Un ensayo de complementación con luciferasa dividida para la medición temporalmente resuelta de la eliminación de tau en microglía

Resumen

Describimos una plataforma cuantitativa sensible y resuelta en el tiempo para medir la eliminación de la tau extracelular en microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC) utilizando un sistema de luminiscencia basado en microplacas. Este enfoque permite la detección sensible de la cinética de degradación de tau en formato micropozo, lo que permite una interrogación de alto rendimiento del manejo de tau bajo diversas condiciones experimentales.

Resumen

Como células inmunitarias residentes del sistema nervioso central, la microglía es reguladora central de la homeostasis cerebral y mediadora clave de las enfermedades neurodegenerativas. Estas células estudian continuamente el entorno neural y desempeñan un papel fundamental en el reconocimiento, internalización y degradación de sustratos extracelulares, incluyendo proteínas mal plegadas y agregadas como las tau patológicas. A pesar de la creciente evidencia que implica la microglía en la eliminación de tau, los enfoques existentes para medir la captación y degradación de tau carecen de la resolución temporal y la sensibilidad necesarias para captar plenamente estos procesos dinámicos. Aquí, desarrollamos un ensayo basado en luminiscencia para monitorizar cuantitativamente la eliminación de tau en microglías derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC). Esta plataforma aprovecha un sistema de complementación basado en luciferasa dividida para permitir la detección altamente sensible y en tiempo real de tau en células vivas, lo que permite un seguimiento preciso de su procesamiento intracelular. Este ensayo es escalable y adaptable a múltiples tipos celulares, proporcionando una herramienta versátil para analizar las vías endolisosomales y los mecanismos celulares que rigen el manejo de tau en enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer.

Introducción

Las tauopatías, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), se caracterizan por la agregación y dispersión de la proteína tau asociada a microtúbulos a través de los circuitos^{neuronales 1,2}. Las glias han sido cada vez más valoradas como reguladoras de la dinámica de la enfermedad tau, incluyendo la absorción, degradación y^propagación 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Comprender cómo contribuyen las gliales a las tauopatías es una preocupación urgente para resolver dinámicas clave de enfermedades, incluyendo la neuroinflamación y la propagación de la tau. Entre las poblaciones gliales, la microglía —los fagocitos residentes del cerebro— está en una posición única para mediar la eliminación de tau.

A pesar de la urgente necesidad de dilucidar los mecanismos de manejo de tau en microglías, el campo sigue limitado en la resolución y el rendimiento de los ensayos disponibles. Las cuestiones clave sobre la internalización de las tau, el tráfico intracelular y la eliminación celular siguen sin resolverse. Cada uno de estos pasos representa un proceso mecanicamente distinto: la captación se refiere a la internalización de tau extracelulares en la membrana plasmática; El tráfico abarca la clasificación y transporte de tau internalizados a través de compartimentos endosomales, lisosomales y otros compartimentos intracelulares; y la degradación denota la degradación proteolítica de la tau, principalmente a través de vías lisosomales y proteasómicas. Aunque estos pasos son secuenciales para el procesamiento extracelular de tau, ya que la tau internalizada debe transitar compartimentos intracelulares antes de alcanzar la maquinaria degradativa, están regulados de forma independiente y una perturbación experimental dada puede afectar un paso sin alterar otros. Por ejemplo, una reducción en la señal tau intracelular podría reflejar una captación deteriorada, un error de desviación fuera de los compartimentos degradativos o una degradación acentuada. Resolver estos procesos requiere nuevas plataformas de ensayo que puedan detectar la presencia de proteínas y combinarse con medidas existentes para determinar el destino de las proteínas a lo largo del tiempo.

Los métodos actuales para resolver la internalización y degradación de tau se basan en inmunocitoquímica, citometría de flujo, western blot y marcajes fluorescentes para cuantificar la captación, localización subcelular y procesamiento intracelular de especies^tau 13,14,15,16,17,18 . Sin embargo, cada uno de estos enfoques presenta limitaciones fundamentales cuando se aplican al estudio de la dinámica de eliminación de proteínas. La inmunocitoquímica y el western blot carecen de sensibilidad para detectar especies tau de baja abundancia y requieren mucho trabajo. La citometría de flujo y los ensayos basados en fluorescencia no informan fielmente sobre la eliminación de proteínas porque los fluoróforos pueden persistir después de que la proteína conjugada haya sido^{degradada 19}, desacoplando así la señal fluorescente del destino real de la proteína de interés. En conjunto, estas restricciones dejan un hueco crítico, sin que ningún método existente proporcione simultáneamente la sensibilidad, resolución temporal y escalabilidad necesarias para seguir cuantitativamente la dinámica de despegue de tau. Por lo tanto, un gran obstáculo para avanzar en la comprensión de la dinámica de manejo de tau en la microglía ha sido la falta de ensayos cuantitativos, con resolución temporal y alto rendimiento para medir la aclaración de tau en células vivas.

Para abordar la falta de una plataforma cuantitativa para monitorizar la dinámica de tau vivo, desarrollamos un ensayo sensible basado en luminiscencia que puede utilizarse para detectar la dinámica intracelular de la proteína tau. Este enfoque emplea un sistema de complementación basado en luciferasa dividida, en el que una pequeña etiqueta peptídica (High Affinity Binary Technology o HiBiT) se fusiona con tau, permitiendo mediciones cinéticas en células vivas. Al interactuar con su compañero complementario de unión (Tecnología Binaria Grande o LgBiT), la proteína marcada reconstituye una enzima luciferasa activa, generando una señal bioluminiscente^cuantitativa 20,21,22. Esta señal luminiscente proporciona una lectura directa y sensible de la abundancia de proteínas, permitiendo el seguimiento dinámico de los cambios en los niveles intracelulares a lo largo del tiempo. Como resultado, la luminiscencia puede utilizarse como un reportero robusto de la presencia o pérdida de proteínas, como en el caso de la degradación intracelular. En conjunto, esta plataforma permite una medición precisa y temporalmente resuelta del manejo de tau y ofrece una estrategia ampliamente aplicable para estudiar la renovación proteica.

Protocolo

Todos los experimentos celulares se realizaron en un laboratorio adecuado de Bioseguridad Nivel 2, aprobado por los Servicios Ambientales y de Salud de la Universidad de Massachusetts Amherst.

1. Expresión, purificación y eliminación de endotoxinas de la proteína Tau-SLP

1. Añadir el péptido de luciferasa dividida o la etiqueta SLP (VSGWRLFKKIS) sobre una construcción Tau para crear una construcción etiquetada (Tau-SLP) utilizando métodos estándar de clonación, como el ensamblaje^{Gibson 23}.
   NOTA: La complementación de la etiqueta peptídica de luciferasa dividida genera una señal robusta cuando se coloca en el terminal C, N-terminal o en los dominios internos de 2N4R Tau²⁴.
2. Exprime y purifica la Tau-SLP usando los métodos previamente^{descritos 25,26} y asegura la pureza usando SDS-PAGE e inmunobloting.
3. Para su uso con células microgliales, siga los protocolos publicados para eliminar endotoxinas bacterianas tras la purificación con Tau-SLP con el fin de limitar la reactividad de^{confusión 27}.
4. Cuantificar la concentración de proteínas Tau-SLP utilizando un ensayo estándar de ácido bicinconinico (BCA) o ensayo^{de Bradford 28,29}.
5. Si se desea, agregar Tau-SLP siguiendo los protocolos²⁴ previamente décritos.
6. Validar la luminiscencia funcional de la Tau-SLP generando una curva estándar utilizando un sustrato de luciferasa y un reactivo de complementación disponibles comercialmente, siguiendo las instrucciones del fabricante (véase Tabla de Materiales).

2. Cultivo de microglía derivada de iPSC (iTF-Microglia)

1. Cultivar células microgliales en 5% de_CO2 a 37 °C en el medio de cultivo adecuado.
2. Diferenciar una línea de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) que albergue seis factores de transcripción inducibles por doxiciclina para producir una célula similar a la microglia (inducida con factor de transcripción microglia-Like o iTF-Microglia) utilizando un protocolo^{validado 30} (véase la Tabla de Materiales).
   NOTA: Este ensayo no se limita a la iTF-Microglía y puede usarse con cualquier línea celular adherente. Puede ser necesaria optimizar los tiempos de eliminación al trabajar con otras líneas celulares.

3. Ensayo de eliminación de tau

1. En una placa de 24 pozos, las células de placa a una densidad de 1 x 10⁵ células por pozo, en triplicado por condición, con medio de cultivo (250 μL) e incuban durante la noche a 37 °C y 5% de_CO2 (Figura 1A).
2. Retirar el medio de cultivo, lavar las células una vez con PBS (250 μL) y reemplazar por un medio de cultivo de 250 μL.
3. Para medir temporalmente la limpieza de Tau-SLP, exponer las células a Tau-SLP de forma escalonada para que todos los pozos se extraigan simultáneamente, aunque solo difieran en el tiempo de limpieza. Por ejemplo, para grupos de despeje de 0, 2 h y 4 h, añadir primero un medio que contenga Tau-SLP de 100 nM al grupo de 4 h, luego 1 h después al grupo de 2 h y finalmente 1 h después al grupo de 0 h (véase la Figura 1B para recomendaciones de temporización). Una vez completado el periodo final de internalización, todos los pozos habrán pasado por el mismo periodo de exposición a Tau-SLP, pero solo diferirán en la duración del despeje (Figura 1B).
4. Incluir pozos que no reciben tratamiento Tau-SLP para la sustracción de fondo (Figura 1C).
5. Al final del periodo de internalización, se retira el medio que contiene Tau-SLP. Lava las células tres veces con PBS para eliminar la Tau-SLP extracelular y sustituyela por un medio de cultivo libre de Tau-SLP.
6. Incubar las células durante el periodo de liberación designado (Figura 1A). El grupo de liberación de 0 h, cosechado inmediatamente después del periodo de internalización, representa la cantidad total de Tau-SLP internalizada al inicio de la fase de liberación.
7. Siguiendo todos los puntos de tiempo de liberación, retirar el medio de los pozos y lavar con PBS de 250μL.
8. Trata cada pozo con 250 μL de tripsina-EDTA 0,25% durante 5 minutos a 37 °C. Este paso elimina la tau unida a la superficie para asegurar que la luminiscencia refleje la Tau-SLP internalizada. Neutraliza cada pozo con un inhibidor de tripsina de 250 μL (5 mg/mL).
9. Recoge cada pozo en un tubo microcentrífuga de 1,5 mL correctamente etiquetado y en pellets mediante centrifugación (500 x g, 5 min).
10. Prepara una cantidad adecuada de tampón de lisis que contenga sustrato luciferasa y componentes de complementación (véase Tabla de Materiales; 50 μL x # de pozos + 10%).
11. Retirar cada sobrenadante con una pipeta aspiradora y volver a suspender el pellet celular en 50 μL de tampón de lisis que contiene sustrato de luciferasa y componentes de complementación. Esto producirá un complejo de complementación de luciferasas divididas y generará luminiscencia (Figura 1D).
12. Transfiere las células lisadas a una placa blanca de medio volumen de 96 pozos.
13. Lee la luminiscencia en un lector de microplacas con agitación orbital durante 10 s a temperatura ambiente (~23 °C) antes de la lectura para asegurar la lisis completa de los pellets celulares.
14. Determinar la abundancia normalizada de Tau-SLP restando primero el valor medio de luminiscencia obtenido de pozos no expuestos a Tau-SLP. Normalizar cada valor a la señal media de fondo restada del grupo de despeje 0 h.
15. El gráfico normalizó la abundancia de Tau-SLP en función del tiempo de despeje. Una reducción progresiva de la luminiscencia indica una disminución en la abundancia intracelular de Tau-SLP y se interpreta como la clearance Tau-SLP, mientras que los valores estables de luminiscencia indican una clearance deteriorada o retrasada. Calcular el porcentaje de despeje como: % de reñimiento = [1 − (LUt / RLUt = 0)] x 100.

Resultados

Utilizando este ensayo sensible basado en luminiscencia, la abundancia intracelular de Tau-SLP podría monitorizarse a lo largo del tiempo tras un periodo sincronizado de captación en microglías derivadas de iPSC humanas. Tras el lavado de Tau-SLP, la luminiscencia disminuyó de forma constante, coherente con la eliminación intracelular de Tau-SLP. Esta plataforma era lo suficientemente sensible para detectar diferencias en el manejo de especies monoméricas y fibrilares de Tau-SLP por parte de la microglía. La Tau-SLP monomérica se eliminó completamente en la iTF-Microglía en 60 minutos, mientras que la Tau-SLP fibrilar persistió durante más de 240 minutos (Figura 2A). Además, hemos realizado el ensayo con tau mutante (por ejemplo, N279K) para evaluar la cinética de clearance y hemos encontrado que TauN279K-SLP muestra una cinética de clearance significativamente reducida solo en puntos cortos de tiempo de clearance (15 min) (Figura 2B). Estos resultados sugieren que la degradación observada puede ser solo evidente debido a la alta sensibilidad de este ensayo. Hemos realizado el experimento de degradación de Tau-SLP utilizando la pequeña molécula L-Leucil-L-Leucina éster metilo (LLOMe) para confirmar la implicación lisosomal. LLOMe es un sustrato de catepsina C que permeabiliza las membranas lisosomales, interrumpiendo la actividad^lisosomal. Con el tratamiento con LLOMe, hemos observado un aumento significativo de los niveles estables de Tau-SLP a t=0 (Figura 3A) y una tasa de degradación significativamente reducida (Figura 3B), con un aumento de 4 veces de la Tau-SLP restante tras un tiempo de eliminación de 60 minutos. Por último, hemos realizado el ensayo de eliminación Tau-SLP en neuronas derivadas de iPSC para confirmar la compatibilidad del ensayo entre tipos celulares. Aquí hemos encontrado que las neuronas derivadas de iPSC tienen una cinética de clearance reducida tanto para las formas monoméricas (Figura 4A) como para las fibrillas (Figura 4B) de la Tau-SLP. Lo más destacado es que los niveles de fibrilla Tau-SLP se mantienen estables en ~100% durante una eliminación de 240 minutos, mientras que en el mismo periodo los niveles de fibrilla Tau-SLP han bajado por debajo del 50% en iTF-Microglia. Estos resultados demuestran que nuestra plataforma de complementación basada en luciferasa dividida ofrece una detección robusta y fiable de la eliminación endolisosomal intracelular de la Tau-SLP y demuestra un diseño de ensayo altamente adaptable que podría aplicarse a numerosas otras proteínas o tipos celulares.

Figura 1: Diseño experimental representativo del ensayo de eliminación Tau-SLP. (A) Imagen representativa de campo claro de la iTF-Microglía utilizada para este ensayo (barra de escala = 100μm) (B) La microglía humana (iTF-Microglia) se expone a la 2N4R-SLP recombinante de manera escalonada, lo que permite una detección robusta basada en luminiscencia. Tras una incubación de 1 hora, la tau extracelular se elimina mediante intercambio de medios y las células se lavan con PBS. Las células se mantienen en medios basales durante su respectivo periodo de eliminación (0 h, 2 h, 4 h) antes de la cosecha. En el extremo, las células se lisan y se mide la luminiscencia. (C) Diseño propuesto de placas para medir el espacio de la Tau-SLP comparando la degradación monomérica con la fibrilar. (D) La proteína Tau-SLP se internaliza en las células y se dirige para la degradación lisosomal. La adición de LgBiT proporciona una lectura cuantitativa de la cantidad de Tau-SLP restante en la célula mediante la complementación y producción de luminiscencia. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: iTF-Microglía limpia de Tau-SLP extracelular. (A) la iTF-Microglía estuvo expusa a Tau-SLP monomérica (100nM) o Tau-SLP fibrilar (50nM), las muestras se normalizaron a la captación inicial respectiva (t = 0; 100%) y a células que no estuvieron expuestas a Tau-SLP (0%) (media ± DS; n = 9 a partir de tres diferenciaciones independientes). (B) la iTF-Microglia se incubó con Tau-SLP monomérica o TauN279K-SLP (100nM), y las muestras se normalizaron a la captación inicial respectiva (t = 0; 100%) y a las células no expuestas a Tau-SLP (0%) (media ± SD; n ≥ 7 a partir de tres diferenciaciones independientes; ∗ p < 0,05 usando la prueba t de Welch no emparejada). Datos reimpresos de Shultz et al., 2025²⁴, y usados bajo una licencia Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3: La inhibición lisosomal afecta la clearance de la Tau-SLP. (A) El tratamiento con 1 mM inhibidor lisosomal L-Leucil-L-Leucina (LLOMe) durante 24 horas aumentó la captación inicial de Tau-SLP (t = 0) en células neurogliomas H4 (media ± DS; n = 9 cultivos independientes; ∗ p < 0,05 usando la prueba t de Welch no emparejada). (B) El tratamiento con LLOMe (1 mM) durante 24 horas incrementó el % normalizado de la RLU de la Tau-SLP tras un tiempo de liberación de 60 minutos (t = 60 min) en comparación con el vehículo (DMSO). La señal luminiscente se normaliza a los niveles iniciales de captación respectivos (100%) y a las células que no estuvieron expuestas a Tau-SLP (0%) (media ± SD; n = 9 cultivos independientes; ∗∗∗∗ p < 0,0001, ∗ p < 0,05 usando la prueba t de Welch no emparejada). Datos reimpresos de Shultz et al., 2025²⁴, y usados bajo una licencia Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: La iTF-Microglía y las iNeuronas muestran diferencias en la clearance Tau-SLP. (A) las iTF-Microglia o iNeuronas fueron incubadas con Tau-SLP monomérica (100nM), las muestras se normalizaron a la captación inicial respectiva (t=0; 100%) y las células que no estuvieron expuestas a Tau-SLP (0%) (media±DE; n ≥ 6 a partir de dos o tres diferenciaciones independientes; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 usando una ANOVA bidireccional; tiempo: F(1, 28) = 7,489, p = 0,0107; tipo celular: F(1, 28) = 46,61, p < 0,0001; interacción: F(1, 28) = 3,229, p = 0,0831; La prueba de comparaciones múltiples de Sidak, valores p indicados en la figura, valores t=0 se muestran como referencia pero fueron excluidos del análisis estadístico). (B) las iTF-Microglía o iNeuronas fueron incubadas con Tau-SLP fibrilar (50nM), las muestras normalizadas a la captación inicial respectiva (t=0; 100%) y las células que no estuvieron expuestas a Tau-SLP (0%) (media±DE; n ≥ 6 de dos a tres diferenciaciones independientes; ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗∗ p < 0,0001 usando una ANOVA bidireccional; tiempo: F(1, 26) = 0,3888, p = 0,5384; Tipo de celda: F(1, 26) = 43,09, p < 0,0001; interacción: F(1, 26) = 1,209, p = 0,2816; La prueba de comparaciones múltiples de Sidak, valores p indicados en la figura, valores t=0 se muestran como referencia pero fueron excluidos del análisis estadístico). Datos reimpresos de Shultz et al., 2025²⁴, y usados bajo una licencia Creative Commons Attribution (CC BY 4.0). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discusión

Este ensayo proporciona una plataforma escalable y cuantitativa para medir la eliminación extracelular de Tau-SLP por microglía con alta sensibilidad y resolución temporal. A diferencia de los enfoques tradicionales basados en imagen, que a menudo requieren un procesamiento laborioso de muestras y están limitados en el rendimiento y el muestreo temporal, este sistema basado en luminiscencia permite la cuantificación directa y a nivel poblacional del manejo de tau en formato de microplacas. La lectura resultante proporciona una medición cuantitativa de la claridad de la Tau-SLP tras la exposición a la tau extracelular. Dado que las mediciones pueden obtenerse repetidamente a lo largo de múltiples puntos temporales y con periodos de incubación más largos, el ensayo permite un análisis de alto rendimiento y con resolución cinética de la dinámica de captación y eliminación de tau. Además, los cambios en la luminiscencia a lo largo del tiempo son consistentes con cambios en la abundancia intracelular de Tau-SLP, pero no distinguen entre tráfico, degradación o secreción sin enfoques complementarios. Aunque el marcado Tau-SLP no alteró significativamente la captación o agregación de tau en nuestro estudio^{compañero 24}, las etiquetas exógenas pueden influir en el comportamiento de otras proteínas. Por lo tanto, los hallazgos del ensayo deben complementarse utilizando enfoques ortogonales y compararse con preparaciones tau sin etiquetar cuando sea posible. Una limitación adicional es que este ensayo utiliza especies recombinantes de Tau-SLP en lugar de tau endógenos o agregados patológicos derivados del paciente. Aunque la tau recombinante 2N4R proporciona un sustrato experimental reproducible, no recapitula completamente la heterogeneidad endógena (es decir, modificaciones postraduccionales) de especies tau aisladas de cerebros humanos de pacientes. Existen muchos protocolos para la fosforilación in vitro de la proteína tau recombinante y podrían incorporarse fácilmente a este flujo de trabajo. Esta plataforma también podría adaptarse para estudiar tau endógenos; esto requeriría el uso de ingeniería genética para incorporar una secuencia de etiquetas SLP en el locus tau (MAPT).

Es importante destacar que la interpretación de la reducción de señal como degradación depende de la eliminación efectiva de tau extracelular y unida a la superficie, por ejemplo, mediante tripsinización o pasos equivalentes de despullado. Podrían producirse falsos negativos si no se logra una eliminación efectiva. También es posible una pérdida aparente de señal que se interpretaría como un falso positivo de degradación de tau. Esto podría deberse al desprendimiento o muerte celular, la secreción de Tau-SLP o la clivación proteolítica que separa el SLP de la tau sin degradar la proteína. Por tanto, las disminuciones en la luminiscencia deben interpretarse como reducciones en la abundancia intracelular de Tau-SLP en lugar de mediciones directas de la degradación lisosomal. Para atribuir de forma más definitiva los cambios de señal a la degradación lisosomal, se recomiendan estrategias de validación ortogonales. Estos pueden incluir perturbaciones farmacológicas de la función lisosomal, como el tratamiento con bafilomicina A1 o LLOMe (Figura 3), así como diseños experimentales de persecución de pulsos para resolver la cinética de captación frente a degradación.

La flexibilidad de este ensayo lo hace muy adecuado para examinar mecanismos que regulan la captación de tau, el tráfico intracelular y la degradación, así como para el cribado de moduladores farmacológicos o genéticos de la eliminación de tau en sistemas celulares humanos. Aunque se ha demostrado aquí en microglías derivadas de iPSC, la plataforma es fácilmente adaptable a otros tipos celulares (Figura 4), lo que permite una aplicación amplia en modelos de biología tau y enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías primarias y secundarias. Dado que este ensayo depende de la exposición extracelular de la Tau-SLP y la detección basada en luminiscencia, debería ser fácilmente adaptable a astrocitos, oligodendrócitos o líneas celulares comúnmente utilizadas, aunque puede ser necesaria optimizar las condiciones de captación. En conjunto, este enfoque proporciona una herramienta poderosa para diseccionar las vías celulares implicadas en la proteostasis y avanzar en la comprensión mecanicista de los procesos de enfermedades neurodegenerativas.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Accutase	Thermo Scientific	A1110501
Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-268
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231
DMEM/F-12, HEPES	Thermo Scientific	11330057
Doxyciclina	Clontech	631311
DPBS	Thermo Scientific	14-190-250
GlutaMAX	Thermo Scientific	35050061
Software de gráficos	GraphPad Prism (o similar)	n/a
Human GM-CSF	Thermo Scientific	300-03
KnockOut DMEM	Thermo Scientific	10829018
Luminescent Plate Reader	SpectraMax i3x (o similar) - Molecular Devices	n/a
Microcentrifuge Tubes	Fisher Scientific	02-682-002
Microplate, 96 Well, PS, Half-area, White	Greiner	675075
mTeSR Plus	STEMCELL Technologies	100-0276
Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System	Promega	N3030
Poly-L-Lysine hydrobromide	Fisher Scientific	ICN15017750
Recombinant Human IL-34	Thermo Scientific	200-34
Recombinant Human M-CSF	Thermo Scientific	300-25
Recombinant Human TGF-β1	Thermo Scientific	100-21C
Surface Treated Sterile Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	FB012927
Tau-HiBiT protein	In house	n/a	Proteína Tau con una etiqueta de péptido VSGWRLFKKIS
Trypsin Inhibitor	Sigma Aldrich	T9128
Trypsin-EDTA	Thermo Scientific	5-200-072
Y-27632 dihydrochloride	Bio-techne	1254