Este protocolo describe un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos que recapitulan características clave de la morfogénesis mamaria en un sistema de cultivo tridimensional controlado.
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Artículo de método
Un método definido basado en hidrogel para generar organoides mamarios humanos tridimensionales que recapitulan la morfogénesis mamaria
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Resumen
Resumen
El desarrollo de sistemas modelo humanos fisiológicamente relevantes que recapitulen la arquitectura tisular y la dinámica del estado celular sigue siendo un gran desafío en el estudio del desarrollo mamario y los primeros eventos en la carcinogénesis. Los cultivos bidimensionales convencionales y muchos sistemas tridimensionales no logran captar la organización estructural y las señales microambientales que definen la glándula mamaria humana. Aquí describimos un método reproducible para generar organoides mamarios humanos tridimensionales a partir de células epiteliales primarias incrustadas en una matriz hidrogel definida compuesta por colágeno tipo I, laminina, fibronectina y ácido hialurónico. Este sistema apoya la progresión de células individuales a través de etapas clave de la morfogénesis mamaria, incluyendo la expansión de los progenitores, el patrón epitelial y la formación de estructuras terminales en forma de unidad lobular ductal, así como la aparición de un compartimento similar a mesénquima, durante un periodo de cultivo de 21 días. Ofrecemos un protocolo paso a paso para la preparación de hidrogel, la siembra celular y las condiciones de cultivo. El método es compatible con imágenes de alto contenido y análisis cuantitativo del número de organoides, la distribución de tamaño y la complejidad arquitectónica. Esta plataforma permite estudios mecanicistas de la plasticidad epitelial y las perturbaciones ambientales, proporcionando un sistema escalable y biológicamente relevante para investigar los cambios tempranos a nivel de tejido asociados al riesgo de cáncer de mama.
Introducción
Comprender el desarrollo de las glándulas mamarias humanas y los primeros eventos que predisponen el tejido a la transformación maligna requiere sistemas experimentales que recapitulen fielmente la arquitectura tisular, la jerarquía celular y la señalización microambiental. Aunque las culturas epiteliales bidimensionales han proporcionado importantes conocimientos mecanicistas, carecen del contexto estructural necesario para modelar la organización epitelial y lamorfogénesis 1. Los sistemas de cultivo tridimensionales existentes, incluidos los basados en extractos de membrana basal, han avanzado en el campo per....
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Protocolo
Los tejidos primarios que de otro modo se habrían descartado como residuos médicos tras la cirugía se obtuvieron cumpliendo con todas las leyes pertinentes, utilizando protocolos aprobados por los comités de revisión institucional del Maine Medical Center y del Tufts Medical Center. Todos los tejidos fueron anonimizados antes de la transferencia y no se pudieron rastrear hasta pacientes específicos. Por esta razón, esta investigación obtuvo el estatus de exención por parte del Comité sobre el Uso de Humanos como Sujetos Experimentales del Instituto Tecnológico de Massachusetts y de Tufts University Health Sciences (IRB #13521). Todos ....
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Resultados
La ejecución exitosa de este protocolo da lugar a la formación de estructuras organoides tridimensionales que exhiben morfología epitelial organizada y características arquitectónicas específicas de cada tejido. Los organoides comienzan a formarse entre 3 y 7 días tras la siembra y continúan desarrollándose durante todo el periodo de cultivo. La caracterización previa de este sistema organoide hidrogel demostró la formación reproducible de organoides en múltiples donantes humanos primari.......
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Discusión
El protocolo descrito aquí permite la generación reproducible de organoides mamarios humanos tridimensionales dentro de un microambiente de hidrogel definido que apoya características clave de la morfogénesismamaria 3. Varios pasos son fundamentales para el éxito de este método. En primer lugar, el procesamiento tisular y la disociación enzimática deben controlarse cuidadosamente para preservar la viabilidad epitelial minimizando la sobredigestión, lo que puede re.......
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Divulgaciones
C.K. es cofundador y consultor de Naveris.
Agradecimientos
Agradecemos mucho a Karla Murga, Daniela Requena y Megan Maloney del Tufts Biomedical Repository por el apoyo tisular. Esta investigación fue apoyada por la Fundación Find The Cause contra el Cáncer de Mama y el Premio Tufts CTSI NIH de Ciencia Clínica y Translacional (UM1TR0043, G.R.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-664 | Tubos estériles para procesamiento de tejido y centrifugación |
| 40 μm cell strainer | VWR | 732-2757 | Dispositivo de filtración para la preparación de suspensión de células individuales |
| 40 μm cell strainer for low volumes | Bel-Art | 136800040 | Dispositivo de filtración para la preparación de suspensión de células individuales |
| Automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Dispositivo utilizado para contar células y determinar la viabilidad |
| Bovine pituitary extract | Thermo Scientific | 13028014 | Suplemento para medio de células epiteliales |
| Cell counting slides | Bio-Rad | 145-0011 | Diapositivas de doble cámara utilizadas para contar células |
| Centrifuge | N/A | N/A | Se necesitan centrifugadoras de mesa/s con capacidad de velocidad de al menos 500 x g y capacidad para tubos de 15 mL y 1,5 mL. |
| Collagen I | Millipore Sigma | 08-115 | Proteína de matriz extracelular utilizada para la formación de hidrogel |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich | 11088793001 | Enzima utilizada para la disociación de tejidos |
| Cryovials | Corning | 976171 | Viales estériles para almacenamiento criogénico de muestras |
| Culture vessels (e.g., chamber slides, multiwell plates) | Corning | 354104 354108 3603 | Platos para la deposición de hidrogel y cultivo de organoides. |
| Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | 317275 | Crioprotector utilizado en medio de congelación |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Enzima utilizada para la disociación secundaria de tejidos |
| DNase I | Roche | 10104159001 | Enzima utilizada durante la disociación celular. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437 | Suplemento de suero utilizado en medios de lavado y neutralización |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | Componente de proteína de matriz extracelular |
| GlutaMAX | Thermo Scientific | 35050061 | Suplemento para medio de células epiteliales |
| Human epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 | Suplemento para medio de células epiteliales |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Suplemento para medio de células epiteliales |
| Hyaluronic acid | Millipore Sigma | 385908 | Componente de matriz extracelular para la formulación de hidrogel |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Enzima utilizada para la disociación de tejidos |
| Incubator | Thermo Scientific | 3598 | Dispositivo utilizado para la incubación de cultivos de tejidos |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | Suplemento para medio de células epiteliales |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Componente de proteína de matriz extracelular |
| Mammary epithelial basal medium | Thermo Scientific | M171500 | Medio de crecimiento para células epiteliales |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Thermo Scientific | 3451 | Tubos utilizados para reacciones de pequeño volumen |
| Orbital rotator | Thermo Scientific | 400110 | Rotador utilizado para la dispersión de tejidos durante la disociación enzimática |
| P1000 pipette | Gilson | P1000 | Dispositivo utilizado para mezclar y transferir volúmenes de hasta 1,000 μL |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | Suplemento antibiótico para medio de células epiteliales |
| Phosphate-buffered saline | Gibco | 20012-027 | Solución tampón utilizada para lavado y enjuague |
| Precision balance | Mettler Toledo | ML303E | Balanza utilizada para pesaje de tejidos |
| Serological pipette | Nunc | 170356N | Pipeta utilizada para la recolección de células epiteliales no adherentes |
| Sodium hydroxide (1 N) | Fisher Chemical | SS261 | Reactivo utilizado para la neutralización de colágeno |
| Sterile scalpels | Bard-Parker | 372615 | Herramientas utilizadas para el picado mecánico de tejidos |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | Tinte utilizado para la evaluación de la viabilidad celular |
| Trypsin (0.25%) | Gibco | 25200056 | Reactivo enzimático utilizado para la disociación celular |
| Water bath (37 °C) | VWR | 10LA | Dispositivo utilizado para la descongelación controlada de muestras |
Referencias
- Rauner G, Gupta PB, Kuperwasser C. From 2D to 3D and beyond: the evolution and impact of in vitro tumor models in cancer research. Nat Methods. 2025;22:1776-87.
- Traugh N, et al. Immune-epithelial interactions via TGF-β orchestrates stem-cell niche formation and morphogenesis [Preprint]. Available from: https://doi.org/10.1101/2025.05.22.655596. 2025.
- Rauner G, et al. Single-cell organogenesis captures complex breast tissue formation in 3D. Development. 2025. Available from: https://doi.org/10.1242/dev.204813.
- Trepicchio C, et al. DDR1 regulates RUNX1-CBFβ to control breast stem cell differentiation [Preprint]. bioRxiv. 2024. Available from: h....
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Reimpresiones y permisos
