Enriquecimiento de tirotropos hipofisarios de ratón en ratones hipotiroideos mediante clasificación celular activada por fluorescencia basada en CD90

Resumen

Este protocolo describe el enriquecimiento de tirotropos de glándulas pituitarias adultas de ratón hipotiroideas mediante disociación enzimática y clasificación celular activada por fluorescencia basada en CD90, permitiendo análisis moleculares posteriores y cultivos primarios a corto plazo de una población celular enriquecida con tirotiropi.

Resumen

Los tirotropos son células endocrinas especializadas en la glándula pituitaria anterior que secretan la hormona estimulante de la tiroides (TSH) y regulan la actividad tiroidea. La secreción de TSH está regulada positivamente por la hormona hipotalámica liberadora de tirotropina y regulada negativamente por las hormonas tiroideas circulantes. Los tirotropos constituyen solo una pequeña fracción de las células hipofisarias (~5%), lo que complica los esfuerzos por aislar y estudiar su fisiología. Aquí describimos un enfoque mejorado para aislar tirotropos de ratones adultos hipotiroideos. El hipotiroidismo se indujo para expandir la población de tirotropos antes de la disociación enzimática de la glándula pituitaria anterior y la clasificación celular activada por fluorescencia utilizando el antígeno superficial CD90.2. El procesamiento de glándulas pituitarias anteriores de doce ratones produjo aproximadamente 1,5 × 10 células⁶ CD90,2 positivas enriquecidas para la expresión de ARN mensajero Tshb . Las células CD90.2 positivas representaban aproximadamente el 25% de las células de la hipófisis anterior y exhibían una expresión de Tshb aproximadamente cinco veces mayor en comparación con las células CD90.2 negativas, lo que indica un enriquecimiento sustancial de tirotropos. Las células aisladas permanecieron viables en cultivos a corto plazo y mantuvieron la respuesta al tratamiento con triiodotironina. Este protocolo permite el enriquecimiento y cultivo de tirotropos de ratón para análisis moleculares, transcriptómicos, epigenómicos y fisiológicos posteriores.

Introducción

La glándula pituitaria es un órgano endocrino situado en la base del cerebro que ejerce un control jerárquico sobre la homeostasis hormonal. Su actividad está regulada por señales hipotalámicas que estimulan o inhiben la producción de hormonas hipofisarias, que a su vez gobiernan la función de los órganos endocrinos periféricos. La glándula contiene una población heterogénea y dinámica de células, incluyendo células madre o progenitoras y células diferenciadas productoras^{de hormonas 1}. En respuesta al estrés o lesión fisiológica, las células madre/progenitoras hipofisarias pueden activarse, auto-renovarse y diferenciarse en múltiples linajes secretores^{de hormonas 2,3}. Estructuralmente, la hipófisis está organizada en dos lóbulos principales: el lóbulo posterior (PL), compuesto por pituicitos y terminales neurosecretorias que liberan oxitocina y vasopresina, y el lóbulo anterior (AL), que contiene tipos celulares endocrinos especializados que secretan hormona del crecimiento, prolactina, hormona tiroideestimulante (TSH), hormona adrenocorticotrópica y las gonadotropinas hormona folículo-estimulante (FSH) y hormona luteinizante (LH). La hipófisis anterior también alberga tipos celulares no hormonales, como las células folliculoesteladas S100Bpositivas, las células endoteliales y los pericitos, que apoyan la función^{endocrina 4,5,6}. Los roedores también contienen melanótrofos en el lóbulo intermedio de la glándula^{pituitaria 7,8}.

El interés por la función, diferenciación y desarrollo hipofisario ha impulsado el desarrollo de múltiples protocolos destinados a aislar células madre y progenitoras hipofisarias adultas en modelos de roedores. Las ratas se utilizan frecuentemente en la investigación de fisiología hipofisaria porque sus glándulas pituitarias más grandes proporcionan un mayor número celular y mejoran la recuperación durante el procesamiento de^{tejidos 4,9}. En cambio, aislar células hipofisarias de ratones sigue siendo técnicamente complicado, y los protocolos estandarizados son limitados. Los protocolos recientes que utilizan agregados de células madre y progenitoras de la hipófisis adulta proporcionan herramientas útiles para modelar el desarrollo y la función^{hipofisaria 10}; sin embargo, estos sistemas aún no permiten el aislamiento directo de poblaciones celulares endocrinas específicas. Entre los tipos celulares productores de hormonas de la hipófisis anterior, los tirotropos son los principales reguladores del eje hipotalámico–hipófisis–tiroidea (THP), controlando la síntesis y secreción de la hormona tiroidea (TH) en mamíferos. La TSH producida por los tirotropos es una glicoproteína heterodimérica compuesta por una subunidad α común (codificada por Cga y compartida con FSH y LH) y una subunidad β (codificada por Tshb), que confiere especificidad receptora. Estas células son muy sensibles a los niveles circulantes de triiodotironina (T3) y tiroxina (T4). La población de tirotropos se expande cuando los niveles de T3 y T4 son bajos durante el hipotiroidismo y se contrae durante el hipertiroidismo mediante un mecanismo clásico de retroalimentación^negativa 11,12,13.

A pesar de su papel fisiológico esencial, los tirotropos siguen siendo difíciles de estudiar porque constituyen solo una pequeña fracción de las células hipofisarias anteriores (aproximadamente el 5%) y comparten características fenotípicas con otras poblaciones endocrinas. Esta escasez, junto con la ausencia de modelos in vitro robustos, ha limitado las investigaciones mecanicistas sobre la regulación tirotropa y el control del eje HPT. La línea celular tumoral TαT1 representa un modelo¹⁴ similar al tirorope, pero no refleja completamente las respuestas fisiológicas; en particular, la represión dependiente de T3 de Tshb suele ser difícil de evaluar debido a su nivel basal^{de transcripción muy batal, 15}. En consecuencia, muchos estudios se han basado en líneas celulares no tirotropas como HEK293, COS, CV1, GH3 o JEG3 que expresan diferentes construcciones de Tshb ¹⁵. Sin embargo, estos son sistemas heterólogos que pueden introducir artefactos reguladores no fisiológicos, incluyendo efectos impulsados por los esquenos de plásmidos en lugar de mecanismos transcripcionales endógenos.

Aquí presentamos un protocolo paso a paso para aislar tirotropos de la glándula pituitaria adulta del ratón, adaptado de un método previamente establecido en^{ratas 9}, y optimizado para el menor tamaño y menor contenido de tirotropos en la hipófisis del ratón. Se introdujeron varias modificaciones clave para mejorar el rendimiento de las células que expresan Tshb y garantizar un análisis fiable a nivel posterior. El protocolo aprovecha la expresión del antígeno superficial CD90, un marcador superficial enriquecido en tirotropos. CD90 (también conocida como THY1) es una proteína de membrana anclada en glicosilfosfatidilinositol ^16,17 que media la señalización yuxtacrina mediante interacciones heterotípicas con el ligando integrina β2 (ITGB2). Aunque CD90 se asocia comúnmente con poblaciones de células inmunitarias y neuronales, estudios transcriptómicos previos identificaron el enriquecimiento de Thy1 en tirotropos. La señalización de contacto dependiente de THY1 ocurre en diversos tipos celulares, incluyendo células hematopoyéticas, células T, fibroblastos, células endoteliales y neuronas, donde regula la adhesión, migración, apoptosis, supresión tumoral y^fibrosis 18,19,20.

Es importante destacar que el perfil transcriptómico unicelular de la hipófisis anterior de rata identificó a Thy1 como uno de los genes relacionados con adhesiones más expresados en los^{tirotropos 5}, lo que sugiere que THY1 es un marcador superficial enriquecido en tirotropos. Además, los conjuntos de datos de secuenciación de ácido ribonucleico (ARN) unicelular en la hipófisis de ratón de acceso público indican que la expresión de Thy1/CD90 está enriquecida en los^{tirotropos 22,23}. Sin embargo, su expresión no se limita completamente a esta línea, con una expresión detectable en subconjuntos de células de la línea PIT1, incluyendo somatotropos y lactotropos, así como en poblaciones similares a progenitores. Estudios transcriptómicos unicelulares han demostrado una superposición transcripcional sustancial entre las células hipofisarias de la línea PIT1, incluyendo la identificación de una población progenitora común de PIT1 capaz de generar somatotropos, lactotropos y^{tirotropos 24}. De manera similar, Thy1/CD90 no identifica exclusivamente la población de tirotropos, pero puede usarse para enriquecer tirotropos de ratón. A partir de estos hallazgos, el uso de anticuerpos dirigidos a THY1 en nuestra estrategia de aislamiento proporciona un método eficaz para enriquecer los tirotropos tras la expansión inducida por hipotiroidismo y permite estudios funcionales, incluyendo la evaluación de las respuestas hormonales a la T3.

El protocolo comienza alimentando a ratones silvestres tipo C57BL/6 con una dieta baja en yodo e inhibiendo la función tiroidea con metimazol (MMI) y perclorato de potasio (_{KClO 4}) en el agua^{potable 25}. Este tratamiento induce hipotiroidismo significativo en el plazo de una semana y aumenta la población de tirotropos que expresan TSHB en la hipófisis anterior. Las células productoras de TSH bajo condiciones hipotiroideas experimentan adaptaciones fisiológicas y morfológicas sustanciales, incluyendo hiperplasia, hipertrofia, citoplasma vacuolado abundante, procesos citoplasmáticos prominentes y lisosomas agrandados, reflejando la adaptación a la ausencia de retroalimentación TH 26,27,28. Por tanto, la inducción del hipotiroidismo puede utilizarse como estrategia para expandir la población de tirotropos.

Tras la inducción del hipotiroidismo, los ratones son anestesiados con isoflurano y sometidos a perfusión cardíaca con solución salina amortiguada con HEPES libre de Ca^2+/Mg 2+ para maximizar la viabilidad celular durante la disociación tisular. Tras la extracción, la glándula pituitaria anterior sufre una digestión enzimática suave para generar una suspensión unicelular que se incuba con un anticuerpo anti-CD90.2 conjugado con ficoeritrina-cianina 7 para enriquecer los tirotropos mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las células marcadas se recogen posteriormente en medio de cultivo para cultivo a corto plazo o en TRIzol para la extracción de ARN. Para validar la estrategia de enriquecimiento, se midió la expresión de ARN mensajero Tshb en poblaciones clasificadas y se encontró que estaba altamente enriquecida en células CD90-positivas. Este método apoya una amplia gama de aplicaciones posteriores en ratones, incluyendo el perfilado de expresión génica, análisis transcriptómicos y epigenómicos, ensayos de alto rendimiento y cultivo celular primario, y proporciona una plataforma valiosa para investigar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la función del tirotropo y la regulación del eje HPT.

Protocolo

Este protocolo describe el aislamiento de tirotropos del AL de glándulas pituitarias recién diseccionadas obtenidas de ratones adultos tras al menos 1 semana de inducción de hipotiroidismo. Todos los procedimientos animales se realizaron conforme a las directrices institucionales y de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas aprobó todos los procedimientos con animales.

Durante los experimentos se agruparon ratones machos y hembras porque no se observaron diferencias dependientes del sexo en el rendimiento de tirotropos ni en análisis posteriores. Se utilizaron aproximadamente 12 ratones por experimento, aunque cohortes más grandes de hasta 20 animales pueden procesarse escalando proporcionalmente todos los volúmenes de reactivos.

El aislamiento exitoso depende de una perfusión rápida y constante, un tiempo mínimo de disección, la eliminación completa de la PL y un blindaje de alta densidad de las células primarias. El tiempo máximo recomendado entre la eutanasia, la perfusión, la disección de la hipófisis y el inicio de la digestión enzimática fue de 6 horas. Las celdas se enchaparon a una densidad de 2,0–2,5 × 10⁵ celdas por 0,7 cm^{de pozo 2} (la superficie de un pozo de una lámina de cámara de vidrio de 8 pozos). Se requería una viabilidad mínima del 95% para apoyar el cultivo de tirotropos a corto plazo.

Todos los reactivos utilizados para la generación de suspensión de célula única se prepararon en condiciones estériles. Las superficies de trabajo se esterilizaron con un 70% de etanol, los instrumentos de disección se autoclavaron antes de su uso y todos los pasos de preparación del cultivo celular se realizaron en un armario de bioseguridad utilizando técnica aséptica. Este protocolo se estandarizó para 12 animales. Escala todos los volúmenes de reactivos proporcionalmente cuando uses un número diferente de ratones. Consulte la Tabla de Materiales para todos los reactivos, consumibles y equipos.

Durante la inducción del hipotiroidismo, los ratones fueron alojados bajo condiciones específicas libres de patógenos a 20°C–24°C y humedad relativa del 40%–60%, con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad y acceso ad libitum a comida y agua. Los animales se alojaban en grupo (hasta tres ratones por jaula) en jaulas ventiladas individualmente que contenían cama estándar y enriquecimiento ambiental, incluyendo material de anidación y refugio. Se confirmó la inducción exitosa del hipotiroidismo midiendo la expresión hepática de iodotironina deiodinasa (Dio1). Se consideró que una reducción de al menos el 50% en la expresión del ARN mensajero (ARNm ) de Dio1 en comparación con ratones de control eutiroideos indicativa de una inducción exitosa del hipotiroidismo.

1. Inducción de hipotiroidismo en ratones C57BL/6

NOTA: Realice este procedimiento durante 7–10 días para inducir hipotiroidismo in vivo mediante una dieta deficiente en yodo e inhibición química de la función tiroidea. Véase la Figura 1A para el diseño experimental y la Figura 1B para la validación de la inducción del hipotiroidismo.

Figura 1. Inducción de hipotiroidismo en ratones C57BL/6. (A) Representación esquemática del flujo de trabajo experimental utilizado para inducir el hipotiroidismo en ratones adultos C57BL/6. Los ratones recibieron 0,05% de metimazol (MMI) y 0,1% de perclorato de potasio (KClO₄) en agua potable junto con una dieta deficiente en yodo durante 7 días antes del aislamiento anterior de la hipófisis. (B) Análisis de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (RT-qPCR) con transcripción inversa de la expresión hepática de ácido ribonucleico mensajero Dio1 (ARNm) en ratones eutiroideos e hipotiroideos. Se utilizó la ciclofilina A (CyA) como gen de referencia. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (DS) (n = 6 por grupo). La significación estadística se determinó utilizando la prueba t de Student. **P < 0,001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

1. Prepara agua potable MMI/KClO₄
   1. Disuelva 1 g de MMI y 2 g de KClO₄ en 2 L de agua filtrada.
   2. Remueva la solución a temperatura ambiente (20°C–25°C) durante 1 hora hasta la disolución completa.
      PRECAUCIÓN: MMI y KClO₄ son productos químicos peligrosos. Lleva guantes, bata de laboratorio y protección ocular durante la preparación y el manejo.
      NOTA: La MMI inhibe la organificación del yoduro, mientras que el KClO₄ bloquea la captación de yoduro a través del simportador²⁵ de sodio-yoduro. Sustituye la solución de beber cada 2 días para mantener la dosis correcta y minimizar la contaminación por la cama, los restos de comida y el crecimiento microbiano. Si no se usa inmediatamente, guarda la solución en un recipiente herméticamente cerrado y resistente a la luz a 4°C durante un máximo de 14 días.
2. Inducir hipotiroidismo
   1. Ratones machos o hembras de 8 semanas C57BL/6 en grupos de hasta tres animales por jaula bajo condiciones de alojamiento libres de yodo.
      NOTA: Ratones domésticos bajo condiciones específicas libres de patógenos a 20°C–24°C y humedad relativa del 40%–60%, con un ciclo de luz de 12 h y 12 horas de oscuridad y acceso ad libitum a comida y agua. Mantener a los animales en jaulas ventiladas individualmente que contengan cama estándar y enriquecimiento ambiental, incluyendo material para anidar y refugio. Aclimatar a los animales durante 3 días antes de iniciar el tratamiento. Ratones machos y hembras de casa por separado. Para los experimentos aquí descritos, el grupo eutiroideo consistía en seis machos y seis hembras alojados en jaulas separadas, y el grupo hipotiroideo consistía en seis machos y seis hembras alojados en jaulas separadas. Se agruparon AL de ratones machos y hembras dentro del mismo grupo de tratamiento durante la preparación celular porque no se observaron diferencias dependientes del sexo en el rendimiento de tirotropos ni en análisis posteriores.
   2. Alimenta a los ratones con una dieta deficiente en yodo ad libitum durante 7–10 días.
      NOTA: Inicie simultáneamente la dieta con deficiencia de yodo y el tratamiento con MMI/KClO₄.
   3. Proporcionar agua potable con 0,05% de MMI y 0,1% de KClO₄ ad libitum durante todo el periodo de tratamiento.
      NOTA: Mantener el tratamiento hasta la eutanasia. Controla el peso corporal, la ingesta de alimentos, la ingesta de agua y los síntomas clínicos diariamente durante la inducción del hipotiroidismo. La inducción exitosa del hipotiroidismo suele asociarse a una reducción del aumento de peso corporal y a signos clínicos como disminución de la actividad o un pelaje opaco en comparación con los controles eutiroideos. Los periodos de inducción de siete y diez días producen una eficiencia comparable de enriquecimiento de tirotropos.

2. Perfusión cardíaca y disección de AL

NOTA: Realizar este procedimiento en aproximadamente 15 minutos por ratón para maximizar la viabilidad tisular y preservar la integridad celular durante el aislamiento hipofisario.

1. Preparar soluciones de perfusión y recogida
   1. Prepara solución salina tamponada con HEPES (HBSS) sin Ca²⁺ ni Mg²⁺
      1. Combinar 667 mL de 0,9% de NaCl, 20 mL de 1 M HEPES y 313 mL de agua doble destilada (ddH₂O) para preparar 1 L de HBSS preparado a medida sin Ca²⁺ ni Mg²⁺.
      2. Autoclava la solución y guárdala a 4°C hasta su uso.
   2. Prepara HBSS heparinizado sin Ca²⁺ ni Mg²⁺
      1. Añade 27 μL de enoxaparina sódica (solución de stock de 100 mg/mL) a 50 mL de HBSS preparado a medida sin Ca²⁺ y Mg²⁺.
   3. Preparar el medio de recogida (CM)
      1. Combina 440 mL de medio Eagle modificado de Dulbecco, 50 mL de suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor, 4 mM de L-glutamina y 10 mL de 1 M HEPES para un volumen final de 500 mL.
      2. Esteriliza la solución con un filtro de 0,22 μm y guárdala a 4°C hasta 1 mes.
         NOTA: Prepare 50 mL de alicuotas bajo un armario de bioseguridad antes de almacenarlo para minimizar la contaminación.
      3. Calienta el CM a 20°C–25°C antes de usarlo.
   4. Esterilizar instrumentos de disección
      1. Esteriliza tijeras, pinzas, pinzas, portaagujas, pinzas de iris, cucharas quirúrgicas y sondas romas con etanol al 75% antes de su uso.
         NOTA: Permitir que los instrumentos se sequen completamente al aire tras la esterilización con etanol antes del contacto con el tejido.
2. Realizar perfusión cardíaca
   1. Anestesiar profundamente al ratón usando isoflurano administrado al 100% de oxígeno. Inducir anestesia en una cámara al 5% de isoflurano y mantener la anestesia a través de un cono nasal al 3% de isoflurano con monitorización continua y eliminación de gases residuales.
      PRECAUCIÓN: Realizar procedimientos de anestesia con isoflurano conforme a las directrices de seguridad institucionales y utilizar sistemas adecuados de saqueo para minimizar la exposición a la inhalación.
   2. Confirma la anestesia completa verificando la ausencia del reflejo de retirada del pedal usando un pellizco en el dedo del pie.
   3. Rocía al animal con etanol al 75% y colócalo en la etapa de perfusión dentro de la bandeja de recogida.
   4. Sujeta las extremidades para exponer la región peritoneal.
   5. Abre la cavidad torácica con cuidado evitando dañar órganos principales y vasos sanguíneos.
   6. Corta a lo largo de las costillas para crear una colgaja en el pecho, dobla la solapa sobre la cabeza y sujeta con un hemostato.
   7. Estabiliza el corazón con una pinza e inserta una aguja calibre 23 en el ápice del ventrículo izquierdo.
   8. Conecta la aguja a una bomba peristáltica usando tubos de silicona.
   9. Comienza la perfusión con HBSS heparinizado sin Ca²⁺ y Mg²⁺ mantenidos a temperatura ambiente.
   10. Incisa la aurícula derecha inmediatamente después de que empiece la perfusión para permitir el drenaje.
   11. Perfunde al animal durante 5 minutos a un caudal de 3 mL/min.
       NOTA: Confirma la perfusión exitosa observando un palidor visible del hígado.
3. Aislar la AL
   1. Decapita al ratón inmediatamente después de la perfusión.
   2. Retira el cuero cabelludo y los huesos craneales usando tijeras finas de disección y pinzas para exponer el cerebro.
   3. Inserta una cuchara quirúrgica entre el cerebro y el cráneo.
   4. Levanta el cerebro suavemente y corta el quiasma óptico.
   5. Retira la fina membrana meníngea (dura madre) que cubre la glándula pituitaria bajo un estereomicroscopio usando pinzas finas.
   6. Disecciona y descarta cuidadosamente la PL como se muestra en la Figura 2A.
      NOTA: Identificar la AL como el tejido rosado más grande ubicado rostralmente. Identifica la PL como el tejido blanco-translúcido más pequeño situado dorsalmente.
   7. Recorta el tejido conectivo circundante y las membranas meníngeas residuales con una sonda roma para mejorar el acceso a la ALA.
   8. Sujeta la AL con pinzas romas y transfírela a un tubo de polipropileno de 15 mL que contiene 1,8 mL CM.
      NOTA: Agrupa los AL de 12 animales en el mismo tubo de recogida.
   9. Mantén la muestra a temperatura ambiente hasta que se completen todas las disecciones.
      NOTA: No exceder las 3 horas entre la recogida de tejido y el inicio de la digestión enzimática para minimizar la pérdida de viabilidad celular.
4. Confirmar la inducción del hipotiroidismo
   1. Recoge una pequeña muestra de hígado (aproximadamente 50 mg) de cada ratón.
   2. Cuantifique la expresión hepática de ARNm de Dio1 mediante la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real y compárala con controles eutiroideos no tratados (Figura 1B).
      NOTA: Defina la inducción exitosa del hipotiroidismo como una reducción de al menos un 50% en la expresión hepática de Dio1 en relación con los controles eutiroideos. La expresión de Dio1 se correlaciona positivamente con los niveles circulantes^{de TH 29}; por lo tanto, la reducción de la expresión de Dio1 confirma la inducción exitosa del hipotiroidismo.
5. Recogida repetida de tejido
   1. Repite los pasos 2.2–2.4. hasta que se han recogido ALs de 12 ratones.
   2. Procede inmediatamente al paso 3.

Figura 2. Preparación de una suspensión unicelular de la hipófisis anterior del ratón. (A) Flujo de trabajo que ilustra la disección del lóbulo anterior (AL), la disociación enzimática y la preparación de una suspensión unicelular para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). El flujo de trabajo incluye la extracción del lóbulo posterior, la digestión de colagenasa, la digestión del ácido tripsina-etilendidiamina tetraacético (EDTA) y la filtración previa al análisis FACS. (B) Imágenes representativas de la tinción de colorantes de viabilidad y el conteo automático de células disociadas de la hipófisis anterior de ratones eutiroideros e hipotiroideos. Se indica el rendimiento total de la célula y la concentración en células viables. Barra de escala = 200 μm. (C) Distribución de los diámetros de las células de la hipófisis anterior tras la disociación tisular y la preparación para el análisis FACS aguas abajo. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura. 

3. Preparación de una suspensión de célula única a partir de AL de ratón

NOTA: Realice este procedimiento en aproximadamente 60 minutos para generar una suspensión unicelular a partir del tejido hipofisario anterior.

1. Prepara soluciones enzimáticas para la digestión
   1. Prepara una solución de colagénasa al 2%
      1. Disuelva 100 mg de colagénasa de Clostridium histolyticum (>125 unidades digestivas de colagénasa/mg sólido) en 4,9 mL de ddH₂O.
      2. Añadir 100 μL de 1 M HEPES para obtener un volumen final de 5 mL.
      3. Esteriliza la solución usando un filtro de 0,22 μm.
      4. Alicuota la solución en volúmenes de 200 μL y almacena a −30°C durante hasta 2 meses.
         NOTA: Evita ciclos repetidos de congelación-deshielo. No reutilices alicuotas de colagénasa descongeladas.
   2. Preparar ácido tripsina al 0,25% de etilendediamina tetraacético (EDTA)
      1. Mezcla 1 mL de tripsina–EDTA al 0,5% con 1 mL de HBSS sin Ca²⁺ y Mg²⁺.
      2. Guarda la solución a 4°C hasta que se use.
         NOTA: Utilice la solución diluida de tripsina–EDTA el día de la preparación. No almacenar ni reutilizar tripsina–EDTA diluida.
2. Realizar digestión con colagenasa
   1. Añadir 200 μL de solución de colagénasa al 2% a los tejidos de AL recogidos.
   2. Mezcla el tejido suavemente pipeteando con una micropipeta P1000 equipada con puntas de baja retención.
   3. Incuba la suspensión en un baño maria a 37°C durante 15 minutos.
      NOTA: Mantén la tapa del tubo cerrada durante la incubación para minimizar la contaminación.
   4. Golpea suavemente el tubo cada 5 minutos durante la incubación.
3. Realizar la digestión con desoxirribonucleasa I (DNasa I)
   1. Añadir 5 μL de DNasa I (1 U/μL) directamente a la suspensión sin eliminar el sobrenadante.
   2. Golpea suavemente el tubo 10 veces para mezclar la solución.
   3. Incuba la suspensión a 37°C durante 5 minutos.
4. Pelleta el tejido
   1. Centrifuga la suspensión a 100 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   2. Retira el sobrenadante con cuidado usando una pipeta de 1 mL.
      NOTA: Dejar aproximadamente 50 μL de líquido residual sobre el pellet durante la extracción del sobrenadante para minimizar la pérdida celular.
5. Realizar la digestión de tripsina
   1. Añade 2 mL de tripsina–EDTA al 0,25% al pellet.
   2. Incubar la suspensión a 37°C durante 10–15 minutos hasta que no queden fragmentos de tejido intactos visibles.
      NOTA: No excedas los 15 minutos para evitar una digestión excesiva de tejidos y una reducción de la viabilidad celular.
6. Detener la digestión enzimática y disociar el tejido
   1. Añadir 2 mL de muc para detener la tripsinización.
   2. Haz una pipete suave en la suspensión arriba y abajo 10–20 veces usando una micropipeta ajustada a 1 mL hasta que no queden fragmentos de tejido visibles.
      NOTA: Utiliza puntas de micropipe de baja retención durante la disociación mecánica. Una suspensión aceptable de celda única es una suspensión uniforme de baja viscosidad que contiene predominantemente células individuales con agregados o restos visibles mínimos (≤5%–10% de grumos mediante inspección microscópica usando exclusión de azul de tripán).
7. Recoger la suspensión de celda única
   1. Centrifuga la suspensión a 100 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   2. Quita el sobrenadante con cuidado.
   3. Procede inmediatamente al Paso 4.
      NOTA: Comienza a teñir en un plazo de 15 minutos desde la preparación de la suspensión de célula única y completa la clasificación de celda en 1 hora siempre que sea posible. Mantener las células sobre hielo durante este intervalo para minimizar la pérdida de viabilidad.

4. Tinción para la clasificación celular activada por fluorescencia

NOTA: Realice este procedimiento en aproximadamente 60 minutos para teñir las células disociadas de la hipófisis anterior en busca de FACS de células CD90-positivas.

1. Prepara la suspensión de la celda
   1. Añadir 350 μL de tampón de tinción compuesto por solución salina tamponada con fosfato (PBS, 1×) que contiene un 2% de FBS y 0,09% de azida de sodio al granulado celular.
   2. Resuspende el pellet suavemente pipeteando arriba y abajo 10 veces usando una micropipeta P1000 equipada con puntas de baja retención para obtener una suspensión de celda única.
   3. Transfiere la suspensión a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL de baja adherencia.
2. Determinar la concentración y viabilidad celular
   1. Retirar una alicuota de 5 μL de la suspensión para contar celdas.
   2. Mezcla la alicuota con un tinte de viabilidad de 5 μL.
   3. Carga 10 μL de la mezcla en un contador de celdas automatizado.
      NOTA: Proceda a FACS cuando la viabilidad celular sea del ≥85%, según lo determinado por la exclusión de colorantes de viabilidad, y cuando se observen residuos y agregados celulares mínimos.
   4. Confirme que la concentración total de células es aproximadamente 1 × 10⁷ células/mL para muestras eutiroideas y 2 × 10⁷ células/mL para muestras de hipotiroides (Figura 2B). La distribución del tamaño celular tras la disociación se muestra en la Figura 2C.
3. Preparar controles de compensación
   1. Transfiere 50 μL de la suspensión de la celda a un tampón de tinción de 300 μL.
   2. Divide la suspensión en tres alicotas de 100 μL en tubos microcentrífugas separados de 1,5 mL.
   3. Prepara los siguientes controles: (i) control sin tinción, (ii) control solo yoduro de propidio (PI) y (iii) control solo con ficoeritrina-ciana 7 (PE-Cy7) CD90.2.
4. Tinchar las células
   1. Añadir 3 μL de anticuerpo anti-CD90.2 conjugado con PE-Cy7 a una suspensión celular de 300 μL.
      NOTA: La concentración de anticuerpos se determinó mediante experimentos previos de titulación. Una dilución final de 1:100 proporcionó una separación óptima entre poblaciones positivas y negativas minimizando la tinción de fondo.
   2. Añadir 1 μL de anticuerpo al control de compensación CD90.2 para obtener una dilución final de 1:100.
   3. Incuba todas las muestras sobre hielo en la oscuridad durante 30 minutos.
      NOTA: Mezcla las muestras suavemente cada 10 minutos durante la incubación para mantener una tinción homogénea.
5. Lava las células teñidas
   1. Añade 1 mL de tampón de tinte en frío a cada tubo.
   2. Centrifuga las muestras a 210 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
      NOTA: Si está disponible, desactive el freno de la centrífuga para minimizar la interrupción del perdigón de la celda durante la desaceleración.
   3. Retira y descarta el sobrenadante con cuidado.
6. Vuelve a suspender las células teñidas
   1. Resuspende la suspensión de la celda principal en un tampón de tinción de 300 μL.
      NOTA: Añadir PI inmediatamente antes de clasificar hasta una concentración final de 1 μg/mL.
   2. Resuspende cada control de compensación en un tampón de tinción de 100 μL.
7. Filtra la suspensión de la celda
   1. Filtrar la suspensión celular a través de un tubo de citometría de flujo equipado con un colador de 35 μm inmediatamente antes de clasificar.
8. Proceder a la clasificación celular activada por fluorescencia
   1. Procede inmediatamente al paso 5 y clasifica las células teñidas usando un clasificador de células activado por fluorescencia.

5. Estrategia de filtración y clasificación de FACS

NOTA: Realice este procedimiento en aproximadamente 60 minutos para aislar tirotropos viables CD90.2-positivos mediante FACS.

1. Configurar el clasificador de celdas
   1. Instala una boquilla de 100 μm en el clasificador de celdas.
   2. Ajusta la presión de la vaina a 20 psi.
      NOTA: Utilice un fluido de vaina estéril a base de PBS mantenido a temperatura ambiente.
2. Realizar el control de calidad de los instrumentos
   1. Ejecuta procedimientos de control de calidad del instrumento según las instrucciones del fabricante antes de la adquisición de la muestra.
      NOTA: En clasificadores de celdas alternativos pueden usarse flujos de control de calidad recomendados por el fabricante equivalentes.
   2. Verifica el retardo de caída y la estabilidad del flujo usando perlas de calibración.
3. Realizar compensación de fluorescencia
   1. Adquiere controles de compensación de color único.
   2. Realiza la compensación de fluorescencia antes de hacer la compuerta y la clasificación.
      NOTA: Calcular la compensación usando controles sin teñir y con una sola tinción. Verifica y ajusta manualmente las matrices de compensación antes de clasificarlas cuando sea necesario.
4. Definir la estrategia de acceso
   1. Excluir los residuos usando parámetros de dispersión directa y lateral (Figuras 3A,B).
   2. Configura las celdas individuales usando la altura de dispersión directa frente al área de dispersión directa y la altura de dispersión lateral frente al área de dispersión lateral (Figura 3A,B).
   3. Excluye las células muertas mediante la entrada de células PI-negativas.
   4. Células de compuerta CD90.2 positivas para enriquecimiento de tirotropos.
      NOTA: Defina las células CD90.2-positivas como eventos que exhiben una intensidad de fluorescencia mayor a 10-3 en el canal de detección CD90 (Figura 3C–F).
5. Preparar tubos de recogida
   1. Preparar tubos de recogida según la aplicación prevista aguas abajo.
      NOTA: Prellena los tubos de recogida de baja retención con reactivo de lisis QIAzol de 1 mL para aislamiento de ARN o Medium 199 suplementado con suero fetal bovino despojado con carbón al 10% para aplicaciones en cultivo celular.
6. Ordenar tirotropos CD90.2 positivos
   1. Clasifica las células individuales CD90.2 positivas en tubos de colección.
   2. Recoger células para análisis de ARN
      1. Recoge las células directamente en un reactivo de lisis de 1 mL.
      2. Haz vórtices en los tubos durante 1 minuto para lisar las células.
      3. Congela las muestras inmediatamente sobre hielo seco.
      4. Almacena las muestras a −80°C hasta la extracción de ARN.
   3. Recoger células para cultivo primario
      1. Recoger las células en un medio de cultivo suplementado con suero fetal bovino al 10% despojado de carbón y 1% de penicilina-estreptomicina.
      2. Sembra las células en portaobjetos de cámara de vidrio de 8 pozos a una densidad de al menos 2 × 10⁵ celdas por pozo en un volumen final de 200 μL.
      3. Cultiva las células hasta 72 horas a 37°C en una incubadora humidificada que contenga un 5% de CO₂.
         NOTA: El rendimiento aceptable en cultivo se indica por la unión celular visible en un plazo de 24 horas, una eficiencia de unión aproximadamente del 60%–80% y una viabilidad ≥70%–80% tras 72 horas.
      4. Añade 100 nM T3 al medio de cultivo cuando sea necesario.
         NOTA: Iniciar el tratamiento T3 tras la unión de la celda, normalmente 24 horas después del placado, y mantener el tratamiento hasta la recogida de la muestra a las 72 horas. Preparar la solución de T3 en 40 mM de NaOH e incluir controles tratados con vehículo a la misma concentración final de disolvente.
         NOTA: El suero despojado con carbón mantiene un entorno de cultivo pobre en TH y mejora la detección de la supresión dependiente de T3 inducida experimentalmente de la expresión de Tshb .

Figura 3. Estrategia de bloqueo FACS y validación del enriquecimiento de tirotropos. (A,B) Estrategia de gating secuencial utilizada para aislar células viables de la hipófisis anterior única. Las compuertas incluyen exclusión de escombros usando área de dispersión frontal (FSC-A) y área de dispersión lateral (SSC-A), discriminación de singlets usando altura de dispersión directa (FSC-H) frente a FSC-A y altura de dispersión lateral (SSC-H) frente a SSC-A, y exclusión de células muertas positivas para yoduro de propidio (PI). (C–F) Gráficos representativos de FACS que muestran la identificación y enriquecimiento de poblaciones celulares CD90.2-positivas y CD90.2-negativas utilizando un anticuerpo anti-CD90.2 conjugado con ficoeritrina-cianina 7 (PE-Cy7). (G–I) Validación de la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa por transcripción inversa (RT-qPCR) del enriquecimiento de tirotropos en poblaciones celulares clasificadas. Abreviaturas: FSC-A, área de dispersión hacia adelante; SSC-A, área de dispersión lateral; FSC-H, altura de dispersión hacia adelante; SSC-H, altura de dispersión lateral; PI, yoduro de propidio; PE-Cy7, ficoeritrina–cianina 7; NT, sin tratar. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

6. Análisis de la expresión génica del ARNm de Tshb en células CD90-positivas frente a CD90-negativas mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

NOTA: Realice este procedimiento en aproximadamente 5 horas para cuantificar la expresión de ARNm de Tshb en poblaciones celulares clasificadas.

1. Recoger las células clasificadas para la extracción de ARN
   1. Recoger un número igual de células CD90-positivas y CD90-negativas (2,5 × 10⁵ celdas) en tubos separados de 1,5 mL que contengan 1 mL de reactivo de lisis.
2. Lisar las células
   1. Haz un vórtice vigoroso de las muestras durante 1 minuto para lisar completamente las células y coloca las muestras sobre hielo.
      NOTA: Almacenar muestras lisadas a −80°C antes de la extracción de ARN si es necesario.
3. Extraer ARN total
   1. Extrae ARN total según las instrucciones del fabricante proporcionadas con el kit de extracción de ARN.
      NOTA: Realizar la digestión de DNasa durante la purificación utilizando DNasa I libre de RNasa según las instrucciones del fabricante para eliminar el ácido desoxirribonucleico genómico residual (ADN) antes de la elución.
   2. Mide la concentración de ARN usando un espectrofotómetro.
      NOTA: Utilice muestras con una proporción A260/A280 de aproximadamente 1,8–2,1 y una proporción A260/A230 superior a 1,8 para la síntesis de ADN complementario (cDNA).
4. Sintetizar ADNcM
   1. Sintetizar ADNcD a partir de 100 ng de ARN total según las instrucciones del fabricante proporcionadas con el kit de síntesis de ADNc de primera cadena.
      NOTA: Utiliza cebadores oligo(dT) durante la síntesis de ADNc.
   2. Prepara la mezcla de plantilla y cebador según la Tabla 1.
   3. Mezcla los reactivos suavemente y centrifuga brevemente para recoger la muestra en el fondo del tubo.
   4. Desnaturaliza la mezcla de plantilla y cebador a 65°C durante 10 minutos.
   5. Enfría las muestras inmediatamente sobre hielo.
   6. Prepara la mezcla de reacción de transcripción inversa según la Tabla 2 para obtener un volumen final de 20 μL.
      NOTA: Prepara una mezcla maestra multiplicando los volúmenes de reactivos listados en la Tabla 2 por el número total de muestras y añadiendo un 10% adicional de volumen extra para tener en cuenta la variabilidad del pipeteo.
   7. Mezcla la reacción suavemente sin que se forme vórtice y centrifuga brevemente.
   8. Incuba la reacción a 50°C durante 60 minutos.
   9. Inactiva la reacción a 85°C durante 5 minutos.
   10. Enfría las muestras en hielo.
   11. Proceder directamente a la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa con transcripción inversa (RT-qPCR) o almacenar el ADNc a −30°C hasta su uso.
       NOTA: el ADNc puede almacenarse a −30°C durante hasta 6 meses en condiciones libres de nucleasa. Evita ciclos repetidos de congelación y deshielo.
       NOTA: Realizar pasos de síntesis de ADNc en un termociclador equipado con una tapa calefactada para minimizar la evaporación.
5. Prepara la mezcla de reacción RT-qPCR
   1. Preparar la mezcla de reacción RT-qPCR según la Tabla 3.
6. Carga la placa RT-qPCR
   1. Añadir 9 μL de mezcla de reacción RT-qPCR a cada pozo de una placa de 96 pozos.
   2. Añadir 1 μL plantilla de ADNc correspondiente al producto transcrito inversamente generado a partir de 5 ng de ARN total de entrada.
   3. Mezcla las muestras suavemente y centrifuga brevemente.
7. Realizar RT-qPCR
   1. Realiza RT-qPCR según las instrucciones del fabricante proporcionadas con la mezcla maestra SYBR Green.
      NOTA: Utiliza un paso inicial de desnaturalización de 95°C durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de 95°C durante 5 s y 60°C durante 30 s. Adquiere fluorescencia al final de cada paso de extensión. Realizar análisis de curva de fusión de 65°C a 95°C en incrementos de 0,5°C para verificar la amplificación de un solo producto.
8. Normalizar la expresión de Tshb
   1. Normaliza la expresión de Tshb a la expresión de ciclofilina A (CyA) usando el método ΔCt.
      NOTA: Validar la estabilidad de CyA antes del análisis confirmando la mínima variación de Ct entre los grupos experimentales.
9. Calcular la expresión génica relativa
   1. Calcula la expresión relativa de Tshb en células CD90-positivas en relación con las CD90-negativas usando el método 2^−ΔΔCt .
      NOTA: Realizar análisis RT-qPCR utilizando ocho muestras biológicas, cada una analizada en reacciones técnicas duplicadas (Figura 3G–I).

Reactivo	Volumen	Cantidad/concentración final
ARN total	Variable	100 ng
Cebador anclado de oligo(dT)18 (50 pmol/μL)	1 μL	2,5 μM
Agua de grado PCR	Variable	Ajustar a un volumen total de 13 μL
Total	13 μL	—

Tabla 1: Preparación de la mezcla plantilla–cebador para la síntesis complementaria de ácidos desoxirribonucleicos. Reactivos, volúmenes y cantidades finales utilizados para preparar la mezcla plantilla-cebador para la síntesis complementaria de ácido desoxirribonucleico (cDNA). Cada reacción contenía 100 ng de ácido ribonucleico total (ARN), un cebador de oligo(dT)18 anclado y agua de grado reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ajustada a un volumen final de 13 μL. La concentración reportada de 2,5 μM se refiere a la concentración de cebador en la mezcla de 13 μL de plantilla y cebador antes de la adición de los componentes de la reacción de transcripción inversa.

Reactivo	Volumen	Cantidad/concentración final
Buffer de reacción de transcriptor inverso (5×)	4 μL	1×
Inhibidor protector de RNasa (40 U/μL)	0,5 μL	20 U
Mezcla de desoxinucleótidos (10 mM cada una)	2 μL	1 mM cada uno
Transcriptasa Inversa de Transcriptor (20 U/μL)	0,5 μL	10 U
Mezcla plantilla-cebador (Tabla 1)	13 μL	—
Total	20 μL	—

Tabla 2: Mezcla de reacción de transcripción inversa para síntesis complementaria de ácidos desoxirribonucleicos. Reactivos, volúmenes y concentraciones finales utilizados para la síntesis de ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) de primera cadena. El volumen final de reacción fue de 20 μL. Las concentraciones reportadas de trifosfato desoxinucleótido (1 mM cada una) se refieren a las concentraciones finales en la mezcla completa de la reacción.

Reactivo	Volumen	Cantidad/concentración final
PowerTrack SYBR Green Master Mix (2×)	5 μL	1×
Cebadores de oligonucleótidos TSHB hacia adelante y hacia atrás (véase Tabla de Materiales)	0,5 μL	400 nM
Agua de grado PCR	3,5 μL	Ajustar a 9 μL de volumen de reacción
Volumen subtotal de reacción	9 μL	—
Plantilla de ADNcD	1 μL	5 ng
Volumen final de reacción	10 μL	—

Tabla 3: Preparación de mezcla cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa. Reactivos, volúmenes y concentraciones finales utilizados para la amplificación de la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (RT-qPCR) con transcripción inversa del ácido ribonucleico mensajero Tshb (ARNm). El volumen de mezcla de reacción antes de la adición de la plantilla era de 9 μL. Añadir 1 μL de plantilla complementaria de ácido desoxirribonucleico (cDNA) inmediatamente antes de la amplificación para obtener un volumen final de reacción de 10 μL.

Resultados

Doce ratones C57BL/6 de 8 semanas (6 machos y 6 hembras) fueron tratados con MMI y KClO₄ en agua potable junto con una dieta deficiente en yodo durante una semana para inducir hipotiroidismo (Figura 1A). La expresión de ARNm de Dio1 tipo 1 hepático se cuantificó en ratones eutiroideo e hipotiroideo para confirmar la inducción exitosa de hipotiroidismo²⁹. Los ratones hipotiroideos mostraron una reducción aproximada del 60% en ...

Discusión

El protocolo FACS basado en CD90 descrito aquí proporciona un método reproducible para enriquecer tirotropos primarios del tejido hipofisario adulto de ratón, preservando la respuesta hormonal. Este método aborda una limitación técnica de larga data en el estudio de la biología de la tirotropa y la regulación del eje HPT. Históricamente, las investigaciones sobre la regulación de tirotropos se han basado en gran medida en la línea celular TαT1; sin embargo, las células TαT1 presentan una...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 µm filter	Corning	430769	Para esterilización del medio de recolección
Filtro de jeringa de 0,22 µm	Pall Life Sciences	PN4602	Para esterilización de colagenasa
Trypsina EDTA al 0,5%	Gibco	15400-054	Para disociación celular
Tubos de microcentrífuga de baja unión de 1,5 mL	Invitrogen	AM12450	Para tinción FACS
Tubos de polipropileno de 15 mL	Falcon	352097	Para recolección del lóbulo anterior y disociación celular
Agujas de 23 calibre	BD Vacutainer Safety-Lok	367283	Para perfusión cardíaca
Diapositiva de cámara de vidrio de 8 pozos	Millipore	PEZGS0816	Para cultivo post-FACS
Perlas Accudrop	BD Biosciences	345249	Para calibración del retraso de goteo durante FACS
Anticuerpo anti-ratón PE-Cy7 anti-CD90.2	Invitrogen	25-0902-82	Para tinción FACS
Contador de células automatizado	DeNovix	s-10700	Para conteo celular
Suero fetal bovino tratado con carbón	Gibco	12676029	Para cultivo de tirotropos post-FACS
Colagenasa de Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9263	Para disociación celular
Bandeja de disección de laboratorio estándar	Bandeja de disección de laboratorio estándar	N/A	Para perfusión cardíaca
Solución de sal salina tamponada con HEPES preparada a medida (HBSS) sin Ca2+ y Mg2+	N/A	N/A	Para perfusión y disociación celular
Primers de oligonucleótido de ciclofilina A (CyA) hacia adelante	Integrated DNA Technologies	5′-GCC GAT GAC GAG CCC TTG-3′	Para RT-qPCR
Primers de oligonucleótido de ciclofilina A (CyA) hacia atrás	Integrated DNA Technologies	5′-TGC CGC CAG TCG CAT TAT-3′	Para RT-qPCR
DMEM, 1×	Gibco	11965-092	Para medio de recolección
Solución de DNase I	Promega	M6101	Para disociación celular
Inyección de enoxaparina sódica	Sandoz	0781-3119-64	Para perfusión
Suero fetal bovino (FBS)	Cytiva HyClone	SH30088.02HI	Para medio de recolección
Tampon de tinción para citomeitría de flujo	Invitrogen	00-4222-26	Para tinción FACS
Hemostato	Fine Science Tools	13008-12	Para estabilización de la cavidad torácica
HEPES, 1 M	Gibco	15630-080	Para medio de recolección
HEPES, 1 M	Teknova	H1035	Para preparación de HBSS
Dieta deficiente en yodo	Envigo	TD.95007	Para inducción de hipotiroidismo in vivo
Pinzas de iris	Fine Science Tools	11065-07	Para disección pituitaria
Isoflurano	Piramal Critical Care	66794-017-25	Para anestesia
L-glutamina	Gibco	35050-061	Para medio de recolección
Medium 199	Gibco	11150-059	Para cultivo post-FACS
Metimazol (MMI)	Sigma-Aldrich	M8506-100G	Para inducción de hipotiroidismo in vivo
Placa de reacción de 96 pozos rápidos MicroAmp	Applied Biosystems	4346907	Para RT-qPCR
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122	Para cultivo post-FACS
Bomba peristáltica	Fisher Scientific	GP1000	Para perfusión cardíaca
Perclorato de potasio (KClO4)	Sigma-Aldrich	241830-500G	Para inducción de hipotiroidismo in vivo
PowerTrack SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	A46109	Para RT-qPCR
Yoduro de propidio	eBioscience	00-6990-50	Para tinción de viabilidad durante FACS
Reactivo de lisis QIAzol	Qiagen	79306	Para extracción de ARN
Tubo de silicona	Cole-Parmer	EW-96410-13	Para perfusión cardíaca
Estereomicroscopio	Nikon	SMZ-745T	Para disección del lóbulo anterior
Sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus	Applied Biosystems	4376600	Para RT-qPCR
Cuchara quirúrgica	Fine Science Tools	10090-13	Para elevación del cerebro durante la exposición pituitaria
Kit de síntesis de ADNc de primera hebra Transcriptor	Roche	4379012001	Para preparación de ADNc
Azul de Tripán	Thermo Fisher Scientific	T10282	Para conteo celular
Primers de oligonucleótido de Tshb hacia adelante	Integrated DNA Technologies	5′-TCT GTG CTG GGT ATT GTA TGA C-3′	Para RT-qPCR
Primers de oligonucleótido de Tshb hacia atrás	Integrated DNA Technologies	5′-GCG GCT TGG TCG AGT AGT TG-3′	Para RT-qPCR
Baño de agua	Baño de agua Fisher Scientific Isotemp	15-462-5Q	Para digestión enzimática