Un protocolo eficiente de cría y microinyección para la modificación genética de la mosca estable, Stomoxys calcitrans

Summary

Este protocolo describe un método fiable de microinyección embrionaria para integrar material genético extraño en el genoma de moscas estables, un sistema de cribado fluorescente para monitorizar el desarrollo embrionario tras la inyección, y un sustrato de cría larval compuesto por ágar de yema de huevo suplementado con carbón activado inoculado con Escherichia coli que apoya el desarrollo de huevo a adulto.

Abstract

Las moscas de cuadra son plagas que se alimentan de sangre para el ganado, animales de compañía y humanos, y se encuentran en todos los continentes excepto en la Antártida. Las mordeduras dolorosas tanto de hombres como de mujeres inducen comportamientos relacionados con el estrés en el ganado, lo que resulta en pérdida de peso y pérdidas económicas sustanciales para los productores. Tanto los machos como las hembras de moscas de cuadra son hemorragicos obligatorios, lo que supone un reto para la técnica de insectos estériles y otras estrategias de control de plagas que requieren la liberación masiva de machos. Las estrategias actuales de manejo estable de plagas de moscas a menudo no logran controlar adecuadamente las poblaciones de moscas. Aunque se han desarrollado numerosos métodos de manipulación genética para introducir material genético exógeno o inducir knockouts génicos para mosquitos, Drosophila y otros grupos modelo de insectos, los métodos para la transformación genética de moscas estables siguen siendo limitados. Este protocolo describe un enfoque fiable y mejorado para introducir material genético extraño en moscas estables utilizando una variante hiperactiva de la transposasa piggyBac y un nuevo medio sólido de cría larval que favorece la recuperación larvaria, la eclosión, la alimentación y el cribado fluorescente tras microinyección embrionaria.

Introduction

Las moscas de cuadra (Stomoxys calcitrans L., 1758) son plagas y vectores de enfermedades económicamente^{importantes en el ganado 1,2,3} y tienen una distribución cosmopolita a nivel global. Las estrategias de gestión integrada de plagas (MIP) a menudo no logran controlar adecuadamente las poblaciones estables de^{moscas 2,3}, lo que resulta en pérdidas anuales estimadas en superar los 2.000 millones de dólares solo en Estados^Unidos. Además, se ha documentado resistencia a insecticidas en poblaciones estables de moscas en^{Europa 4,5} y también se ha reportado en Estados^Unidos6. En consecuencia, los enfoques de control genético como la técnica de insectos estériles (SIT) y los sistemas de impulsos genéticos representan añadidos deseables a los programas tradicionales de MII.

Los esfuerzos previos para desarrollar métodos de control genético en moscas estables, incluyendo la generación de cepas genéticas de sexado para SIT, se basaron en la selección genética y la translocación inducida^{por radiación 7,8}. Estos enfoques requieren mucho trabajo y se limitan a modificaciones no transgénicas. Posteriormente, O'Brochta et al.⁹ demostró que el uso del sistema de transposasas de Hermes podía integrar transgenes en S. calcitrans; sin embargo, el protocolo produjo una baja eficiencia de transformación, con aproximadamente el 0,11% de los embriones inyectados produciendo descendencia transgénica, y produjo una débil expresión del marcador de la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) bajo el control de un promotor^{exógeno 9}.

Otros enfoques de manipulación genética, incluidos los sistemas CRISPR-Cas, aún no se han aplicado ampliamente en moscas estables, en parte debido a la dificultad de penetrar el corión resistente de embriones de moscas estables. El corión exterior duro es comparable al de otras moscas^{musculosas 10,11}. Los intentos de inyectar a través del corión usando agujas de cuarzo o de retirar el corión con cinta adhesiva de doble cara no tuvieron éxito, requiriendo tratamiento con una solución oxidante (hipoclorito de sodio al 3%, NaOCl), que reduce las tasas de eclosión de huevos.

Las moscas estables pueden mantenerse a largo plazo en condiciones de laboratorio, y las etapas inmaduras suelen criarse en sustratos celulósicos fermentados como astillas de madera, salvado de trigo o paja suplementadas con fuentes de nitrógeno, incluyendo suplementos de proteína de ternera o copos de pescado¹². Sin embargo, estos sustratos presentan varios inconvenientes cuando se utilizan para la cría de embriones microinyectados. Su opacidad y alta autofluorescencia dificultan identificar larvas positivas para GFP tras la eclosión y la excavación en el sustrato. Además, aunque se requiere cierta presencia bacteriana para la supervivencia^{larval 13}, los medios fermentados introducen comunidades bacterianas y fúngicas impredecibles que pueden dañar o consumir embriones antes de la eclosión. Estas limitaciones impidieron la recuperación de larvas transformadas utilizando métodos de inyección y crianza previamente^{descritos 9}, lo que pone de manifiesto la necesidad de un protocolo de inyección más fiable que también permita el cribado fluorescente durante todo el desarrollo.

Aquí se presenta un protocolo de microinyección reproducible que incorpora mejoras en la selección de transposasas, metodología de inyección y medios de cribado y crianza. Estas modificaciones facilitan el desarrollo de moscas estables genéticamente modificadas para aplicaciones que incluyen cepas de sexado genético para SIT, gene drives y knockouts genéticos mediados por CRISPR-Cas. Las mejoras clave incluyen el uso de la transposasa piggyBac¹⁴ hiperactiva bajo el control del promotor estable de la proteína de choque térmico (hsp)83, la desecación embrionaria para minimizar la pérdida de ooplasma tras la inyección y la eliminación de cinta adhesiva y aceite de halocarbono durante la inyección embrionaria.

La recuperación de embriones inyectados mejoró aún más al reemplazar el medio de cría a granel por placas de agar nutritivo planas y pigmentadas, inoculadas con un césped de Escherichia coli. Esta formulación de agar ofrece dos grandes ventajas. Primero, proporciona una fuente de alimento bacteriano monogénica previsible para el desarrollo larval. En segundo lugar, proporciona un fondo de alto contraste y baja autofluorescencia que facilita la observación de la morfología, el desarrollo y la expresión de GFP en larvas de primera generación (G0). Las moscas domésticas y las moscas de cuadra se desarrollan y pupan normalmente en placas de agar a base de yema de huevo inoculadas con E. ^{coli 13,15}. La formulación descrita aquí incorpora polvo de carbón activado como un aditivo no reactivo y seguro para los alimentos, para reducir aún más la fluorescencia de fondo.

Protocol

Todos los experimentos y operaciones se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Bioseguridad Institucional de Texas A&M (protocolo IBC2019-081). Los reactivos, productos químicos y herramientas utilizados en este protocolo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Criar moscas para la producción de huevos

1. Preparación de jaulas para adultos
   1. Ajusta el termostato de una cámara incubadora a 28°C y mezcla 3 kg de cloruro de sodio con ~5 L de agua del grifo en una bandeja de 10 L, disolviendo el ~50% de la sal.
   2. Coloca esta bandeja de salmuera sin tapa en el fondo de la cámara incubadora para mantener una humedad de alrededor del 80% de humedad relativa (HR). Mantén un ciclo 16:8 día-noche en la cámara o habitación.
   3. Forra la parte inferior de las jaulas para insectos (jaulas de acero inoxidable/aluminio de 30 x 30 cm con malla) con dos capas de papel de cocina y coloca un vaso desechable de condimentos de 45 mL lleno de azúcar granulado sobre la capa de papel de cocina (Figura 1A).
      NOTA: Las toallas de papel ayudan a absorber las motas moscas, y el azúcar proporciona una fuente de alimento antes de la alimentación sanguínea.
   4. Rellena un vaso de precipitados Griffin de 250 mL con aproximadamente 100 mL de agua del grifo a temperatura ambiente y mete un cuadrado de 20 cm x 20 cm de tela de algodón negro (cortado de funda o sábanas negras lisas) en el agua hasta que la tela esté humedecida. Ajusta la tela negra para que sus bordes sobresalgan 1-2 cm más allá del borde del vaso (Figura 1B).
      NOTA: Este paño húmedo proporciona tanto agua líquida como una superficie de oviposición para las moscas adultas. La muerte puede ocurrir rápidamente si los adultos no tienen acceso a una fuente de humedad.
   5. Transfiere entre 500 y 1.500 pupas de moscas estables a un recipiente pequeño o vaso de precipitados y colócalas en la jaula de insectos. Coloca la jaula de adulto en la cámara de cría húmeda (paso 1.1.1) y monitorea diariamente la eclosión. Una vez que los adultos salgan, comienza la alimentación diaria con sangre bovina citratada (sección 1.2).
2. Alimentar moscas adultas
   1. Prepara sangre bovina citratada añadiendo una concentración final de 10,9 mM de dihidrato de citrato trisódico a la sangre bovina recién recogida.
   2. Brevemente, suspende ~12,8 gramos de sal de citrato en un volumen mínimo de agua desionizada y ságalle a los 4 litros de sangre recogidos en el matadero local.
      NOTA: Los recipientes de sangre deben tener tapas roscadas (por ejemplo, botellas cuadradas, de boca ancha, de 4L) y limpiarse a fondo con agua y jabón antes de usarlas. En el matadero, evita recoger el primer ~1 litro de sangre bovina de un animal sacrificado para minimizar la contaminación con pelo, sudor, suciedad y otros coagulantes.
   3. Congela la sangre bovina citada en 200 mL y descongela según sea necesario, manteniendo las alicuotas descongeladas refrigeradas a 4°C durante hasta una semana.
   4. Proporciona ~40 mL de sangre a temperatura ambiente por cada 600 moscas a cada jaula de adulto.
   5. La sangre puede ofrecerse en un recipiente de condimentos o vaso de precipitados, y se debe insertar una esponja de gasa de algodón plegada y no estéril en el vaso para absorber la sangre. Agita la mecha hasta que el algodón esté completamente saturado y insértalo en la jaula.
      NOTA: La sangre debe cambiarse diariamente a partir de las 24 horas después de la eclosión.
3. Recogida de huevos
   1. Una vez observados los huevos en la tela de algodón negro, retira el paño del vaso de precipitados y lava los huevos en un recipiente de plástico poco profundo separado de ~700 mL usando un biberón (Figura 2A). La oviposición suele ocurrir cuando las moscas tienen entre 7 y 10 días de edad.
      NOTA: Revisa también los vasos de sangre en busca de huevos y recoge cualquier huevo que pueda haber depositado allí.
   2. Recoge huevos en papel filtro mediante filtración al vacío. Esto se hace colocando un filtro negro en un embudo Buchner, aplicando un vacío y luego vertiendo los huevos del paso 1.3.1 sobre la instalación.
   3. Después, transfiere los huevos a un cilindro graduado o a un tubo microcentrífuga graduado de 1,7 mL usando un frasco y registra el volumen de huevos recogidos (Figura 2B).
      NOTA: Evita la inmersión prolongada de los huevos en agua, ya que la mortalidad comienza a aumentar ~10 minutos después de la inmersión.
4. Preparación de medios larvales a granel
   1. Recoger materiales para material larvario a granel (Figura 3A), como se describe en la Tabla 1.
   2. En un vaso de precipitados de 1000 mL, añade el suplemento de proteína de ternera y toda el agua del grifo. Deja rehidratar toda la noche a temperatura ambiente.
   3. Añade el salvado de trigo y la vermiculita a un recipiente separado y más grande para mezclar.
   4. Tras una rehidratación nocturna, remueve bien el suplemento de terneros rehidratado para deshacer los grumos y vierte la mezcla en el recipiente con salvado de trigo y vermiculita. Mezcla bien hasta que quede homogéneo y todo el salvado de trigo esté cubierto con la mezcla de suplementos para terneros.
   5. Transfiere el medio a granel a un recipiente de almacenamiento de alimentos de polipropileno en una capa de ~8 cm de profundidad que cubra todo el fondo del recipiente (Figura 3B).
   6. Añade ~1.000 embriones (aproximadamente 0,2 mL de óvulos por cada 2,2 L de medios a granel) recogiendo embriones a través de .filtración al vacío sobre un papel filtro circular de 90 mm de diámetro y luego colocar el papel con los huevos boca abajo en el centro del contenedor de medio (Figura 3B, C).
   7. Cubre el papel filtro con ~1 cm de medio para retener la humedad (Figura 3C) y cubre el recipiente con un rectángulo sobredimensionado de tela negra de algodón, con 5 cm de tela de algodón sobresaliente que sobresalga más allá del borde del recipiente.
   8. Haz un agujero grande (~12 cm de diámetro) en la tapa del recipiente de comida para permitir el intercambio de gases y coloca la tapa en el contenedor de medios mientras atrapas la tela de algodón negro entre el recipiente y la tapa (Figura 3D).
      NOTA: Esto actúa como una junta, evitando que la separación entre tapa y recipiente atrape a las larvas de^{primer estadio en} gotas de condensación.
   9. Colocar el contenedor de medio terminado en la cámara de cría de adultos hasta la pupación y monitorizar el desarrollo larvario (Figura 4) (la pupación ocurre en ~10 días dependiendo de la temperatura del medio y la densidad larval).
      NOTA: La cubierta de tela debe ser lo suficientemente fina para evitar que las larvas de primer estadio pasen, pero lo bastante permeable para evitar la formación de condensación en las paredes interiores de los contenedores de medios, que puede atrapar y ahogar las larvas.
5. Separación de las pupas
   1. Retira la cubierta de tela de los contenedores de pupas y recoge las pupas con una cuchara o cuchara.
      NOTA: Las pupas de moscas estables aparecen como cilindros rojo-marrón no móviles, de 4-7 mm de longitud, en contraste con las larvas móviles de color amarillo-blanco. Las pupas suelen acumularse en el perímetro exterior de las paredes del recipiente o en posiciones húmedas y elevadas dentro de su contenedor de medio a medida que las moscas comienzan la metamorfosis de larvas a pupas y adultas.
   2. Pone entre 500 y 1.500 pupas a ~1 cm de profundidad en un plato y colócalas en una nueva jaula limpia como se describe en la sección 1.1 para propagar la siguiente generación.

Figura 1: Materiales de crianza de moscas adultas. (A) Jaula de crianza de moscas adultas mostrando la copa de sacarosa (S) y la copa de oviposición (O). (B) Taza de oviposición preparada con tela negra de algodón saturada en agua que se extiende ligeramente más allá del borde del vaso de precipitados. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2: Recogida de huevos. (A) Recogida de huevos del paño de oviposición usando un biberón de lavado. (B) Recuperación de huevos mediante filtración al vacío sobre papel filtrante de alto contraste. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Materiales para medios larvales a granel
Reactivo	Misa (g)
Agua	900
Salvado de trigo	230
Suplemento para la pantorrilla	100
Vermiculita (grueso A4)	70
Materiales para soluciones de descorionización
Solución	Composición
Baño oxidante	Hipoclorito de sodio al 3% en agua desionizada
Baño de lavado	Triton X-100 0,02% solución en agua desionizada
Enjuague	Agua desionizada
Materiales para el criado y las placas de criado de agar negro
Reactivo	Misa (g)
Agua	500
Yemas de huevo en polvo	18
Carbón activado	4
Cloruro de sodio	1

Tabla 1: Reactivos para medios larvales a granel, soluciones de decorionación y placas de agar negro. Reactivos usados para la preparación de medios larvales a granel para el mantenimiento de colonias, así como para la composición de soluciones destinadas a debilitar y eliminar el corión de embriones estables de moscas, y materiales necesarios para preparar 500 mL de medio de cribado y crianza de agar negro.

Figura 3: Preparación de medios larvales a granel. (A) Materiales utilizados para la preparación de medios larvales a granel: suplemento de proteína de ternera (CM), salvado de trigo (WB), vermiculita (VM), recipiente de almacenamiento (SC), tapa (L) y junta de tela (FG). (B) Mezcla exhaustiva de los componentes del medio. (C) Colocar el papel filtro cubierto de huevo (EP) boca abajo sobre la superficie del medio y cubrirlo con medio adicional para evitar la desecación. (D) Instalación de la junta de algodón entre el recipiente y la tapa. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 4: Desarrollo larvario en medios a granel. Los contenedores transparentes permiten monitorizar el desarrollo larvario y el estado del medio. Las larvas (L) son visibles en las paredes del recipiente, en la tapa y dentro del medio. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

2. Preparación para la inyección: descorionización y desecación

1. Coloca un paño de algodón negro humedecido en un vaso de precipitados como se describe en el paso 1.1.4 y transfiere a una jaula para adultos durante 25 minutos para recoger los huevos. Enjuaga los huevos sobre un tamiz de acero inoxidable de 106 μm usando un frasco de lavado.
   NOTA: Un periodo de recogida de 25 minutos suele dar aproximadamente 400 huevos.
2. Deja reposar los embriones sin molestar en el tamiz durante otros 30 minutos.
3. Mientras los embriones envejecen, preparar 150 mL de cada una de las soluciones oxidantes, lavado y enjuagados descritas en la sección "Materiales para soluciones de descorionización" de la Tabla 1 (Figura 5). Utiliza suficiente volumen para cubrir los embriones con aproximadamente 1 cm de solución.
4. Sumergir el tamiz que contiene embriones en el baño oxidante durante 2 minutos y agitar suavemente los embriones usando una pipeta Pasteur (Figura 6A).
   NOTA: La aspiración repetida y la dispensación de solución para crear un vórtice circular ayudan a concentrar los embriones en el centro del tamiz y evitan que los embriones recién descorionados se adhieran a las paredes del tamiz.
5. Retira el colador del baño oxidante y elimina el exceso de solución. Transfiere el colador a la solución de lavado y agita por aspiración y dispensación durante 2 minutos.
6. Transfiere el tamiz que contiene embriones a la solución de enjuague y agita como se describe en el paso 2.4 durante 2 minutos. Retira el colador de la solución de enjuague y saca el exceso de agua con un sorro.
7. Coloque un tamiz estéril de vidrio sobre el tamiz y, bajo un microscopio de disección, utilice un pincel de nylon de punta fina para transferir embriones (Figura 6B) desde el tamiz hasta el borde del tamiz. Colocar los embriones cerca sin permitir que se toquen, con el polo posterior más ancho mirando hacia el borde del abrigo. Evita doblarse, deformar o desgarrar embriones durante la transferencia.
8. Prepara una cámara de desecación cubriendo el fondo de un matraz de 1 L con 100 mL de desecante de sulfato de calcio y sellando el matraz con un tapón de goma.
   NOTA: Tras 24 horas de equilibrio, la cámara de desecación suele alcanzar una humedad relativa del <5% a 23 °C.
9. Retira el exceso de agua del cobertor y coloca el cubrimiento que contiene embriones descoriionados sobre el desecante. Vuelve a sellar el matraz con un tapón de goma y deseca los embriones durante 8 minutos.
10. Retira el abrigo de la cámara de desecación y colócalo sobre el escenario del microscopio bajo un objetivo de 20× para microinyección.

Figura 5: Soluciones de decorionización. De izquierda a derecha: tamiz de acero inoxidable, solución oxidante, solución de lavado y solución de enjuague usados para la decorionación embrionaria. El hipoclorito de sodio se mantiene como una solución stock al 6% protegida de la luz, y el Triton X-100 se mantiene como una solución stock del 10× y se diluye hasta una concentración final del 0,02% antes de su uso. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 6: Descorionación embrionaria. (A) La aspiración suave y la dispensación de solución generan un vórtice que concentra a los embriones en el centro del tamiz y reduce la adhesión a las paredes del tamiz. (B) Embrión descoriionado que emerge del corión translúcido tras el enjuague. El polo anterior (extremo más estrecho) suele emerger antes del polo posterior. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Microinyección

1. Extrae agujas de microinyección de cuarzo de capilares de vidrio filamentados de 100 mm (I.D. 0,7 mm, O.D. 1,0 mm) utilizando los parámetros indicados en la Tabla 2. Guarda las agujas en un lugar libre de polvo hasta que se usen.
   NOTA: También pueden usarse agujas borosilicatas con geometría similar.
2. Preparar el tampón de inyección (0,1% p/v de fenol rojo en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4) y filtrar-esterilizar a través de un filtro de jeringuilla de 0,22 μm.
3. Prepara 20 μL de mezcla de inyección combinando 10 μg de plásmido auxiliar y plásmido donante de piggyBac, que contiene la carga genética entre las repeticiones terminales invertidas izquierda y derecha de PiggyBac, con 4 μL de buffer de inyección. Diluye hasta una concentración final de 500 ng/μL usando agua libre de nucleasa.
   NOTA: El plásmido auxiliar comprende la secuencia promotora hsp83 de 3,1 kb aguas arriba del codón inicial de hsp83 y la secuencia codificante de la transposasa PiggyBac hiperactiva.
4. Transfiere la mezcla de inyección a un filtro de jeringuilla de PTFE de bajo volumen de 0,20 μm y coloque el filtro en la abertura de un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL (Figura 7A). Centrifuga a ≥11.000 x g durante 10 minutos o hasta que toda la mezcla de inyección haya pasado por el filtro. Guarda la mezcla de inyecciones no utilizada a -20 °C.
5. Rellena una aguja de microinyección de cuarzo con aproximadamente 2 μL de mezcla de inyección usando una punta de micro gel (Figura 7B). Evita introducir burbujas de aire durante la carga.
   NOTA: Orientar la aguja de microinyección paralela al eje largo del embrión y mantener un desplazamiento angular horizontal y vertical cero para minimizar desgarros y cizallamientos.
6. Golpea suavemente la punta de la aguja contra el borde de una lámina de vidrio hasta que la mezcla de inyección fluya a través de la punta de la aguja (Figura 7C).
   NOTA: Rompe la punta de la aguja gradualmente para crear la apertura más pequeña y nítida que permita el flujo de mezcla por inyección.
7. Inyectar el embrión a través del polo posterior inmediatamente después de la desecación utilizando aproximadamente 700 hPa de presión de inyección y 300 hPa de contrapresión.
8. Perfora suavemente el embrión e inyecta aproximadamente una décima parte del volumen embrionario con la mezcla de inyección (Figura 7D–F).
   NOTA: Minimizar la penetración de la aguja para reducir la perturbación de la membrana vitelina y evitar la pérdida de ooplasma durante la extracción de la aguja.
9. Transfiere el engobe de cubierta a una placa de Petri revestida con un papel filtro negro estéril y humedecido de 90 mm inmediatamente después de la inyección e incuba a temperatura ambiente durante 48 horas.
   NOTA: Completar todas las inyecciones en un plazo de 2 horas desde la oviposición para dirigir embriones antes de la etapa sincitial.
10. Examinar los embriones para la eclosión cada 12–16 horas. Transfiere las larvas recién eclosionadas y la cubierta de vidrio a una placa de agar inoculada y acondicionada preparada según lo descrito en la sección 4.

Parámetro	Calor	Fil	Vel	Del	Tira
Valor	825	5	60	150	175

Tabla 2: Parámetros de extracción de aguja. Parámetros utilizados para generar agujas de microinyección de cuarzo.

Figura 7: Microinyección de embriones. (A) Filtración de la mezcla de inyección usando un filtro de jeringuilla anidado en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL. (B) Carga de la mezcla filtrada de inyección en una aguja de microinyección usando una punta de pipeta con carga de gel. (C) Geometría terminal de una aguja de microinyección de cuarzo. (D) Alineación de la aguja con el polo posterior del embrión. (E) Penetración de la superficie del embrión minimizando la perturbación de la membrana vitelina. (F) Inyección de aproximadamente una décima parte del volumen embrionario seguida de retirada de aguja. Un aumento de transparencia indica desplazamiento del ooplasma por la mezcla de inyección. Barra de escala = 400 μm (D–F) Haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

4. Preparación de placas tratadas

1. Formulación de medio de agar
   1. Prepara el medio descrito en la sección "Materiales para placas de cribado y crianza de agar negro" de la Tabla 1 y el autoclave durante 15 minutos a 121 °C. Vierte el agar a 40 °C o guárdalo a temperatura ambiente antes de recalentarlo y dispensarlo en placas de Petri de 90 mm.
      NOTA: Haz girar vigorosamente antes de verter para resuspender las partículas sólidas.
2. Inoculación de placas
   1. Diluir un cultivo de 24 horas de K12 Escherichia coli. a OD600 = 0,200 en caldo Luria-Bertani y dispensar 200 μL sobre una placa de agar enfriada y solidificada. Extiende el cultivo de forma uniforme usando perlas de vidrio estériles o un separador de vidrio y permite que la placa absorba el exceso de humedad (Figuras 8A, B).
      NOTA: Utiliza placas de agar dentro del mes siguiente al vertido o deséchalas para asegurar un crecimiento fiable de bacterias y larvas.
3. Acondicionamiento de placas
   1. Dobla 6 × 6 cm de papel filtro negro para crear 6-10 crestas onduladas y esterilizara horneando o haciendo autoclave. Coloca un papel filtro corrugado estéril asépticamente sobre la placa de Petri inoculada y humédelo con varias gotas de agua estéril (Figura 8C).
   2. Esterilizar en superficie las larvas de primer estadio de tipo silvestre (WT) sin tratar y sin inyectar, y transferir 10 larvas al papel filtrante humedecido.
      NOTA: Esteriliza los embriones de WT sumergiéndolos en lejía al 10% (0,6% NaOCl) durante 1 minuto, seguido de enjuagarlo en agua desionizada estéril durante 2 minutos.
   3. Coloca un papel filtro de 90 mm entre la tapa y el cuerpo de la placa de Petri para que actúe como junta.
   4. Permite que las larvas de WT condicionen las placas durante 24 horas antes de añadir embriones inyectados sobre cubiertas de vidrio (Figura 8C). Retira las larvas de WT después de que eclosionen los primeros embriones inyectados.

Figura 8: Preparación de placas de agar y recuperación post-inyección. (A) Inoculación de placas de agar con un OD600 = 0,2 cultivo de Escherichia coli utilizando perlas de vidrio estériles. (B) Absorción del exceso de humedad superficial antes de la transferencia del embrión. (C) Colocación de una junta de papel filtro de 90 mm entre la tapa y el cuerpo de la placa de Petri. (D) Cribado de larvas para marcadores fluorescentes en placas de agar acondicionado. Los embriones inyectados se recuperan en un papel filtro de 90 mm saturado en agua desionizada, colocado en la tapa de una placa de Petri invertida e incubados durante 48 horas antes de transferirlos a placas de cribado. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Results

Utilizando este protocolo, 431 embriones de mosca estable fueron decorionizados e inyectados con plásmido donante piggyBac-Hsp83 y plásmido auxiliar Hsp83 a una concentración final de 500 ng/μL. De los 431 embriones inyectados, 18 larvas ZsGreen-positivas (4,2%) y 8 ZsGreen-negativas (1,9%) eclosionaron entre 48 y 76 horas después de la inyección cuando fueron cribadas en placas de agar negro (Tabla 3). En total, 26 de 431 embriones inyectados eclosionaron (6,0%) y 16 de 26 larvas eclosionadas sobrevivieron hasta la edad adulta (61,5%).

Especies	Tipo de inyección	Constructo	# inyectado	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	Pupas ZsGreen(+)	Pupas ZsGreen(-)	ZsGreen(+) Adultos	ZsGreen(-) Adultos	# Adultos que producen descendencia ZsGreen(+)
Stomoxys calcitrans	Inserción de transposasas	Hsp83:hy-pBac (ayudante, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donante, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	Inserción de transposasas	Hsp83:hy-pBac (ayudante, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donante, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

Tabla 3: Estadísticas de inyecciones. Tasas de supervivencia, transformación y recuperación tras la microinyección embrionaria.

De las 18 larvas G0 ZsGreen-positivas, 12 sobrevivieron hasta la pupación (66,7%) y 10 se eclosaron como adultas. Seis adultos ZsGreen positivos (1,4% de los embriones inyectados, 60% de los supervivientes fértiles de G0) produjeron descendencia ZsGreen positiva. Estos descendientes (Figura 9A–E) se autocruzaron y mantuvieron fluorescencia durante seis generaciones en el momento de escribir esto.

De las ocho larvas ZsGreen-negativas, seis sobrevivieron hasta la edad adulta (75%). Ninguno de los adultos no fluorescentes produjo descendencia fluorescente.

Figura 9: Cribado fluorescente de moscas transgénicas. (A) Comparación entre larvas F1 que expresan ZsGreen y larvas WT. (B) Fluorescencia visible a través de la cutícula pupal, lo que permite el cribado transgénico en la etapa pupal. (C,D) Comparación de tres larvas y pupas que expresan ZsGreen (izquierda) con tres larvas y pupas WT (derecha) bajo iluminación de luz blanca (C) y fluorescencia (D). (E) Mosca adulta transgénica F1 expresando ZsGreen (izquierda) comparada con una mosca adulta WT (derecha). Barras de escala = 1 mm (A), 2 mm (B,E) y 3 mm (C,D). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Discussion

La transformación genética de especies de insectos no modelo sigue siendo un importante cuello de botella en el desarrollo y evaluación de estrategias de control genético para plagas y vectores de artrópodos.

Para moscas estables, el protocolo descrito aquí reduce el tiempo, los recursos, la mano de obra y la variabilidad asociados a la inyección y crianza de moscas G0 tras la microinyección embrionaria. Además, el uso de placas de cribado de agar negro permite la observación directa del desarrollo a lo largo del ciclo de vida, facilitando la identificación y corrección de problemas que surgen durante la inyección, recuperación y crianza larval. Utilizando los constructos plasmídicos evaluados en este estudio, el protocolo generó líneas de moscas estables transgénicas con menos embriones inyectados que los métodos previamente^{reportados 9}. Aunque está fuera del alcance de este artículo sobre métodos, la confirmación y localización de los sitios de inserción de transgenes pueden realizarse utilizando enfoques establecidos como la PCR inversa y la PCR por splinkerette.

Un protocolo de inyección eficiente también facilita futuros estudios en genómica funcional, incluyendo la caracterización de promotores mediante reporteros fluorescentes; competencia vectorial, mediante análisis de genética inversa de genes asociados a la transmisión de patógenos; caracterización de nucleasas, incluyendo la evaluación de CRISPR-Cas9 y otras nucleasas programables en moscas estables; investigación sobre resistencia a insecticidas mediante la modificación de alelos candidatos a resistencia; y investigaciones de biología básica, incluyendo genes implicados en la alimentación sanguínea, el apareamiento y el desarrollo. Nuestro protocolo también elimina la necesidad de inyecciones embrionarias inmersas en aceite y cámaras de humedad oxigenadas para la recuperación post-inyección, como se documenta en la literatura previa de transformación doméstica de Musca y Lucilia cuprina ^{piggyBac 16,17}.

Varios parámetros son críticos para una transgénesis exitosa. La desecación embrionaria y el momento de la inyección son especialmente importantes porque el ADN plasmídico debe introducirse antes de la celularización para asegurar su incorporación en las células precursoras de la línea germinal. Sin embargo, el momento exacto de la formación del sincicio en embriones de moscas estables sigue siendo desconocido. Además, la tasa de desarrollo embrionario está influida por la temperatura, y la cronología de desarrollo de embriones de moscas estables bajo diferentes condiciones ambientales no ha sido completamente caracterizada. Investigaciones futuras sobre las tasas de desarrollo y embriogénesis de cepas estables de laboratorio podrían aportar información para optimizar los protocolos de microinyección y transformación, aumentando así aún más la eficiencia y la reproducibilidad del protocolo. Sin embargo, hasta entonces, determinar la ventana óptima de inyección sigue siendo una limitación metodológica que puede afectar a la eficiencia de la transformación. Cuando las tasas de supervivencia son bajas, la resolución de problemas puede realizarse comparando las tasas de eclosión y de adulto entre embriones no tratados, embriones descorionados, embriones inyectados con PBS esterilizado por filtros y embriones WT criados en placas de agar. La literatura previa que describía la transformación de Musca doméstica produjo 14 eventos de integración de 1.668 inyecciones (0,84% de las inyecciones⁾¹⁶, y la transformación de la plaga ovina Lucilia cuprina estableció 3 líneas transgénicas a partir de aproximadamente 900 inyecciones embrionarias (0,33% de las inyecciones⁾¹⁷, lo que sugiere que el protocolo de transformación estable de moscas descrito en este protocolo (6 eventos de integración en 431 inyecciones, El 1,4% de los inyectados) ofrece una mejora en la eficiencia de inyección en comparación con otras especies de dípteros plaga en la literatura.

El promotor constitutivo estable de mosca hsp83 proporcionó una expresión robusta de ZsGreen durante todo el desarrollo y apoyó la expresión de la transposasa piggyBac hiperactiva durante la embriogénesis temprana, mejorando así la visibilidad de marcadores fluorescentes y la eficiencia de transformación en comparación con un protocolo de transformación de moscas^{estables previamente reportado 9}. El plásmido auxiliar utilizado en este estudio se generó subclonando 3,1 kb de ADN genómico inmediatamente aguas arriba del codón inicial hsp83 en un vector plásmido mínimo aguas arriba de la secuencia codificante hiperactiva de la transposasa piggyBac. La proporción ayudante-carga de plásmidos se estableció empíricamente en 1:1 por masa y se utilizó durante todo el estudio. Aunque no se evaluaron proporciones de plásmidos adicionales, también pueden resultar efectivas las proporciones alternativas.

Las mejoras descritas aquí pueden ser aplicables a protocolos de transgénesis para otros artrópodos. Además, el sistema de cribado y crianza basado en ágar se está aplicando actualmente a la inyección y cribado de embriones de mosca soldado negra (Hermetia illucens). El protocolo puede ser especialmente útil para esfuerzos de transgénesis en otras moscas muscidas, incluyendo Musca domestica y Haematobia irritans, debido a su similar ecología larvaria y su desarrollo en sustratos fibrosos en descomposición. El uso de placas de agar inoculadas con Escherichia coli puede proporcionar un enfoque práctico para el monitoreo post-inyección, permitiendo a los investigadores evaluar el desarrollo embrionario, la morfología larval, la expresión de marcadores, las tasas de eclosión y la recuperación general. Adaptar el componente bacteriano del medio a la biología de la especie objetivo puede aumentar aún más la utilidad de este enfoque para desarrollar y optimizar protocolos de transgénesis.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	Cámara de desecación
Bacto Agar	Difco	281230	Agar para placas de agar negro
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	Tela de algodón negra para tazas de recolección de huevos y junta de tela para recipientes de cría de larvas
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	Desecante para cámara de desecación
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	Medio larval a granel
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	Microscopio de inyección
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Fuente de nutrientes para placas de agar negro
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Bacteria utilizada en placas de agar negro
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	Suministro de presión para microinyección
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	Transferencia de embriones
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	Capilares para extraer agujas
Forceps	Fine Science tools	11251-20	Manipulación de muestras
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Sostiene los embriones durante la descorionación
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	Solución de lejía para eliminar el corion
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	Recipiente de medio larval a granel
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	Recolección de embriones
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	Caldo LB para cultivo de E.coli
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Microscopio para mover y alinear embriones
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Usado para cargar mezcla de inyección en las agujas
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Micromanipulador para inyección
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Usado para filtrar la mezcla de inyección
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	Tampon de inyección
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Pigmento para placas de agar negro
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Dispositivo para extraer agujas de capilares
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	Tampon de inyección
Petri plates	VWR	391-0609	Placas Petri para placas de agar negro con huevos
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Tinte para inyección
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Tapón de cámara de desecación
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	Medio larval a granel
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Portaobjetos de vidrio para microinyección
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	Lámpara fluorescente y filtros para cribado de larvas
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	Distribución de bacterias en placas
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	Lavado de embriones durante la descorionación
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Descorionar embriones
Wash bottle	Safetyware	Z423335	Lavado de embriones de superficies