogel recapitulan con mayor fidelidad la jerarquía epitelial, la diversidad celular y las interacciones epitelio-mesenquimales presentes en el tejido mamario humano^{nativo 3}. En contraste, los organoides cultivados en Matrigel se enriquecieron para estados basales híbridos proliferativos y carecieron de poblaciones similares a estromas, lo cual era compatible con el autoensamblaje epitelial en lugar de la organogénesis dirigida.

El protocolo descrito aquí proporciona un método reproducible y escalable para generar organoides a partir de tejido humano primario, con pasos opcionales para la depleción y disociación de fibroblastos a células individuales. Debido a que esta plataforma es compatible con imágenes en vivo, imágenes de alto contenido, análisis morfométrico cuantitativo, seguimiento celular y estudios de perturbación genética, puede integrarse con enfoques posteriores que evalúan el número de organoides, tamaño, arquitectura y dinámica de crecimiento. Por tanto, esta plataforma proporciona un sistema biológicamente relevante para estudiar el desarrollo mamario humano, la plasticidad epitelial, las interacciones epitelial-microambiente y las respuestas a nivel tisular ante perturbaciones del desarrollo, moleculares o ambientales.

En la Figura 1 se ofrece una visión esquemática del flujo de trabajo, incluyendo procesamiento de tejidos, preparación de hidrogeles, cultivo de organoides, progresión del desarrollo y análisis posteriores, mientras que las morfologías organoides representativas generadas con esta plataforma se muestran en la Figura 2.

Figura 1. Visión general del flujo de trabajo de generación de organoides a base de hidrogel. (A) Diagrama de flujo que resume el flujo de trabajo del protocolo, incluyendo recogida de tejidos, procesamiento de tejidos, criopreservación, recuperación y preparación celular opcional, preparación de hidrogel, cultivo de organoides, desarrollo de organoides y aplicaciones analíticas posteriores. (B) Esquema visual que representa las principales etapas del protocolo de generación de organoides a base de hidrogel, incluyendo procesamiento y preparación de tejidos, recuperación y preparación opcional de células, preparación de hidrogel y siembra de organoides. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2. Morfologías organoides representativas generadas en el sistema hidrogel definido. Imágenes representativas en campo claro de organoides derivadas de diferentes tejidos humanos cultivados en la matriz de hidrogel definida. Los organoides mamarios generados a partir de células epiteliales individuales derivadas de la mamoplastia reductora fueron fotografiados en el día 21 de cultivo. Los organoides xenoinjertos derivados del paciente generados a partir de fragmentos tumorales se imaginaron en el día 16 de cultivo. Los organoides de las glándulas salivales generados a partir de fragmentos epiteliales se imarjaron en el tercer día de cultivo. Los organoides renales generados a partir de fragmentos epiteliales se imagaron en el día 17 de cultivo. Barras de escala = 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Protocolo

Los tejidos primarios que de otro modo se habrían descartado como residuos médicos tras la cirugía se obtuvieron cumpliendo con todas las leyes pertinentes, utilizando protocolos aprobados por los comités de revisión institucional del Maine Medical Center y del Tufts Medical Center. Todos los tejidos fueron anonimizados antes de la transferencia y no se pudieron rastrear hasta pacientes específicos. Por esta razón, esta investigación obtuvo el estatus de exención por parte del Comité sobre el Uso de Humanos como Sujetos Experimentales del Instituto Tecnológico de Massachusetts y de Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Todos los pacientes inscritos en este estudio firmaron un formulario de consentimiento informado aceptando participar en el estudio y la publicación de los resultados.

1. Procesamiento y preparación de tejidos

NOTA: Realizar todos los procedimientos relacionados con tejido humano de acuerdo con las directrices institucionales de bioseguridad y ética. Consulte los esquemas del flujo de trabajo mostrados en las Figuras 1A y 1B para una visión visual de los pasos del protocolo y del flujo de trabajo de preparación del organoide antes de comenzar el procedimiento.

1. Preparar MEGM utilizando medio basal epitelial mamario suplementado con extracto de hipófisis bovina de 52 μg/mL, 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico humano, 5 μg/mL de insulina, 500 ng/mL de hidrocortisona, 1% (v/v) de GlutaMAX y 1% (v/v) antibiótico-antimicótico (100X).
2. Prepara el medio de disociación añadiendo 1,5 mg/mL de colagenasa A (almacenada a −20°C) y 100 U/mL de hialuronidasa (almacenada a 4°C) al medio epitelial mamario (MEGM).
3. Recibir tejido mamario humano obtenido de mastectomías profilácticas y mamoplastias de reducción dentro de las 24 horas posteriores a la extirpación, no fijado en solución salina con fosfato tamponado (PBS) y mantenido a 4°C. Pesa el tejido con una balanza de precisión para determinar el peso total del tejido.
4. Coloca el tejido en un armario de bioseguridad estéril. Pica mecánicamente el tejido en fragmentos de 3–5^mm 3 usando bisturí estéril. Transfiere aproximadamente 2–3 g de tejido picado a un tubo cónico de 15 mL. Añade 10 mL de medio de disociación a cada tubo.
5. Incubar los tubos a 37°C en un rotador orbital a 8 rpm durante 12–18 horas para digerir enzimáticamente el tejido. Considera la digestión completa cuando no quedan grandes fragmentos de tejido y se puede ver una suspensión homogénea de material fragmentado uniformemente en todo el medio.
6. Deja que los fragmentos epiteliales se asienten por gravedad durante 5 minutos. Confirma que no quedan fragmentos visibles suspendidos en el medio y que hay un pellet distinto presente. Decanta cuidadosamente y desecha el sobrenadante sin mover la bola.
   NOTA: El sobrenadante contiene células estromales y componentes de la matriz, y puede lavarse y utilizarse o preservarse para otros estudios.
7. Resuspende el pellet en un medio de lavado de 10 mL que contiene un 5% de suero fetal bovino (FBS) en PBS. Centrifuga a 250 × g durante 5 minutos en una centrífuga oscilante a temperatura ambiente.
8. Repite el paso de lavado tres veces más o hasta que el sobrenadante esté limpio y libre de restos visibles.
9. Resuspende el pellet final en un medio congelante que contiene 10% de dimetil sulfóxido (DMSO) en MEGM a un volumen de 1 mL por gramo de peso tisular inicial.
   PRECAUCIÓN: El DMSO es perjudicial al contacto o inhalación. Manejar el uso de equipos de protección individual adecuados y trabajar con una capucha de seguridad química si lo requieren las directrices institucionales.
10. Alicuota 1 mL de la suspensión en cada criovial. Coloque los crioviales a −80°C en un recipiente congelante antes de almacenarlos a largo plazo en nitrógeno líquido.
    NOTA: Este paso representa un punto de pausa. Almacenar muestras a −80°C antes de transferirlas a condiciones de almacenamiento a largo plazo.

2. Recuperación y preparación celular opcional

1. Deshielo y recuperación inicial
   1. Retira el tejido criopreservado del almacenamiento a −80°C tras congelarlo durante al menos 24 horas, o del nitrógeno líquido almacenado a largo plazo. Sumerge inmediatamente el cryovial hasta la tapa en un baño de maria a 37°C y descongela rápidamente durante 1 minuto para minimizar la muerte celular.
      NOTA: Agita suavemente el cryovial durante el descongelamiento para asegurar un calentamiento uniforme.
   2. Una vez completamente descongelado, transfiere inmediatamente el contenido del criovial a un tubo cónico de 15 mL que contiene 10 mL de MEGM. Centrifuga a 250 × g durante 5 minutos.
2. Agotamiento opcional de fibroblastos
   NOTA: La depleción de fibroblastos por pre-placado es un paso opcional de enriquecimiento utilizado para reducir poblaciones de estromas o fibroblastos que se adheren rápidamente cuando se desea una población inicial más enriquecida en epitelial. Este paso no es necesario para la formación del organoide y puede ajustarse según el objetivo experimental.
   1. Resuspende el pellet con 10 mL de MEGM.
   2. Transfiere el tejido resuspendido a una placa de cultivo celular de 10 cm. Incubar a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ durante 90 minutos para permitir la inserción de fibroblastos.
      NOTA: No molestar el plato de cultivo durante la incubación para asegurar una adherencia eficiente de los fibroblastos.
   3. Recoge las células no adherentes que contienen sobrenadante usando una pipeta serológica de 10 mL mientras inclinas suavemente el plato de cultivo aproximadamente a 45°. Enjuaga suavemente el plato con 5 mL de PBS y combina el enjuague con el sobrenadante recogido.
   4. Centrifugar la suspensión combinada a 250 × g durante 5 minutos para recuperar material enriquecido epitelialmente.
      NOTA: Las células adheridas a la placa se enriquecen para fibroblastos de las glándulas mamarias y pueden propagarse por separado añadiendo un medio compuesto por DMEM + 10% FBS y antibióticos.
3. Disociación opcional a células individuales
   1. Resuspende el pellet en 500 μL de solución enzimática de disociación precalentada (37°C) que contiene un 0,25% de tripsina. Los reactivos alternativos de disociación pueden requerir optimización. Transfiere la suspensión a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL. Tritura la muestra 20 veces usando una pipeta P1000 para promover la disociación.
      PRECAUCIÓN: Los reactivos enzimáticos de disociación pueden ser perjudiciales. Manipula el uso de un equipo de protección personal adecuado y evita el contacto visual con la piel o los ojos.
   2. Incuba el tubo a 37°C durante 3-5 minutos. Disociar mecánicamente la muestra inmediatamente después de la incubación triturando 20 veces con una pipeta P1000.
   3. Añade 1 mL de medio de lavado que contenga suero para neutralizar la reacción enzimática. Centrifuga a 500 × g durante 5 minutos.
   4. Resuspende el pellet en una solución de dispasa de 300 μL (5 U/mL) y una solución de DNasa de 30 μL (1 mg/mL). Incuba a 37°C durante 3–5 minutos.
   5. Disocia mecánicamente la muestra pipeteando 15–20 veces. Añade 700 μL de medio de lavado que contiene sérum a la suspensión.
   6. Filtra la suspensión de la celda a través de un colador de celda de 40 μm hasta un tubo limpio. Se puede utilizar un colador estándar de celda de 40 μm o un colador con punta de pipeta Flowmi. Los coladores Flowmi pueden reducir la pérdida de muestras cuando trabajan con números celulares limitados.
   7. Determinar el número de células viables usando la exclusión de azul de tripán. Mezclar 10 μL de la suspensión de celdas con azul de tripán en una proporción 1:1 y cargar 10 μL de la mezcla en una cámara de conteo o portaobjetos de conteo. Determinar la viabilidad celular utilizando un contador celular automatizado o un hemocitómetro.
   8. Centrifuga la suspensión a 500 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   9. Resuspende la pelota celular en MEGM a la concentración deseada para la siembra de hidrogel.
      NOTA: Para experimentos de siembra de célula única, las entradas típicas oscilan entre aproximadamente 1.000 y 5.000 células por hidrogel de 200 μL, dependiendo del objetivo experimental y de las características de la muestra donante. Las densidades de siembra más bajas se utilizan generalmente para estudios de imagen en vivo y morfogénesis para facilitar el seguimiento del desarrollo individual de organoides, mientras que las densidades más altas se emplean habitualmente para análisis moleculares de puntos finales, incluyendo la recogida de ARN y proteínas.

3. Preparación de hidrogel y siembra de organoides

1. Preparación de stock y cálculos de volumen
   1. Colocar la solución de laminina (1,18 mg/mL), la solución de ácido hialurónico (1 mg/mL en agua estéril), la solución de fibronectina (2 mg/mL en agua estéril) y la PBS 1× sobre hielo antes de su uso. Almacenar alicuotas de laminina y fibronectina a −80°C y almacenar la solución de ácido hialurónico a 4°C. Descongelar los componentes congelados lentamente sobre hielo a 0°C–4°C antes de su uso.
   2. Prepara una solución de suplemento extracelular matriz al 25×. Para preparar 1 mL, combinar 425 μL de laminina, 250 μL de ácido hialurónico, 250 μL de fibronectina y 75 μL de PBS en un tubo mantenido sobre hielo. Mezcla suavemente invirtiendo el tubo 3–4 veces. Guarda la solución a 4°C hasta un mes.
   3. Determina el volumen y la composición final de hidrogel deseados antes de la preparación. Prepara al menos un 20% de volumen excedente para compensar la pérdida de material durante el pipeteo y la transferencia.
      NOTA: La formulación hidrogel consiste en colágeno I, una concentración final de 1× de suplementos de matriz extracelular (de un stock del 25×) y 12,5% (v/v) de hidróxido de sodio de 0,1 N en relación con el volumen de colágeno I para neutralización del pH y polimerización.
      NOTA: Las concentraciones finales de hidrogel son 1,7 mg/mL de colágeno I, 20 μg/mL de laminina, 20 μg/mL de fibronectina y 10 μg/mL de ácido hialurónico.
   4. Calcula el volumen requerido de colágeno I (_colágeno V) usando la siguiente fórmula:
      
      Aquí, C_final  = 1,7 mg/mL, V_total es el volumen final deseado de hidrogel, y C_stock es la concentración de la solución de colágeno. Utiliza concentraciones de colágeno entre 2 y 12 mg/mL.
      NOTA: La concentración de stock de colágeno puede variar entre lotes. Concentraciones más altas aumentan la viscosidad y deben filetearse lentamente.
   5. Calcula el volumen de hidróxido de sodio (V_NaOH) de 0,1 N usando la siguiente fórmula:
      V_NaOH = 0,125 x _{V colágeno}
      Prepara una solución de trabajo de hidróxido de sodio de 0,1 N diluyendo hidróxido de sodio de 1 N en agua estéril.
   6. Calcular el volumen del suplemento de matriz extracelular (V_ES) usando la siguiente fórmula:
      
   7. Calcular el volumen restante que se va a llenar con medio de crecimiento usando la siguiente fórmula:
      _{Medio de crecimiento} V = _{V total} - (_Colágeno V + _{V NaOH} + _{V ES} + _{células V/tejido})
      NOTA: Determinar el volumen de células o fragmentos de tejido para cada experimento individualmente. Utiliza un rango típico de 10–100 μL dentro del volumen permitido. No se realiza un recuento preciso de fragmentos porque el tamaño y la composición del fragmento varían sustancialmente entre preparaciones. Estandarizar la siembra mediante una evaluación visual de la abundancia y distribución de fragmentos.
2. Preparación de la mezcla maestra de hidrogel
   1. Colocar colágeno I, suplemento de matriz extracelular, hidróxido de sodio (0,1 N) y medio de crecimiento sobre hielo a 0°C–4°C. Mantén todos los componentes a baja temperatura para evitar la polimerización prematura.
   2. Añade el volumen calculado de colágeno I a un tubo de microcentrífuga refrigerado.
   3. Añade el volumen calculado del medio de crecimiento preenfriado a la solución de colágeno.
   4. Añade el volumen calculado de 0,1 hidróxido de sodio de N para neutralizar la solución.
      NOTA: La optimización previa estableció que estas condiciones producen el pH adecuado del gel; por lo tanto, no es necesario realizar pruebas rutinarias de pH de la mezcla de hidrogel.
      NOTA: Realizar todos los pasos posteriores rápidamente para evitar la polimerización prematura del colágeno.
   5. Mezcla la solución agitando el tubo vigorosamente a un ritmo aproximado de una agitación por segundo durante al menos 6 agitaciones.
   6. Añade el volumen calculado del suplemento de matriz extracelular a la mezcla.
   7. Añade el volumen calculado de células individuales o fragmentos de tejido usando una pipeta P1000 o una punta de pipeta de gran calibre. Mezcla inmediatamente agitando como se describe en el Paso 3.2.5 y pasa inmediatamente al siguiente paso.
3. Deposición de hidrogel
   1. Pipetear la mezcla de hidrogel en recipientes de cultivo al volumen deseado por pozo. Utilizar 200 μL de hidrogel por pozo para portaobjetos de cámara de 4 pozos, 100 μL por pozo para portaobjetos de cámara de 8 pozos y 20 μL por pozo para placas de 96 pozos.
   2. Extiende el hidrogel en una almohadilla fina sobre la superficie cuando uses las láminas de la cámara. Coloca la punta de la pipeta en el borde central superior del pozo de la cámara y arrastra la punta por la superficie mientras dispensas el gel para crear una almohadilla uniforme. Para placas de 96 pozos, coloca la punta de la pipeta en el centro del pozo manteniendo el contacto con la superficie y dispensa el gel en el centro para mantener una estructura de cúpula. Evita pipetear aire en el gel, ya que esto creará burbujas.
   3. Incubar los recipientes de cultivo a 37°C en una incubadora humidificada con 5% de_CO2 durante 60 minutos para permitir la polimerización completa.
      NOTA: Las condiciones de polimerización descritas aquí fueron optimizadas para los formatos de cultivo utilizados en este estudio. Pueden ser necesarios pequeños ajustes en el tiempo de polimerización dependiendo de la geometría del vaso de cultivo, el volumen de hidrogel y las condiciones de incubación.
4. Cultura y mantenimiento
   1. Añade MEGM precalentado a cada pozo. Ajusta el volumen según el formato de cultura utilizado.
   2. Desprende suavemente el hidrogel de la superficie del cultivo usando una punta de pipeta para permitir que el gel flote. Desliza la punta de la pipeta alrededor del perímetro del gel y levanta suavemente por debajo del hidrogel polimerizado para liberarlo de la superficie.
   3. Sustituye el MEGM dos veces por semana por medio fresco y precalentado. Mantener los cultivos en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ durante aproximadamente 3–4 semanas y terminar los cultivos antes de que ocurra el colapso total del hidrogel. Identificar hidrogeles colapsados por la aparición de estructuras densas, opacas y similares a tapones, resultantes de un extenso crecimiento celular dentro del gel (véanse ejemplos representativos en la Figura Suplementaria 1).

Resultados

La ejecución exitosa de este protocolo da lugar a la formación de estructuras organoides tridimensionales que exhiben morfología epitelial organizada y características arquitectónicas específicas de cada tejido. Los organoides comienzan a formarse entre 3 y 7 días tras la siembra y continúan desarrollándose durante todo el periodo de cultivo. La caracterización previa de este sistema organoide hidrogel demostró la formación reproducible de organoides en múltiples donantes humanos primari...

Discusión

El protocolo descrito aquí permite la generación reproducible de organoides mamarios humanos tridimensionales dentro de un microambiente de hidrogel definido que apoya características clave de la morfogénesis^{mamaria 3}. Varios pasos son fundamentales para el éxito de este método. En primer lugar, el procesamiento tisular y la disociación enzimática deben controlarse cuidadosamente para preservar la viabilidad epitelial minimizando la sobredigestión, lo que puede re...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
15 mL conical tubes	VWR	89039-664	Tubos estériles para procesamiento de tejido y centrifugación
40 μm cell strainer	VWR	732-2757	Dispositivo de filtración para la preparación de suspensión de células individuales
40 μm cell strainer for low volumes	Bel-Art	136800040	Dispositivo de filtración para la preparación de suspensión de células individuales
Automated cell counter	Bio-Rad	1450102	Dispositivo utilizado para contar células y determinar la viabilidad
Bovine pituitary extract	Thermo Scientific	13028014	Suplemento para medio de células epiteliales
Cell counting slides	Bio-Rad	145-0011	Diapositivas de doble cámara utilizadas para contar células
Centrifuge	N/A	N/A	Se necesitan centrifugadoras de mesa/s con capacidad de velocidad de al menos 500 x g y capacidad para tubos de 15 mL y 1,5 mL.
Collagen I	Millipore Sigma	08-115	Proteína de matriz extracelular utilizada para la formación de hidrogel
Collagenase A	Sigma-Aldrich	11088793001	Enzima utilizada para la disociación de tejidos
Cryovials	Corning	976171	Viales estériles para almacenamiento criogénico de muestras
Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates)	Corning	354104 354108 3603	Platos para la deposición de hidrogel y cultivo de organoides.
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	317275	Crioprotector utilizado en medio de congelación
Dispase II	Roche	4942078001	Enzima utilizada para la disociación secundaria de tejidos
DNase I	Roche	10104159001	Enzima utilizada durante la disociación celular.
Fetal bovine serum	Gibco	10437	Suplemento de suero utilizado en medios de lavado y neutralización
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F2006	Componente de proteína de matriz extracelular
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061	Suplemento para medio de células epiteliales
Human epidermal growth factor	Sigma-Aldrich	E9644	Suplemento para medio de células epiteliales
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Suplemento para medio de células epiteliales
Hyaluronic acid	Millipore Sigma	385908	Componente de matriz extracelular para la formulación de hidrogel
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H3506	Enzima utilizada para la disociación de tejidos
Incubator	Thermo Scientific	3598	Dispositivo utilizado para la incubación de cultivos de tejidos
Insulin	Sigma-Aldrich	I9278	Suplemento para medio de células epiteliales
Laminin	Gibco	23017-015	Componente de proteína de matriz extracelular
Mammary epithelial basal medium	Thermo Scientific	M171500	Medio de crecimiento para células epiteliales
Microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Scientific	3451	Tubos utilizados para reacciones de pequeño volumen
Orbital rotator	Thermo Scientific	400110	Rotador utilizado para la dispersión de tejidos durante la disociación enzimática
P1000 pipette	Gilson	P1000	Dispositivo utilizado para mezclar y transferir volúmenes de hasta 1,000 μL
Penicillin-streptomycin	Thermo Scientific	15140122	Suplemento antibiótico para medio de células epiteliales
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012-027	Solución tampón utilizada para lavado y enjuague
Precision balance	Mettler Toledo	ML303E	Balanza utilizada para pesaje de tejidos
Serological pipette	Nunc	170356N	Pipeta utilizada para la recolección de células epiteliales no adherentes
Sodium hydroxide (1 N)	Fisher Chemical	SS261	Reactivo utilizado para la neutralización de colágeno
Sterile scalpels	Bard-Parker	372615	Herramientas utilizadas para el picado mecánico de tejidos
Trypan blue solution	Gibco	15250061	Tinte utilizado para la evaluación de la viabilidad celular
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200056	Reactivo enzimático utilizado para la disociación celular
Water bath (37 °C)	VWR	10LA	Dispositivo utilizado para la descongelación controlada de muestras