Artículo de método

Flujo de trabajo estandarizado para la obtención de imágenes de alto contenido y el procesamiento de datos

DOI:

10.3791/71863

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21 de agosto de 2026

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1College of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Institute of Interdisciplinary Studies, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Life Science and Technology, Southeast University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un protocolo para la obtención de imágenes de alto contenido y el procesamiento de datos estandarizados de células teñidas con yoduro de propidio (PI) y Hoechst 33342, con el fin de realizar un análisis reproducible de viabilidad celular mediante flujos de trabajo automatizados de adquisición y análisis de imágenes.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para abordar los desafíos de baja reproducibilidad debidos a variaciones operativas en la obtención de imágenes en la investigación científica y la complejidad de analizar un gran número de muestras mediante métodos convencionales, presentamos un protocolo para teñir células HT22 con PI y Hoechst 33342, seguido de la adquisición de imágenes y el análisis de los datos utilizando el Sistema de Imágenes de Alto Contenido. Este flujo de trabajo tiene como objetivo establecer parámetros robustos de configuración de imágenes y estándares rigurosos de control de calidad. Se describe la configuración del equipo y el procedimiento para tres métodos diferentes de procesamiento de imágenes proporcionados por el instrumento: Puntuación Celular Multilongitud de Onda (Multi), Viable-Muerto (Live) y Editor de Módulo Personalizado (CME). Los métodos de procesamiento de imágenes se comparan y validan frente al método tradicional, ImageJ, para garantizar su eficacia. El estudio concluye con un resumen del flujo de trabajo para utilizar el Sistema de Imágenes de Alto Contenido en la determinación de la viabilidad celular mediante el método de doble tinción con PI y Hoechst. Al estandarizar todo el flujo de trabajo de adquisición de imágenes y procesamiento de datos, este estudio mejora significativamente la reproducibilidad y fiabilidad de las imágenes en la investigación científica, proporcionando así un sólido respaldo metodológico para la comparación de datos entre laboratorios y promoviendo el avance de la investigación científica.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El sistema de imagen de alto contenido sirve como una herramienta fundamental en la investigación científica moderna, permitiendo la adquisición de imágenes a alta velocidad y la evaluación multiparamétrica de células dañadas o indemnes1,2,3. Desempeña un papel insustituible en diversas disciplinas. En el campo de las ciencias de la vida, ayuda a los investigadores a explorar el mundo microscópico de células y tejidos4,5. Por ejemplo, la detección precisa de moléculas y estructuras marcadas con fluorescencia dentro de las células permite visualizar claramente las estructuras finas celulares y sus cambios dinámicos6. En la investigación en neurociencia, puede realizar imágenes tridimensionales de neuronas, facilitando el análisis de las conexiones complejas y los mecanismos de transducción de señales en las redes neuronales, y aportando pistas fundamentales para comprender las funciones cerebrales y la patogénesis de enfermedades neurológicas7,8,9.

A pesar de las ventajas significativas de la tecnología del sistema de imágenes de alto contenido, aún persisten varios problemas en su proceso de obtención de imágenes. En la etapa de preparación de muestras, existe un alto grado de subjetividad. En la preparación de muestras biológicas, procesos como el manejo celular y la tinción carecen de estándares adecuados. En cuanto a los parámetros de imagen, hay diferencias notables en los tiempos de exposición y en la selección de placas de pocillos entre laboratorios y modelos de microscopios de alto contenido. En la fase de procesamiento de datos, existe una falta de estandarización, desde la reducción del ruido y el ajuste del contraste de las imágenes crudas hasta la identificación de parámetros y la determinación de características objetivo. Estos problemas conducen directamente a sesgos en los resultados de las imágenes microscópicas, provocando una crisis de reproducibilidad.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo utiliza una línea celular comercial (HT22, ATCC) y no involucra sujetos humanos ni tejidos humanos primarios. No se utilizaron animales en este estudio.

1. Preparación estandarizada de muestras

  1. Preparar células HT22
    1. Cuando la confluencia de las células HT22 alcance el 80%10,11, deseche el medio antiguo. Utilice tripsina al 0,25% para despegar las células, incubando durante 1–2 min a temperatura ambiente.
    2. Añada Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) en un volumen 3 veces mayor que el de la tripsina al 0,25% para detener el desprendimiento. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL.
    3. Centrifugue a 175 x g durante 3 min a temperatura ambiente, luego deseche el sobrenadante. Re-suspenda las células en DMEM completo para obtener una suspensión de células individuales.
    4. Recuente las células utilizando una cámara de conteo. Siembre 5.000 células por pocillo en 100 µL de medio completo en una placa de 96 pocillos12.
    5. Incube la placa a 37 °C con 5% CO2 durante 24 h. Realice las operaciones de agrupación de muestras, administración de tratamientos y tinción en la placa de 96 pocillos según el diseño experimental.
      ​NOTA: Utilice una placa de 96 pocillos compatible con el sistema de imagen. Seleccione una placa con espesor y geometría de fondo adecuados, según las especificaciones del fabricante. Se recomiendan placas con fondo de vidrio (espesor de fondo de 130–170 µm) cuando se requiera una calidad de imagen superior13,14,15,16.
  2. Procedimiento de tinción
    1. Asegúrese de que las células formen una monocapa única y bien dispersa, sin exceder el 70% de confluencia, para minimizar el solapamiento celular (Figura 1B).
    2. Agrupe las muestras según los requisitos experimentales y continúe con la tinción tras el tratamiento. Prepare las soluciones de trabajo de colorante con una concentración final de 6,684 µg/mL para PI y 10 µg/mL para Hoechst 3334217,18.
    3. Deseche el medio antiguo de la placa de 96 pocillos y lave cada pocillo dos veces con 100 µL de PBS. Añada la solución de trabajo de colorante e incube a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante 30 min para la tinción.
    4. Lave cada pocillo dos veces con 100 µL de PBS, luego añada DMEM.
      NOTA: Diferentes diseños experimentales pueden presentar variaciones en los parámetros de carga de muestras y tinción.

2. Especificaciones y ajustes de parámetros de imagen

  1. Normas de parámetros de imagen
    ​NOTA: Este estudio demuestra únicamente el flujo de trabajo de imagen de campo amplio para el instrumento tras la tinción con yoduro de propidio y Hoechst 33342.
    1. Encienda el instrumento y luego encienda la computadora. Abra el software de análisis proporcionado con el dispositivo.
    2. Cargue la placa de 96 pocillos en el instrumento. Seleccione el campo de visión con las muestras para la adquisición de imágenes.
    3. En la configuración de Objetivo y Cámara, establezca la Ampliación en «20XPh1SPlanFluorELWDADM» (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), el binning de la cámara en «2» y el Modo de Adquisición en «Widefield».
    4. En el modo de placa, seleccione los parámetros correspondientes de la placa de 96 pocillos y ajuste los parámetros de la placa según los datos de tamaño del producto.
    5. En la opción de Sitio, seleccione normalmente 9 campos por pocillo para una imagen densa. En las opciones de enfoque automático, seleccione Activar enfoque basado en láser.
    6. Ajuste los parámetros de enfoque automático láser en Enfoque automático, según el espesor promedio del fondo de la placa medido en al menos tres pocillos de muestra. Ajuste adecuadamente el espesor inferior, la variación máxima del espesor inferior, la variación máxima entre pocillos adyacentes, la variación máxima intra-pocillo y la variación máxima de la placa.
    7. En Longitudes de onda, establezca el Número de longitudes de onda en 3. Para la primera Iluminación, seleccione DAPI. En Corrección de sombreado, elija «Corrección automática para FL» (Figura 2B).
    8. Después de encontrar la imagen, establezca la Exposición inicial (ms) en 20–30. Observe las imágenes capturadas y ajuste continuamente la exposición para lograr una intensidad de fluorescencia moderada sin sobreexposición, y establezca la profundidad de bits en 16 (Figura 2A).
    9. Seleccione Láser con desfase en z para el ajuste de enfoque. Si el enfoque no es claro, marque Usar pila Z, haga clic en Calcular desfase y seleccione una distancia focal adecuada. Marque Confocal digital (info) y establezca los parámetros de ajuste para Aumentar nitidez y Reducir ruido en 0.200.
      NOTA: Si la exposición o la claridad de la imagen no son satisfactorias, ajuste la exposición y vuelva a calcular los parámetros de desfase.
    10. Para la segunda Iluminación, seleccione Cy3. Siga los mismos ajustes que en los pasos 2.1.7-2.1.9.
    11. Para la tercera Iluminación, seleccione TL 25. Siga los mismos ajustes que en los pasos 2.1.7-2.1.9.
      NOTA: Establezca la corrección de sombreado según el canal, y TL 25 debe seleccionar Corrección automática para TL. En Longitudes de onda, el canal TL debe configurarse para la ubicación celular y la observación morfológica.
    12. En la pestaña Ejecutar, asigne un nombre a la placa según la convención de nomenclatura: nombre de placa-tipo de célula-ID del experimento-fecha-ampliación del objetivo-tipo de imagen. Confirme los parámetros relacionados con el canal de imagen en Descripción.
    13. Haga clic en Adquirir placa para comenzar la imagen. Una vez finalizada la adquisición, apague secuencialmente el software, el instrumento y la computadora.
      ​NOTA: Posteriormente, la computadora puede abrirse únicamente para exportar imágenes, procesar datos y analizar resultados.
  2. Normas y requisitos de operación de imagen
    1. Centre el campo de visión en el pocillo para evitar efectos de borde (Figura 1A). Durante la configuración de los parámetros de imagen, utilice el control positivo con la mayor intensidad de fluorescencia como referencia. Además, al enfocar, elija un campo de visión con una sola capa de células, limpia y libre de residuos.
    2. Para la cámara, controle que los valores de píxeles sean estrictamente inferiores a 60000 (el valor máximo es 65535) para evitar la saturación, que puede causar pérdida permanente de información. Si aparecen puntos o áreas brillantes saturadas, acorte el tiempo de exposición. Al mismo tiempo, no mantenga el tiempo de exposición demasiado bajo; de lo contrario, el ruido dominará la imagen.
    3. Para señales de fluorescencia débiles, priorice un ligero aumento de la exposición en lugar de elevar forzosamente los parámetros, para evitar daños irreversibles causados por el fotoblanqueo.
      NOTA: Para la imagen de campo claro, estos principios pueden relajarse adecuadamente, pero el enfoque principal sigue siendo la integridad de la señal y la protección de la muestra.
    4. Asegúrese de que los contornos externos de la muestra sean claramente distinguibles y de que las estructuras internas finas (como gránulos, fibras, orgánulos) presenten texturas definidas, sin borrosidad, y de que la luz dispersa de fondo esté distribuida uniformemente sin puntos brillantes locales o halos difusos. Evite estrictamente el enfoque excesivo y el enfoque insuficiente.
    5. Asegúrese de que existan grupos normal, positivo, negativo y experimental, y de que cada grupo de tratamiento tenga al menos 3 pocillos paralelos. Se recomienda organizar los pocillos paralelos verticalmente.

3. Procesamiento y análisis de imágenes

NOTA: Este documento describe tres métodos de procesamiento de imágenes proporcionados por el software complementario del instrumento, todos adecuados para el protocolo de tinción utilizado en este estudio. Aunque estos métodos comparten el mismo principio subyacente de reconocimiento, difieren en las técnicas específicas de procesamiento y en los tipos de resultados de datos. El flujo de trabajo de procesamiento de imágenes fue el mismo en todos los casos: Abrir el archivo → Cargar la imagen original con el método de procesamiento correspondiente → Establecer los parámetros adecuados del canal → Generar una máscara → Establecer el tipo de datos de medición en Medir → Ejecutar el análisis → Observar los resultados → Exportar los datos.

  1. Abra el software de análisis proporcionado con el dispositivo → Revisar placa → Seleccionar placa.
  2. En la vista de fecha, seleccione Disposición de pocillos y elija un campo de visión del grupo positivo como referencia.
  3. En Ejecutar análisis, seleccione el programa de procesamiento correspondiente y configure los parámetros de procesamiento de imágenes o exporte la imagen.
  4. Después de configurar y guardar los parámetros, seleccione Ejecutar en todos los pocillos / Ejecutar en selecciones / Ejecutar en sitio mostrado según el objeto de configuración de parámetros.
  5. Una vez que el ordenador termine de procesar los datos, en la pestaña Mediciones, seleccione el programa de procesamiento de datos correspondiente en Análisis y elija diferentes resultados de medición en Medición para verificar los datos.
  6. Haga clic en Abrir registro para comenzar a exportar los datos. Configure los siguientes detalles en la configuración de parámetros para los tres métodos de procesamiento de imágenes:
    1. Método de procesamiento de imágenes uno: Puntuación celular multilongitud de onda
      1. Seleccione el programa de Puntuación celular multilongitud de onda y configure los ajustes. Establezca el Número de longitudes de onda. Elija Estándar para el Algoritmo.
      2. Configure los parámetros de reconocimiento para todos los núcleos basándose en los resultados de tinción con PI. La imagen fuente predeterminada W1 es el canal DAPI.
      3. Establezca el Ancho mínimo aproximado en 8–10 µm y el Ancho máximo aproximado en 30–35 µm, según el tamaño de los objetos individuales a reconocer.
      4. Establezca la intensidad por encima del fondo local en 2.000–10.000 niveles de gris. Utilice Previsualización para probar y ajustar los parámetros según los resultados de reconocimiento.
      5. Configure los parámetros W2 según los resultados de tinción con Hoechst 33342. Asigne un nombre a este canal. La imagen fuente W2 es Cy3.
      6. En Área teñida, seleccione la región teñida por este canal como Núcleo. Siga los mismos ajustes que en los pasos 3.6.1.3–3.6.1.4 para las configuraciones posteriores. En Configurar registro resumen o Configurar registro de datos (Células), seleccione la configuración de parámetros correspondiente según los parámetros de resultado deseados.
        NOTA: Por lo general, Configurar registro resumen se utiliza para establecer los tipos de datos requeridos, mientras que Configurar registro de datos (Células) se utiliza cuando se necesita una marcación especial de células individuales.
      7. Realice una Ejecución de prueba para observar el reconocimiento. Si los resultados de reconocimiento son satisfactorios, guarde los ajustes.
    2. Método de procesamiento de imágenes dos: Viable-Muerto
      1. Seleccione el programa Viable-Muerto y comience a configurar los ajustes. Configure secuencialmente los parámetros de Longitud de onda 1 y los parámetros de Longitud de onda 2.
      2. En Parámetros de longitud de onda 1, establezca la Fuente de longitud de onda 1 en DAPI. El algoritmo predeterminado es «Estándar».
      3. Establezca el Tipo de célula teñida en Todas las células y el Área teñida en Núcleo según las condiciones de tinción. Configure el Ancho mínimo aproximado, el Ancho máximo aproximado y la intensidad por encima del fondo local utilizando los mismos ajustes que en el método de Puntuación celular multilongitud de onda.
      4. Marque Dividir objetos en contacto y utilice Previsualización para probar.
      5. En Parámetros de longitud de onda 2, establezca la Fuente de longitud de onda 2 en Cy3.
      6. Establezca el Tipo de célula teñida en Muerta y el Área teñida en Núcleo según la tinción específica. Configure el Ancho mínimo aproximado, el Ancho máximo aproximado y la intensidad por encima del fondo local utilizando los mismos ajustes que en el método de Puntuación celular multilongitud de onda.
      7. Haga clic en Configurar registro resumen y seleccione la configuración de parámetros según los tipos de datos requeridos. Realice una Ejecución de prueba para observar el reconocimiento. Si los resultados de reconocimiento son satisfactorios, guarde los ajustes.
    3. Método de procesamiento de imágenes tres: modo desarrollador CME
      1. Seleccione el programa de Módulo personalizado (CME) y comience a configurar los ajustes. Configure los Nombres de imágenes y canales.
        NOTA: Para facilitar los ajustes de parámetros posteriores, generalmente se recomienda establecerlos con los nombres de canal utilizados durante la adquisición de imágenes.
      2. En Encontrar objetos, abra Umbral simple para configurar el reconocimiento del conjunto completo.
      3. Establezca Fuente para que coincida con Nombre de imagen. Según el rango de valores de escala de grises de 16 bits, complete 0 en Umbral inferior y 65535 en Umbral superior.
      4. Asigne un nombre al resultado del procesamiento en Resultado, aplíquelo y observe la situación de marcación. En Encontrar objetos, abra Encontrar manchas para generar un resultado de máscara.
      5. Establezca Fuente para que coincida con Nombre de imagen, como en Umbral simple. Configure el Ancho mínimo aproximado, el Ancho máximo aproximado y la intensidad por encima del fondo local según los ajustes del método de Puntuación celular multilongitud de onda.
      6. Asigne un nombre al resultado del procesamiento en Resultado, aplíquelo y observe el resultado de marcación. Para el resultado de reconocimiento de Encontrar manchas, utilice la herramienta Modificar objetos para filtrar, expandir, contraer e invertir.
      7. En Medir, establezca Modificado. En Entradas de medición, introduzca 1 para Valor de área estándar y marque Crear superposición de objetos.
      8. En Objetos a medir, seleccione la fuente de los objetos marcados en Máscara de objetos y la imagen fuente a medir en Imagen a medir. Elija el Nombre de medición correspondiente según los parámetros de resultado de procesamiento requeridos, aplíquelo y observe el resultado de reconocimiento de parámetros.
      9. Después de confirmar los ajustes de parámetros, guarde la configuración.
    4. Método general: ImageJ
      ​NOTA: Analice los resultados de imágenes utilizando el método ImageJ para imágenes fluorescentes19 y luego realice un análisis comparativo con los tres métodos de este instrumento.
      1. Abra el software ImageJ. Importación de imagen: Archivo → Abrir → Seleccione la imagen original en escala de grises que se analizará.
      2. Convierta la imagen a 8 bits: Imagen → Tipo → 8 bits. Reconocimiento de valor de escala de grises: Imagen → Ajustar → Umbral → Predeterminado, Rojo → Marque Fondo oscuro → Establecer → Aceptar.
        NOTA: Si el reconocimiento del área roja no es satisfactorio, reemplace Predeterminado por uno de los otros 16 modelos de reconocimiento integrados de ImageJ o ajuste el control deslizante en el cuadro de diálogo.
      3. Configure parámetros: Analizar → Establecer mediciones. En el cuadro de diálogo emergente, marque Área, Valor medio de gris, Densidad integrada, Limitar al umbral, Mostrar etiqueta, Redirigir a Ninguno por defecto e introduzca 2 para Número de decimales (0-9). Haga clic en Aceptar.
      4. Analice resultados de reconocimiento: Analizar → Medir. Guarde resultados: En el cuadro de diálogo emergente de resultados, Archivo → Guardar como y seleccione la ubicación de guardado.
  7. Exportación de imágenes
    1. Seleccione un campo de visión de un pocillo positivo de alta calidad como estándar de referencia.
      NOTA: Los requisitos básicos de calidad son autenticidad, enfoque preciso, exposición adecuada (16 bits) y contraste apropiado (una mayor relación señal-ruido es mejor). Los requisitos de alta calidad incluyen características definidas, contraste, utilidad, cambios morfológicos intuitivos y puntos clave resaltados.
    2. En Ejecutar análisis, seleccione ExportPro en la sección Análisis e inicie Configuración de ejecución para análisis. En Seleccionar opciones de salida, elija Canal individual, Superposición de color, reducir imagen (opcional) y Barra de escala (opcional) según los requisitos de la imagen.
    3. Seleccione las imágenes de canales fluorescentes que se exportarán para cada campo de visión. En Canal individual, seleccione un color para cada canal, por ejemplo, Azul para el canal DAPI y Monocromático para el canal TL.
    4. En Superposición de color, seleccione los canales correspondientes a CAMPO CLARO, ROJO, AZUL y VERDE en orden (seleccione la longitud de onda de color para la superposición de color). Establezca el Número en 100; observe la imagen de previsualización y acepte el resultado de previsualización.
    5. En salida, seleccione la carpeta donde se almacenarán las imágenes exportadas en Exportar a carpeta. Inicie la ejecución.
      NOTA: Las imágenes de un mismo lote no deben exportarse por separado; un lote de imágenes se refiere a un conjunto de imágenes de cuatro muestras centrales: control negativo, control positivo, grupo de control básico y grupo experimental objetivo, todas obtenidas bajo condiciones experimentales completamente consistentes.
  8. Comparación de métodos de procesamiento de imágenes
    1. Seleccione 9 campos de visión y compare el conteo manual tradicional de células muertas y viables con los métodos de Puntuación celular multilongitud de onda, Viable-Muerto, CME e ImageJ para el conteo de células viables, células muertas y la relación de muertas a viables. Utilice GraphPad Prism versión 10.1 para realizar un ANOVA unidireccional, acompañado de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, para analizar las diferencias.
    2. Seleccione 81 campos de visión y compare las diferencias en el conteo celular, área e intensidad entre los métodos de Puntuación celular multilongitud de onda, Viable-Muerto, CME e ImageJ. Utilice GraphPad Prism versión 10.1 para realizar un ANOVA unidireccional, acompañado de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, para analizar las diferencias.
      NOTA: Los experimentos de cultivo celular y tinción deben realizarse dentro de una cabina de seguridad biológica. Deseche los líquidos residuales, puntas y otros residuos experimentales según las normativas del laboratorio. Asegure una protección completa durante todo el experimento.

Resultados

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Impacto de la preparación estandarizada en la calidad de la imagen

Los parámetros de la placa se configuraron para garantizar que el instrumento pudiera localizar de forma confiable la capa de imágenes celulares. Las muestras preparadas como una sola capa de células con una confluencia moderada facilitaron el enfoque de la imagen a diferentes aumentos del objetivo y mejoraron el reconocimiento de imágenes y el análisis cuantitativo. La preparación estandarizada de muestras y la optimización de los parámetros de la placa minimizaron eficazmente los efectos de borde, el solapamiento celular y otros factores que contribuyen a una imagen de baja calidad (Figura 1).

Comparación de las funciones del método de cálculo de imágenes

Se utilizó el método de doble tinción con PI/Hoechst 33342 para distinguir células vivas y muertas. Los métodos de puntuación celular multilongitud de onda, de células vivas-muertas y de CME procesaron con éxito estas imágenes identificando objetos según la intensidad de fluorescencia y el tamaño del objeto, mientras que ImageJ identificó objetos basándose en valores de escala de grises. Los resultados de marcado obtenidos con estos métodos fueron generalmente comparables (Figura 3A–E).

El método de puntuación celular multilongitud de onda requirió tinción nuclear para identificar todas las células (Figura 4A). Puede procesar hasta 7 canales de imágenes y calcular parámetros que incluyen el recuento celular, el área y la densidad óptica.

El método Live-Dead fue más flexible que el método de puntuación celular multilongitud de onda. Ambos canales proporcionan módulos para tinción nuclear, tinción citoplasmática o tinción combinada nuclear-citoplasmática para identificar todas las células, células vivas o células muertas. La función de separación de objetos superpuestos divide los objetos que se tocan, permitiendo el cálculo del número de células, área y densidad óptica. Sin embargo, dado que solo procesaba datos de dos canales, era especialmente adecuado para ensayos de viabilidad celular doblemente teñidos con PI/Hoechst 33342 (Figura 4B).

El método de CME dependía de una lógica definida por el usuario para el procesamiento de imágenes. El número de canales procesados correspondía al número de canales adquiridos. Los resultados de reconocimiento se refinaron mediante funciones como Rellenar Agujeros, Invertir Objetos, Ampliar Objetos, Reducir Objetos, Operaciones Lógicas, Eliminar Objetos del Borde, Mantener Objetos Marcados, Ampliar Objetos sin Tocar, Marcar Centros de Objetos, Watershed, Eliminar Objetos Marcados y Filtrar Máscara para eliminar impurezas y otras fuentes de interferencia. Este método también permitió el cálculo de múltiples parámetros de objetos para análisis multidimensionales.

ImageJ no procesó múltiples canales simultáneamente. Para lotes de imágenes con variación sustancial del fondo, fue necesario un procesamiento manual y el ajuste de umbrales, lo que aumentó la subjetividad y redujo la reproducibilidad.

Análisis de las diferencias en los resultados del procesamiento

Un análisis comparativo de los métodos de procesamiento de imágenes no mostró diferencias significativas en el número total de células, el número de células muertas o la proporción de células muertas respecto al total entre los métodos de puntuación celular multilongitud de onda, vivo-muerto, CME, ImageJ y el recuento manual tradicional en 9 campos de visión (Figura 5A–C, Archivo Suplementario 1).

De manera similar, no se observó una diferencia significativa en la proporción entre el área de células muertas y el área celular total entre los métodos de puntuación celular multilongitud de onda, vivo-muerto, CME y ImageJ. Sin embargo, se observó una diferencia significativa en la proporción de la intensidad de fluorescencia promedio de las células muertas respecto a la de todas las células entre los métodos de puntuación celular multilongitud de onda, vivo-muerto y CME, basada en datos obtenidos de 81 campos de visión (Figura 5D–F).

Basándose en estos hallazgos, se estableció un flujo de trabajo estandarizado para el sistema de imagen de alto contenido (Figura 6).

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Figura 1: Resultados de imágenes de baja calidad. (A) El campo de visión está cerca del borde del pocillo, mostrando sombras provenientes del borde del mismo (en este caso, células BV2). (B) Las flechas a y b indican el solapamiento de células en el canal DAPI y en el canal TL, con una confluencia excesiva de células, e incluso una segunda capa o algunas células flotantes. (C) El campo de visión no contiene células; los parámetros de la placa son incorrectos; el enfoque no está en la capa celular, o las células no están teñidas, lo que resulta en ausencia de imagen en este campo de visión. Barra de escala = 100 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Configuración de los parámetros de imagen. (A) La flecha a indica el icono de profundidad de bits. (B) La flecha b indica la posición de la Corrección de Sombreado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Resultados del mismo campo de visión identificado mediante varios métodos. (A) Resultados de la máscara de puntuación celular multilongitud de onda: las áreas grises y rojas representan todos los núcleos celulares identificados en el canal DAPI, siendo el área roja la que representa los núcleos de células muertas identificados en el canal Cy3. (B) Resultados de la máscara de células vivas-muertas: las áreas verdes y rojas representan todos los núcleos celulares identificados en el canal DAPI, siendo el área roja la correspondiente a los núcleos de células muertas identificados en el canal Cy3. (C) Resultado de la máscara CME: las áreas amarillas y azules representan todos los núcleos celulares identificados en el canal DAPI, siendo el área azul la correspondiente a los núcleos de células muertas identificados en el canal Cy3. (D) Resultado de la máscara de ImageJ en DAPI. (E) Resultado de la máscara de ImageJ en Cy3. Barra de escala = 100 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Páginas parciales de configuración de parámetros. (A) La ubicación indicada por a muestra que el primer canal de la puntuación celular multilongitud de onda solo puede seleccionar el núcleo; (B) b y c indican que el ensayo de viabilidad celular (Live-Dead) solo puede procesar dos canales, permitiendo la doble tinción con PI/Hoechst 33342 para células muertas y vivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Diferencias en los resultados del procesamiento de imágenes de fluorescencia. (A) Diferencias en el recuento total de células entre los cinco métodos de procesamiento. (B) Diferencias en el recuento de células muertas entre los cinco métodos de procesamiento. (C) Diferencias en la proporción de células muertas respecto al total de células entre los cinco métodos de procesamiento. (D) Diferencias en la proporción de células muertas respecto al total de células entre los cuatro métodos de procesamiento. (E) Diferencias en la proporción del área de células muertas respecto al área total de células entre los cuatro métodos de procesamiento. (F) Diferencias en la proporción de la intensidad media de fluorescencia de las células muertas respecto a la de todas las células entre los cuatro métodos de procesamiento. Todas las barras de error en los gráficos representan desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

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Figura 6: Proceso de operación estandarizado. Flujo de trabajo que resume el procedimiento estandarizado para la preparación de muestras, tinción de fluorescencia, adquisición de imágenes de alto contenido, procesamiento de imágenes, exportación de imágenes y análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo suplementario 1. Datos brutos para el análisis del recuento celular, área e intensidad de fluorescencia presentados en la Figura 5. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Utilizando el método de doble tinción con PI y Hoechst para determinar la viabilidad celular, por ejemplo, el instrumento de alto contenido puede calcular de forma rápida y de alto rendimiento la viabilidad celular dentro del mismo lote mediante módulos algorítmicos integrados. Este método presenta varias ventajas, incluyendo bajo volumen de muestra, bajo costo, daño celular mínimo, baja fotodegradación de la fluorescencia, resistencia al apagado y la capacidad de capturar múltiples imágenes. Además, el tiempo de obtención de imágenes para una placa de 96 pocillos generalmente es solo de 30 a 45 min20.

En el protocolo experimental, para garantizar la calidad de la imagen, preste atención a los siguientes pasos: primero, asegúrese de una densidad adecuada de placas para evitar una densidad celular excesiva, que podría llenar la imagen con células, o una densidad insuficiente, que podría provocar el arrastre de células durante la tinción y los lavados. Segundo, lave completamente el colorante para evitar que queden residuos que afecten la obtención de imágenes. Para células con baja adhesión, manipule con cuidado la adición y eliminación de líquidos de forma suave y lenta antes y después de la tinción, evitando la adición vertical. Utilice una adición por la pared lateral para evitar la pérdida de células en el centro del campo de visión, prestando especial atención al desprendimiento de células muertas durante los ensayos de viabilidad. Considere centrifugar la placa de muestra para reducir errores experimentales si es necesario. Tercero, seleccione un tiempo de exposición adecuado. Una exposición demasiado larga aumentará el tiempo total de obtención de imágenes y podría perderse la ventana de detección, lo que potencialmente llevaría a la sobreexposición de algunas células o al reconocimiento del fondo. Una exposición demasiado corta podría resultar en información de imagen incompleta, perdiéndose algunos detalles característicos.

Si no se puede obtener una imagen nítida durante la adquisición de imágenes, identifique el problema en la condición de las células, residuos del colorante, ajustes de parámetros y otros factores. Durante el experimento, si no hay células en el fondo del pocillo, no se encontrará ninguna imagen en el campo de visión. Si se forman dos o más capas celulares irregulares en el fondo del pocillo, el enfoque se vuelve difícil, lo que resulta en una imagen borrosa. Un exceso de residuo del colorante puede provocar un fondo intenso, haciendo que la imagen objetivo sea menos visible. Áreas grandes de residuo del colorante pueden ocultar células en el campo de visión, mientras que partículas pequeñas de residuo, similares en tamaño a las células, pueden interferir con el reconocimiento y la segmentación posteriores de la imagen. Si la altura de la placa y la altura del pocillo no se ajustan según las especificaciones del fabricante para la placa de 96 pocillos, no se encontrará ninguna imagen en el campo de visión, o la posición de la muestra puede desplazarse, lo que podría dañar el objetivo del lente.

Dada la flexibilidad y simplicidad de operación, así como los buenos resultados en el procesamiento de datos, el módulo de procesamiento de imágenes óptimo para el método de doble tinción con PI y Hoechst es Live-Dead. Este programa está específicamente optimizado para los colorantes PI y Hoechst y, en comparación con otros métodos y software, es sencillo de operar, realiza cálculos rápidamente y permite la carga fácil de imágenes por lotes en la base de datos con configuraciones de parámetros consistentes. Los resultados son más comparables que los obtenidos con el software comúnmente utilizado actualmente, ImageJ. Diferentes modos experimentales pueden utilizar métodos propietarios correspondientes o el modo general de cálculo Multi-Wavelength Cell Scoring; los métodos propietarios son más convenientes, mientras que el modo de cálculo general tiene menos restricciones respecto a los métodos de tinción. Diferentes protocolos de tinción requieren diferentes módulos óptimos de procesamiento de imágenes. Desarrolle métodos computacionales adaptados a los objetivos experimentales. El método ExportPro para la exportación de imágenes es sencillo y fácil de aprender, y permite la visualización previa de objetos de referencia. Es amigable para principiantes, con una interfaz gráfica que explica claramente el significado de los parámetros y simplifica las mediciones, eliminando barreras al análisis con múltiples programas y ahorrando tiempo en el aprendizaje de herramientas.

Este estudio solo validó un protocolo básico de tinción. Como referencia, otros protocolos experimentales que difieren significativamente de este aún deben validarse frente al nuevo estándar.

El sistema de imagen de alto contenido sirve como una plataforma tecnológica fundamental que integra imágenes de alta resolución, detección sincrónica multiparamétrica, análisis cuantitativo automatizado y cribado de alto rendimiento21,22,23. Se espera que el diseño integrado de las capacidades de imagen y cálculo del dispositivo permita el desarrollo y establecimiento de protocolos experimentales y modelos computacionales correspondientes para un mayor número de experimentos de imagen existentes7,24, mejorando最终mente la consistencia y comparabilidad de los datos obtenidos por diferentes operadores, en diferentes momentos y entre lotes.

Divulgaciones

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Todos los autores declaran que no existe ningún conflicto de interés. Durante la traducción del manuscrito, Zhipu AI se utilizó únicamente para la traducción y no para generar datos de investigación, resultados experimentales ni contenido académico central. Los autores asumen total responsabilidad por el contenido del manuscrito.

Agradecimientos

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Los autores agradecen el apoyo brindado por la Fundación de la Escuela de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu. Los autores agradecen el apoyo del subsidio MPRC2022034. Esta financiación se utiliza para desarrollar un método de imagen dinámica tridimensional para bacterias intestinales en la Decocción Erchen destinado a tratar ratones obesos simples. Los autores reconocen la plataforma de investigación proporcionada por el Instituto Innovador de Medicina y Farmacia China de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu y por el Instituto de Estudios Interdisciplinarios.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de centrífuga de 1,5 mLLabigic Technology Co., Ltd.MCT-001-150
Puntas de pipeta de 1000 µLLabigic Technology Co., Ltd.35423003E
Tubo de centrífuga de 15 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-15A
Puntas de pipeta de 2,5 µLQingdao Haier Biomedical Co., Ltd.B10T
Puntas de pipeta de 200 µLLabigic Technology Co., Ltd.T-001-200
Tubo de centrífuga de 50 mLLabigic Technology Co., Ltd.CT-002-50A
Placa de cultivo celular de 96 pocillosCorning Incorporated3599
Pipeta monocanal ajustable, 0,1–2,5 μLEppendorf SE3120000216
Pipeta monocanal ajustable, 100–1000 μLEppendorf SE3120000267
Pipeta monocanal ajustable, 20–200 μLEppendorf SE3120000259
Pipeta monocanal ajustable, 2–20 μLEppendorf SE3120000232
Placa de cultivo celularCorning Incorporated430167
Viales criogénicosLabigic Technology Co., Ltd.BS-20-ST
Dietil sulfoxido (DMSO)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.D8371
Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)Life Technologies Limited11966-025En este estudio, el DMEM completo se preparó utilizando 10 % de FBS, 1 % de solución de penicilina-estreptomicina y 89 % de DMEM.
Incubadora de CO2 ESCO CelCultureEsco Micro Pte. Ltd.CCL-170B-8
Suero bovino fetal (FBS, Superfine)Procell Life Science & Technology Co., Ltd.164210-50
Tinciones fluorescentes Hoechst 33342Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.B8040
Célula HT22Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0697
ImageJNational Institutes of HealthImageJ es uno de los programas informáticos de procesamiento de imágenes utilizados en el manuscrito.
Sistema de imágenes de alto contenido con microscopio confocal ImageXpressMolecular Devices, LLCImageXpress Micro ConfocalEn el manuscrito, utilice «Sistema de imágenes de alto contenido» como sustituto del nombre del instrumento.
Centrífuga refrigerada de baja velocidadHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.L530R
Software de adquisición y análisis de imágenes de alto contenido MetaXpressMolecular Devices, LLCEl software es un complemento del sistema de imágenes de alto contenido con microscopio confocal ImageXpress®. En el manuscrito, «El software de análisis proporcionado con el dispositivo» se refiere a este software.
Cabina de flujo laminar vertical OptiMairEsco Micro Pte. Ltd.ACB-4E1
Parafilm MPechiney Plastic Packaging Inc.PM996
PBS Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd YC-5013
Solución de penicilina-estreptomicinaProcell Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
Solución de yoduro de propidio (PI)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.C0080
Solución de tripsina-EDTABasalMedia Technology Co., Ltd.S310KJ

Referencias

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