Artículo de método

Medición de los efectos de los compuestos farmacológicos en la morfología mitocondrial en modelos de envejecimiento de ratones

DOI:

10.3791/71930

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4 de agosto de 2026

 ,  ,  , 
1Division of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2MicRoN Core, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe métodos para medir los efectos de fármacos administrados mediante minibombas osmóticas implantables sobre la morfología mitocondrial en modelos murinos envejecidos. Se realiza imágenes confocales tridimensionales (3D) de superresolución de hígados de ratón, y se desarrolla una canalización para la segmentación, clasificación y análisis cuantitativo sesgado de estructuras mitocondriales.

Resumen

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La acumulación de daños moleculares relacionados con el envejecimiento puede contribuir a cambios en la morfología mitocondrial y la disfunción metabólica, especialmente en tejidos con altos gastos energéticos. Los compuestos farmacológicos que mejoran la disfunción metabólica y restauran morfologías mitocondriales sanas y 'jóvenes' pueden representar modalidades efectivas para prolongar la esperanza de salud (es decir, la parte de la vida libre de la carga de enfermedades crónicas relacionadas con el envejecimiento) en mamíferos. En este caso, se describen métodos para realizar implantaciones de bombas osmóticas subcutáneas en ratones envejecidos para la administración estable de compuestos farmacológicos hidrofóbicos. Luego, los tejidos se fijan, crioseccionan, teñen e imaginan usando microscopía confocal de superresolución. Finalmente, se presenta una cadena automatizada para la segmentación tridimensional, clasificación y medición cuantitativa de estructuras mitocondriales. Por tanto, estos métodos pueden ser útiles para evaluar cuantitativamente los cambios en la estructura tridimensional mitocondrial en diferentes tejidos a lo largo de la vida del ratón. Además, estas técnicas pueden ayudar en la identificación reproducible de fármacos de moléculas pequeñas que mitiguen la disfunción metabólica relacionada con el envejecimiento.

Introducción

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Las mitocondrias son orgánulos dobles unidos a membranas que están organizados espaciotemporalmente para adaptarse a las demandas metabólicas actuales de su célula y tejido huésped1. Las invaginaciones en la membrana interna, denominadas cristas, se forman y organizan mediante una coordinación dinámica entre fosfolípidos de membrana interna no bicapa como la cardiolipina y la fosfatidiletanolamina, filas de dímeros de ATP sintasa en las puntas de las cristas, oligómeros que se unen a la cardiolipina de la GTPasa Óptica Atrofia 1 (OPA1) similar a la dinamina en la parte superior de las cristas, y complejos del sitio de contacto mitocondrial y sistema organizador de Cristae (MICOS) en las unionesde las cristas 1. Estas estructuras de membrana interna subcompartimentan las mitocondrias en unidades funcionalesindividuales 2 y proporcionan una mayor superficie sobre la que los complejos respiratorios productores de potencial transmembranario mitocondrialpueden ensamblarse 1. Como orgánulos dinámicos con funciones celulares secundarias relacionadas con la señalizaciónapoptótica 3, la homeostasis de especies de oxígeno reactivaCa 2+ y la biosíntesislipídica 4, las estructuras morfológicas mitocondriales son altamente sensibles a cambios ambientales como la disminución de la disponibilidad deoxígeno 5 y el aumento de la liberación de Ca2+ del retículoendoplasmático 6,7.

La acumulación de daño molecular contribuye a cambios en la estructura y función mitocondrial durante elenvejecimiento 8. Estudios pioneros de criotomografía electrónica (crio-ET) realizados por el grupo de Kühlbrandt en varios organismos modelo han demostrado una clara correlación entre la densidad de las cristas y la capacidad de respiración, así como una disminución dependiente de la edad en la densidad de las cristas y la pérdida asociada de dímeros de ATPsintasa 9,10. Además, los cambios en el volumen mitocondrial pueden deberse a fisión mitocondrial deteriorada y dinámicade fusión 11, aumento de la acumulación delípidos 12 y aumento de lahinchazón 13. En el músculo esquelético, VO2 max, que es un fuerte predictor de la esperanza de vida14,15, puede predecirse con precisión en función del grado de fragmentación mitocondrial intermiofibrilar y la densidad decristas 16.

No es de extrañar que los cambios estructurales y funcionales relacionados con el envejecimiento en las mitocondrias puedan contribuir a la patogénesis de varias enfermedadescrónicas 17,18,19,20. El aumento de la fragmentación mitocondrial y las alteraciones en la biogénesis y morfología mitocondrial están asociados tanto con la enfermedad de Alzheimer como con la enfermedad de Parkinson20. Estos cambios provocan alteraciones en los complejos de fosforilación oxidativa, dificultando la generación de la fuerza motriz de los protones y conduciendo a una producción excesiva de especies reactivas deoxígeno 20,21,22. En la disfunción cardíaca y la insuficiencia cardíaca relacionadas con el envejecimiento, el aumento de la fragmentación mitocondrial, la hinchazón, la vacuolización y la pérdida de densidad de cristas contribuyen a una disminución en la producción deATP 23,24. Estas alteraciones estructurales pueden estar en parte relacionadas con la manipulación alterada del Ca2+ mitocondrial y el aumento de la actividad del poro de transición de permeabilidadmitocondrial 6,7,13,25. Como posible regulador de la mitofagia, la apertura excesiva del poro de transición de permeabilidad durante el envejecimiento puede ser destructiva y conducir a una muerte celular descontrolada13. Por último, se sabe que los déficits relacionados con el envejecimiento en el metabolismo lipídico mitocondrial y la mitofagia también pueden contribuir al desarrollo de la enfermedad hepática grasano alcohólica 26. En particular, se ha demostrado que la esteatosis hepática va acompañada de un aumento del estrés oxidativo y de una mayor formación de estructuras mitocondriales similares adonuts 3,27.

Por ello, existe un interés considerable en desarrollar terapias que se dirijan a la disminución de la función mitocondrial relacionada con el envejecimiento para mejorar la calidad de vida de las personas que padecen ciertas enfermedades crónicas. Forzinity (elamipretida), un péptido interactivo con lípidos que atenúa el potencial superficial de la membranainterna 28 y aumenta la generación de ATP mitocondrial29,30, se convirtió recientemente en el primer fármaco dirigido a mitocondrias aprobado por la FDA para el tratamiento del síndrome de Barth. El síndrome de Barth es un trastorno ligado al cromosoma X en el que los defectos en la remodelación cardiolipina contribuyen a la miocardiopatía, debilidad del músculo óseo y mortalidadprematura 31. Aunque el tratamiento a corto plazo no produjo cambios detectables en la edad biológica muscular en ratonesenvejecidos 32, el tratamiento con elamipretida ha mostrado mejoras repetidas en los parámetros funcionales del envejecimiento, como la fracción de eyección cardíaca y la tensión longitudinalglobal 32,33, la fatiga muscular y generaciónde fuerza 33,34,35 y la fragilidad32. La urolitina A, una eligatanina derivada del intestino que inducemitofagia 36, también ha mostrado mejoras clínicas en la resistencia y fuerza muscularaeróbica 37,38, además de efectos positivos sobre la disfunción cardíaca en ratones ancianos y en ratas modelos de insuficiencia cardíacainducida 39. La metformina, un fármaco antidiabético que se ha demostrado que interactúa con el ComplejoI 40, también se ha sugerido que actúa como un mimético parcial de la restricción calórica41,42. Sin embargo, aunque el tratamiento con metformina se ha asociado con una reducción del riesgo de cáncer y un retraso del deterioro cognitivo en datos epidemiológicosprevios 43,44, sus efectos sobre la esperanza de salud y la vida en pacientes no diabéticos siguen siendo una cuestiónabierta 45. Finalmente, el tratamiento con ribosido de nicotinamida, precursor de NAD+, puede aumentar la biogénesis mitocondrial y la respuesta de proteínas desplegadas mitocondriales para mejorar la generaciónde energía 46,47,48,49, pero su tratamiento a largo plazo en ratones UM-HET3 no tuvo un efecto significativo sobre la mediana del ratón ni sobre la esperanza de vida del percentil90 del ratón.

En este caso, se describen métodos para preparar tejidos de ratones envejecidos tratados con compuestos farmacológicos para la imagen confocal de superresolución de la morfología mitocondrial. Se demuestra la implantación exitosa de minibombas osmóticas para la administración sostenida de fármacos en ratones, y se analizan los hígados para detectar los efectos del tratamiento en la estructura de la membrana externa. Finalmente, se presenta una línea de análisis para la medición cuantitativa imparcial y reproducible del volumen mitocondrial, área superficial y esfericidad, así como la clasificación de las mitocondrias en diferentes estructuras. Por tanto, estos métodos son aplicables tanto para estudiar los cambios en la morfología mitocondrial a lo largo de la vida de los mamíferos como para identificar compuestos farmacológicos que puedan mitigar el deterioro de la salud metabólica relacionado con el envejecimiento.

Protocolo

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Todos los procedimientos que involucraron animales de investigación se realizaron conforme a las directrices institucionales para el uso de animales de laboratorio y fueron aprobados por los comités de Cuidado y Uso Institucional de Animales del Brigham and Women's Hospital y de la Escuela de Medicina de Harvard bajo el Protocolo nº 2016N000368. Los investigadores interesados en aplicar este protocolo en otros países deberían consultar a sus organismos institucionales y reguladores locales para garantizar el cumplimiento de las normativas de bienestar animal aplicables.

1. Implantación de bomba osmótica subcutánea

NOTA: Las cirugías a los animales solo deben ser realizadas por personal experimentado y formado, y se debe tener un gran cuidado para minimizar el estrés y/o sufrimiento animal. Realizar procedimientos que involucren animales de investigación solo según lo descrito exactamente en los protocolos aprobados para animales. Toda la investigación que implique el uso de animales debe cumplir estrictamente con los 3R – Reemplazo, Reducción y Refinamiento. Este protocolo detalla la implantación de la bomba osmótica subcutánea, que se clasifica como un procedimiento quirúrgico menor. También se pueden realizar implantaciones de bombas osmóticas intraperitoneales, pero este es un procedimiento más complejo que se clasifica como un procedimiento quirúrgico mayor. Por lo tanto, se recomienda realizar el procedimiento subcutáneo salvo que exista una justificación científica sólida a favor de la implantación intraperitoneal.

  1. Relleno de bombas osmóticas
    NOTA: La preparación de soluciones farmacólicas y el llenado de bombas osmóticas deben realizarse en un gabinete de bioseguridad utilizando técnica estéril. Los modelos de bomba deben elegirse en función del volumen deseado del depósito y la duración del tratamiento. Para este estudio se utilizó el modelo 2004 (~200 μL volumen de reservorio, administración de tratamiento durante 4 semanas).
    1. Prepara la solución del fármaco en un disolvente compatible con las bombas osmóticas. Consulta https://alzet.com/formulating-the-solution/. Utiliza el caudal (μL/h) indicado en el lote de bombas osmóticas ordenadas para determinar la concentración de fármacos necesaria para alcanzar la dosis diaria deseada.
      NOTA: Una solución de 50% v/v DMSO y 50% v/vPEG 300 solubiliza de forma estable los compuestos hidrofóbicos y es compatible con las bombas osmóticas. Todo(los) compuesto(s) y disolvente(s) deben ser de grado farmacéutico siempre que sea posible.
    2. Filtra, esteriliza la solución farmacológica con un filtro de jeringuilla de 0,22 μm y manténla a temperatura ambiente.
    3. Coloca un moderador de flujo en una bomba y empuja hacia abajo hasta que encaje en un tubo microfuge. No empujes el moderador de flujo hasta abajo.
    4. Haz una balanza analítica sobre un tubo de microfuga vacío y luego registra el peso de la bomba osmótica.
    5. Conecta el tubo de llenado a una jeringuilla de 1 mL y toma al menos 1,5 veces el volumen del depósito de la bomba. Elimina las burbujas de aire tirando del émbolo hacia abajo, haciendo girar la jeringuilla y empujándola hacia arriba hasta que se forme líquido en la parte superior del tubo de llenado.
    6. Quita el moderador de flujo manteniendo la bomba en posición vertical.
    7. Introduce el tubo de llenado por la abertura en la parte superior de la bomba hasta que no pueda avanzar más.
    8. Empuja lentamente el émbolo hacia abajo mientras mantienes la bomba en posición vertical. Sigue llenando hasta que aparezca la solución en el enchufe. Luego, retira el tubo de relleno y limpia el exceso de solución con una toallita delicada.
    9. Introduce el moderador de flujo hasta que el tapón quede al ras de la parte superior de la bomba.
    10. Coloca la bomba llena de nuevo en un tubo de microfuga y pesa. Determinar el peso de la solución y verificar que el volumen de relleno sea al menos el 90% del volumen del depósito (diferencia de peso en miligramos ≈ volumen en microlitros).
    11. Llena un tubo cónico de 15 mL con 5 mL de solución fisiológica estér×il amortiguada con fosfato (PBS) y añade la bomba prellenada. Sella con película de parafina y ceba la(s) bomba(s) incubando a 37 °C durante el tiempo requerido por el modelo de bombas osmóticas. Para el modelo 2004, esto es 40 h.
  2. Preparación de meloxicam
    NOTA: Esto debe realizarse en un armario de bioseguridad utilizando una técnica estéril. El meloxicam, un antiinflamatorio no esteroideo (AINE), no es una sustancia controlada, pero puede requerir una licencia para adquirirlo.
    1. Usando una aguja de 27 g y una jeringuilla Luer-lok de 3 mL, diluye la base de meloxicam de 5 mg/mL a 1 mg/mL usando PBS estéril en un vial de vidrio estéril de 5 mL. Prepáralos el mismo día y guárdalos a temperatura ambiente.
  3. Preparación del lugar quirúrgico
    NOTA: No es necesario realizar la implantación de la bomba osmótica dentro de un armario de bioseguridad, ni es posible mantener la esterilidad durante los procedimientos quirúrgicos. Sin embargo, el lugar de la cirugía debe seguir cumpliendo con estrictas normas de limpieza y prácticas asépticas. El lugar de la cirugía debe estar limpio, libre de desorden y tener poco tráfico de personas. Idealmente, hay tanto un lugar de preparación (es decir, para afeitarse y frotar) como un sitio quirúrgico (es decir, para realizar la implantación de la bomba).
    1. Desinfecta completamente la zona de la cirugía con etanol al 70% y sécala con papel de cocina.
    2. Enciende el esterilizador de vidrios y ponlo a 250 °C. Déjalo calentar entre 15 y 30 minutos.
    3. Enciende el vaporizador y pon la almohadilla térmica al 65%. Ajusta el peso corporal del animal y el porcentaje de isoflurano al 3,2%.
    4. Pega una de las sondas de temperatura a la superficie de la almohadilla térmica. Deja que la almohadilla calefactante se caliente a 35–37 °C.
    5. Quita la jeringuilla del vaporizador. Introduce la pestaña verde hasta el fondo y llénala con isoflurano conectándolo a una botella de isoflurano y tirando del émbolo.
    6. Vuelve a unir la jeringuilla al vaporizador y ceba la jeringuilla.
    7. Coloca una segunda almohadilla térmica debajo de una jaula limpia para el animal para recuperarte. Coloca la jaula medio puesta, medio fuera de la almohadilla térmica.
  4. Implantación de la bomba
    NOTA: Todas las herramientas quirúrgicas deben limpiarse y autoclavarse con antelación. Para esterilizar herramientas quirúrgicas entre animales, se puede utilizar un esterilizador de cuentas de vidrio. Esto solo puede usarse para lotes de hasta 5 animales. Asegúrate de incluir una tira indicadora de autoclave para verificar que se han cumplido los parámetros de esterilización. El equipo de protección individual (EPP) adecuado incluye bata limpia, mascarilla quirúrgica, guantes quirúrgicos estériles y cubrimiento para el cabello. Los animales que se someten a cirugía no deberían estar a la vista de otros animales.
    1. Agarra al ratón por la base de la cola y colócalo en la cámara de anestesia. Desenganche los tubos y activa el flujo de isoflurano (3,2%) hacia la cámara. Coloca dos láminas esterilizadas sobre la almohadilla térmica.
    2. Espera a que el ratón se gire de lado y controla su respiración. Cuando la respiración se ha ralentizado y se relaja, detiene el flujo de isoflurano hacia la cámara. Sujeta los tubos a la recámara y desengancha los tubos del morro que se van a usar. Inicia el flujo de isoflurano (2%) hacia el nasal.
    3. Saca el ratón de la cámara y mete su nariz en el morro de la almohadilla térmica. Añade pomada oftálmica en ambos ojos.
    4. Pesa el ratón en una báscula y luego vuelve al morro. Determina el volumen de 1 mg/mL de meloxicam que se va a administrar. Para una dosis de 5 mg/kg, multiplica el peso del ratón en gramos por 5 para obtener los microlitros de meloxicam que se administran.
    5. Rocía la tapa del vial con 1 mg/mL de meloxicam con etanol al 70% y seca con una toallita suave. Luego, usando una jeringuilla de insulina de 0,3 mL, calcula el volumen correcto de meloxicam. Quita todas las burbujas de aire de la jeringuilla.
    6. Sujeta o sujeta al ratón con una mano, inclinando la cabeza hacia abajo. Inserta la aguja en un ángulo de 30°–45° en el cuadrante inferior derecho del abdomen con el bisel hacia arriba. Aspira para confirmar la colocación correcta de la aguja.
    7. Si no se observa aspirado, presiona suavemente el émbolo y inyecta meloxicam intraperitonealmente.
    8. Vuelve a colocar el ratón en el morro y la almohadilla térmica. Afeita completamente el 150% del área alrededor del lugar de implantación (media y parte superior de la espalda) con una tijera quirúrgica. Una vez hecho, aspira o cepilla suavemente el pelo del animal y desecha la primera hoja de caída.
      NOTA: Es necesario un afeitado limpio para realizar una cirugía aséptica. Como mínimo, cualquier incisión debe estar completamente libre de pelo de animales.
    9. Coloca el ratón de modo que su cabeza mire hacia el cirujano. Realizar un fregado alternado con povidona-yodo y etanol al 70%, utilizando aplicadores con punta de algodón, para un total de 3 aplicaciones. Asegúrate de empezar en el centro de la incisión prevista y espiralar hacia fuera con los aplicadores de punta de algodón.
    10. Cubre al animal con cortinas quirúrgicas estériles con fenestras y utiliza la técnica aséptica adecuada para ponerte guantes quirúrgicos.
    11. Antes de hacer cualquier incisión, asegúrate de revisar bien los reflejos pedales pellizcando firmemente ambos pies con pinzas de tejido. No continúes hasta después de varias pulsaciones, no hay movimiento. Esto confirma un plano quirúrgico de anestesia.
    12. Añade la piel de la escápula media con pinzas tisulares y realizad una incisión de 1 cm perpendicular a la columna vertebral con unas pequeñas tijeras quirúrgicas de iris. Para hacer un corte recto, corta con las tijeras quirúrgicas Iris en un ángulo de 90° respecto al ratón.
    13. Utiliza pequeñas pinzas hemostáticas dentro de la incisión para dispersar el tejido subcutáneo y crear un bolsillo para la bomba. Asegúrate de que el bolsillo de la bomba esté alejado de la parte delantera del animal y colocado ligeramente hacia un lado. Utiliza las pinzas hemostáticas para aflojar la piel en todos los lados de la incisión.
    14. Abre la incisión con las pinzas de tejido e inserta la bomba usando las pinzas hemostáticas. Inserta la bomba con el moderador de flujo entrando primero.
      PRECAUCIÓN: La bomba debe insertarse de forma que quede lo suficientemente alejada de la incisión, es decir, de modo que la piel que la rodea no esté bajo tensión. Si no se posiciona correctamente, esto puede provocar dehiscencia de la herida. La bomba también puede cambiar de posición durante la recuperación del animal.
    15. Con las pinzas de tejido, tensa suavemente la piel y tira de ambos lados de la incisión de forma uniforme. Comenzando por un extremo de la incisión, utiliza el aplicador de clips para colocar clips de herida de 7 mm a lo largo de toda la incisión (pueden ser necesarios 2–4 clips).
    16. Para cualquier espacio en la incisión que sea demasiado pequeño para ser acomodado con otro clip, aplica una pequeña cantidad de adhesivo de tejido usando el aplicador estéril. Pellizca con las pinzas de tejido.
    17. Tira y estira suavemente la piel alrededor de la incisión para confirmar que la herida está cerrada. Luego, corta el flujo de isoflurano hacia el morro y corta los tubos correspondientes. Coloca los ratones en la jaula de recuperación sobre la almohadilla térmica.
    18. Vigila completamente al ratón hasta que despierte y esté en modo ambulatorio. Vigila a los animales con frecuencia en busca de signos de angustia o dolor, y mantenlos aislados de otros ratones hasta que se recuperen.
    19. Después de 24 horas, volver a administrar 5 mg/kg de meloxicam mediante inyección intraperitoneal. (Opcional) Para ayudar en la recuperación animal, proporciona suplementos de electro-gel y/o coloca la comida en el suelo de la jaula.
    20. Después de 10–14 días, anestesiar de nuevo a los animales con isoflurano, aplicar pomada oftálmica y retirar los clips con el quita-clips.
      NOTA: Las pinzas deben retirarse en este plazo para evitar que el vello vuelva a crecer sobre las pinzas de la herida. Además, todas las bombas osmóticas tienen un periodo de duración definido. Asegúrate de explantar las bombas o de eutanasiar a los animales antes de que termine su duración. Para periodos de tratamiento más largos, se pueden realizar múltiples implantaciones de bomba consecutivas en el mismo animal.

2. Fijación, incrustación y seccionamiento de tejidos

  1. Fijación de tejidos
    NOTA: Todos los procedimientos con animales deben ser realizados por personal experimentado para minimizar el estrés y el sufrimiento animal. La cámara de eutanasia debe limpiarse y vaciarse físicamente entre cada animal para eliminar cualquier residuo de dióxido de carbono. Para minimizar el estrés, los animales deben ser sacrificados en sus jaulas domésticas cuando sea posible. Por último, los animales no deben ser sacrificados en proximidad espacial o a la vista de otros ratones. Se requieren herramientas quirúrgicas limpias para procedimientos no de supervivencia, pero no necesitan ser estériles (es decir, autoclaveadas).
    1. Coloque el ratón en la cámara de inducción y abra el regulador hasta que el caudalímetro alcance el caudal previsto (~40%–70% del volumen de la cámara por minuto).
    2. Observa al ratón durante todo el procedimiento, asegurándote de que no haya signos de angustia como saltar. Monitoriza la cesación de la actividad respiratoria y mantén el flujo deCO2 durante al menos 2 minutos tras la cesación de la actividad respiratoria. Asegúrate de que el tiempo total de exposición alCO2 sea de al menos 5 minutos.
    3. Recuperar al ratón y realizar un método secundario de eutanasia como una luxación cervical.
    4. Sujeta las extremidades del animal a un trozo de espuma de poliestireno cubierto con papel de aluminio usando agujas de 23-G. Moja el pelaje rociando con etanol al 70%.
    5. Haz una pequeña incisión cerca de la base del abdomen y corta la piel hasta el cuello. Sigue esa misma incisión para abrir la cavidad corporal y corta cuidadosamente la caja torácica.
    6. Haz incisiones en forma de U empezando en la base del abdomen y sujeta la piel con agujas de 23-G.
    7. Diseca el(los) órgano(s) relevante(s) y colócalos en un tubo cónico de 15 mL prellenado con 5 mL de paraformaldehído (PFA) al 4%. Corrige durante 24 horas a 4 °C en un asador.
      PRECAUCIÓN: La solución PFA es peligrosa. Evita el contacto con la piel. El EPI adecuado durante la manipulación incluye bata de laboratorio, guantes de nitrilo y gafas de seguridad.
      NOTA: Si es necesario perfundir sangre de los tejidos, y/o si se desea fijación por perfusión, realizar la perfusión cardíaca como se ha descritoanteriormente 51. En la fijación por inmersión, como se realiza aquí, puede tardar un tiempo en que el fijador se difunda a través del tejido, especialmente en fragmentos de tejido más grandes. Esto puede alterar la morfología mitocondrial; además, la fijación con PFA también puede hacer que los tejidos sereduzcan 52.
    8. Tras 24 horas, retira la solución de paraformaldehído y enjuaga los pañuelos con 10 mL de 1× PBS. Realiza un total de 3 veces durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente en un asador.
    9. Retira el PBS y sumerge los tejidos en 10 mL de sacarosa al 30% durante 48 horas a 4 °C en un asador. La infiltración de sacarosa se completa cuando el/los tejido(s) se hunden.
      NOTA: Para verificar que el disolvente fue administrado al animal, mide la cantidad restante en la bomba.
  2. Incrustación de tejidos
    NOTA: Asegúrate de llevar un control de la ubicación y orientación del tejido en los moldes.
    1. Llena un recipiente de espuma de poliestireno con hielo seco y coloca una lámina de metal plana encima.
    2. Coloca los moldes sobre la chapa de metal y rellena 2/3–3/4 hasta arriba con un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) (medio de incrustación de tejido). Lleva cualquier burbuja de aire a la superficie o a las esquinas con un par de pinzas finas. Para acelerar la congelación, coloca algunas bolitas de hielo seco directamente sobre los moldes.
    3. Coloca un medio de incrustación de tejido en un pesaje y mezcla los tejidos en él. Intenta evitar llevar la solución de sacarosa.
    4. Una vez que el medio de incrustación de tejido se haya congelado completamente en el fondo del molde (debe ser totalmente opaco), sumerge el tejido dentro del molde de modo que no toque ningún lado ni la superficie del molde. Colocado en la ubicación y orientación deseadas.
    5. Espera a que el medio de incrustación de tejido se congele completamente antes de transferir los moldes a un congelador a -80 °C.
      NOTA: (Punto de pausa) Los tejidos incrustados pueden almacenarse al menos durante 3 meses.
  3. Seccionamiento de tejidos
    NOTA: Para reducir la variación de lote a lote en el grosor de las secciones, todos los tejidos que se van a analizar juntos deben ser seccionados en una sola sesión.
    1. Saca los pañuelos incrustados del congelador a -80 °C y colócalos en un recipiente de espuma de poliestireno lleno de hielo seco.
    2. Preenfría la temperatura de la cámara del criostato y el soporte de la muestra a -24 °C y -25 °C, respectivamente.
    3. Coloca una hoja nueva para microtomos en el soporte de la hoja e inserta la placa anti-rollo. Para facilitar la limpieza, forra la cámara del criostato con papel de cocina.
    4. Retira el mandrillo de la muestra de la cámara del criostato y calienta hasta la temperatura ambiente.
    5. Utiliza una cuchilla de afeitar para cortar cuidadosamente cada esquina del moho de tejido. Deslánzalo suavemente para eliminar el tejido que incrusta el bloque de medio.
    6. Presiona firmemente el bloque de tejido contra el mandril de la muestra mientras giras hacia adelante y atrás. Una vez adherido firmemente, coloca el manche de la muestra en la cámara del criostato durante unos minutos para que se congele.
      NOTA: Asegúrate de colocar el bloque de tejido sobre el mandril en la orientación adecuada para que el tejido quede seccionado en la orientación deseada.
    7. Una vez que el bloque de tejido esté completamente congelado al mandril de la muestra, coloca el mandril en el portamandril y apriétalo en su sitio. Mueve la hoja del criostato para que quede justo delante del bloque de tejido sin tocarlo.
    8. Ajusta el ajuste de corte a 50 μm y comienza a recortar el bloque hasta que quede expuesta una sección transversal completa del tejido.
    9. Desselecciona la configuración del recorte y ajusta el grosor de la sección a 20 μm. Corta unas rodajas a este grosor antes de bajar la placa anti-rodante. Corta lenta y suavemente el ~80%–90% de la sección antes de detenerte.
    10. Levanta la placa anti-rodillo. Saca una llave de vidrio cargada y presiona el lado cargado sobre la sección de tejido en la posición deseada.
      NOTA: Si la sección de tejido se enrolla tras levantar la placa anti-rollo, usa los pinceles finos para desenrollarla.
    11. Quita el mandril del portamandillas. Saca el mandril del criostato y calienta hasta la temperatura ambiente. Saca el bloque de papel de seda del mandril y colócalo de nuevo en el molde.
    12. Envuélvelo en papel de aluminio para evitar que el bloque de tejido se salga del molde y vuelva al congelador a -80 °C.
    13. Coloca las secciones de tejido montadas a -20 °C.
      NOTA: (Punto de pausa) Las secciones de tejido pueden almacenarse de forma segura a -20 °C indefinidamente.

3. Tinción por inmunofluorescencia

  1. Recupera las criosecciones y déjalas secar durante 10 minutos a 37 °C en una incubadora.
  2. Lava las láminas para eliminar el exceso de tejido que impregna.
    1. Preparar 1 L de 1× PBS que contenga 0,1% v/v de Triton X-100 (PBS-T)
    2. Llena 3 tarros de tinte con PBS-T.
    3. Coloca los deslizadores en el portadeslizadores. Sumerge las láminas en el tarro de tinte durante 10 minutos. Repite un total de 3 veces.
  3. Bloquea el tejido para que lo teñan.
    1. Toca suavemente cada portaobjetos en una toallita delicada para que se seque. Coloca los deslizadores suspendidos en una caja con el tejido hacia arriba.
    2. Prepara una solución bloqueadora de 20 mL de 1× PBS, 0,3% v/v de Triton X-100 y 5% v/v albúmina sérica bovina (BSA).
    3. Pipetea 1 mL de solución bloqueante en cada lámina, asegurándote de que los tejidos estén completamente cubiertos.
    4. Incuba a temperatura ambiente durante 1 hora.
  4. Incuba los tejidos con el anticuerpo primario.
    1. Toca suavemente cada portaobjetos en una toallita delicada para que se seque. Utiliza otra toallita delicada para absorber suavemente el líquido que queda entre las secciones de pañuelo.
    2. Prepara una dilución 1:200 del anticuerpo Tom20 para α ratón en solución bloqueante (200 μL por lámina)
    3. En la parte inferior de la caja deslizante, coloca las toallas de papel y humédelas completamente con agua.
    4. Coloca los deslizadores suspendidos en la caja con el pañuelo hacia arriba. Pipetear 200 μL de anticuerpo primario diluido en cada lámina, asegurando que los tejidos estén completamente cubiertos.
    5. Corta piezas de película de parafina aproximadamente del tamaño de las cubiertas que se van a usar. Corta 1 trozo de película de parafina por cada diapositiva.
    6. Coloca cada fragmento de película de parafina en cada lámina para distribuir la dilución de anticuerpos a lo largo de las secciones del tejido. Cierra la caja de diapositivas y incuba a 4 °C durante la noche.
  5. Lava las láminas tras la incubación con el anticuerpo primario.
    1. Llena 3 tarros de tinte con PBS-T. Recupera las láminas y retira trozos de película de parafina.
    2. Coloca los deslizadores en el portadeslizadores. Sumerge las láminas en el tarro de tinte durante 10 minutos. Repite un total de 3 veces.
  6. Incuba las láminas en el anticuerpo secundario.
    NOTA: Para confirmar el marcaje específico de las mitocondrias, prepare al menos una lámina de cada grupo teñida únicamente con el anticuerpo secundario.
    1. Toca suavemente cada portaobjetos en una toallita delicada para que se seque. Utiliza otra toallita delicada para absorber suavemente el líquido que queda entre las secciones de pañuelo.
    2. Preparar una dilución 1:200 del anticuerpo Alexa Fluor 568 de α-conejo de cabra y 5 μg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en solución bloqueante (200 μL por portaobjetos).
    3. Coloca los deslizadores suspendidos en la caja con el pañuelo hacia arriba. Pipete 200 μL de anticuerpo secundario diluido en cada lámina, asegurando que los tejidos estén completamente cubiertos.
    4. Corta piezas de película de parafina aproximadamente del tamaño de las cubiertas que se van a usar. Corta 1 trozo de película de parafina por cada diapositiva.
    5. Coloca un trozo de parafilm en cada lámina para dispersar la dilución de anticuerpos por las secciones del tejido. Cierra la caja de portaobjetos e incuba a temperatura ambiente durante 4 horas, o a 4 °C durante la noche.
  7. Lava las cubiertas.
    NOTA: Usa pinzas de plástico para recoger y manipular las fundas
    1. Coloca los cubiertos uno a uno en un vaso lleno de agua caliente del grifo y un detergente para cristalería, como Contrad 70. Cúbrelo con un trozo de película de parafina.
    2. Sonica durante 30 minutos en un sonicador de baño.
    3. Enjuaga varias veces con agua caliente del grifo. Luego enjuaga varias veces más en agua destilada doblemente. Sonica durante 15 minutos en el enjuague final con agua destilada doble.
    4. Coloca los cubrientes en etanol al 70% y guárdalos. Cuando esté listo para montar las cubiertas, sácalas del etanol al 70% y déjalas secar al aire en una campana extractora.
  8. Lava las láminas tras la incubación con el anticuerpo secundario.
    1. Llena 3 tarros de tinte con PBS-T. Recupera las láminas y retira trozos de película de parafina.
    2. Coloca los deslizadores en el portadeslizadores. Sumerge las láminas en el tarro de tinte durante 10 minutos. Repite un total de 3 veces.
    3. Toca suavemente cada portaobjetos en una toallita delicada para que se seque. Utiliza otra toallita delicada para absorber suavemente el líquido que queda entre las secciones de pañuelo.
  9. Monta las cubiertas.
    1. Añade 2–3 gotas distribuidas uniformemente de antifade mountant en una corredera.
    2. Para evitar burbujas de aire, toma un deslizante de cobertura #1.5 limpio y mantenlo en un ángulo de 45° respecto al deslizador a lo largo del eje largo. Inclina suavemente y despacio la funda sobre el tobogán. Repite para todas las diapositivas del juego.
    3. Deja que las láminas curen durante 18–60 horas a temperatura ambiente mientras están protegidas de la luz.
    4. Guarda las diapositivas a 4 °C protegidas de la luz.
      NOTA: (Punto de pausa) Las láminas pueden ser imágenes inmediatamente después del periodo de curado, o hasta 1 mes cuando se almacenan a 4 °C. No es necesario sellar los bordes. Asegúrate de usar coberturas #1.5 o #1.5H, ya que otros grosores introducirán aberraciones esféricas y pueden reducir la calidad de imagen. No uses medios de montaje con DAPI, ya que DAPI tiene amplios espectros de excitación y emisión. El tiempo de curado depende del grosor de la muestra; Aquí, 48 h.

4. Imagen de superresolución

NOTA: Este protocolo utiliza un confocal de escaneo puntual ZEISS Airyscan2 LSM 980 construido alrededor de un ZEISS Axio Observer Z1 y equipado con dos tubos fotomultiplicadores multialcalinos (PMTs) y un detector espectral GaASP de 32 canales, una carcasa ambiental y un objetivo Plan Apo 63×/1.4 de contraste de interferencia diferencial de aceite (DIC) III.

  1. Organiza la adquisición.
    1. Añade una sola pista Airyscan SR y selecciona el fluoróforo adecuado.
    2. Selecciona la placa de 10" y los filtros pasa-banda de emisión apropiados.
      NOTA: La placa de 10" es específica para este microscopio, ya que también está equipada con detectores infrarrojos (IR).
    3. Selecciona el(los) láser(es) adecuado(s). Establece los criterios de muestreo de Nyquist a 2 haciendo clic en SR (el tamaño del píxel debe ajustarse a 0,05 μm).
    4. Haz clic en vivo y alinea el detector Airyscan (selecciona la función de alineación en vivo). Haz clic en parar una vez que la intensidad esté localizada en el centro del icono del detector y cuando el detector esté en verde.
      NOTA: Si todo está configurado correctamente, debería aparecer un mensaje en el lado izquierdo del software que dice "Los ajustes de Airyscan están optimizados con éxito".
    5. Vuelve a hacer la directa y ajusta la intensidad del láser para que haya una señal decente pero sin píxeles saturados (haz clic en el indicador de distancia). Haz clic en stop una vez optimizado.
      1. (Opcional) Para aumentar la señal sin ajustar la potencia del láser, aumenta la ganancia.
  2. Realiza la adquisición de datos.
    1. Haz clic en z-stack y verifica que el tamaño del paso está fijado a 0,1 μm (ajusta si no lo está).
    2. Haz clic en directo y establece los límites inferior y superior del z-stack.
    3. Haz clic en iniciar experimento.
    4. Una vez recogido la pila z, ve a la pestaña Airyscan debajo de la imagen y haz clic en procesar 3D. Mantén los parámetros del filtro de Weiner de eliminación de ruido usados aquí consistentes entre diferentes réplicas y grupos de tratamiento.
    5. Guarda el Z-stack procesado de Airysscan.
      NOTA: Si se utilizan dos pistas Airyscan SR, asegúrate de que el microscopio cambie de pista en cada fotograma.

5. Creación de una tubería automatizada para cuantificar la morfología mitocondrial

NOTA: Este protocolo describe el desarrollo de una cadena automatizada de análisis de imágenes para la cuantificación 3D de la morfología mitocondrial utilizando el software ZEISS arivis Pro 4.1.2.

  1. Convierte archivos .czi procesados por Airyscan a formato .sis usando la herramienta de conversión arivis.
    NOTA: Si la imagen completa es grande y el tiempo de procesamiento es demasiado largo durante la optimización de parámetros, recorta una pequeña subregión representativa de la imagen para usarla como referencia de trabajo y optimizar la configuración. Esta imagen recortada debe incluir tanto mitocondrias bien aisladas como regiones de mayor densidad, para representar con precisión el campo completo de la imagen. Una vez lograda una segmentación satisfactoria en la imagen recortada, la tubería optimizada puede aplicarse al conjunto completo de imágenes. Este enfoque ahorrará significativamente tiempo y facilitará ajustar todos los parámetros sin comprometer la calidad de la pipeline.
  2. Configura y optimiza la pipeline.
    1. Abre una imagen representativa (por ejemplo, del grupo de control) en el software.
    2. Selecciona el canal de inmunofluorescencia Tom20 como entrada para el análisis.
    3. Aplica un paso de eliminación de ruido antes de la segmentación. Aquí se utilizó el algoritmo de mejora de partículas, con un diámetro de 5,42 y una intensidad de 0,5.
      NOTA: El filtro de mejora de partículas es un algoritmo de reducción de ruido que preserva la estructura diseñado para amplificar objetos compactos, aproximadamente esféricos o alargados mientras suprime el ruido de fondo. Funciona aumentando la intensidad local a una escala espacial (diámetro) especificada, lo que la hace especialmente adecuada para mitocondrias, que aparecen como partículas o túbulos brillantes y aislados sobre un fondo oscuro. Si el valor del parámetro de diámetro se ajusta demasiado pequeño, aumentará el ruido, mientras que un valor demasiado grande difuminará los objetos adyacentes. El parámetro de intensidad controla el grado de realzamiento, en el que valores altos aumentan la amplificación de la señal pero pueden introducir artefactos si se ajustan demasiado altos. Comienza con los valores por defecto y ajusta mientras inspeccionas visualmente la salida en una región representativa de interés. Existen varios métodos de eliminación de ruido en arivis Pro. El suavizado gaussiano es una opción sencilla y rápida que reduce el ruido de alta frecuencia de forma uniforme, pero puede difuminar detalles estructurales finos. El filtrado mediano es mejor para preservar los bordes afilados y eliminar el ruido de sal y pimienta. El aumento de partículas (utilizado aquí) se prefiere cuando el objetivo es detectar objetos fluorescentes discretos, ya que amplifica selectivamente la señal de estructuras que coinciden con el rango de tamaño especificado. Para imágenes con baja relación señal-ruido o con una gran heterogeneidad de fondo, puede ser necesario un paso de reducción de ruido más fuerte. Se recomienda probar dos o tres métodos en la misma imagen representativa y comparar la calidad de segmentación aguas abajo.
    4. Segmentar mitocondrias individuales usando el algoritmo Blob Finder, que detecta objetos en el espacio 3D.
    5. Ajustar los parámetros de segmentación, incluyendo el tamaño del objeto y el umbral de sensibilidad, e inspeccionar visualmente la superposición entre los objetos detectados y la imagen denoidada para asegurar una segmentación precisa. Aquí se utilizaron los siguientes parámetros: un diámetro de 0,244 μm, un umbral de probabilidad del 25% y una sensibilidad dividida del 22,22%, con la normalización fijada en el primer punto de inicio.
      NOTA: Los parámetros de segmentación dependen de la resolución de la imagen y del tamaño del voxel. En este estudio, las dimensiones de la imagen fueron 1354 × 1354 píxeles con un tamaño XY de píxel de 0,049 μm y un tamaño de vóxel de 0,049 × 0,049 × 0,100μm 3.
  3. Realizar la extracción de características y el control de calidad.
    1. Extrae parámetros morfológicos para cada objeto detectado, incluyendo el volumen (μm3), la superficie (μm2) y la esfericidad (área superficial de una esfera con el mismo volumen/área superficial de las mitocondrias).
    2. Exporta objetos segmentados como archivos TIFF para validación visual.
    3. Abre archivos exportados en FIJI o arivis y superponlos con la imagen original para una inspección visual de la precisión de segmentación.
    4. Exporta las mediciones cuantitativas como archivos individuales de hoja de cálculo para cada muestra.
  4. Aplica el oleoducto.
    1. Guarda la pipeline optimizada. Un ejemplo de pipeline puede encontrarse en el Archivo Suplementario 1.
    2. Aplicar la tubería a imágenes adicionales de todos los grupos experimentales del estudio.
    3. Refinar iterativamente los parámetros de segmentación si es necesario para asegurar un rendimiento consistente en todos los grupos experimentales.
    4. Una vez finalizado, aplica la tubería en modo lote a todas las imágenes del estudio.
  5. Realizar análisis de datos
    1. Importa los datos exportados en RStudio (versión 4.3.2) para análisis estadístico.
    2. Si no está instalado, instala los paquetes: readxl, dplyr, tidyr, purrr, ggplot2, ggpubr, patchwork, scales, randomForest, caret, umap, factoextra, RColorBrewer, mclust, outliers y tidyverse.
    3. Sube el script (Archivo Suplementario 2) para fusionar todos los conjuntos de datos, filtra los datos (véase más abajo), grafica los valores de volumen, área superficial y esfericidad, y analiza las mitocondrias segmentadas para obtener proporciones por subtipo de muestra.
    4. (Opcional) Filtrar las mitocondrias segmentadas según el volumen para excluir artefactos de segmentación y ruido.
      1. Para determinar los filtros adecuados, inspecciona visualmente las distribuciones de volumen.
        NOTA: Todas las muestras mostraron un pico pronunciado en volúmenes muy pequeños (por debajo de 0,0003μm 3), consistente con ruido de segmentación más que con mitocondrias reales.
      2. Para identificar el límite inferior, evalúa la retención de partículas a través de umbrales candidatos (0,0009, 0,003, 0,005, 0,007 y 0,01μm 3). La caída más pronunciada en el recuento de partículas se produjo por debajo de 0,003μm 3, lo que indica que la mayoría de las partículas de ruido se encuentran en ese rango. La inspección visual confirmó que 0,003μm 3 correspondía al borde derecho del pico de ruido.
      3. Para el límite superior, las distribuciones se estrecharon naturalmente muy por debajo de 10μm 3; fija este límite para excluir grandes objetos artefactuales como redes mitocondriales sobresegmentadas. El filtrado final retuvo partículas con volúmenes entre 0,003 y 10μm 3.
        NOTA: Este script calcula los valores medianos por muestra en todas las mitocondrias detectadas y utiliza estos como unidad de análisis. Este enfoque explica la falta de independencia de mitocondrias individuales dentro de la misma muestra biológica.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito anteriormente se ha realizado (Figura 1) en ratones machos UM-HET3 de 20 meses. A los ratones se les administró un vehículo (Control) o un cóctel de reprogramación química (Treated) utilizando minibombas osmóticasmodelo 2004 53. Después, los hígados se seccionaron e imaginaron en un microscopio confocal Airyscan2 antes de procesar los z-stacks utilizando la tubería de análisis.

Las imágenes de fluorescencia 3D fueron procesadas y analizadas usando el software ZEISS arivis Pro 4.1.2. Antes de la segmentación de mitocondrias, se aplicaba el algoritmo de mejora de partículas para eliminar el ruido de las imágenes y eliminar el fondo, la luz desenfocada, la autofluorescencia y/o la fluorescencia originada en la unión no específica. El realce de partículas amplifica selectivamente la señal a partir de un diámetro dado. Tras la reducción de ruido, las mitocondrias individuales se segmentaron en 3D usando el algoritmo Blob Finder, que detecta objetos basándose en máximos locales de intensidad dentro de un rango de tamaño definido. Finalmente, la segmentación de objetos reduce cada segmento 2D a una imagen binaria.

Para ilustrar el flujo de trabajo de segmentación, la Figura 2 presenta cortes ópticos representativos en cada etapa de la cadena de procesamiento para muestras de Control y Tratadas. La imagen de fluorescencia en bruto muestra la señal Tom20 sin procesar, que contiene una mezcla de fluorescencia mitocondrial específica y fondo no deseado, luz desenfocada y autofluorescencia. Tras aplicar la reducción de ruido por mejora de partículas, la señal de fondo se redujo sustancialmente y la fluorescencia restante se confina a estructuras discretas y bien definidas (Figura 2). Esto da lugar a una representación más limpia de los límites mitocondriales que facilita una segmentación precisa.

La salida de la segmentación del Blob Finder se muestra en verde. Para confirmar que los z-stacks están segmentados con precisión, se superpusieron los cortes 2D con ruido reducido a las imágenes binarias segmentadas asociadas (Figura 2). Si el proceso de segmentación está suficientemente optimizado, debe observarse una colocalización fuerte y consistente de la fluorescencia mitocondrial con los objetos binarios. Si el proceso de segmentación es una sobresegmentación (es decir, la división de mitocondrias individuales en múltiples objetos) o la subsegmentación (es decir, la combinación de múltiples mitocondrias en una sola), ajusta los parámetros de segmentación. La inspección visual de los insertos confirma una segmentación de alta calidad: los objetos detectados co-localizan precisamente con la señal de fluorescencia Tom20 desnodificada, sin evidencia de sobresegmentación, sobredimensionamiento de objetos, fusión inapropiada de mitocondrias espacialmente adyacentes en objetos individuales, ni generación de objetos espurios en regiones sin señal Tom20. Este nivel de fidelidad de segmentación se logró de forma constante tanto en muestras de Control como Tratadas, demostrando que los parámetros de la tubería optimizados en el software ZEISS arivis son robustos y generalizables entre los grupos experimentales. En conjunto, estos resultados validan el enfoque de segmentación y respaldan la fiabilidad de las mediciones morfológicas derivadas de él.

Los objetos segmentados pueden medirse por parámetros mitocondriales como volumen, esfericidad y superficie (Figura 3). Para tener en cuenta el gran número de mitocondrias detectadas por muestra biológica y la falta de independencia de orgánulos individuales dentro de una célula, se calcularon valores medianos por muestra y se utilizaron como unidad de comparación estadística. Las diferencias entre grupos se evaluaron utilizando la prueba de Wilcoxon. Las muestras tratadas mostraron un volumen y área superficial mitocondrial significativamente mayores en comparación con los controles, lo que indica que la reprogramación química induce una remodelación sustancial de la morfología mitocondrial.

Por último, las mitocondrias segmentadas pueden clasificarse en diferentessubtipos 54,55 (Figura 4). Se utilizó el método del codo56 para determinar el número óptimo de agrupaciones para la agrupación k-media 57,58 (Figura 4A). Luego, usando k = 4 grupos, se graficaron submuestras aleatorias de mitocondrias para grupos Control y Tratado mediante reducción de dimensionalidad por aproximación y proyección uniforme de variedad (UMAP) (Figura 4B), coloreadas tanto por subtipo mitocondrial (izquierda) como por grupo de tratamiento (derecha). Finalmente, se representaron las proporciones de cada subtipo mitocondrial (Figura 4C) para los grupos Control y Tratado. En el grupo de tratamiento, hubo menos mitocondrias fragmentadas pero ningún cambio significativo en la proporción de mitocondrias en red o alargadas.

figure-results-1
Figura 1: Resumen del protocolo. Los ratones son tratados con fármacos o con un vehículo durante hasta 6 semanas mediante implantación de minibomba osmótica subcutánea (1). Tras el tratamiento, los tejidos del ratón se fijan, se infiltran con sacarosa, se incrustan en compuesto OCT y se hacen criosecciones (2). Las secciones de tejido se tiñen con anticuerpos contra Tom20 y anticuerpos secundarios marcados con Alexa Fluor 568 (3). Se recogen los pilas z de superresolución en un microscopio confocal de barrido puntual Airyscan2 (4), y las pilas z procesadas con desruido se segmentan en arivis para cuantificar la morfología mitocondrial (5). Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Tubería automatizada para la segmentación mitocondrial y el análisis morfológico de la zona.
Cortes ópticos simples representativos de muestras de Control (paneles superiores) y Tratados (paneles inferiores). La señal de inmunofluorescencia Tom20 se muestra en gris (izquierda). La misma imagen tras la reducción de ruido se muestra en gris, seguida de la salida de segmentación que resalta objetos mitocondriales detectados en verde. La imagen fusionada muestra la superposición entre la señal con ruido reducido y los objetos segmentados. Los insertos muestran vistas de mayor aumento de las regiones indicadas, ilustrando los efectos de la reducción de ruido y la precisión de la segmentación. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-3
Figura 3: Morfología mitocondrial en los grupos Control y Tratado. Los diagramas de caja muestran el rango mediano ± intercuartiles de valores medianos por muestra (n = 10 por grupo). Cada punto representa una muestra biológica, resumida como la mediana de todas las mitocondrias detectadas dentro de esa muestra. El volumen y la superficie se muestran en una escala delog 10 . Los grupos se compararon mediante pruebas de suma de rangos de Wilcoxon. Niveles de significación: ns p ≥ 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

figure-results-4
Figura 4: Clasificación morfométrica no supervisada de subtipos mitocondriales. (A) Gráfico de codo que muestra la suma total de cuadrados dentro del cúmulo (WSS) en función del número de cúmulos (k), calculado sobre una submuestra aleatoria de 10.000 mitocondrias. El punto de inflexión en k = 4 se seleccionó como el número óptimo de clústeres para el análisis posterior. (B) (Izquierda) Reducción de dimensionalidad UMAP de características morfométricas mitocondriales (n = 20.000 mitocondrias muestreadas aleatoriamente), coloreadas por subtipo asignado. Se identificaron cuatro subtipos morfológicamente distintos: fragmentados (pequeños, alta esfericidad), alargados (largos y de baja esfericidad), en red (grandes, irregulares) e intermedios. (Derecha) Proyección UMAP coloreada por grupo experimental (Control vs. Tratado) mostrando la distribución de cada grupo a lo largo del espacio morfológico. (C) Proporciones por muestra de cada subtipo mitocondrial en cada grupo experimental. Cada punto de datos representa una muestra biológica (n = 10 por grupo). Los diagramas de caja muestran el rango y la mediana intercuartiles, con bigotes que se extienden hasta 1,5 veces el rango intercuartil. Se compararon las proporciones de subtipos entre grupos utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, y se corrigieron los valores p para comparaciones múltiples mediante el método de Benjamini-Hochberg. ns p ≥ 0,05, ****p < 0,0001. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Archivo suplementario 1: Ejemplo de tubería arivis. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2: Script R para cuantificar la morfología mitocondrial y las poblaciones de subtipos.Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los dos pasos más críticos para realizar con éxito este protocolo son (i) el cierre de la incisión durante la implantación de la bomba osmótica y (ii) la segmentación precisa. Para lo primero, ten especial cuidado de crear un bolsillo subcutáneo lo suficientemente grande para la bomba, pero no demasiado grande para que la bomba se deslice por el costado del animal. Cuando la incisión está cerrada, la bomba debe colocarse lo suficientemente lejos para no inducir tensión en la piel circundante, lo que podría provocar dehiscencia. Asegúrate de tirar de la piel que rodea la incisión cerrada en todas las direcciones para comprobar que la herida está suficientemente cerrada antes de iniciar la recuperación del animal. Los clips para heridas son ventajosos porque se aplican y quitan rápidamente. Sin embargo, si surgen problemas por no poder cerrar correctamente las incisiones, pueden usarse suturas interrumpidas. Para este último, una segmentación precisa requiere que compares constantemente los resultados de la segmentación con las imágenes desnodadas hasta que haya suficiente similitud de imagen. Las pilas Z de animales de control y tratados deben recogerse utilizando los mismos parámetros de la recogida y, preferiblemente, durante la misma sesión de imagen. Del mismo modo, todos los pasos de procesamiento deben aplicarse a todas las imágenes usando exactamente los mismos parámetros. El parámetro de segmentación de diámetro define el tamaño esperado de los objetos a detectar. Un buen punto de partida es la anchura mitocondrial media medida de unos pocos objetos inspeccionados manualmente usando una sola franja óptica. El umbral de probabilidad controla la confianza mínima de detección requerida para que un objeto sea aceptado. Valores más bajos aumentan la sensibilidad y detectan más objetos, pero algunos de estos objetos pueden ser falsos. Por el contrario, valores más altos mejoran la especificidad pero pueden hacer que se pierdan objetos con menor señal. Un rango inicial recomendado es del 25%–30%. Por último, la sensibilidad dividida determina cuán agresivamente se separan los objetos que se tocan o se superponen en objetos individuales. Una baja sensibilidad dividida dejará las mitocondrias agrupadas como objetos fusionados individuales. Por otro lado, una alta sensibilidad a la división puede provocar una sobre-división de mitocondrias alargadas o ramificadas en fragmentos. Valores entre el 15% y el 30% son razonables para estudios morfológicos mitocondriales típicos. Si la segmentación precisa sigue resultando complicada, se puede realizar la segmentación utilizando el Analizador deMitocondrias 59 en FIJI60. Recientemente también se ha descrito recientemente una tubería semi-automatizada para la cuantificación de morfologías mitocondriales tanto en células como en tejidos utilizando el software Huygens Professional y un script personalizadoen Python 61.

Una limitación es el límite de resolución del microscopio confocal Airyscan2, que es de ~150 nm en XY y ~350 nm en el plano Z. Esto evita imágenes de alta resolución de cristas mitocondriales, ya que se encuentra que las distancias entre cristas individuales son de ~40–120nm 62,63,64. En cambio, la depleción de emisión estimulada (STED) puede alcanzar límites de resolución de ~20–50 nm lateralmente y puede distinguir claramente las cristas mitocondrialesindividuales 62,63,64. Recientemente se han desarrollado varios tintes STED que permiten una tinción e imagen efectiva de la membrana interna mitocondrial tanto en células vivas comofijas 63,64,65. Dado que el análisis de las morfologías de las cristas puede aportar información sobre la salud bioenergética mitocondrial10, se desea dichos datos. Sin embargo, la morfología mitocondrial difiere mucho entre los tejidos de mamíferos y el cultivo celular (se discute en profundidad más adelante), y actualmente no existe una metodología para teñir la membrana interna de los tejidos para imágenes STED y análisis de estructuras de las cristas.

Cuantificar la morfología mitocondrial en tejido intacto presenta desafíos únicos en comparación con los sistemas de cultivo celular. En las células cultivadas, las mitocondrias suelen estar distribuidas por todo el citoplasma en redes bien separadas con una superposición mínima entre células. Sin embargo, en secciones tisulares o preparaciones de montaje completo, las células están densamente empaquetadas y sus límites no están bien definidos. Si se requiere un análisis a nivel celular, debe incorporarse una etiqueta fluorescente adicional dirigida a la membrana plasmática o un marcador específico de cada tipo celular, junto con un paso de segmentación correspondiente en la cadena de análisis de imágenes para definir los límites celulares individuales antes de cuantificar la morfología mitocondrial. Una segunda diferencia importante es que en las células cultivadas, las mitocondrias suelen formar redes reticulares continuas e interconectadas que son fáciles de visualizar e interpretar. En los tejidos, este patrón rara vez se observa. Por ejemplo, las mitocondrias de secciones hepáticas muestran un patrón de puntiados, bastones y fibrados que ocupa todo elcitosol 66. Sin embargo, los hepatocitos en cultivo muestran morfologías tubulares con formaciones claras de redes66. De manera similar, al comparar mitocondrias de tejido liso con las de células musculares lisas en cultivo, se observan diferencias claras en sus morfologías y patrones de red67. La arquitectura tridimensional, combinada con diferencias específicas de tipo celular en la distribución mitocondrial, hace que las mitocondrias en estos tejidos aparezcan como puntos discretos y densamente empaquetados o fragmentos cortos, en lugar de redes alargadas. Por lo tanto, se justifica una interpretación cautelosa de los datos al comparar características morfológicas entre tejidos y cultivo celular, ya que las diferencias entre ambos pueden atribuirse en parte al contexto de imagen más que a una verdadera variación biológica.

Un punto destacado de este protocolo es la capacidad de medir cuantitativamente estructuras mitocondriales en tejidos mediante microscopía óptica. Aunque existen otros métodos para cuantificar la morfología mitocondrial a partir de imágenes de microscopía óptica de superresolución, muchos de ellos son adecuados solo para células en cultivo. Además, a diferencia de otros métodos de análisis, la tubería presentada aquí es totalmente automatizada, cuantifica tanto las dimensiones mitocondriales como las proporciones de subtipos, y requiere poca experiencia en codificación para funcionar con éxito. La microscopía electrónica de barrido/transmisión (SEM/TEM) y la crio-ET se han utilizado anteriormente para obtener imágenes de estructuras mitocondriales en tejidos en 2D y 3D 10,68,69. Sin embargo, en el caso de los primeros, existen preocupaciones sobre la preservación de estructuras nativas tras la fijación de muestras, deshidratación e incrustaciónde 70,71. Además, la medición manual de parámetros mitocondriales en FIJI60 es a veces el método de análisis preferido para imágenesTEM 72, lo que requiere un trabajo significativo y puede conducir a un sesgo muestral. Sin embargo, recientemente se han descrito métodos de aprendizaje profundo para la cuantificación automatizada de morfologías mitocondriales a partir de imágenesTEM 73,74. Una ventaja del enfoque presentado es que, una vez establecida la canalización de análisis, puede procesar imágenes en lotes con poca o ninguna intervención del usuario. En el segundo caso, la congelación a alta presión puede preservar estructuras tisulares en condiciones cercanas alas nativas 75. Sin embargo, la congelación de muestras crio-ET, la sección, el fresado, la recogida y el procesamiento de datos requieren formación extensa y equipos altamente avanzados. En cambio, la microscopía confocal de superresolución es relativamente más accesible y requiere menos formación y recursos para realizarse con éxito.

Las implantaciones de bombas osmóticas pueden realizarse de forma segura en ratones envejecidos para evaluar los efectos de diferentes compuestos farmacológicos sobre el deterioro de la función fisiológica relacionado con el envejecimiento. Además, los métodos descritos aquí son generalizables a muchos órganos diferentes. Se caracteriza bien que los descensios en la función metabólica relacionados con el envejecimiento contribuyen a la enfermedad y surgen de la disfunción mitocondrial, una de las características coloquiales del envejecimientode los 76 años. Además, se entiende que las estructuras mitocondriales informan la capacidad bioenergética y el estado metabólicomitocondrial 77,78. Por tanto, evaluar cuantitativamente los compuestos por sus efectos sobre la estructura mitocondrial durante el envejecimiento del ratón, utilizando los métodos descritos aquí, puede ayudar a identificar terapias que puedan prolongar la salud humana.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen intereses en competencia que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores desean reconocer a los Recursos de Microscopía en el núcleo North Quad (MicRoN) de la Escuela de Medicina de Harvard por proporcionar acceso y formación a los microscopios confocales y recursos computacionales utilizados en este estudio. Esta investigación fue financiada por subvenciones de la NIA otorgadas a VNG.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Airyscan2 point scanning confocal microscopeZEISSLSM 980 with Airyscan2ZEISS point scanning LSM 980 confocal built around a ZEISS Axio Observer Z1 and equipped with two multi-alkali PMTs and a GaASP 32 channel spectral detector, an environmental enclosure, and a Plan Apo 63×/1.4 Oil DIC III objective. The microscope used in this study is also equipped with two external NIR detectors, as well as the following laser lines: 405, 458, 488, 514, 561, 594, 639, and 730 nm. 
Aluminum foilEssendantBWK7112
Analytical balanceMettler ToledoMR204
Anti-roll glass plateGel CompanyLGI70
Arivis Pro SoftwareZEISSVersión 4.1.2
Bath sonicatorBranson Ultrasonics71020-MT
Bovine serum albuminResearch Products InternationalA30075
Centrifuge tubes, 15 mLCELLTREAT229411
Charged microscope slidesGlobe Scientific1358W
Clip removerAlzet0009976
CO2AirgasCD 50
Contrad 70Decon Labs1003
Cotton-tipped applicatorsPuritan Medical25-8061WC
CryostatLeica BiosystemsCM3050 S
Cryostat bladesSakura Finetek USA Inc4689
DAPISigma-AldrichD9542Prepare to 5 mg/mL en ddH2O, aliquot, and store at -20 °C protected from light
Dimethyl sulfoxideSigma-AldrichD2650
EasyDip slide staining systemElectron Microscopy Services71388-01
Electro-GelBio-ServEGS-1
Embedding molds, 22 mm ´ 22 mm ´ 20 mmPolysciences18646A-1
Ethanol, 200 proofDecon LabsV1001
Fenestrated sterile drape sheetsDukal20001
Fine forcepsFine Science Tools11445-12
Glass bead sterilizerVWR75999-324
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568InvitrogenA-11036
Heating padCVS215313
Hemostatic forcepsWorld Precision Instruments501705
Immersion oil Immersol 518 FZEISS433802-9010-000
Induction chamberWorld Precision InstrumentsEZ178
Insulin syringes, 0.3 mLBD328431
Iris surgical scissorsSklar Surgical Instruments47-1135
IsofluranePatterson Veterinary07-890-8115
KimwipesKimberly-Clark34120
Luer-Lok 1 mL syringesBD309628
Luer-Lok 3 mL syringesBD309657
Luer-Lok 50 mL syringesBD309653
Meloxivet (meloxicam)Patterson Veterinary07-894-8524
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLCELLTREAT229443
Microscope slide boxHeathrow Scientific15994E
Microscope slide cover glass, #1.5, 22 mm ´ 50 mmElectron Microscopy Services72204-04
Non-CO2 incubatorBenchmark ScientificH2200-H
Non-fenestrated sterile drape sheetsDukal20-002
OCT CompoundSakura Finetek USA Inc4583
Opthalmic ointmentPatterson Veterinary07-888-2572
Osmotic minipumpsAlzet2004
ParafilmBemisPM999
Paraformaldehyde, 4% w/vSanta-Cruz Biotechnologysc-281692
PBS, 1´Thermo Scientific10010023
PEG300Sigma-Aldrich90878
PES syringe filters, 0.22 µm CELLTREAT229747
Povidone iodine 10% USP swabsticksMedlineMDS093901ZZ
ProLong Glass AntifadeInvitrogenP36980
Rabbit anti-Tom20 antibodyNovus BiologicalsNBP2-67501
Razor blades, 0.22 mmVWR55411-050
Rotator/rotisserieLabnetH5500
RStudioThe R Project for Statistical Computingversión 4.3.2
ScaleFisher ScientificS72422
SomnoSuite low-flow anesthesia systemKent ScientificSS-01
Steam sterilization indicator stripsCrosstexSIS-250
Sterile glass vials, 5 mLThermo ScientificST5
Sterile needles, 0.5", 23 GBD305145
Sterile needles, 0.5", 27 GBD305109
Sterilization pouchesCardinal Health92510
SucroseSigma-AldrichS9378Prepare a solution of 30% w/v in 1´ PBS
Surgical clippers3M9680
Surgical glovesCardinal Health2D73DP75
Tissue forcepsSklar Surgical Instruments47-1447
Toploading balanceCole-ParmerEW-55000-14
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Vetbond tissue adhesive3M1469SB

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