Un modelo de angiogénesis tridimensional basado en perlas de microportadores utilizando células endoteliales de venas umbilicales humanas

Resumen

Este protocolo describe un modelo de angiogénesis tridimensional basado en perlas microportadoras utilizando células endoteliales de venas umbilicales humanas. El ensayo permite la visualización directa del brote endotelial y la formación de estructuras similares a la luz, y puede aplicarse a estudios de mecanismos angiogénicos e intervenciones terapéuticas.

Resumen

La angiogénesis es un proceso biológico de varios pasos que implica activación, migración, elongación, formación de lumen, ramificación y anastomosis de células endoteliales. Los sistemas convencionales de cultivo bidimensional son útiles para la evaluación preliminar de fármacos, genes o condiciones de cultivo, pero no recapitulan adecuadamente la organización espacial de la morfogénesis endotelial dentro de una matriz extracelular tridimensional. El protocolo actual describe un ensayo de angiogénesis tridimensional basado en perlas microportadoras utilizando células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVECs). Los HUVECs se siembran primero sobre perlas microportadoras que contienen colágeno porcino tipo I desnaturalizado químicamente con ácido y luego se incrustan en una matriz de membrana basal. Posteriormente, los fibroblastos mucosos orales se siembran sobre el gel para proporcionar soporte paracrino al brote endotelial y a la formación de estructuras similares a vasculares. El medio de cultivo se reemplaza cada 2 días, y el comportamiento de germinación y los fenotipos angiogénicos se monitorizan mediante microscopía invertida. Bajo condiciones de cultivo adecuadas, los brotes endoteliales emergen en pocos días, seguidos de la formación de estructuras similares a lumen y conexiones entre brotes. Este método proporciona una plataforma conveniente y reproducible para estudios in vitro de morfogénesis endotelial y puede aplicarse además a investigaciones sobre manipulación génica, intervención farmacológica y modelización de enfermedades.

Introducción

La germinación endotelial es un evento clave en la angiogénesis e implica la emergencia, migración, proliferación y alineación de células endoteliales a partir de estructuras vasculares preexistentes, seguida de la formación de lumen y el establecimiento de redes vasculares^{interconectadas 1,2}. Aunque los sistemas convencionales de cultivo bidimensional y los ensayos de formación de tubos basados en gel son técnicamente sencillos, están limitados en su capacidad para recapitular la remodelación espacial de células endoteliales dentro de un microambiente^{tridimensional 3,4}. El ensayo clásico de germinación tridimensional basado en perlas de microportadores reproduce varias etapas de angiogénesis in vitro, incluyendo germinación endotelial, elongación, formación de lumenes y ensamblaje de redes, y por ello se ha convertido en un método ampliamente utilizado para la investigación de angiogénesis.

En el protocolo actual, se establece un modelo tridimensional de germinación basado en perlas microportadoras utilizando células endoteliales normales de venas umbilicales humanas. Basado en ensayos previamente reportados sobre brotes de microperlas de microportadores^{endoteliales 5,6,7}, este método preserva el marco básico del recubrimiento celular endotelial sobre perlas microportadoras, incrustándose en una matriz tridimensional y en cultivo de fibroblastos, sustituyendo al gel convencional de fibrina por una matriz basal para simplificar el procedimiento y facilitar la obtención rutinaria de imagen. La matriz de membrana basal fue seleccionada en este protocolo modificado por varias razones prácticas y biológicas. Experimentalmente, proporciona una matriz tridimensional lista para usar que permite la formación rápida de geles, incrustación sencilla de perlas y una observación microscópica rutinaria conveniente sin los pasos adicionales de polimerización necesarios para la preparación del gel de fibrina. Biológicamente, la matriz de membrana basal contiene componentes extracelulares que apoyan la adhesión de las células endoteliales, la migración, la extensión de los brotes y la formación de estructuras similares a la luz de las células. Por lo tanto, esta modificación es adecuada para estudios que requieren visualización directa del comportamiento de brotación endotelial, comparación de fenotipos angiogénicos y evaluación de intervenciones farmacológicas o genéticas en un entorno de cultivo tridimensional. Sin embargo, dado que la matriz de membrana basal difiere del gel de fibrina en composición de la matriz, propiedades mecánicas, degradabilidad y señales bioactivas, el presente ensayo debe interpretarse como un modelo de germinación modificado basado en perlas microportadoras en lugar de un reemplazo directo del ensayo clásico basado en fibrina. Estas diferencias relacionadas con la matriz pueden influir en la cinética de brotación, la estabilidad del lumen y la morfología de la red, y deben tenerse en cuenta al comparar resultados entre diferentes sistemas de angiogénesis tridimensionales. Este modelo es adecuado para observar el comportamiento de brotación endotelial en tres dimensiones y puede aplicarse además a estudios de intervención farmacológica, manipulación génica y mecanismos angiogénicos.

Protocolo

Las células endoteliales de la vena umbilical humana utilizadas en este protocolo fueron aisladas y cultivadas a partir de tejidos del cordón umbilical humano recogidos en el Departamento de Obstetricia del Primer Hospital Popular de la provincia de Yunnan. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los donantes antes de la recogida de la muestra. Todos los procedimientos que involucran materiales de origen humano fueron aprobados por el Comité de Ética Médica del Primer Hospital Popular de la Provincia de Yunnan (número de aprobación). KHLL2023-KY198). Los fibroblastos mucosos orales humanos (HOMFs) fueron amablemente proporcionados por el grupo de investigación de la Dra. Jiemei Zhai en el Hospital Estomatológico Afiliado de la Universidad Médica de Kunming. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de la célula

1. Cultivar células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVECs) en un medio de crecimiento de células endoteliales suplementado con suero fetal bovino adicional (FBS) hasta una concentración final del 10% a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Las células utilizadas para el ensayo deben estar libres de contaminación, mostrar un crecimiento estable y estar en fase logarítmica. Usa las celdas en los pasajes 4–6.
2. Cultivar fibroblastos mucosos orales humanos (HOMFs) en un medio basal de alta glucosa suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10% a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Usa las celdas en los pasajes 4–6.
3. Antes de recubrir la perla de microportadores, confirma que ambos tipos celulares están en una confluencia adecuada. Evita cultivos excesivos o digestión enzimática excesiva, ya que estos pueden afectar negativamente a la germinación posterior.

2. Preparación de perlas microportadoras

1. Hidrata 0,5 g de microperlas secas de microtransportadores en 50 mL de PBS durante al menos 3 horas. Después del lavado, resuspende las perlas en 50 mL de PBS para obtener una suspensión de microportadores de 10 mg/mL, que corresponde aproximadamente a 3 × 10⁴ perlas/mL.
2. Transfiere la suspensión a una botella de cristal siliconado, esteriliza autoclavándola a 115 °C durante 15 minutos y guárdala a 4 °C hasta su uso.
3. Antes de recubrir células endoteliales, retira la solución de almacenamiento y lava las perlas con PBS estéril. Equilibrar las perlas en el medio de crecimiento de células endoteliales a 37 °C durante al menos 30 minutos.
4. Suspende suavemente las perlas equilibradas inmediatamente antes de usarlas para evitar sedimentación y agregación de cuentas.
5. Antes del recubrimiento celular, examina una pequeña alitería de la suspensión de perlas bajo un microscopio invertido. Procede solo cuando las cuentas estén completamente hidratadas, suspendidas uniformemente y libres de agregados visibles o partículas fragmentadas.

3. Recubriendo células endoteliales sobre perlas microportadoras

1. Desprende los HUVECs usando tripsina y resuspende las células en un medio de crecimiento endotelial celular.
2. Recubre las microperlas de microtransportadores a una densidad de 1.500 celdas por perla. Mezclar 3 ×^{10 6} HUVECs con 2.000 microperlas portadoras en 1,5 mL de medio de crecimiento de células endoteliales.
3. Transfiere la mezcla de perlas celulares a un tubo de microcentrífuga e incuba durante 12 horas en una incubadora de cultivo celular. Durante todo el periodo de incubación de 12 horas, invierte suavemente el tubo cada 20 minutos para mantener un contacto adecuado entre las células y las perlas y promover una unión uniforme de las células endoteliales.
4. Tras 12 horas, transfiere las perlas recubiertas a un matraz^{de cultivo celular} de 25 cm de 25 cm que contenga 4 mL de medio de crecimiento endotelial y continúe la incubación durante la noche para permitir una fijación firme de las células endoteliales a la superficie de la microperla portadora.
5. Antes de incrustar, examina las perlas recubiertas representativas bajo un microscopio invertido. Procede a la incrustación de matriz solo cuando más del 80% de las perlas examinadas muestren una capa celular endotelial continua y relativamente uniforme en la superficie de la perla, con células libres mínimas, sin agrupaciones celulares evidentes y sin agregación severa de perlas. No se deben usar perlas con recubrimiento desigual, grandes agrupaciones celulares o agregación extensa para incrustar.
6. Si las cuentas se adhieren al fondo del matraz, agita suavemente el frasco para liberarlos. Evita el pipeteo vigoroso, que puede causar agregación de perlas o desprendimiento celular.

4. Incrustar las cuentas recubiertas en una matriz tridimensional

1. Transfiere las microperlas microportadoras endoteliales recubiertas por células a un tubo centrífuga de 15 mL y permite que las perlas se asienten por gravedad. Retira el exceso de medio y añade un volumen adecuado de medio fresco.
2. Mezcla la suspensión de perlas microportadoras con matriz de membrana basal preenfriada en una proporción 1:1 (v/v) para obtener una concentración final de 500 perlas/mL.
3. Añade 100 μL de la suspensión de perlas matricial al centro de cada pozo de una placa de 24 pozos, permitiendo que la mezcla forme una única gota de gel en forma de cúpula sin tocar la pared del pozo. Mezcla suavemente la suspensión justo antes de dispensar y evita introducir burbujas de aire.
4. Deja la placa de 24 pozos a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir la gelificación inicial y la estabilización de la gota de gel. Luego incubar la placa en posición vertical a 37 °C en un 5% de CO₂ durante 15 minutos, seguida de una incubación adicional de 15 minutos en posición invertida para asegurar una gelificación completa y la formación adecuada del gel.
5. Una vez que el gel se haya solidificado completamente, proceda inmediatamente al cultivo de recubrimiento de fibroblastos.

5. Cultivo de superposición de fibroblastos

1. Resuspende 3 × 10⁴ fibroblastos mucosos orales humanos (HOMFs) en 1 mL de medio de crecimiento de células endoteliales y añade suavemente la suspensión celular a lo largo de la pared de cada pozo, permitiendo que las células se distribuyan por la superficie del gel sin alterar directamente la cúpula del gel.
2. Continúa la incubación en un medio de crecimiento de células endoteliales a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂. Los fibroblastos mucosos orales humanos se utilizan como células de apoyo porque proporcionan señales paracrinas derivadas del estroma que promueven la extensión de los brotes endoteliales, la estabilización y la remodelación similar a los vasculares en el sistema de cultivo tridimensional.

6. Mantenimiento del cultivo y observación microscópica

1. Cambia el medio de cultivo cada 2 días. Durante los cambios de medio, aspira lentamente el medio gastado y añade medio de cultivo fresco a lo largo de la pared del pozo para evitar alterar el gel.
2. Observa los cultivos a diario o día sí un día no bajo un microscopio invertido usando el modo de campo claro o contraste de fase. Para el análisis cuantitativo longitudinal, selecciona múltiples campos de visión en cada pozo en el día 7 y fotografía los mismos campos predefinidos en los días 9 y 11.
3. En condiciones óptimas de cultivo, se observa un brote endotelial evidente típicamente en los días 4–6, aparecen estructuras similares a lumen en los días 5–7, y se forman gradualmente redes microvasculares interconectadas después del día 7.
4. Defina la germinación exitosa como la presencia de múltiples extensiones endoteliales que crecen radialmente desde la superficie de la perla hacia la matriz tridimensional circundante. Un brote debe contarse solo cuando se extiende claramente más allá de la superficie de la perla y permanece conectado a la capa celular endotelial asociada a la perla.
5. Defina la formación de estructuras similares a lumenes como la aparición de estructuras endoteliales alargadas con un espacio central visible o una morfología tubular. Las conexiones entre brotes se definen como contactos directos o estructuras continuas formadas entre brotes adyacentes.
6. Los cultivos con muerte celular extensa, agregación severa de perlas, estructura gelosa alterada, abundantes burbujas, colapso de la matriz o solo protuberancias celulares cortas e irregulares deben considerarse subóptimas y excluirse del análisis cuantitativo.

7. Adquisición de imágenes y análisis cuantitativo

1. Selecciona múltiples campos de visión en cada pozo en el día 7 y adquiere imágenes de los mismos campos predefinidos en los días 9 y 11. Las imágenes deben recogerse usando la misma ampliación, ajustes de exposición y condiciones de imagen en todos los momentos.
2. Cuantifica el número de brotes por perla microportadora y la zona vascularizada.
   1. Para la medición de áreas vascularizadas, utiliza software de análisis de imágenes de código abierto. Abre la imagen adquirida y delimita manualmente el límite de la región vascularizada de interés (ROI) usando la herramienta de selección de polígonos o a mano alzada. Añade el ROI seleccionado al gestor de ROI.
   2. Para la visualización, utiliza un complemento de visualización por región de interés para mostrar el ROI delineado. Permitir la medición del área en los ajustes de medición y medir el ROI seleccionado para obtener el área vascularizada. Aplica los mismos ajustes de análisis a todas las imágenes.
   3. Para el análisis de la frecuencia angiogénica, utiliza el área vascularizada del día 7 como línea base y calcula el cambio relativo en el área vascularizada en los días 9 y 11.
3. Cuenta el número de brotes individuales de forma independiente por tres observadores y utiliza el valor medio para el análisis.

Resultados

Angiogénesis en el modelo tridimensional HUVEC

En cultivos establecidos con éxito, las células endoteliales están distribuidas uniformemente en la superficie de las microperlas portadoras, y no se observa una agregación evidente de perlas. La observación dinámica mostró brotes endoteliales progresivos y formación de redes microvasculares en los días 7, 9 y 11 (Figura 1A). El análisis cuantitativo confirmó además l...

Discusión

El protocolo actual describe un modelo modificado de germinación endotelial tridimensional basado en microperlas portadoras. La Figura 3 ofrece una visión esquemática del flujo de trabajo experimental. El protocolo fue adaptado del ensayo clásico de angiogénesis reportado por Nakatsu y Hughes y optimizado para cumplir los objetivos del presente^{estudio 8,9}. En el sistema clásico, las células e...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1.5 mL microcentrifuge tube	Beyotime	FTUB306	Transparente, libre de nucleasas
15 mL centrifuge tube	Haier	311005	Cono inferior, estéril, empaquetado en bolsa
24-well cell culture plate	Haier	612003	Fondo plano, tratado para cultivo de tejidos, envuelto individualmente, para cultivo de células adherentes
Automated cell counting slide	Countstar	12-0005-50	Diapositiva desechable para contador de células automatizado, 50 diapositivas/caja
CO2 cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	3110	Usado para cultivo de células a 37 °C con 5% CO2
Cytodex 3 microcarriers	Cytiva	17048503	Polvo seco; perlas de microportador de dextrano recubiertas de colágeno
Dotted Line plugin	N/A	N/A	Plugin de visualización de la región de interés utilizado para mostrar áreas vascularizadas delineadas
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose	EvaCell (EVA Life Sciences)	E2102	DMEM básico (1×), contiene 4.5 g/L D-glucosa, L-glutamina y 110 mg/L de piruvato de sodio, 500 mL
Endothelial Cell Medium (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Medio de cultivo de células endoteliales complementado con FBS adicional a una concentración final del 10% antes de su uso
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10099141C	Calificado, formato de uso único, origen Australia, 500 mL
Human oral mucosal fibroblasts (HOMFs)	Jiemei Zhai research group, The Affiliated Stomatological Hospital of Kunming Medical University	N/A	Fibroblastos primarios aislados de la mucosa oral humana; amablemente proporcionado por otro laboratorio
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)	In-house	N/A	Células endoteliales primarias aisladas de las venas umbilicales humanas; no tiene número de catálogo
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH), USA	N/A	Software de código abierto; versión 1.54p
Inverted microscope	Olympus, Japan	N/A	Para imágenes de campo brillante, contraste de fase y fluorescencia
Laser scanning confocal microscope	Nikon, Japan	N/A	Para imágenes confocales; modelo no especificado
Matrigel basement membrane matrix	Corning	354262	Alta concentración (HC), libre de fenol rojo, libre de LDEV, 10 mL
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco	15140-122	Solución de penicilina-estreptomicina para cultivo celular, 100×, 100 mL
Phosphate-buffered saline (PBS)	LiJi Bio	AC08L011	1×, estéril, 500 mL
T25 cell culture flask	ABCBIO	ABC707008	T25, tapa ventilada, tratada para cultivo de tejidos, para cultivo de células adherentes
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Solución de tripsina-EDTA al 0.25%, 100 mL