Aquí presentamos un protocolo de disección que conserva la glándula pineal, la cual a menudo se pierde cuando el cerebro se extrae de la cavidad craneal. Este protocolo asegura la retención de la glándula pineal en preparaciones de cerebro de ratón embrionario y posnatal temprano para aplicaciones posteriores, incluyendo inmunohistoquímica, hibridación in situ y transcriptómica espacial.
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Artículo de método
Preservación de la glándula pineal en preparaciones de cerebro de ratón perinatal
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Resumen
Resumen
La glándula pineal, una estructura neuroendocrina que secreta melatonina, se forma a partir de una anlage en la línea media dorsal del prosencéfalo embrionario. En el día embrionario (E) 14,5 en el ratón, se observa un divertículo pineal que sobresale desde el techo del diencéfalo entre las vesículas telencefálicas emparejadas. Este divertículo está en estrecho contacto con el cartílago, el tejido meníngeo y vascular adyacentes. Es fácil perderlo cuando se abre la bóveda craneal para extraer el cerebro en etapas embrionarias tardías o postnatales tempranas. A pesar de su importante función neuroendocrina, el desarrollo temprano de la glándula pineal y los mecanismos de señalización que regulan este proceso permanecen poco comprendidos, en parte debido a la dificultad de preservar intacta esta estructura durante las etapas embrionarias del desarrollo cerebral del ratón.
Este artículo presenta un procedimiento de disección innovador que conserva la glándula pineal manteniendo su integridad estructural y su conexión con el techo del diencéfalo durante el aislamiento del cerebro desde etapas embrionarias hasta el día posnatal (P) 7. El procedimiento se demuestra utilizando un cerebro de ratón E18.5 y, por lo tanto, es adecuado para aplicaciones posteriores que requieran la preservación de la arquitectura del tejido, incluyendo hibridación in situ, inmunohistoquímica y transcriptómica espacial. El protocolo también puede utilizarse para aislar la glándula pineal en desarrollo, mejorando así la representación específica de la pineal en análisis transcriptómicos y proteómicos, lo cual es difícil de lograr debido a su pequeño tamaño.
Introducción
La glándula pineal es una pequeña estructura neuroendocrina ubicada en la línea media dorsal del cerebro de los vertebrados y desempeña un papel central en la regulación de la fisiología circadiana mediante la secreción rítmica de melatonina1,2. Durante la embriogénesis de los mamíferos, la glándula pineal se origina a partir de la línea media dorsal del prosencéfalo en desarrollo. En los ratones, el desarrollo pineal comienza cuando una región especializada del neuroepitelio diencefálico dorsal forma la anlage pineal/recesión pineal, que posteriormente evagina para formar el divertículo pineal en el día embrionario (E) 14.53,4,5. Este divertículo está unido al techo del diencefalo y se observa entre las vesículas telencefálicas emparejadas. A medida que avanza el desarrollo, este divertículo se asocia estrechamente con estructuras adyacentes en la línea media dorsal del cerebro, en particular con el seno sagital superior (SSS) y el seno transverso (TS), canales venosos que recorren la superficie dorsal del prosencéfalo6. La glándula pineal en desarrollo se encuentra inmediatamente debajo de la intersección del SSS y el TS, y su delicada inserción en el diencefalo dorsal es particularmente vulnerable cuando se eliminan las estructuras vasculomeningeales superpuestas para extraer el cerebro de la cavidad craneal7. Esto hace que la glándula pineal sea especialmente susceptible al daño, ya que puede desgarrarse al abrir la cavidad craneal para la extracción del cerebro. Como resultado, la glándula pineal se pierde frecuentemente durante disecciones rutinarias, lo que limita el análisis de su estructura y composición molecular en preparaciones intactas.
Aquí, describimos un protocolo paso a paso para diseccionar el cerebro de ratón conservando la glándula pineal y su inserción en el techo del diencéfalo. El método es aplicable desde las etapas embrionarias E16.5 hasta las primeras etapas posnatales (P7), y es adecuado para estudios del desarrollo de la glándula pineal mediante hibridación in situ, inmunohistoquímica y transcriptómica espacial. Como demostración de aplicaciones posteriores, se presentan la hibridación in situ y la inmunohistoquímica para el marcador enriquecido en la pineal CRX.
La innovación clave de este método consiste en que se minimiza el estrés sobre las estructuras de la línea media al eliminar cuidadosamente las uniones físicas que, de otro modo, desgarrarían la glándula pineal cuando se extrae el cerebro de la cavidad craneal. Esto representa una mejora respecto al procedimiento estándar.
Este método de disección está limitado a estadios hasta P7 porque la osificación progresiva de la bóveda craneal durante el desarrollo posnatal temprano aumenta la rigidez del cráneo y fortalece su asociación con estructuras meníngeas y vasculares. Aunque varios estudios han descrito procedimientos de disección de la glándula pineal en roedores adultos8, muy pocos se han centrado en preservar la glándula pineal durante las etapas embrionarias y posnatales tempranas, cuando la glándula es particularmente frágil y susceptible de daño durante el aislamiento cerebral.
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Protocolo
Todos los procedimientos cuentan con aprobación y se llevan a cabo de acuerdo con el Comité Institucional de Ética en Experimentación Animal del Instituto Tata de Investigación Fundamental.
1. Preparación de materiales
- Asegúrese de que todos los instrumentos necesarios para la microdisección (consulte la Tabla de Materiales) estén preparados antes del procedimiento. Esterilice todos los instrumentos utilizando etanol al 70 %. Para recoger preparaciones destinadas a aplicaciones posteriores como transcriptómica espacial/hibridación in situ, limpie los instrumentos con solución de descontaminación de RNasas.
- Limpie el platillo del microscopio de disección con solución de descontaminación de RNasas y mantenga cerca del banco de disección un frasco con PBS 1× frío con hielo.
- Tenga listos los siguientes instrumentos y material de plástico antes de este procedimiento:
- Para la preparación del animal, tenga listos: 2 pares de pinzas romas, 1 par de tijeras quirúrgicas, 2 placas de Petri (10 cm) y varias placas de Petri (6 cm; según sea necesario, una por cada cabeza).
- Para aislar el cerebro, tenga listos: 1 par de pinzas #5, 1 par de pinzas #55, 1 par de tijeras de microdisección y tubos/placas de recolección adecuados según la aplicación posterior.
- NOTA: Si la aplicación posterior implica hibridación in situ o transcriptómica espacial, limpie los instrumentos de disección con solución de descontaminación de RNasas antes de usarlos.
2. Preparación de los animales
- Siga los pasos (2.1.1–2.1.6) para animales E14.5–P0
- Sacrificar a la hembra preñada de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Ética en Experimentación Animal. En el ejemplo mostrado, la hembra fue sacrificada mediante dislocación cervical.
- Haga una incisión media en la cavidad abdominal de la hembra preñada para exponer el útero. Utilizando pinzas romas, extraiga suavemente los cuernos uterinos y colóquelos en una placa estéril de 10 cm que contenga hielo frío 1× PBS
- Aislar cuidadosamente cada feto separándolo del saco amniótico circundante y de la placenta.
- Transfiera los fetos a una nueva placa de Petri de 10 cm que contenga hielo frío 1× PBS y mantener en hielo hasta que cada uno se tome para el aislamiento del cerebro. Transferir un solo feto a una placa de Petri de 6 cm que contenga PBS frío con hielo.
- Para las etapas posnatales hasta P7, sacrificar la cría de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Ética en Experimentación Animal. A continuación, continuar desde el paso 2.1.6 en adelante.
- Utilizando un par de tijeras quirúrgicas, separe la cabeza del cuerpo de manera que el cerebro posterior quede incluido en la cabeza para proteger el cerebro anterior de daños inadvertidos.
- Lave la cabeza con PBS frío para eliminar la sangre. Transfiera a una nueva placa de Petri de 6 cm que contenga PBS frío con hielo× PBS. Mantenga la cabeza sumergida en el PBS para permitir que la sangre y los restos celulares sean eliminados durante los pasos subsiguientes de la disección.
3. Procedimiento de disección para aislar el cerebro con la glándula pineal intacta
NOTA: Todos los pasos siguientes deben realizarse utilizando un microscopio de disección. Ajuste el aumento a al menos 2× (o según sea necesario) para visualizar claramente el cerebro y las estructuras circundantes durante todo el proceso de disección. Todo el procedimiento de disección debe llevarse a cabo en PBS frío con hielo para minimizar la degradación del ARN y de las proteínas. Para los pasos 3.1–3.10, utilice la mano no dominante para sostener firmemente la cabeza y estabilizarla durante todo el procedimiento según las instrucciones del paso 3.1. Los pasos 3.2–3.9 deben realizarse manteniendo la cabeza estabilizada con la mano no dominante, y utilizando la mano dominante para las habilidades motoras finas, comenzando con una pinza #5 y luego cambiando a pinza #55 o tijeras de microdisección según se especifique en cada paso.
- Utilice una pinza #5 en la mano no dominante. Inserte las dos puntas en las cuencas oculares con un movimiento firme hacia abajo. Mantenga la presión hacia abajo para fijar el cerebro al fondo de la placa de Petri hasta que se complete el paso 3.9.
NOTA: El cerebro se encuentra por encima de las cuencas oculares y no se ve afectado por la inserción de la pinza en ellas. Mantener una presión constante hacia abajo estabiliza el cerebro durante toda la disección. - Con la mano dominante, pellizque y retire la piel que cubre la cabeza utilizando una pinza #5.
NOTA: En esta etapa, se observa el condrocráneo liso que cubre el cerebro. - Retire la porción del condrocráneo que sobrepasa el mesencéfalo-rombencéfalo de la siguiente manera:
- Utilice la pinza #5 para hacer dos incisiones penetrantes en el condrocráneo a ambos lados del mesencéfalo, justo donde este se une al telencéfalo.
- Deslice una punta de la pinza #5 tangencialmente debajo del condrocráneo a lo largo de la línea tangencial imaginaria que separa el telencéfalo del mesencéfalo. Agarre firmemente y desgarre el condrocráneo.
- Continúe retirando el condrocráneo hasta que queden expuestos el mesencéfalo y el rombencéfalo.
- Cambie a la pinza #55. Inserte una punta justo debajo del borde caudal del condrocráneo que cubre el telencéfalo. Separe suavemente el condrocráneo desprendiendo cualquier conexión con los tejidos vasculares y meníngeos.
- Utilizando una tijera de microdisección, corte a lo largo de la línea media dorsal del telencéfalo hacia el bulbo olfatorio. Con una pinza #55 cerrada, retire suavemente cualquier adhesión del condrocráneo al cerebro. Separe las dos mitades del condrocráneo que cubren los hemisferios telencefálicos utilizando la pinza #5.
NOTA: En esta etapa, la SSS se observa como una vena de color rojo oscuro a lo largo del margen superior del condrocráneo en el cerebro, y la TS se observa ortogonal a la SSS. - La glándula pineal se encuentra justo debajo de la SSS. Realice un corte en el extremo rostral de la SSS utilizando una tijera de microdisección.
- Utilizando una pinza #55, retire completamente la porción dorsal del condrocráneo de cada lado para exponer mejor la pineal, la SSS y la TS.
- Realice dos cortes en la TS a ambos lados de la glándula pineal, utilizando una tijera de microdisección. Con una pinza #55, separe las adhesiones laterales de la TS.
- Utilizando una pinza #5 cerrada, desaloje suavemente la porción rostral del cerebro desde la bóveda craneal ventral. Deslice la pinza cerrada por debajo de la cara ventral del cerebro, desprendiéndolo completamente.
- Guarde el cerebro con la glándula pineal intacta según sea apropiado para aplicaciones posteriores.
4. Pasos críticos en el protocolo
NOTA: El éxito de este protocolo de disección depende del manejo cuidadoso de las inserciones vasculares que rodean la glándula pineal. Los siguientes puntos son fundamentales para mantener la glándula pineal intacta durante todo el procedimiento de disección:
- Estabilice la cabeza insertando las puntas de una pinza #5 en ambas órbitas oculares y mantenga una presión firme hacia abajo durante todos los pasos 3.1–3.9. Esto proporciona un soporte estable evitando la presión directa sobre el cerebro.
- Durante la remoción del condrocráneo (paso 3.3), evite tirones o desprendimientos excesivos, ya que podrían provocar la separación de la glándula pineal del diencéfalo dorsal.
- Durante la eliminación de las adherencias meníngeas y vasculares (paso 3.4) y al abrir el condrocráneo telencefálico dorsal (paso 3.5), utilice únicamente las puntas de la pinza #55. La penetración profunda de la pinza podría dañar la glándula pineal, que se encuentra inmediatamente debajo del techo telencefálico caudal.
- Complete la sección del seno sagital superior (paso 3.6) y la sección bilateral del seno transverso (paso 3.8) antes de extraer el cerebro. Estos cortes alivian la tensión en la red venosa dorsal y previenen el desgarro de la glándula pineal durante la extracción del cerebro.
- En el paso 3.9, desaloje suavemente el cerebro usando la pinza cerrada sin perturbar la línea media dorsal. El cerebro debe separarse libremente de la cavidad craneana una vez que todas las adherencias meníngeas y vasculares hayan sido liberadas.
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Resultados
Este protocolo de disección permite el aislamiento consistente de cerebros de ratón embrionarios y posnatales tempranos desde E16.5 hasta P7, conservando la glándula pineal en su posición anatómica nativa (Figura 1).
La eliminación progresiva del condrocráneo, combinada con una cuidadosa limpieza de las adherencias meníngeas y vasculares, evita tensiones cortantes accidentales en la glándula pineal. Además, la sección controlada del seno sagital superior (SSS) en ...
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Discusión
Se han desarrollado métodos estandarizados de disección de la glándula pineal para el cerebro fetal/lactante humano, lo que ayuda a los patólogos forenses a comprender la causa del síndrome de muerte súbita del lactante11. Protocolos previos demostraron la extracción de la glándula pineal junto con la vasculatura superficial, las meninges y el plexo coroideo12; sin embargo, no se han descrito métodos para retener de forma confiable una glándula pineal intacta unida al techo...
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Divulgaciones
Todos los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Shital Suryavanshi y al personal del animalario del Instituto Tata de Investigación Fundamental por su excelente apoyo. Agradecemos al Dr. Sundar Naganathan por permitir generosamente el uso del microscopio estéreo macro zoom Olympus MVX10 en su laboratorio para grabar el video del procedimiento. Este trabajo fue financiado por una subvención del Departamento de Energía Atómica (DAE), Gobierno de la India, número de identificación del proyecto RTI4003 y RTI4015 (ST); subvención ICMR-DHR SUG, GAP00303, subvención ANRF PMECRG GAP00313 (AP).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio de campo claro | Olympus | IX73 | Cualquier microscopio de campo claro con una cámara de color es adecuado. |
| Microscopio confocal | Olympus | FV3000 | Cualquier microscopio confocal o microscopio de epifluorescencia es adecuado, dependiendo de la resolución requerida |
| Anticuerpo CRX | Invitrogen | PA5-32182 | Protocolo de inmunotinción descrito en Parichha et al.9. |
| Sonda CRX | Hecho a medida | Hecho a medida | Protocolo de hibridación in situ Parichha et al.10. |
| Pinzas finas # 5 | F.S.T | 11251-23 | Pueden sustituirse por herramientas similares de cualquier empresa. |
| Pinzas finas # 55 | F.S.T | 11255-20 | Pueden sustituirse por herramientas similares de cualquier empresa. |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | Puede sustituirse por productos similares de cualquier empresa. |
| Placa de Petri | Corning | CLS351029 | Puede sustituirse por productos similares de cualquier empresa. |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9782 | La solución de descontaminación RNaseZap es una solución para descontaminar superficies que destruye las RNasas al contacto |
| Tijeras de resorte (tijeras para microdisección) | F.S.T | 15020-15 | Pueden sustituirse por herramientas similares de cualquier empresa. |
| Microscopio estereoscópico de zoom | Nikon | SMZ745 | Cualquier microscopio de disección es adecuado |
Referencias
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- Rath MF, Rohde K, Klein DC, Møller M. Homeobox genes in the rodent pineal gland: roles in development and phenotype maintenance. Neurochem Res. 2013;38(6):1100-12.
- Estivill-Torrús G, Vitalis T, Fernández-Llebrez P, Price DJ. The transcription factor Pax6 is required for development of the diencephalic dorsal midline secretory radial glia that form the subcommissural organ. Eur J Neurosci. 2001;14(6):1011-22.
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Reimpresiones y permisos
