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Artículo de método

Ensayo ELISpot para la cuantificación de células secretoras de anticuerpos totales y específicas de antígenos en sangre y médula ósea de macacos rhesus inmunizados

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DOI:

10.3791/71836

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21 de agosto de 2026

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1Department of Comparative Medicine, Michale E. Keeling Center for Comparative Medicine and Research, University of Texas, 2New Iberia Research Center, University of Louisiana at Lafayette, 3Department of Immunology and Microbiology, Scripps Research Institute

En este artículo

Resumen

ELISpot para células B es un método validado para cuantificar la magnitud y durabilidad de las células plasmáticas de larga duración específicas para antígenos IgG, IgM e IgA, así como de las células secretoras de anticuerpos (ASC) totales, tanto en sangre (que refleja plasmablastos de corta duración tras la inmunización) como en las ASC de médula ósea más duraderas.

Resumen

La evaluación de nuevos antígenos y adyuvantes vacunales tradicionalmente depende de la medición de títulos de anticuerpos, lo cual requiere tiempo para desarrollarse tras la inmunización. La cuantificación de células secretoras de anticuerpos (ASCs) tras inmunizaciones primaria y de refuerzo proporciona una medida temprana e informativa desde el punto de vista mecanicista de la inmunidad humoral inducida por la vacuna, y puede facilitar la optimización de formulaciones vacunales y estrategias de inmunización. Aquí se describe un protocolo para enumerar ASCs a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y células de médula ósea (BM) de macacos rhesus, un modelo preclínico importante para la investigación de vacunas contra el VIH. Este ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISpot) permite cuantificar tanto ASCs específicos para antígenos como ASCs totales de IgG, IgM e IgA, midiendo sus frecuencias absolutas y relativas. En sangre periférica, el ensayo capta la respuesta máxima de plasmablastos tras la inmunización, mientras que en la médula ósea detecta la acumulación de células plasmáticas específicas para antígenos de diferentes isotipos, evaluando así la durabilidad de las ASCs de larga vida. Este protocolo ofrece un enfoque robusto y reproducible para evaluar combinaciones de inmunógenos y adyuvantes en estudios preclínicos de vacunas, y proporciona datos valiosos para apoyar la transición de candidatos vacunales prometedores al desarrollo clínico.

Introducción

Las células secretoras de anticuerpos (ASC) son componentes clave de la inmunidad adaptativa e incluyen tanto a los plasmablastos de vida corta, que se generan rápidamente tras la inmunización, como a los plasmocitos de vida larga, responsables de la producción sostenida de anticuerpos. Los plasmablastos son detectables transitoriamente en sangre periférica y en órganos linfoides secundarios, alcanzando frecuencias máximas en momentos definidos tras la inmunización, que varían según la formulación de la vacuna y la especie del huésped (típicamente entre los días 4 y 5 en macacos rhesus y aproximadamente el día 7 en humanos). En contraste, los plasmocitos maduros son de vida larga y residen principalmente en tejidos linfoides secundarios y en la médula ósea (BM). Una vacuna eficaz debe inducir tanto respuestas inmunitarias humorales como mediadas por células. La medición de las respuestas de memoria, reflejadas por la rápida expansión de plasmablastos en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) tras una inmunización de refuerzo, proporciona información valiosa sobre la magnitud de la respuesta inmunitaria inducida por la vacuna. El objetivo general de este protocolo es ofrecer un método robusto para cuantificar las respuestas tempranas de plasmablastos y de plasmocitos de vida larga tras una inmunización específica contra Env en macacos rhesus.

En un ensayo por inmunoadsorción enzimática (ELISpot), las células plasmáticas se cultivan en placas de 96 pocillos con membrana de fondo de fluoruro de polivinilideno (PVDF) o éster mixto de celulosa (MCE) recubiertas con antígeno (Ag), lo que permite que las células viables secreten proteínas que se capturan directamente sobre la superficie de la membrana. Las proteínas capturadas se detectan posteriormente mediante anticuerpos en un formato convencional de inmunoensayo tipo sándwich. En los ensayos cromogénicos de ELISpot, las manchas se generan mediante la conversión del sustrato 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) por la peroxidasa de rábano picante (HRP) en un precipitado coloreado insoluble, lo que permite la visualización y enumeración de células plasmáticas individuales. ELISpot ofrece varias ventajas importantes, incluida la capacidad de detectar respuestas específicas frente al antígeno ex vivo, la evaluación funcional altamente sensible de células inmunitarias individuales y el monitoreo cuantitativo de las respuestas inmunitarias de linfocitos T y B tanto en estudios preclínicos como clínicos1,2,3.

Aquí se describe un protocolo de ELISpot para células B destinado a cuantificar las CEA totales y específicas para el antígeno de IgG, IgM e IgA en PBMC y células de MO de macacos rhesus. El protocolo detalla todos los pasos críticos, incluyendo el recubrimiento de placas, bloqueo, siembra de células, desarrollo del ensayo, enumeración de manchas y análisis de datos, para caracterizar la cinética de las respuestas de plasmablastos y células plasmáticas totales y específicas para Env. Este método proporciona un enfoque reproducible para evaluar y comparar la inmunogenicidad de diferentes formulaciones de antígenos y adyuvantes en estudios preclínicos de vacunas, y apoya la optimización de estrategias vacunales para su posterior traslación clínica.

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Protocolo

Los macacos rhesus utilizados en este protocolo procedían de colonias libres de patógenos específicos (SPF) del Centro de Investigación de Nueva Iberia y se mantuvieron en el Centro Michale E. Keeling para Medicina y Investigación Comparativas del Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas. El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas (Protocolo #2616RN00).

Este protocolo representa una optimización de la técnica descrita en estudios preclínicos previos de inmunización4,5,6,7, desarrollada para detectar respuestas de células secretoras de anticuerpos (ASC). El protocolo siguiente describe el procedimiento de ELISpot utilizando PBMC y preparaciones celulares de MO  frescas de macacos rhesus incluidos en un protocolo experimental de vacuna contra el VIH.

NOTA: Realice todos los procedimientos de las Secciones 1–4 dentro de una cabina de seguridad biológica certificada de Clase II utilizando técnica aséptica. Utilice pipetas multicanal siempre que sea posible.

1. Preparación de placas ELISpot

  1. Recubrir las placas de ELISpot
    1. Recubrir las placas de inmunoglobulina total (Ig) 1 y 3 con 100 µL/pocillo de 5 µg/mL de anticuerpo de cabra anti-IgG + IgM + IgA de mono no conjugado, diluido en DPBS estéril. Incubar las placas a 4 °C durante al menos 8 h, preferiblemente durante la noche (Figura 1A,C).
    2. Recubrir las placas específicas para antígeno 2 y 4 con 100 µL/pocillo de 20 µg/mL de lectina de Galanthus nivalis (GNL) diluida en DPBS. Incubar las placas a 4 °C durante al menos 8 h, preferiblemente durante la noche (Figura 1B,D).
    3. Almacenar las placas recubiertas a 4 °C hasta su uso.
  2. Lavar y bloquear las placas de inmunoglobulina total
    1. Eliminar la solución de recubrimiento de las placas 1 y 3 invirtiendo rápidamente cada placa sobre un recipiente de desecho. Golpear firmemente la placa invertida sobre papel absorbente para eliminar el líquido residual.
    2. Lavar cada placa dos veces con 200 µL/pocillo de PBS que contenga 0,05 % de Tween 20. A continuación, lavar las placas dos veces con 200 µL/pocillo de DPBS para eliminar el detergente residual.
      NOTA: El Tween 20 es citotóxico. Eliminarlo completamente antes de sembrar las células.
    3. Añadir 200 µL/pocillo de RPMI-10 a cada pocillo. Incubar las placas durante 2 h a 37 °C en un incubador humedecido.
  3. Lavar y bloquear las placas específicas para antígeno
    1. Eliminar la solución de recubrimiento de GNL de las placas 2 y 4 invirtiendo rápidamente cada placa sobre un recipiente de desecho. Golpear firmemente las placas invertidas sobre papel absorbente para eliminar el líquido residual.
    2. Lavar cada placa cuatro veces con 200 µL/pocillo de DPBS.
      NOTA: No utilizar PBS que contenga Tween 20 para las placas recubiertas con GNL.
    3. Añadir 200 µL/pocillo de RPMI-10 a cada pocillo. Incubar las placas durante 2 h a 37 °C en un incubador humedecido.
    4. Desechar la solución de bloqueo. Lavar cada placa cuatro veces con 200 µL/pocillo de DPBS.
    5. Añadir 100 µL/pocillo de antígeno CH505 SOSIP a una concentración final de 5 µg/mL. Incubar las placas durante 2 h a 37 °C.
    6. Desechar la solución de antígeno y lavar cada placa cuatro veces con DPBS estéril.
      NOTA: Dejar DPBS en los pocillos tras el lavado final para evitar que la membrana MCE se seque antes de sembrar las células.

2. Preparación de muestras: aislamiento de PBMCs y células mononucleares de médula ósea

  1. Aislar PBMCs de sangre total
    1. Centrifugar tubos de 10 mL de sangre con EDTA a 450 x g durante 20 min a temperatura ambiente sin aplicar el freno.
    2. Eliminar el plasma y añadir 4 mL de DPBS sin Ca2+ ni Mg2+. Mezclar suavemente usando una pipeta serológica de 10 mL.
    3. Colocar cuidadosamente la sangre diluida sobre 4 mL de Ficoll en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 800 x g durante 30 min a temperatura ambiente con aceleración lenta y desaceleración lenta.
    4. Transferir la capa leucocitaria que contiene las células mononucleares de sangre periférica a un tubo cónico nuevo de 15 mL. Añadir 8–10 mL de DPBS y centrifugar a 450 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    5. Desechar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento celular.
    6. Añadir 2 mL de tampón de lisis de cloruro amónico potásico (ACK) a la suspensión celular. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
      ADVERTENCIA: No exceder el periodo de incubación de 5 min, ya que una exposición prolongada al tampón de lisis ACK reduce la viabilidad celular.
    7. Detener la lisis de eritrocitos añadiendo 10 mL de DPBS que contenga 2% de suero bovino fetal (FBS). Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    8. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI-10.
    9. Contar los PBMCs utilizando un método adecuado de recuento celular y asegurarse de que la viabilidad sea >90%, por ejemplo, mediante tinción con azul de tripano.
    10. Ajustar una alícuota a 5 × 106 células/mL para ensayos de ELISpot específicos de antígeno. Ajustar una segunda alícuota a 1 × 106 células/mL para ensayos de ELISpot de inmunoglobulina total.
  2. Aislar células mononucleares de médula ósea
    1. Colocar un filtro celular de 70 µm en un tubo cónico de 50 mL. Humedecer previamente el filtro con 1 mL de DPBS.
    2. Añadir 4 mL de DPBS a 1 mL de aspirado de médula ósea. Mezclar completamente usando una pipeta serológica.
    3. Pasar la suspensión de médula ósea a través del filtro celular de 70 µm. Enjuagar el filtro con 2 mL de DPBS antes de desecharlo.
    4. Colocar la suspensión filtrada sobre 4 mL de Ficoll en un tubo cónico de 15 mL. Centrifugar a 800 x g durante 30 min a temperatura ambiente con aceleración lenta y desaceleración lenta.
    5. Transferir la capa de células mononucleares a un tubo cónico nuevo de 15 mL. Añadir 8–10 mL de DPBS y centrifugar a 450 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    6. Desechar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento celular.
    7. Añadir 2 mL de tampón de lisis ACK a la suspensión celular. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
      ADVERTENCIA: No exceder el tiempo de lisis recomendado para preservar la viabilidad celular.
    8. Detener la lisis de eritrocitos añadiendo 10 mL de DPBS que contenga 2% de FBS. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    9. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en RPMI-10.
    10. Contar las células mononucleares de médula ósea utilizando un método adecuado de recuento celular y asegurarse de que la viabilidad sea >90%, por ejemplo, mediante tinción con azul de tripano.
    11. Ajustar una alícuota a 5 × 106 células/mL para ensayos de ELISpot específicos de antígeno. Ajustar una segunda alícuota a 1 × 106 células/mL para ensayos de ELISpot de inmunoglobulina total.

3. Siembra e incubación de células

  1. Siembre las placas de inmunoglobulina total
    1. Retire el medio bloqueante de las placas 1 y 3 invirtiendo rápidamente cada placa sobre un recipiente de desecho. Toque firmemente las placas invertidas sobre papel absorbente para eliminar el medio residual.
    2. Añada 100 µL de RPMI-10 a cada pocillo de la primera fila y 133 µL de RPMI-10 a cada pocillo de las filas segunda y tercera. Estos se realizan por duplicado técnico.
    3. Añada 100 µL de suspensión de PBMC (1 × 106 células/mL) al primer pocillo de cada columna en la placa 1. Organice las muestras según el diseño de la placa [por ejemplo, los pocillos A1–A6 para el macaco rhesus 1 (RM1) y A7–A12 para el macaco rhesus 2 (RM2)].
    4. Añada 100 µL de suspensión de células de médula ósea (1 × 106 células/mL) al primer pocillo de cada columna en la placa 3. Organice las muestras según el diseño de la placa.
    5. Prepare diluciones seriadas al tercio transfiriendo 67 µL de un pocillo al siguiente y mezclando completamente tras cada transferencia. Continúe la dilución seriada en los pocillos designados y luego deseche los últimos 67 µL para mantener un volumen final de 133 µL por pocillo.
    6. Incube las placas durante la noche a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 5% de CO2.
      ​NOTA: Evite mover o perturbar las placas durante la incubación para prevenir la formación de manchas dobles.
  2. Siembre las placas específicas para antígeno
    1. Retire el DPBS de las placas 2 y 4 invirtiendo rápidamente cada placa sobre un recipiente de desecho. Toque firmemente las placas invertidas sobre papel absorbente para eliminar el tampón residual.
    2. Añada 100 µL de RPMI-10 a cada pocillo de la primera fila y 133 µL de RPMI-10 a cada pocillo de las filas segunda y tercera.
    3. Añada 100 µL de suspensión de PBMC (5 × 106 células/mL) al primer pocillo de cada columna en la placa 2. Añada las muestras según el diseño de la placa.
    4. Añada 100 µL de suspensión de células de médula ósea (5 × 106 células/mL) al primer pocillo de cada columna en la placa 4. Añada las muestras según el diseño de la placa.
    5. Prepare diluciones seriadas al tercio transfiriendo 67 µL de un pocillo al siguiente y mezclando completamente tras cada transferencia. Continúe la dilución seriada en los pocillos designados y luego deseche los últimos 67 µL para mantener un volumen final de 133 µL por pocillo.
    6. Incube las placas durante la noche a 37 °C en un incubador humedecido que contenga 5% de CO2.
      NOTA: Evite perturbar el incubador durante la incubación, ya que las vibraciones pueden producir manchas dobles o artefactos en forma de cola de cometa.

4. Procesar las placas de ELISpot

  1. Procesar las placas de inmunoglobulina total
    1. Retire las placas del incubador tras aproximadamente 18 h de incubación.
    2. Deseche las células y el medio de cultivo invirtiendo rápidamente cada placa sobre un recipiente de desecho que contenga lejía al 10%. Toque firmemente las placas invertidas sobre papel absorbente para eliminar el líquido residual.
      NOTA: Realice los pasos restantes de procesamiento en condiciones no estériles.
    3. Lave cada placa cuatro veces con 200 µL/pocillo de DPBS que contenga Tween 20 al 0,05%.
      NOTA: Deje el último tampón de lavado en los pocillos para evitar que las membranas se sequen.
    4. Alternativamente, lave las placas utilizando un lavador automático de microplacas cuando se procesen grandes cantidades de placas.
    5. Prepare la solución de anticuerpo de detección diluyendo los anticuerpos anti-mono IgG e IgM biotinilados 1:1.000 y el anticuerpo anti-mono IgA biotinilado 1:500 en DPBS que contenga Tween 20 al 0,05% y FBS al 1%.
    6. Retire el último tampón de lavado golpeando las placas sobre papel absorbente. Añada 100 µL/pocillo de anticuerpo anti-IgG diluido a las columnas 1 y 2, 7 y 8, anticuerpo anti-IgM a las columnas 3 y 4, 9 y 10, y anticuerpo anti-IgA a las columnas 5 y 6, 11 y 12.
      NOTA: Procese una placa a la vez para evitar que las membranas se sequen.
    7. Incube las placas durante 2 h a temperatura ambiente.
    8. Deseche la solución de anticuerpo de detección y lave las placas cuatro veces con DPBS que contenga Tween 20 al 0,05%.
    9. Prepare el conjugado enzimático diluyendo HRP-avidina 1:1.000 en DPBS que contenga Tween 20 al 0,05% y FBS al 1%.
    10. Añada 100 µL/pocillo de HRP-avidina diluida a cada pocillo. Incube las placas durante 2 h a temperatura ambiente, protegidas de la luz.
    11. Deseche la solución de HRP-avidina y lave las placas cuatro veces con DPBS que contenga Tween-20 al 0,05%.
      ​NOTA: Deje el último tampón de lavado en los pocillos hasta que finalice el desarrollo del sustrato.
  2. Procesar las placas específicas de antígeno
    NOTA: El procedimiento es similar al utilizado para las placas de inmunoglobulina total. Sin embargo, realice todos los pasos de lavado usando DPBS sin Tween 20 para preservar el recubrimiento de GNL.
    1. Retire las placas del incubador tras aproximadamente 18 h de incubación.
    2. Deseche las células y el medio de cultivo invirtiendo rápidamente cada placa sobre un recipiente de desecho que contenga lejía al 10%. Toque firmemente las placas invertidas sobre papel absorbente para eliminar el líquido residual.
      NOTA: Realice los pasos restantes de procesamiento en condiciones no estériles.
    3. Lave cada placa cuatro veces con 200 µL/pocillo de DPBS.
      NOTA: Deje el último tampón de lavado en los pocillos para evitar que las membranas se sequen.
    4. Prepare la solución de anticuerpo de detección diluyendo los anticuerpos anti-mono IgG e IgM biotinilados 1:1.000 y el anticuerpo anti-mono IgA biotinilado 1:500 en DPBS que contenga FBS al 1%.
    5. Retire el último tampón de lavado golpeando las placas sobre papel absorbente. Añada 100 µL/pocillo de anticuerpo anti-IgG diluido a las columnas 1 y 2, 7 y 8, anticuerpo anti-IgM a las columnas 3 y 4, 9 y 10, y anticuerpo anti-IgA a las columnas 5 y 6, 11 y 12.
      NOTA: Procese una placa a la vez para evitar que las membranas se sequen.
    6. Incube las placas durante 2 h a temperatura ambiente.
    7. Deseche la solución de anticuerpo de detección y lave las placas cuatro veces con 200 µL/pocillo de DPBS.
    8. Prepare el conjugado enzimático diluyendo HRP-avidina 1:1.000 en DPBS que contenga FBS al 1%.
    9. Añada 100 µL/pocillo de HRP-avidina diluida a cada pocillo. Incube las placas durante 2 h a temperatura ambiente, protegidas de la luz.
    10. Deseche la solución de HRP-avidina y lave las placas cuatro veces con 200 µL/pocillo de DPBS.
      NOTA: Deje el último tampón de lavado en los pocillos hasta que finalice el desarrollo del sustrato.
  3. Realizar el lavado automático (Opcional)
    1. Prepare el lavador automático de microplacas con DPBS según las instrucciones del fabricante.
    2. Seleccione el programa de lavado de ELISpot predefinido y realice todos los pasos de lavado usando DPBS.
      NOTA: Use DPBS para todos los lavados automáticos para evitar tener que volver a preparar el instrumento repetidamente con diferentes tampones de lavado.
    3. Utilice la configuración del lavador indicada en Tabla 1 para el lavador de microplacas.

5. Detección

  1. Preparar la solución de sustrato
    1. Prepare el sustrato de trabajo AEC inmediatamente antes de usarlo, añadiendo una gota de solución cromógena por cada 1 mL de solución de sustrato. Mezcle bien mediante vortex.
      NOTA: Preparar aproximadamente 40 mL de sustrato de trabajo para cuatro placas de 96 pocillos.
  2. Desarrolle las placas de ELISpot a temperatura ambiente
    1. Procese una placa a la vez. Deseche el último tampón de lavado y agregue inmediatamente 100 µL/pocillo sustrato de trabajo AEC
    2. Monitorear visualmente el desarrollo de los puntos hasta que aparezcan puntos rojos definidos, generalmente dentro de los 2–4 minutos.
      PRECAUCIÓN: No sobredesarrolle las placas, ya que un desarrollo excesivo aumenta la tinción de fondo y compromete la resolución de los puntos.
    3. Detenga la reacción enzimática lavando la placa cuidadosamente con agua corriente del grifo.
    4. Lave la placa cuatro a cinco veces con agua del grifo. Retire el exceso de agua utilizando toallas de papel absorbente.
    5. Retire el drenaje inferior de la placa y deje secar las placas al aire durante aproximadamente 24 h antes de contar los puntos.
      NOTA: Detenga la reacción tan pronto como aparezcan visibles los puntos en los pocillos que contienen las concentraciones más altas de células, para evitar un desarrollo excesivo.
    6. Repita los pasos 5.2.1 a 5.2.5 para cada placa restante.

6. Cuantificación de manchas

  1. Adquirir imágenes de ELISpot
    1. Escanea cada placa utilizando un lector de ELISpot equipado con software de adquisición de imágenes.
    2. Selecciona la plantilla de placa adecuada, define los pocillos que se analizarán y adquiere las imágenes según las instrucciones del software.
    3. Guarda los datos brutos y exporta las imágenes de la placa en formato TIFF para fines de archivo.
  2. Contar células secretoras de anticuerpos
    1. Revisa los conteos automatizados de manchas para cada pocillo.
    2. Verifica manualmente cada pocillo para identificar manchas incorrectamente fusionadas o divididas. Marca las manchas individuales manualmente cuando sea necesario para obtener conteos precisos.
      NOTA: Se recomienda la verificación manual porque el software de análisis automatizado puede contar varias veces las manchas grandes.
    3. Registra los conteos de manchas junto con los factores de dilución correspondientes en una hoja de cálculo como se describe en Tabla 2.
    4. Analiza los pocillos por duplicado por separado para IgG, IgM e IgA antes de calcular el conteo promedio de manchas para cada dilución.
    5. Calcula las células secretoras de anticuerpos por millón de células iniciales multiplicando el conteo promedio de manchas por el factor de dilución correspondiente.
      NOTA: Utiliza factores de dilución de 15×, 45× y 135× para los ensayos de inmunoglobulina total y de 3×, 9× y 27× para los ensayos específicos de antígeno.
    6. Realiza todos los cálculos en un software de hojas de cálculo y genera gráficos utilizando un software estadístico de graficación.

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Resultados

En este ensayo de ELISpot de linfocitos B, se detectaron células secretoras de anticuerpos (ASC) utilizando CH505 SOSIP, un trímero soluble de la glucoproteína de envoltura (Env) del VIH-1, como antígeno recubridor en un estudio de vacuna dirigido a inducir anticuerpos neutralizantes amplios (bnAbs) contra el VIH-1. Figura 1 ilustra la distribución de las placas de ELISpot utilizada para cuantificar ASC totales y específicos para el antígeno en placas separadas. La distribución identifica a ...

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Discusión

ELISpot de células B es un método sensible para detectar respuestas de células secretoras de anticuerpos (ASC) de inmunoglobulina total y específicas de antígeno en sangre, plasma y células de médula ósea8,9,10,11. Varios pasos son fundamentales para garantizar la reproducibilidad del protocolo. En primer lugar, las membranas deben recubrirse con precisión con la concentración óptima del anticu...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros que declarar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los animales y al personal de cuidado investigativo del Centro Keeling de Medicina y Investigación Comparativas por su atención, así como a muchos exmiembros del equipo y colaboradores por las mejoras sucesivas al procedimiento. La financiación para este proyecto de vacuna contra el VIH en primates no humanos fue proporcionada por las subvenciones del NIH 5R01AI183472 a MBZ y R24OD010947 a FJV.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Lisis ACKQuality Biological118-156-101500 ml
Filtro de 70µmFisher22363548Filtro estéril para células, compatible con tubos cónicos de 50 mL
Sustrato de trabajo AECBD Biosciences551951Reactivos para 10 placa(s)
Análisis: ExcelMicrosoft OfficeVersión 2508 Build 16.0.19127.20678Microsoft Excel para Microsoft 365
Análisis: GraphPad PrismGraphPad Software, LLCVersión 10.6.1 (892) GraphPad Prism 10
Anti Rhesus IgA biotinaNHPRRAB-3086851linfofilizado
Anti-mono IgG biotinaRocklandP/N 617-106-012linfofilizado
Anti-mono IgM biotinaRocklandP/N 617-106-007linfofilizado
Medio de bloqueoReactivos preparados en el laboratorioformulado in situRPMI-10
Tampón para diluir el anticuerpo secundario y la HRPReactivos preparados en el laboratorioformulado in situDPBS 1X con 1 % de FBS
Centrífuga Thermo Scientific75004521Sorvall Legend XTR, fabricado en 2013, rotor TX-750 y 75003608 (cubo redondo)
Tampón de recubrimientoReactivos preparados en el laboratorioformulado in situDPBS 1X
DPBSGibco14190-1361X
Placas ELISpotMillipore SigmaMSHAN4B50Paquete de 50 placas
Suero bovino fetal (FBS)Omega ScientificFB-011X
FicollSTEMCELL Technologies18061500 ml
GNL sin conjugaciónVector LaboratoriesL-1240-5linfofilizado
Peroxidasa de rábano picante (HRP) - AvidinaVector LaboratoriesA-20045 mg/ml listo para usar
Lector Mabtech IRIS Fluorospot/ELISpotMabtech ABP/N: 2000Imagen y análisis automatizados para ensayos ELISpot y Fluorospot
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140-122100X
Lavadora de placasBioTek Instruments, Inc.REF# 405TSRSLavadora de microplacas 405 TS
RPMI-10Reactivos preparados en el laboratorioformulado in situRPMI-1640 + 10 % de suero bovino fetal y 1 % de penicilina/estreptomicina 
RPMI-1640Gibco22400-0711X
Tween20Sigma Life SciencesP7949500 ml
Anticuerpo policlonal de cabra sin conjugación anti-mono IgG+IgA+IgM, IgG/IgM/IgALS-BioC347340linfofilizado
Tampón de lavado (placas específicas de antígeno)Reactivos preparados en el laboratorioformulado in situ(solo DPBS 1X)
Tampón de lavado (placas de Ig total)Reactivos preparados en el laboratorioformulado in situ(DPBS 1X + 0,05 % Tween 20)

Referencias

  1. Hwai H, Chen YY, Tzeng SJ. B-Cell ELISpot Assay to Quantify Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Methods Mol Biol. 2018;1808:133-141.
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