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Artículo de método

Diseño y funcionamiento de una instalación propia de criomicroscopía electrónica con infraestructura de TI y flujos de procesamiento de datos en tiempo real

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DOI:

10.3791/71837

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1 de septiembre de 2026

 , 
1ITS-Technology Engineering, Information Technology Services, Physical & Biological Sciences Division, University of California-Santa Cruz, 2Biomolecular Cryo-Electron Microscopy Facility, University of California-Santa Cruz, 3Chemistry and Biochemistry Department, University of California-Santa Cruz

En este artículo

Resumen

Este protocolo proporciona un marco práctico para diseñar y operar la infraestructura informática de una instalación interna de microscopía electrónica criogénica (cryo-EM). Aborda la planificación de la instalación, la arquitectura de red, almacenamiento, computación con GPU, acceso remoto y procesamiento en tiempo real de datos, lo que permite una gestión eficiente de conjuntos de datos de varios terabytes, garantizando al mismo tiempo operaciones de cryo-EM escalables, sostenibles y de alto rendimiento.

Resumen

La microscopía crioelectrónica (crio-EM) se ha convertido en un método dominante para la determinación de estructuras tridimensionales de macromoléculas biológicas a alta resolución. A medida que aumenta el número de instalaciones institucionales de crio-EM en todo el mundo, ha surgido un desafío persistente: la infraestructura de datos necesaria para apoyar estas instalaciones suele planificarse insuficientemente. Los instrumentos modernos de crio-EM acoplados a detectores directos de electrones (DED) generan entre 2 y 5 TB de datos brutos por día, y una instalación con 20 usuarios puede acumular aproximadamente 2 PB de datos en un solo año de operación. El procesamiento de estos datos exige nodos de computación dedicados con GPU, redes internas de alta velocidad y estrategias sólidas de archivo a largo plazo, todos los cuales deben estar implementados antes de comenzar la adquisición de datos. Este protocolo presenta un marco integrado para el diseño informático e informático de una instalación interna de crio-EM. Cubrimos los requisitos físicos de la instalación (diseño de la sala, energía eléctrica, refrigeración y aislamiento de vibraciones), la selección de equipos (microscopios, DED y otros instrumentos auxiliares) y toda la infraestructura computacional: configuración de conmutadores de red, selección y dimensionamiento de servidores de almacenamiento, provisión de nodos de cómputo con GPU y arquitectura de acceso remoto. Luego, proporcionamos un protocolo detallado para implementar tuberías de procesamiento de datos en tiempo real, que incluyen corrección de movimiento, estimación de la función de transferencia de contraste (CTF), selección de partículas y clasificación 2D en tiempo real durante la adquisición de datos, utilizando herramientas estándar de la industria. También se abordan estrategias de transferencia de datos para usuarios externos. Esta guía cubre un vacío crítico en la literatura y permitirá a investigadores y administradores construir instalaciones de crio-EM que estén listas computacionalmente desde el primer día.

Introducción

La revolución de la resolución en microscopía electrónica criogénica ha transformado la biología estructural, permitiendo la visualización a resolución atómica de proteínas, ácidos nucleicos y complejos macromoleculares sin necesidad de cristalización1,2. Tres avances técnicos impulsaron esta transformación: el desarrollo de detectores electrónicos directos con altas tasas de cuadros, mejoras en la óptica electrónica y la mecánica de los microscopios, y la optimización de software de procesamiento de imágenes acelerado por GPU3,4,5,6. Juntos, estos avances han convertido a la microscopía criogénica en el método de elección para una comunidad creciente de biólogos estructurales.

La demanda de acceso a la microscopía crioelectrónica (cryo-EM) ha impulsado una inversión significativa tanto en grandes centros nacionales como en instalaciones institucionales más pequeñas. Los centros nacionales, como NCCAT, S2C2, PNCC y MCCET en Estados Unidos, y eBIC, NeCEN y SciLifeLab en Europa3,5,6, ofrecen acceso a los instrumentos más avanzados para proyectos aprobados. Las instalaciones internas complementan estos recursos al apoyar investigaciones específicas del proyecto, de forma iterativa, con tiempos de respuesta más rápidos y una interacción más estrecha entre usuarios y personal. Sin embargo, establecer una instalación interna funcional requiere mucho más que adquirir un microscopio: la infraestructura informática de apoyo es igualmente crítica, y su insuficiencia es una de las principales causas de fallos operativos en nuevas instalaciones6.

Una sesión única de criomicroscopía electrónica de alta gama puede generar entre 2 y 5 TB de datos brutos en formato de película en 24 horas. Con múltiples microscopios y usuarios, la carga de datos aumenta rápidamente a escala de petabytes. El procesamiento de estos datos requiere tuberías aceleradas por GPU que deben operar simultáneamente con la adquisición de datos7,8. Retrasos en el preprocesamiento implican retrasos en la retroalimentación sobre la calidad de los datos y pérdida de tiempo en el instrumento. A pesar de estas realidades, la mayoría de las guías publicadas sobre la gestión de instalaciones de criomicroscopía electrónica dedican escasa atención a los componentes informáticos, y ninguna proporciona un protocolo operativo paso a paso para configurar y validar una infraestructura completa de datos.

Este protocolo aborda esa brecha. Describimos los requisitos físicos y técnicos para la construcción de las instalaciones, los criterios de selección para microscopios y detectores, y—lo más importante—el diseño e implementación de la infraestructura informática que hace viable operativamente una instalación de microscopía electrónica criogénica6. Se presta especial atención al procesamiento de datos en tiempo real: el preprocesamiento automatizado y simultáneo de los datos durante su adquisición, que permite un control de calidad en tiempo real, orienta las decisiones de adquisición y reduce drásticamente el tiempo de procesamiento posterior a la sesión9,10,11. Al seguir este protocolo, los desarrolladores de instalaciones estarán preparados para construir una operación completa e integrada de microscopía electrónica criogénica que sirva de manera sostenible y eficiente a una amplia comunidad científica.

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Protocolo

Se proporcionan detalles sobre el equipo, software y materiales utilizados en todo este protocolo en la Tabla de Materiales.

1. Diseño físico de la instalación, personal y planificación de infraestructura

  1. Realice una evaluación del lugar. Seleccione un sitio para la construcción que ofrezca: un piso aislado de vibraciones (niveles de vibración ambiental, idealmente < 1 µm/s RMS a 1–100 Hz); estabilidad del campo magnético (< 1 mG/m de gradiente espacial y < 0.1 mG/m de variación temporal para instrumentos de 300 kV); temperatura estable de la habitación (18–22 °C con fluctuaciones < 0,5 °C); control de humedad (40–60 % HR); y bajo ruido acústico (<50 dB). Consulte los requisitos del fabricante del microscopio en cuanto al sitio desde las primeras etapas de planificación.
    NOTA: La rehabilitación de una sala existente puede costar tanto como una construcción nueva. Como regla general, presupueste aproximadamente el 20 % del precio de compra del microscopio para la preparación de la sala.
  2. Diseñe la distribución del laboratorio con una clara separación espacial entre las zonas funcionales: (a) sala(s) de microscopía para microscopios electrónicos de transmisión criogénicos (crio-TEM); (b) una sala de acceso para la preparación de muestras, para el manejo y almacenamiento de rejillas; (c) una sala de controladores que aloje enfriadores de agua, unidades de UPS y sistemas de enfriamiento del microscopio; y (d) una sala de servidores o centro de datos independiente para la infraestructura de almacenamiento y computación.
    NOTA: Mantenga la sala de controladores siempre por debajo de 26 °C y proporcione energía de respaldo y refrigeración dedicadas. Las desviaciones de temperatura en la sala de controladores son una causa frecuente de inactividad del microscopio.
  3. Planifique la infraestructura eléctrica. Instale circuitos eléctricos trifásicos dedicados para crio-TEM de alta gama. Conecte todos los microscopios, cámaras y equipos de servidores a la infraestructura eléctrica protegida designada. Coordine con el equipo de instalaciones de la institución para incluir un generador de emergencia capaz de mantener el funcionamiento del microscopio y el flujo de agua de refrigeración durante cortes de energía.
    NOTA: Varios instrumentos dentro de un laboratorio de crio-EM requieren más de un día para un ciclo de encendido/apagado seguro. La pérdida de energía no planificada puede dañar placas de circuitos sensibles y provocar la pérdida de sesiones activas de adquisición de datos.
  4. Instale sistemas de agua de refrigeración para el microscopio electrónico y el hardware asociado. Establezca un circuito de respaldo de agua de refrigeración con conmutación automática ante fallos. Supervise continuamente el caudal de agua, la temperatura y la conductividad mediante el sistema integrado de monitoreo del microscopio o una matriz de sensores dedicada.
  5. Instale recorridos de cable de fibra óptica desde la(s) sala(s) de microscopía hasta la sala de servidores durante la construcción o remodelación. Especifique al menos fibra multimodo OM4 o monomodo OS2, con suficiente holgura y paneles de conexión etiquetados en ambos extremos.
    NOTA: Instalar la fibra previamente es considerablemente más económico que hacerlo posteriormente.
  6. Asigne operadores de microscopio dedicados o científicos del laboratorio para realizar el mantenimiento del instrumento, la formación de usuarios, la programación, la optimización de muestras y el soporte para la adquisición de datos. Asigne personal de TI dedicado para gestionar la infraestructura, el rendimiento de la red, la ciberseguridad, la copia de seguridad de datos, la implementación de software, los recursos de computación GPU y el acceso remoto de los usuarios.
  7. Determine los requisitos de personal según el nivel de soporte a usuarios proporcionado y la complejidad de la infraestructura computacional. En laboratorios más pequeños, como el UCSC Biomolecular cryo-EM Facility, estas responsabilidades pueden ser compartidas por un gestor del laboratorio con experiencia computacional o por servicios de TI institucionales centralizados; sin embargo, a medida que aumenta el número de microscopios, usuarios y sesiones anuales de adquisición de datos, se vuelve cada vez más necesario contar con personal especializado.
  8. Proporcione soporte de TI dedicado para laboratorios que operen múltiples crio-TEM para garantizar una adquisición de datos ininterrumpida, una gestión eficiente de datos y recursos computacionales escalables. Invierta en una infraestructura y personal de TI robustos desde las primeras etapas del desarrollo del laboratorio para minimizar el tiempo de inactividad operativo, simplificar futuras ampliaciones y proporcionar un marco sostenible capaz de apoyar comunidades crecientes de usuarios y flujos de trabajo de crio-EM cada vez más intensivos en datos.

2. Selección del microscopio y del detector

  1. Defina la misión científica principal de la instalación antes de seleccionar un microscopio. Considere: (a) si el flujo de trabajo principal será análisis de partículas individuales (SPA), tomografía crioelectrónica (crio-ET), difracción microelectrónica (microED), o una combinación; (b) el tamaño esperado de la base de usuarios y la diversidad de proyectos; (c) las limitaciones presupuestarias tanto para la adquisición como para los contratos de servicio continuo.
  2. Evalúe las plataformas de criomicroscopía TEM disponibles según las aplicaciones previstas. Para SPA de alta resolución y promediado de subtomogramas (STA), considere instrumentos de 300 kV. Para cribado y recolección de datos de resolución media, considere instrumentos de 200 kV. Para un punto de entrada más económico con capacidad de cribado, evalúe instrumentos de 100–120 kV (resumido en Tabla 1).
    NOTA: Las hojas de especificaciones cambian con frecuencia. Siempre solicite detalles de configuración actuales y precios directamente al fabricante antes de finalizar las decisiones de equipo.
  3. Seleccione un DED compatible con el microscopio y la aplicación. Para SPA de alta resolución en instrumentos de Thermo Fisher Scientific (TFS), el Falcon 4i es actualmente la opción principal en las series Krios y Glacios.
  4. Para instrumentos JEOL CryoARM, el Gatan K3 ofrece una sensibilidad y tasas de fotogramas excelentes. Para instalaciones que busquen cubrir tanto SPA como microED, confirme la compatibilidad del detector con los modos de recolección de datos de difracción electrónica (Tabla 2).
    NOTA: El DED es uno de los componentes más costosos de la instalación y afecta significativamente la calidad de los datos y los requisitos de almacenamiento. El modo Electron Event Register (EER), por ejemplo, genera archivos brutos considerablemente más grandes que los formatos comprimidos convencionales, lo que requiere una capacidad de almacenamiento y ancho de banda de red proporcionalmente mayores.
  5. Evalúe el papel de un filtro de energía al seleccionar la configuración del instrumento de criomicroscopía electrónica, ya que puede influir notablemente en la calidad de la imagen, la elección del detector y el rendimiento general del sistema. Al eliminar electrones dispersados inelásticamente, los filtros de energía mejoran el contraste y la relación señal-ruido, lo cual es particularmente beneficioso para muestras difíciles, aplicaciones de SPA de alta resolución (beneficioso), crio-ET (crítico) y microED (beneficioso).
  6. Evalúe los sistemas de filtro de energía disponibles durante la selección del instrumento. Los sistemas Gatan Bioquantum y Biocontinuum o los sistemas Thermo Fisher Scientific Selectris y SelectrisX suelen tener un costo aproximado de US$0.3–1.5 millones, dependiendo de la configuración.
  7. Evalúe el costo y la complejidad adicionales asociados con los filtros de energía en combinación con las capacidades del detector, los objetivos de la instalación y las aplicaciones previstas de los usuarios antes de seleccionar la configuración final del instrumento.
  8. Considere los contratos de servicio al calcular el costo total de adquisición. Los contratos de servicio generalmente cubren el microscopio, el filtro de energía, el detector y el sistema de enfriamiento por agua.
  9. Negocie los términos del contrato de servicio—incluyendo garantías de tiempo de respuesta y disponibilidad de piezas de préstamo—en el momento de la compra del instrumento. Presupueste entre el 8 % y el 15 % del precio de compra del instrumento por año para la cobertura de servicios.

3. Diseño e implementación de la arquitectura de red

  1. Diseñe la red interna de la instalación en torno a un conmutador central de alta velocidad. Conecte todos los dispositivos generadores y consumidores de datos directamente a este conmutador a la velocidad más alta soportada: controlador del microscopio, controlador de la cámara (a menudo una estación de trabajo independiente), servidores de almacenamiento y nodos de cálculo con GPU.
  2. Proporcione una conexión mínima de 10 Gbps a cada dispositivo. Implemente enlaces ascendentes de 25 Gbps o más rápidos entre el conmutador y los nodos de almacenamiento y cálculo cuando el presupuesto lo permita.
    NOTA: Con 1 Gbps, transferir 20 TB de datos brutos tomaría 2–3 días. Con 10 Gbps, la misma transferencia tarda 5–6 h. Con 25 Gbps, tarda aproximadamente 2 h. La velocidad de red determina directamente si el procesamiento en tiempo real puede mantenerse al ritmo de la adquisición de datos.
  3. Especifique el conmutador central. Requisitos: (a) estructura de conmutación no bloqueante a velocidad de línea completa; (b) puertos SFP+ o QSFP suficientes para todos los dispositivos de la instalación; (c) funcionalidad de conmutador gestionado (soporte de VLAN, monitoreo de tráfico, clonación de puertos para diagnóstico); (d) módulos de fuente de alimentación redundantes. Seleccione un conmutador gestionado de nivel empresarial que ofrezca una estructura de conmutación no bloqueante, puertos de alta velocidad suficientes, funciones de gestión de tráfico y fuentes de alimentación redundantes.
  4. Segmente la red utilizando VLANs para separar: (a) la VLAN de adquisición de datos (controladores del microscopio y de la cámara, servidores de almacenamiento); (b) la VLAN de cálculo (estaciones de trabajo con GPU y nodos del clúster); (c) la VLAN de gestión (acceso remoto, monitoreo, administración).
    NOTA: La segmentación de la red reduce el tráfico de difusión, mejora la seguridad y permite la resolución de problemas independiente de cada subsistema.
  5. Conecte la red de la instalación a la WAN institucional mediante un puerto de enlace ascendente dedicado en el conmutador central. Un enlace ascendente de 1–10 Gbps a la red del campus es suficiente para el acceso remoto y la transferencia externa de datos.
  6. Coordínese con la unidad de TI institucional para asignar direcciones IP estáticas, entradas DNS y reglas de firewall adecuadas para todos los dispositivos accesibles de la instalación (Figura 1).
  7. Instale y etiquete todos los recorridos de cableado de red. Use cables directos o cables ópticos activos para conexiones de 10+ Gbps hasta 100 m (el cableado Cat6A blindado también funciona para 10 Gbps hasta 100 m); use conjuntos de fibra preterminados (LC-LC o MTP) para enlaces de 25+ Gbps entre bastidores.
  8. Documente completamente el esquema de cableado con un diagrama de red que especifique nombres de dispositivos, direcciones IP, asignaciones de puertos y pertenencia a VLAN.
    NOTA: Consulte la Figura 2 para ver un esquema de la topología de red mínima recomendada para una instalación pequeña de microscopía crioelectrónica.

4. Diseño e implementación del servidor de almacenamiento

  1. Calcule los requisitos de almacenamiento antes de adquirir el hardware. Como referencia: una sola sesión de alta gama de microscopía crioelectrónica genera entre 2 y 5 TB de datos brutos por día.
  2. Estime los requisitos de almacenamiento a largo plazo según el uso previsto del centro. Un centro con capacidad para 20 usuarios y dos microscopios puede generar aproximadamente 2 PB de datos en un período de 3 a 6 meses de operación. Planifique tanto el almacenamiento de datos brutos (a corto plazo, alto rendimiento) como el almacenamiento de datos procesados (a mediano plazo, mayor volumen), ya que los conjuntos de datos procesados suelen ser 10 a 20 veces más grandes que los datos originales.
  3. Seleccione una arquitectura de almacenamiento robusta. Los servidores independientes basados en ZFS son el punto de partida recomendado para la mayoría de los centros, ya que ofrecen una relación favorable entre costo y capacidad, verificación integrada de integridad de datos (checksumming), configuraciones flexibles equivalentes a RAID (RAIDZ, RAIDZ2) y soporte para instantáneas. Los sistemas de archivos distribuidos en clúster (Gluster, Ceph, GPFS/IBM Spectrum Scale) pueden ofrecer mayor rendimiento y escalabilidad, pero requieren múltiples servidores físicos y una administración más compleja.
  4. Configure grupos de almacenamiento ZFS. Configuración recomendada inicial: dos vdevs RAIDZ2 (cada uno compuesto por 6 a 8 discos duros SAS de alta capacidad, de 16 a 20 TB cada uno), lo que proporciona aproximadamente entre un 60% y un 70% de capacidad útil con protección contra fallos simultáneos de dos unidades.
  5. Agregue un vdev de caché de escritura SSD dedicado (L2ARC) utilizando 2 a 4 SSD NVMe para acelerar el rendimiento de lectura aleatoria en trabajos de procesamiento activos.
    NOTA: No utilice unidades SATA de consumo en matrices de almacenamiento de producción. Son esenciales unidades empresariales SAS o NL-SAS con capacidad de carga de trabajo certificada (por ejemplo, 550 TB/año) para los patrones sostenidos de E/S aleatoria de los flujos de trabajo de microscopía crioelectrónica.
  6. Configure exportaciones NFS (para clientes Linux) y recursos compartidos SMB (para clientes Windows) en el servidor de almacenamiento ZFS. Monte el recurso compartido de datos principal en todos los nodos de cálculo con GPU y en la estación de trabajo del controlador de la cámara para permitir el acceso directo a los datos sin copias intermedias.
  7. Establezca una política de retención y ciclo de vida de los datos. Defina: (a) período de retención de las películas originales (típicamente de 3 a 6 meses posteriores a la recolección); (b) retención de micrografías corregidas por movimiento; (c) retención de los conjuntos de datos procesados finales (indefinida hasta la publicación); (d) procedimiento de archivo para proyectos finalizados.
  8. Implemente alertas automatizadas cuando el uso del almacenamiento supere el 70% de la capacidad, para permitir la adquisición oportuna de almacenamiento adicional.
    NOTA: El almacenamiento es el costo más frecuentemente subestimado en la planificación de centros de microscopía crioelectrónica. No confunda la aprobación para adquirir el microscopio con la disponibilidad de fondos adecuados para el almacenamiento. La adquisición de almacenamiento debe planificarse en paralelo con la instalación del instrumento, no después de que comience la recolección de datos.

5. Infraestructura informática de GPU

  1. Determine los requisitos de computación según el rendimiento esperado. Para un microscopio individual que genere entre 3.000 y 5.000 micrografías por sesión de 24 h, se requiere un mínimo de dos nodos de cómputo, cada uno equipado con 4 tarjetas GPU NVIDIA (Maxwell o más reciente, con 11+ GB de memoria VRAM, por ejemplo, RTX 3090, RTX 4090 o A100), para mantener un preprocesamiento en tiempo real a la velocidad de adquisición.
  2. Para instalaciones más grandes o flujos de trabajo de tomografía crioelectrónica (cryo-ET) con alto volumen de series de inclinación, suministre nodos adicionales.
  3. Especifique el hardware de los nodos de cómputo con GPU. Cada nodo debe incluir: (a) 4 GPUs NVIDIA con soporte para CUDA (mínimo 24 GB de VRAM por GPU para refinamientos 3D en CryoSPARC y RELION); (b) una CPU con alto número de núcleos (AMD EPYC o Intel Xeon, ≥32 núcleos) para soportar pasos paralelos dependientes de CPU (estimación de CTF, entrada/salida de archivos); (c) ≥256 GB de RAM del sistema; (d) espacio local de almacenamiento temporal NVMe SSD de 2–4 TB para datos intermedios de trabajos activos; (e) una tarjeta de interfaz de red (NIC) de 10/25 Gbps; (f) almacenamiento local suficiente para conjuntos de datos en uso (típicamente un volumen RAID). NOTA: Las GPUs de consumo (RTX 4090) pueden ofrecer un rendimiento comparable al de alternativas empresariales (A100) a un costo significativamente menor para cargas de trabajo de criomicroscopía electrónica (cryo-EM). Evalúe pruebas comparativas específicas para CryoSPARC y RELION, ya que sus patrones de acceso a la memoria favorecen GPUs con alto ancho de banda de memoria.
  4. Instale la pila de controladores NVIDIA, el kit de herramientas CUDA (versión compatible con CryoSPARC y RELION) y cuDNN en cada nodo de cómputo. Utilice una herramienta de gestión de configuración para estandarizar los entornos de software en todos los nodos y simplificar futuras actualizaciones.
  5. Despliegue CryoSPARC en una configuración independiente o en clúster. Para una instalación con múltiples nodos, instale CryoSPARC-master en un nodo principal dedicado y CryoSPARC-worker en cada nodo de cómputo con GPU.
  6. Configure la programación de trabajos para permitir que múltiples usuarios envíen trabajos de procesamiento simultáneos. Siga la documentación oficial de arquitectura de CryoSPARC para conocer los requisitos mínimos del sistema y la configuración de red.
  7. Instale RELION junto con la plataforma principal de procesamiento para ofrecer a los usuarios ambos ecosistemas de procesamiento. Configure el software para que utilice los nodos de cómputo locales mediante un programador (SLURM o PBS/Torque).
  8. Instale herramientas complementarias: MotionCor2 (corrección de movimiento), CTFFIND4 y Gctf (estimación de CTF), TOPAZ (selección de partículas basada en aprendizaje automático), crYOLO (selector de partículas basado en redes neuronales) y cryoDRGN (análisis de heterogeneidad). Consulte Tabla 3 para obtener una descripción general de los paquetes de software disponibles para SPA, cryo-ET, STA y microED. 
  9. Utilice el despliegue del consorcio SBGrid o la gestión de software basada en contenedores (Singularity/Apptainer para entornos HPC; Docker para estaciones de trabajo) para mantener entornos de software reproducibles y con control de versiones.
    NOTA: SBGrid proporciona versiones precompiladas y validadas de todas las herramientas principales de software para criomicroscopía electrónica, con gestión automatizada de actualizaciones para instituciones académicas.

6. Infraestructura de acceso remoto

  1. Establezca el acceso remoto basado en VPN como el punto de entrada seguro principal para todos los usuarios y personal fuera del sitio. Trabaje con el departamento de TI institucional para configurar un perfil o túnel de VPN específico para la instalación que permita el acceso a la red de computación y almacenamiento sin exponer los dispositivos a internet público en general.
  2. Implemente autenticación de dos factores (2FA) en todos los puntos de acceso remoto (Figura 2).
  3. Despliegue software de escritorio remoto para el acceso gráfico a los controladores del microscopio y estaciones de trabajo con GPU. Opciones recomendadas: (a) TeamViewer (comercial, multiplataforma, con capacidad de traspasar NAT—adecuado para el acceso al controlador del microscopio); (b) NoMachine (comercial, multiplataforma, soporta reenvío de gráficos 3D con OpenGL—recomendado para estaciones de trabajo con GPU que ejecutan herramientas de visualización); (c) TurboVNC con VirtualGL (de código abierto, solo para Linux, soporta renderizado 3D remoto).
    NOTA: Muchas herramientas de visualización de microscopía crioelectrónica utilizan OpenGL para el renderizado 3D. El reenvío estándar X11 no soporta OpenGL con aceleración por hardware. Utilice NoMachine o VirtualGL/TurboVNC para estas aplicaciones.
  4. Configure el acceso remoto al software de adquisición de datos del microscopio. Use Leginon o SerialEM para operar remotamente a través de la VPN institucional. El software de adquisición del microscopio puede accederse remotamente mediante una aplicación de escritorio remoto autorizada.
  5. Pruebe la conectividad remota desde ubicaciones externas representativas (redes domésticas, instituciones colaboradoras) antes de implementar operaciones con usuarios (Tabla 4).
  6. Configure un panel de monitoreo web para la instalación, que permita al personal y a los usuarios supervisar remotamente el estado de la recolección de datos, los resultados del preprocesamiento, el uso de almacenamiento y el estado de las colas de cómputo. Leginon incluye una interfaz de monitoreo web integrada.
  7. Para el flujo de trabajo de CryoSPARC, configure Grafana o un panel web personalizado alimentado por los registros del flujo de trabajo y herramientas de monitoreo del sistema (Prometheus, node_exporter).
  8. Establezca un mecanismo de entrega de datos para usuarios externos. Configure un servicio de transferencia de datos autenticado, como Globus Connect Server, en el sistema de almacenamiento de la instalación.
  9. Para usuarios sin acceso a Globus, prepare procedimientos para el envío de discos duros USB con sumas de verificación documentadas. Es necesaria una conexión de subida de 10 Gbps para permitir descargas directas prácticas de conjuntos de datos de varios TB por parte de usuarios externos.

7. Implementación del flujo de trabajo de procesamiento de datos en tiempo real

  1. Preconfigurar la ruta del flujo de datos antes de cada sesión de recopilación de datos. Confirmar que: (a) el controlador de la cámara escriba películas en bruto directamente en el almacenamiento de alto rendimiento montado mediante NFS del centro; (b) el recurso compartido NFS esté montado y accesible en todos los nodos de cálculo con GPU; (c) exista capacidad de almacenamiento libre suficiente para la sesión planeada (mínimo 5 TB libres para una sesión de SPA de 24 h); (d) los nodos de cálculo con GPU estén disponibles y no haya trabajos de larga duración que compitan por recursos.
  2. Configurar una corrección de referencia de ganancia. Antes de cada sesión, adquirir una imagen de referencia de ganancia según lo especificado por el fabricante del detector (típicamente una exposición al haz en blanco en un área vacía de la rejilla).
  3. Colocar el archivo de referencia de ganancia en el directorio de entrada designado para el preprocesamiento. Todos los programas de corrección de movimiento (MotionCor2, la implementación propia de RELION) aplicarán automáticamente esta referencia si están configurados correctamente.
  4. Iniciar la tubería de preprocesamiento en tiempo real utilizando CryoSPARC-Live (preferido para visualización en tiempo real). La tubería debe iniciarse una vez que aparezcan las primeras películas en el directorio de salida, típicamente dentro de los primeros 5–10 minutos de la recopilación automatizada de datos.
    NOTA: CryoSPARC-Live continúa monitoreando un directorio designado en busca de nuevos archivos de película y los procesa conforme llegan. La diferencia clave es que CryoSPARC-Live proporciona una interfaz web interactiva en tiempo real para el monitoreo.
  5. Flujo de trabajo de CryoSPARC-Live
    1. En la interfaz web, navegar a un proyecto nuevo o existente y crear una nueva sesión en vivo11,36.
    2. Configurar la fuente de entrada: especificar la ruta del directorio al que escribe el controlador de la cámara (la «carpeta de monitoreo»), el patrón de archivo que coincide con los archivos de película en bruto (por ejemplo, *.tif, *.mrc o *.eer para datos en formato EER del Falcon 4i) y la ruta del archivo de referencia de ganancia.
    3. Establecer los parámetros de corrección de movimiento: número de cuadros a utilizar, corrección de movimiento basada en fragmentos (recomendado: fragmentos de 5x5), factor de binning de salida (típicamente 1 para recopilación de datos cerca del criterio de Nyquist; 2 para cribado inicial) y dosis de electrones por cuadro (calculada a partir de la dosis total y el número de cuadros).
    4. Establecer los parámetros de estimación de la CTF: resolución mínima y máxima para el ajuste (típicamente 30 Å y 4 Å), rango de búsqueda de defoco (0,5–5 µm recomendado para SPA) y astigmatismo máximo aceptable. Habilitar la estimación de CTF por inclinación para conjuntos de datos de criotomografía electrónica (crio-ET).
    5. Configurar la selección de partículas: seleccionar el método de selección (selector tipo blob para sesiones iniciales; selector por plantilla tras obtener las primeras buenas clases 2D; selector TOPAZ para muestras difíciles). Establecer el diámetro esperado de las partículas y el espaciado mínimo/máximo entre partículas.
    6. Con el fin de reducir considerablemente los requisitos de almacenamiento, la carga de transferencia de datos y el costo computacional, se recomienda el recorte en el dominio de Fourier durante la extracción de partículas por un factor de 4 (lo que resulta en un tamaño de píxel físico 4 veces mayor). Para la evaluación rutinaria de la calidad de los datos, resoluciones intermedias de 3–5 Å suelen ser suficientes durante el procesamiento en tiempo real.
    7. Habilitar la clasificación 2D dentro de la sesión en vivo. Establecer el número de clases 2D (típicamente 50–200), el tamaño de lote para actualizaciones incrementales (200–500 partículas) y el límite de resolución para la clasificación (6–8 Å para evaluación inicial).
    8. Iniciar la sesión en vivo. Monitorear el panel de control en tiempo real para: número y tasa de películas entrantes, calidad de la corrección de movimiento (movimiento total por película—rechazar películas con un movimiento total >30 Å como regla general), calidad del ajuste de la CTF (rechazar micrografías con resolución de ajuste de CTF >6–8 Å), rendimiento de partículas por micrografía y calidad en evolución de los promedios de clases 2D.
    9. Establecer umbrales de aceptación para la curación automatizada. En el panel de Filtros, definir criterios de rechazo para el movimiento (límite de corte del movimiento total), calidad de la CTF (límite de corte de resolución de ajuste) y rango de defoco (excluir micrografías con defoco extremadamente bajo o alto). Las partículas curadas se enrutan automáticamente al trabajo de clasificación 2D subsiguiente.

8. Control de calidad en tiempo real y retroalimentación durante la recolección de datos

  1. Supervise continuamente las estadísticas de la CTF durante toda la sesión. Represente gráficamente los valores de desenfoque para cada micrografía: la distribución debe agruparse dentro del rango de desenfoque previsto (típicamente de −0,5 a −3,0 µm para la SPA).
  2. Una deriva sistemática hacia valores más altos de desenfoque puede indicar deriva del portaobjetos o una calibración incorrecta de la altura eucentrica. Avisar inmediatamente al personal del laboratorio si la resolución del ajuste de la CTF decae por debajo de 6 Å, ya que esto generalmente indica contaminación del hielo, inestabilidad del haz o una deriva de enfoque que requiere intervención.
  3. Supervise las salidas de corrección de movimiento. El movimiento total dentro del cuadro por película debe ser inferior a 10–30 Å para obtener datos de alta calidad. Se espera un movimiento elevado sistemático en los cuadros iniciales, y este se corrige; sin embargo, un movimiento alto que persista a lo largo de toda la película (>40 Å en total) puede indicar inestabilidad mecánica del portaobjetos o carga de la muestra, y debe investigarse.
  4. Revise los promedios 2D a medida que se actualizan durante la sesión (cada 30–60 minutos). Indicadores de un conjunto de datos de alta calidad: promedios de clases que muestren características de estructura secundaria, múltiples vistas distintas de la partícula y ausencia de artefactos por apilamiento o agregación.
  5. Supervise la presencia de indicadores que requieran intervención: todas las partículas agrupadas en clases sin características definidas ("clases de basura"), lo que sugiere una mala calidad de la muestra o del hielo; ausencia total de ciertas vistas (lo que sugiere una orientación preferida, que podría requerir optimización de la rejilla); o rendimientos extremadamente bajos de partículas por micrografía.
  6. Registre todas las observaciones en un registro estructurado de la sesión. Anote: horarios de inicio y finalización de la sesión, configuraciones del microscopio y de la cámara, resumen de estadísticas en tiempo real (número total de películas recolectadas, fracción que supera el filtro de CTF, fracción que supera el filtro de movimiento, número total de partículas seleccionadas, evaluación de clases 2D) y cualquier intervención realizada. Este registro es esencial para la evaluación retrospectiva de la calidad y para los informes de desempeño del laboratorio.
  7. Al finalizar la sesión, genere un informe resumen de la calidad de los datos. La plataforma de procesamiento en tiempo real exporta automáticamente un resumen de la sesión.
    NOTA: Otra opción para generar resúmenes e informes es utilizar herramientas de inteligencia artificial como Vitreum. En la Instalación de Criomicroscopía Criogénica de Biomoléculas de la UCSC, la plataforma Vitreum se utiliza para gestionar los flujos de trabajo de laboratorio y la documentación experimental. Vitreum registra los pasos experimentales a medida que ocurren, aplica restricciones a nivel de protocolo, verifica la ejecución del flujo de trabajo según criterios de calidad predefinidos y proporciona un registro verificable de las actividades de laboratorio. Al integrar las operaciones de laboratorio con la infraestructura computacional y de gestión de datos del laboratorio, la plataforma minimiza el registro manual, mejora la reproducibilidad, facilita la comunicación entre el personal del laboratorio y los usuarios, y permite un seguimiento consistente de los experimentos desde la preparación de la muestra hasta la recolección de datos y el análisis computacional posterior.

9. Secuencia de procesamiento de datos posterior a la recolección

  1. Una vez completado el preprocesamiento en tiempo real, se exporta la pila de partículas agrupadas curada junto con las películas preprocesadas curadas.
  2. Desconecte el proyecto de CryoSPARC de la estación de trabajo principal y luego vuelva a conectarlo a otra estación de trabajo compartida y accesible de forma remota. Esto permite descargar rápidamente los datos y reiniciar la siguiente sesión de adquisición de datos.
    NOTA: Una sesión típica de recopilación de datos puede variar entre 1 y 2 días, fácilmente monitorizada mediante CryoSPARC-Live. Sin embargo, los pasos de procesamiento 3D pueden tardar semanas o meses, lo que justifica la transferencia del proyecto entre estaciones de trabajo y servidores de almacenamiento.
  3. En CryoSPARC, exporte las partículas agrupadas curadas desde la sesión en vivo hacia un proyecto estándar para el procesamiento 3D fuera de línea36. 
  4. Realice la reconstrucción 3D ab initio. En CryoSPARC, utilice el trabajo de Reconstrucción Ab Initio (se recomiendan 3–5 modelos iniciales para muestras heterogéneas). Genere 1–4 modelos iniciales para evaluar la heterogeneidad estructural.
  5. Una vez que los valores reconstruidos sean satisfactorios, vuelva a extraer las partículas sin agrupar para mejorar la resolución general.
  6. Realice el refinamiento 3D utilizando refinamiento heterogéneo (si se sospecha de múltiples conformaciones o clases), seguido por refinamiento homogéneo para la mejor clase. En CryoSPARC, use refinamiento heterogéneo seguido de refinamiento no uniforme. 
  7. Aplique el alisado bayesiano en RELION13 o utilice la corrección de movimiento por partícula y el refinamiento de la CTF (trabajo de refinamiento de CTF en CryoSPARC) para mejorar la señal por partícula, teniendo en cuenta el movimiento inducido por el haz y la desenfoque por partícula, según la preferencia del usuario. Este paso mejora rutinariamente la resolución del mapa final en 0,2–0,5 Å. Además, la corrección de movimiento basada en referencia (RBMC) en CryoSPARC también puede ser una opción para mejorar la resolución y la calidad del mapa.
  8. Valide el mapa final utilizando el procedimiento de correlación de caparazón de Fourier (FSC) con criterio de oro. Divida la pila de partículas en dos subconjuntos independientes, refinéelos por separado y calcule el FSC entre los dos mapas parciales. Informe la resolución final en FSC = 0,143.
  9. Calcule el FSC entre mapa y modelo (FSC-Q) y las puntuaciones Q tras el ajuste del modelo atómico como métricas de validación independientes37.
  10. Realice la construcción y validación del modelo atómico. Utilice ModelAngelo para la construcción automatizada de modelos de novo a partir del mapa de densidad20. Refine el modelo mediante el refinamiento en espacio real de PHENIX y valídalo con MolProbity.
  11. Utilice COOT35 tras generar el modelo inicial para visualizar el mapa de densidad, ajustar o modificar las coordenadas atómicas, corregir errores de modelado, construir regiones faltantes y optimizar las estructuras de proteínas, ácidos nucleicos o ligandos. Permite la edición interactiva de residuos, conformaciones de cadenas laterales, estructuras secundarias y asignaciones de secuencia, seguida de refinamiento en espacio real para mejorar la concordancia entre el modelo atómico y la densidad experimental.
  12. Finalmente, deposite el modelo atómico final en el Protein Data Bank (PDB), el mapa de densidad en el Electron Microscopy Data Bank (EMDB) y los datos crudos o preprocesados en el Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR).

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Resultados

A successfully implemented facility IT infrastructure and on-the-fly data processing pipeline will produce the following verifiable outcomes at each stage:

Network and storage
Internal data transfer between the camera controller and storage server should sustain ≥800 MB/s (approaching theoretical 10 Gbps throughput) when measured with tools such as iperf3 or fio. This throughput is sufficient to transfer a 10–12 GB movie stack from the detector in under 15 seconds, ensurin...

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Discusión

La infraestructura informática de una instalación de microscopía crioelectrónica no es un complemento secundario, sino un requisito operativo fundamental. Las instalaciones que comienzan la adquisición de datos sin capacidad adecuada de almacenamiento, red y procesamiento se enfrentan inevitablemente a la disyuntiva de descartar datos brutos, detener la adquisición de datos o aceptar retrasos de meses en la determinación de estructuras. Los protocolos descritos aquí están diseñados para evitar estas situaciones, aseguran...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Instalación de Microscopía Crioelectrónica Biomolecular del Departamento de Química y Bioquímica de la Universidad de California–Santa Cruz (RRID: SCR_021755) por el apoyo científico y técnico (Programa de Instrumentación de Alto Rendimiento de los NIH, S10OD02509).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Krios 5ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/es/home/microscopia-electronica/productos/microscopios-electronicos-de-transmision/krios-5-cryo-tem.htmlMicroscopio electrónico de transmisión
Krios G4ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/es/home/microscopia-electronica/productos/microscopios-electronicos-de-transmision/krios-g4-cryo-tem.htmlMicroscopio electrónico de transmisión
GlaciosThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/glacios-cryo-tem.htmlMicroscopio electrónico de transmisión
Glacios 2ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/es/home/microscopia-electronica/productos/microscopios-electronicos-de-transmision/glacios-2-cryo-tem.htmlMicroscopio electrónico de transmisión
Glacios 3ThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/ (última generación; la página del producto puede variar según la región)Microscopio electrónico de transmisión
Talos ArcticaThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/es/home/microscopia-electronica/productos/microscopios-electronicos-de-transmision/talos-arctica.htmlMicroscopio electrónico de transmisión
Talos L120CThermoFisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/talos-l120c.htmlMicroscopio electrónico de transmisión
CRYO ARM 300 II (JEM-Z300FSC)JEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/cryoarm300ii.phpMicroscopio electrónico de transmisión
CRYO ARM 200JEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/cryoarm200.phpMicroscopio electrónico de transmisión
JEM-3200FSCJEOLhttps://www.jeol.com/products/scientific/tem/jem3200fsc.phpMicroscopio electrónico de transmisión
HF8300Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/tem/hf8300.htmlMicroscopio electrónico de transmisión
HT7800Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/tem/ht7800.htmlMicroscopio electrónico de transmisión
SU9000 (TEM/STEM)Hitachihttps://www.hitachi-hightech.com/global/en/products/microscopes/sem-tem/su9000.htmlMicroscopio electrónico de transmisión
Falcon 4iThermo Fisher Scientifichttps://www.thermofisher.com/us/es/home/microscopia-electronica/productos/detectores-electronicos-directos/falcon-4i.htmlDetector de electrones directo
Gatan K3Gatan (AMETEK)https://gatan.com/products/tem-cameras/k3-is-cameraDetector de electrones directo
Gatan K2Gatanhttps://gatan.com/products/tem-cameras/k2-cameraDetector de electrones directo
ApolloElectrón Directohttps://directelectron.com/apollo/Detector de electrones directo
DE64Electrón Directohttps://directelectron.com/de-64/Detector de electrones directo
RELIONLaboratorio de Biología Molecular del MRC (MRC-LMB), Universidad de Cambridgehttps://relion.readthedocs.iopaquete de software SPA
cryoSPARCStructura Biotechnologyhttps://cryosparc.compaquete de software SPA
EMAN2Colegio de Medicina Baylor (Desarrollado por el Laboratorio de Steven Ludtke)https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2paquete de software SPA
cisTEMConsejo Nacional de Investigación de Canadá (desarrollado por Tim Grant y colegas)https://cistem.orgpaquete de software SPA
SPHIREInstituto Max Planck de Fisiología Molecular y Colegio Baylor de Medicinahttps://sphire.mpg.depaquete de software SPA
cryoDRGNUniversidad de Princeton (Desarrollado por el Laboratorio de Ellen Zhong)https://cryodrgn.cs.princeton.edupaquete de software SPA
TopazEscuela de Medicina de Harvard (Desarrollado por el Laboratorio de Travis Bepler)https://github.com/tbepler/topazpaquete de software SPA
crYOLOInstituto Max Planck de Biofísicahttps://cryolo.readthedocs.iopaquete de software SPA
DeformaciónLaboratorio de Biología Molecular del MRC (desarrollado por Dmitry Tegunov)http://www.warpem.compaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas
ModelAngeloLaboratorio MRC de Biología Molecularhttps://www.modelangelo.orgpaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de promedios estructurales (STA)
IMODUniversidad de Colorado en Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/imodpaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subunidades (STA)
DynamoCentro Nacional de Biotecnologíaía (CNB-CSIC)https://www.dynamo-em.orgpaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas (STA)
emClarityUniversidad de California, San Franciscohttps://github.com/StochasticAnalytics/emClaritypaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas (STA)
RELION (módulo ET)Laboratorio de Biología Molecular del MRC (MRC-LMB), Universidad de Cambridgehttps://relion.readthedocs.iopaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas
EMAN2 (SPT)Baylor College of Medicinehttps://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2paquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas (STA)
Warp/MLaboratorio MRC de Biología Molecularhttps://warpem.github.iopaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas
AreTomoUniversidad de Stanford (desarrollado por los grupos de Fei Sun y Wah Chiu)https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo2paquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas (STA)
PEETUniversidad de Colorado en Boulderhttps://bio3d.colorado.edu/PEETpaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas (STA)
PyTomInstituto Max Planck de Bioquímicahttps://pytom.orgpaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas
Tomo3DCentro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC)https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3dpaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas
crYOLO (3D)Instituto Max Planck de Biofísicahttps://cryolo.readthedocs.iopaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas (STA)
AITomUniversidad Carnegie Mellonhttps://github.com/xulabs/aitompaquete de software de criotomografía electrónica y análisis de subtomogramas
DIALSFuente de Luz Sincrotrón Diamond y colaboradoreshttps://dials.github.iopaquete de software microED
XDSInstituto Max Planck de Investigación Médica (desarrollado por Wolfgang Kabsch)https://xds.mr.mpg.depaquete de software microED
MOSFLMLaboratorio de Biología Molecular del MRC (MRC-LMB), Universidad de Cambridgehttps://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/mosflmpaquete de software microED
SHELXUniversidad de Göttingen (Desarrollado por George M. Sheldrick)https://shelx.uni-goettingen.depaquete de software microED
PhenixLaboratorio Nacional Lawrence Berkeley (Consorcio PHENIX)https://phenix-online.orgpaquete de software microED
CootLaboratorio MRC de Biología Molecular (MRC-LMB), Universidad de Cambridgehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/cootpaquete de software microED
Linux (Ubuntu, CentOS/Rocky)Ubuntu: Canonical Ltd.; CentOS: Proyecto CentOS; Rocky Linux: Fundación de Software Empresarial Rocky (RESF)https://ubuntu.com / https://www.centos.org (heredado) /  https://rockylinux.orgSistema Operativo
WindowsMicrosofthttps://www.microsoft.com/windowsSistema Operativo
ZFSOracle Corporation (originalmente Sun Microsystems); OpenZFS mantenido por la comunidad OpenZFShttps://openzfs.orgSistema de archivos
NFSSun Microsystems (actualmente mantenida como un estándar IETF)https://www.rfc-editor.org/rfc/rfc8881Protocolo
SMB (CIFS)Microsofthttps://learn.microsoft.com/windows-server/storage/file-server/file-server-smb-overviewProtocolo
Microsoft Remote Desktop (RDP)Microsofthttps://learn.microsoft.com/windows-server/remote/remote-desktop-servicesAcceso remoto
NoMachineNoMachinehttps://www.nomachine.comAcceso remoto
TeamViewerTeamViewer SEhttps://www.teamviewer.comAcceso remoto
VirtualGL + TurboVNCVirtualGL: El Proyecto VirtualGL; TurboVNC: El Proyecto TurboVNChttps://virtualgl.org y https://turbovnc.orgAcceso remoto
CUDANVIDIAhttps://developer.nvidia.com/cuda-toolkitMarco informático

Referencias

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