Este estudio describe un modelo in vitro. para evaluar los efectos protectores del Sanqi Baiji San frente a la lesión de células epiteliales gástricas inducidas por etanol y su implicación en la señalización relacionada con PI3K/AKT.
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Artículo de investigación
Este estudio describe un modelo in vitro. para evaluar los efectos protectores del Sanqi Baiji San frente a la lesión de células epiteliales gástricas inducidas por etanol y su implicación en la señalización relacionada con PI3K/AKT.
Este trabajo tenía como objetivo aclarar el mecanismo protector de Sanqi Baiji San (SQBJ) frente a la lesión de células epiteliales gástricas inducidas por etanol y explorar su posible relevancia para la úlcera gástrica (GU). La farmacología de redes se utilizó para analizar los componentes activos de SQBJ (Plataforma de Datos y Análisis de Sistemas de Medicina Tradicional China [TCMSP], Biodisponibilidad Oral [OB] ≥ 20%, Semejanza de Fármacos [DL] ≥ 0,1), mapear sus objetivos (Universal Protein Resource [UniProt]), recopilar objetivos relacionados con GU (GeneCards/OMIM/DrugBank) y analizar objetivos superpuestos mediante enriquecimiento y acoplamiento molecular mediante Gene Ontology (GO)/Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Las células de la línea celular epitelial gástrica (GES-1) lesionadas con etanol se trataron con SQBJ o el inhibidor de PI3K LY294002. Se utilizó CCK-8 para determinar la concentración óptima de SQBJ. Los análisis de farmacología en redes identificaron 126 objetivos comunes enriquecidos dentro de cascadas relacionadas con PI3K/AKT/MACK y sugirieron posibles interacciones entre los constituyentes principales de SQBJ y proteínas relacionadas con PI3K/AKT. En células con problemas de etanol, el SQBJ alivió el daño celular al reducir la liberación de mediadores inflamatorios y el estrés oxidativo, como se evidencia en la disminución de especies reactivas intracelulares de oxígeno y los niveles de malondialdehído. SQBJ restauró el potencial de la membrana mitocondrial y el contenido de ATP, y redujo los cambios asociados a la apoptosis en los niveles de linfoma-2 de células B, caspasa-3 escindida y proteína X asociada a Bcl-2. SQBJ también modulaba marcadores de señalización asociados a PI3K/AKT y MAPK. Estos efectos protectores se vieron en gran medida debilitados por LY294002, lo que sugiere que la señalización relacionada con PI3K/AKT está implicada en la citoprotección mediada por SQBJ. Estos hallazgos proporcionan una base mecanicista in vitro para la posible aplicación de la SQBJ en la GU, aunque se requiere una validación adicional en modelos animales de úlcera gástrica inducida por etanol.
La úlcera gástrica (GU) es un trastorno gastrointestinal muy prevalente en todo el mundo, caracterizado por inflamación localizada, erosión y ulceración de la mucosa gástrica. Según estimaciones obtenidas por el análisis Global Burden of Disease (GBD 2021) de 2021, la enfermedad de úlceras pépticas (PUD) sigue imponiendo una carga clínica y económica considerable a millones de pacientes en todo el mundo. Aunque la prevalencia general de la PUD ha disminuido con la amplia y generalizada dependencia clínica de regímenes antiinfecciosos e inhibidores de la bomba de protones supresora de ácido (IBP), esta tendencia descendente se ha estabilizado, con un rebote incluso observado en algunasregiones 1. Cabe destacar que el consumo de alcohol (etanol) es un factor patogénico crítico independiente de la infección por Helicobacter pylori (H. pylori) y del uso de antiinflamatorios no esteroideos (AINE). El consumo excesivo de alcohol a largo plazo daña la barrera mucosa gástrica, acelera el desarrollo de úlceras e incluso aumenta la susceptibilidad a malignidades gástricas, convirtiendo así esta condición en una crisis sanitaria internacionalcrítica 2. En los países en desarrollo, la incidencia de lesiones mucosas gástricas relacionadas con el alcohol está aumentando debido a múltiples factores, incluyendo el aumento del consumo de alcohol y los cambios en el estilo de vida, lo que genera una necesidad urgente de estrategias de prevención y tratamiento eficaces y seguras.
El mecanismo patológico subyacente a la lesión mucosa gástrica inducida por etanol es multifactorial y multicapa. Al entrar en contacto directo con la mucosa gástrica, el etanol altera rápidamente la barrera mucosa-bicarbonato y desencadena un aumento incontrolado de especies reactivas intracelulares de ogénigeno (ROS). Este estallido oxidativo provoca posteriormente la peroxidación lipídica (caracterizada por un elevado malondialdehído, MDA), agota los antioxidantes endógenos en el revestimiento del estómago, incluyendo la superóxida dismutasa (SOD), junto con el glutatión (GSH), y finalmente induce disfunciónmitocondrial 3. La evidencia acumulada indica que la ROS intracelular inducida por etanol se deriva principalmente de mitocondrias y está estrechamente vinculada al colapso del potencial de membrana mitocondrial interna (Δψm) y a la inhibición de la síntesis de trifosfato de adenosina(ATP) 4. Mientras tanto, el estrés oxidativo activa aún más las cascadas proinflamatorias bajo el mando del factor nuclear kappa B (NF-κB). Esta activación promueve posteriormente la liberación masiva de mediadores inflamatorios, principalmente el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), la interleucina-6 (IL-6) y la proteína C-reactiva (CRP), formando así un círculo vicioso de "respuesta oxidativa al estrés-inflamatoria"5. Sobre esta base, se desencadena la cascada apoptótica intrínseca impulsada por las mitocondrias, como lo demuestra una proporción alterada de Bcl-2 respecto a Bax junto con la escisión enzimática proteolítica secuencial de la proteinasa específica de cisteinil aspartato 3 (Caspasa-3), lo que finalmente conduce a la muerte masiva de células epiteliales mucosas gástricas y la formaciónde úlceras 6. En consecuencia, la selección simultánea de los tres enlaces patológicos centrales del estrés oxidativo, la respuesta inflamatoria y la apoptosis representa una estrategia clave para la intervención eficaz de la lesión mucosa gástrica alcohólica.
La vía de señalización fosfoinositida 3-quinasa/proteína quinasa B (PI3K/AKT) constituye un eje regulador central que gobierna la longevidad celular, la proliferación y la muerte programada, desempeñando una función vital en la preservación de la homeostasis mucosa gástrica. Tras la activación, la señalización PI3K/AKT fosforila múltiples sustratos aguas abajo, inhibe la actividad del factor proapoptótico Bad, dificultando así la fuga mitocondrial del citocromo c, que es destructivo para células, manteniendo la homeostasis de ΔΨm y promoviendo la supervivencia celular7. Además, existe una compleja interacción antagónica entre la cascada PI3K/AKT y las redes de proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAPK): la activación al alza de PI3K/AKT puede atenuar la transducción inflamatoria de señales y las reacciones en cascada apoptótica inhibiendo la activación de quinasas de estrés, incluyendo p38, la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) y las quinasas proteicas reguladas extracelulares (ERK)8. Múltiples estudios han indicado que la reducción de la actividad de la vía PI3K/AKT está estrechamente asociada con una inflamación agravada y un aumento de la apoptosis en modelos de lesión mucosa gástrica, mientras que la restauración de la actividad de esta vía puede mejorar significativamente la lesión mucosa9. Sin embargo, actualmente no existe una verificación experimental causal sistemática respecto al mecanismo regulador preciso de PI3K/AKT en la lesión mucosa gástrica inducida por etanol, especialmente su relación sinérgica con la vía MAPK.
En cuanto a la farmacoterapia moderna, los IBP son la opción de primera línea para el manejo clínico de la GU, pero su administración a largo plazo ha generado crecientes preocupaciones de seguridad. Los estudios acumulados han relacionado el uso crónico de IBP con una variedad de resultados adversos, incluyendo enfermedad renal, eventos cardiovasculares, fracturas osteoporóticas, deficiencias nutricionales (hierro, magnesio y vitamina B12), infección por Clostridioides difficile. e incluso un riesgo elevado de cáncergástrico. Además, el fenómeno de la hipersecreción de ácido gástrico de rebote tras la suspensión de IBP ha sido confirmado por datos de farmacovigilancia a granescala 11. Estos riesgos de seguridad han impulsado tanto a las comunidades clínicas como de investigación básica a explorar activamente terapias alternativas con mecanismos de protección multi-objetivo, efectos secundarios mínimos y idoneidad para un uso a largo plazo. En particular, las preparaciones de compuestos naturales de la medicina tradicional china (MTC) han atraído una amplia atención debido a su concepto terapéutico holístico de acción de "multicomponente, multiobjetivo y múltiples vías"12.
El Polvo Sanqi Baiji (SQBJ) es una fórmula clásica de compuesto de MTC compuesta por Panax notoginseng y Bletilla striata en una relación de masas de 1:1. Panax notoginseng es bien conocido por sus efectos de favorecer la circulación sanguínea y detener el sangrado, así como aliviar la inflamación dolorosa. Sus principales componentes bioactivos, incluyendo el notoginsenosido R1 junto con los ginsenósidos (Rg1, Rb1), ejercen efectos antiinflamatorios, antioxidantes y reparadores de la mucosa significativos. Bletilla striata se caracteriza por sus efectos astringentes que detienen el sangrado, reducen la inflamación y promueven la regeneración de los tejidos dañados. Simultáneamente, el polisacárido de Bletilla striata (BSP), que actúa como su principal extracto activo, ha documentado su eficacia en la supresión de la cascada MAPK JNK/p38, disminuyendo así la expresión de interleucina-1β (IL-1β), TNF-α e IL-6, y mejorando la capacidad de defensa antioxidante de la mucosagástrica 13. La evidencia acumulada de la literatura ha confirmado que la coadministración de Panax notoginseng. saponinas (SNP) y BSP ejerce un efecto sinérgico en los modelos14 de úlceras gástricas alcohólicas, y las preparaciones relacionadas con SQBJ han mostrado efectos protectores mucosos significativos en estudios preclínicos de esofagitis por reflujo y úlcerapéptica 15. Sin embargo, actualmente no existe una verificación experimental in vitro sistemática del mecanismo de la vía de señalización subyacente al efecto protector de la mucosa gástrica de la SQBJ, especialmente el papel central de la vía PI3K/AKT y su relación reguladora con MAPK. Mientras tanto, la asociación causal entre los compuestos constituyentes clave y los receptores funcionales de la SQBJ aún no se ha esclarecido completamente.
Para abordar estas carencias, el presente estudio adoptó una estrategia de investigación integrada que combina farmacología en redes y verificación experimental in vitro , empleando la línea celular GES-1 desafiada con etanol como plataforma experimental para investigar el posible mecanismo molecular subyacente a los efectos protectores epiteliales gástricos de la SQBJ, con énfasis en el estrés oxidativo, respuestas inflamatorias, procesos apoptóticos y señalización relacionada con PI3K/AKT. y los cambios asociados a MAPK. Primero, utilizamos el LY294002 inhibidor de PI3K para evaluar preliminarmente la implicación de la señalización PI3K/AKT y descubrimos que inhibir esta vía atenuaba el efecto protector de SQBJ, sugiriendo que la señalización relacionada con PI3K/AKT contribuye a la citoprotección mediada por SQBJ. En segundo lugar, exploramos la asociación entre los cambios relacionados con PI3K/AKT y la regulación de las vías MAPK, proporcionando pruebas preliminares de que los cambios en la señalización MAPK podrían estar relacionados con la modulación SQBJ de la respuesta funcional del eje PI3K/AKT. En conjunto, este trabajo establece un marco molecular invitro para evaluar cómo el SQBJ mitiga la lesión epitelial gástrica inducida por etanol y proporciona evidencia preliminar para una exploración posterior de fórmulas de compuestos MTC en la lesión mucosa gástrica alcohólica. Sin embargo, aún se requieren experimentos con animales para confirmar si estos efectos protectores celulares pueden traducirse in vivo. Eficacia terapéutica dentro de modelos experimentales de ulceración gástrica causada por alcohol (Figura suplementaria S1).
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Este estudio no incluyó participantes humanos, muestras de tejido humano, muestras clínicas ni experimentos con animales. Se utilizaron recursos de bases de datos públicos y anonimizados para el análisis de farmacología de redes, y se emplearon células GES-1 comercialmente disponibles para experimentos in vitro. Por lo tanto, no se requería aprobación ética formal ni consentimiento informado. La información detallada sobre los principales reactivos, anticuerpos, kits de ensayo, instrumentos, fabricantes, números de catálogo e Identificadores de Recursos de Investigación (RRIDs), cuando proceda, se resume en la Tabla de Materiales.
Preparación y control de calidad del extracto acuoso de SQBJ
Materiales herbales
Las materias primas de Panax notoginseng (Burk.), F. H. Chen (raíz y rizoma) y Bletilla striata.(Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tubérculo) fueron obtenidos de un proveedor comercial de medicina tradicional china y posteriormente autenticados por un farmacéutico senior de la MTC siguiendo la Farmacopea China (edición 2025). Especímenes de referencia (Nº SQBJ-20240301, Nº PN-20240301, Nº BS-20240301) fueron depositados en el herbario de nuestra institución. Las dos hierbas se trituraron y mezclaron en una proporción de masas de 1:1 para preparar polvo de SQBJ.
Preparación del extracto acuoso de SQBJ
El polvo de SQBJ fue sometido a dos extracciones sucesivas por reflujo con agua desionizada en una proporción sólido-líquido de 1:10 (g/mL) durante 1 hora por sesión. Posteriormente, los extractos recogidos se combinaban y pasaban por cuatro capas de gasa médica para eliminar material residual. El filtrado resultante se concentró a presión reducida a 60 °C hasta alcanzar una densidad relativa de 1,05–1,10, seguido de liofilización al vacío para obtener polvo de extracto acuoso SQBJ, con un rendimiento final de extracción del 18,2 % ± 0,6 %. El extracto en polvo se sellaba y almacenaba a −20 °C, se disolvía en un medio DMEM sin suero y posteriormente pasaba por un filtro de membrana de 0,22 μm para su esterilización antes de los experimentos celulares.
Control de calidad del extracto acuoso SQBJ
Para evaluar la consistencia y estandarización de lote a lote del extracto acuoso SQBJ, realizamos una determinación cuantitativa junto con el perfil de huellas dactilares de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La Tabla de Materiales enumera los parámetros técnicos completos relacionados con el sistema HPLC. Basándonos en los perfiles químicos de ambas hierbas constituyentes, seleccionamos cuatro marcadores representativos: notoginsenosido R1, ginsenósido Rg1, ginsenósido Rb1 y militarino. Sin embargo, esta estrategia de control de calidad basada en HPLC reflejaba principalmente varios componentes representativos y no proporcionaba un perfil químico completo de todos los compuestos activos en SQBJ.
La separación cromatográfica se logró mediante una columna C18 de fase invertida (4,6 mm × 250 mm, 5 μm). El funcionamiento se mantuvo a una temperatura de columna de 30 °C, con un caudal de 1,0 mL/min, un volumen de inyección de 10 μL y una longitud de onda de detección de 203 nm. La composición de la fase móvil consistía en acetonitrilo (A) y solución acuosa de ácido fosfórico al 0,1%, utilizando la siguiente elución en gradiente: 0–15 min, 19% A; 15–35 min, 19%–35% A; 35–55 min, 35%–55% A; y 55–60 min, 55%–19% A. La información detallada de instrumentos y columnas se proporciona en la Tabla de Materiales.
Preparación de sustancias de referencia
Para realizar un análisis cuantitativo, adquirimos estándares comerciales para notoginsenosido R1, ginsenósido Rg1, ginsenósido Rb1 y militar, todos con pureza ≥ 98%. Los compuestos de referencia individuales se midieron y disolvieron con precisión en un único stock de metanol para lograr una solución mixta de referencia uniforme con una concentración final de 50 μg/mL para cada componente.
Preparación de muestras:
Se midió con precisión el extracto acuoso de SQBJ (50 mg), seguido de la disolución utilizando 25 mL de metanol de grado analítico. Esta mezcla fue sometida a un tratamiento de baño ultrasónico durante 30 minutos bajo parámetros controlados de instrumentación (potencia: 250 W; frecuencia: 40 kHz). Tras el equilibrio de nuevo a la temperatura ambiente de la habitación, el líquido pasaba por una membrana filtrante orgánica de 0,22 μm para obtener la solución analítica final de prueba.
Resultados de la determinación de contenido:
El contenido medio de componentes característicos del núcleo en tres lotes consecutivos de extracto acuoso SQBJ fue el siguiente: notoginsenosido R1 3,12 ± 0,11 mg/g, ginsenósido Rg1 8,45 ± 0,23 mg/g, ginsenósido Rb1 5,26 ± 0,18 mg/g, y militarino 2,78 ± 0,09 mg/g, con el contenido RSD de cada componente < 5 % entre lotes, confirmando una buena consistencia del extracto de lote a lote.
Declaración de ética y cumplimiento
No se incluyeron ni las pruebas en animales ni la inclusión de muestras clínicas humanas, biopsias tisulares y sujetos vivos durante todo este estudio. El análisis farmacológico de redes se realizó utilizando bases de datos públicas, incluyendo TCMSP, UniProt, GeneCards, OMIM, DrugBank, STRING, Metascape, PubCem y RCSB PDB. Todos los datos recuperados de estas bases de datos eran accesibles públicamente y estaban anonimizados; Por lo tanto, el perfilado bioinformático estaba completamente exento de requerir consentimiento informado formal o supervisión ética adicional.
Los experimentos in vitro actuales se realizaron utilizando la línea celular epitelial mucosa gástrica humana GES-1, disponible comercialmente. No se utilizaron células humanas primarias ni materiales biológicos derivados del paciente. La línea celular se obtuvo de un repositorio celular autenticado y se manejó conforme a las directrices institucionales de bioseguridad y cultivo celular. Como este estudio solo involucró líneas celulares establecidas y bases de datos públicas, estuvo exento de la aprobación formal del comité de ética institucional. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con los requisitos de seguridad institucional de laboratorio y cumplimiento de la investigación.
Estudios de farmacología de redes
Identificación y cribado de objetivos de principio activo
Los componentes activos de Panax notoginseng y Bletilla striata., las dos hierbas constituyentes de SQBJ, fueron recuperados de bases de datos públicas. Toda la información derivada de la base de datos utilizada en este estudio era de acceso público y no contenía información personal identificable. Utilizando nombres botánicos como consultas, identificamos fitoquímicos candidatos a partir de la Plataforma de Datos y Análisis de Sistemas de Farmacología de Medicina Tradicional China (TCMSP). Para identificar moléculas bioactivas elegibles, el protocolo de cribado aplicó umbrales de biodisponibilidad oral (OB) ≥ 20% y semejanza de fármaco (DL) ≥ 0,1. A continuación, identificamos los posibles objetivos génicos posteriores asociados a estos componentes candidatos, omitiendo cualquier componente sin objetivos génicos válidos coincidentes. Todos los genes objetivo fueron anotados y estandarizados mediante el Universal Protein Resource (UniProt), restringiendo la búsqueda en la base de datos de referencia exclusivamente a Homo sapiens, generando así la lista definitiva de genes objetivo para los componentes activos funcionales de SQBJ.
Recuperación de objetivos relacionados con la patología
Para recopilar los genes vinculados a la condición, consultamos tres bases de datos públicas: GeneCards, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) y DrugBank, con "úlcera gástrica" como término de búsqueda. El conjunto de datos multiplataforma fue posteriormente fusionado, seguido de la eliminación de entradas redundantes para establecer una lista estandarizada de genes objetivo asociados a úlceras gástricas.
Construcción de redes para ingredientes, objetivos y enfermedades
Determinamos los genes objetivo solapados entre los componentes activos de SQBJ y la úlcera gástrica. Posteriormente, se construyó una red de interacción multicapa utilizando software de visualización de red. Para evaluar la importancia del nodo, el algoritmo integrado de evaluación topológica calculó los parámetros topológicos de cada nodo, incluyendo la centralidad de grado y intermedio. A partir de estos valores calculados, identificamos los componentes activos y los principales objetivos funcionales de la SQBJ en el tratamiento de la úlcera gástrica.
Mapeo de redes de interacción proteína-proteína (PPI)
Los objetivos de consenso identificados compartidos entre SQBJ y úlcera gástrica se cruzaron con la base de datos STRING. Nuestra consulta especificaba la plantilla de análisis multiproteico mientras restringía el fondo analítico a Homo sapiens. Los IBP se filtraron con un umbral mínimo de confianza en interacción de confianza media (> 0,4).
Los registros de conectividad funcional resultantes se exportaron como un archivo TSV, que posteriormente se integró en un software dedicado de visualización de redes para el análisis PPI. Basándonos en la topografía de conexión calculada, evaluamos los nodos funcionales centrales de la red clasificando el valor de grado específico de cada nodo.
Anotación funcional posterior y mapeo de rutas
Para esclarecer los roles biológicos de los nodos de intersección compartidos, realizamos un análisis de enriquecimiento funcional de la Ontología Génica (GO) y un análisis de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG) utilizando una herramienta de anotación bioinformática accesible en la web. La clasificación funcional categoriza los genes en tres categorías clásicas: proceso biológico (BP), componente celular (CC) y función molecular (MF). Se generaron diagramas de burbujas y gráficos de barras para los resultados del enriquecimiento utilizando una plataforma online de trazado bioinformático para mapear los procesos biológicos primarios y las vías de señalización asociadas al efecto terapéutico de la SQBJ sobre la úlcera gástrica.
Simulación computacional de acoplamiento molecular
Los archivos de geometría espacial de los componentes activos principales de SQBJ se descargaban de bases de datos públicas de compuestos y posteriormente se guardaban como archivos MOL2 mediante software de procesamiento de archivos. También obtuvimos las estructuras cristalinas tridimensionales de las proteínas objetivo central consultando el Banco de Datos de Proteínas. Estas estructuras macromoleculares se preprocesaron eliminando ligandos originales y moléculas de agua, y los modelos limpios resultantes se guardaron en formato PDB. Para simular la energética de unión receptor-ligando, la verificación de acoplamiento que involucró componentes activos centrales y proteínas objetivo se ejecutó mediante software estándar de acoplamiento molecular computacional. Los resultados del acoplamiento se optimizaron y renderizaron utilizando software de visualización molecular.
Cultivo celular
Se cultivaron células epiteliales gástricas de origen humano GES-1 utilizando medio RPMI-1640 integrado con un 10% de suero bovino fetal y un 1% de penicilina–estreptomicina a 37 °C bajo una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO₂. Identificamos el cultivo fuente como una línea celular establecida, obteniendo el stock inicial de un repositorio celular autenticado. A una confluencia observada del 80–90%, las monocapas se enjuagaron dos veces con PBS seguidas de un desprendimiento usando tripsina-EDTA al 0,25% durante 2 minutos a 37 °C. Para terminar la reacción enzimática de escisionamiento, introdujimos un volumen igual de medio completo. La suspensión celular resultante se centrifugó a 1.000 × g . durante 5 minutos, tras lo cual el pellet se volvió a suspender en un medio fresco completo y se volvió a sembrar a la densidad adecuada. Los cultivos se devolvieron a condiciones de incubación idénticas. Durante todo el periodo de propagación, se utilizó un microscopio de contraste de fase invertido para evaluar la viabilidad, morfología y estado de crecimiento celular, y las células en su fase logarítmica de crecimiento se recogieron rutinariamente para análisis posteriores.
Establecimiento y tratamiento del modelo de lesión celular GES-1 inducido por etanol
Las células GES-1 en fase logarítmica se sembraron a 5 × 105 células por pozo en placas de 6 pozos o 1 × 10 célulasde 4 pozos por pozo en placas de 96 pozos e incubadas durante la noche para adherirse. Se estableció una lesión inducida por etanol exponiendo células a 500 mmol/L de etanol en RPMI-1640 sin suplemento durante 4 horas. Esta condición se seleccionó en base a experimentos preliminares de concentración y respuesta temporal. En el análisis preliminar, 250 mmol/L de etanol durante 4 horas solo causó daño leve, manteniendo la viabilidad celular aproximadamente en 78,6 ± 5,4%, mientras que 750 mmol/L de etanol redujo la viabilidad a 32,8 ± 4,7%, indicando citotoxicidad excesiva. La exposición a 500 mmol/L de etanol durante 4 horas redujo la viabilidad celular al 54,7 ± 4,9%, lo que produjo daño reproducible de moderado a grave mientras se retenían suficientes células viables para intervenciones posteriores y ensayos mecanicistas. Por ello, se seleccionó etanol de 500 mmol/L para 4 horas para el establecimiento del modelo. Esta condición se utilizó para simular una lesión epitelial aguda inducida por etanol in vitro y no reproduce completamente el patrón fisiológico de exposición de la mucosa gástrica in vivo.
Para la intervención farmacológica, se seleccionaron tres concentraciones de extracto acuoso de SQBJ (5, 10 y 50 μg/mL) y se administraron inmediatamente después del desafío con etanol. En el grupo de inhibición de PI3K, las células fueron preincubadas con 20 μmol/L LY294002 durante 30 minutos antes del cotratamiento con etanol y la concentración óptima de SQBJ. Una cohorte de control positiva recibió 20 μmol/L omeprazol inmediatamente después de la exposición al etanol. El omeprazol se utilizó como agente gastroprotector de referencia en lugar de comparador de dosis equivalente. La concentración se seleccionó en base a una evaluación preliminar de citotoxicidad y en los rangos de intervención in vitro comúnmente utilizados, y tenía como objetivo proporcionar una referencia farmacológica para la protección celular. Las células de control se mantuvieron en un medio completo sin etanol ni agentes adicionales. Todas las incubaciones se realizaron en una atmósfera humidificada con un 5% de CO₂ a 37 °C. Cada grupo experimental estaba compuesto por al menos tres pozos replicados, y todo el protocolo se ejecutaba de forma independiente 3 veces.
Determinación de la concentración óptima de SQBJ mediante el método CCK-8
Los elementos de HGE/GES-1 en fase logarítmica se distribuyeron en vectores de 96 pozos con una densidad de 1 ×10 4 células por pozo e incubados durante la noche en medio RPMI-1640 completo bajo condiciones estándar (37 °C, 5% CO₂) para asegurar su adherencia. Los cultivos se distribuyeron aleatoriamente en cuatro grupos: control vehicular (solo medio completo), intervención de SQBJ a dosis baja (5 μg/mL), intervención con SQBJ a dosis media (10 μg/mL) e intervención con SQBJ a dosis alta (50 μg/mL); estas tres concentraciones se utilizaron para el cribado terapéutico y se prepararon disolviendo SQBJ en PBS. Todas las condiciones se analizaron en al menos tres pozos paralelos, y el protocolo total se repitió en tres lotes experimentales distintos. Tras el periodo de tratamiento designado, cada pozo recibió 10 μL de reactivo CCK-8, seguido de un periodo de incubación de 2 horas a 37 °C. La densidad óptica (OD) a 450 nm se medía usando un lector de microplacas. El porcentaje de viabilidad celular se calculó como (absorbance_treatment / absorbance_control) × 100%, permitiendo identificar la concentración más efectiva de SQBJ para experimentos posteriores.
qPCR
Los elementos GES-1 en fase logarítmica se cultivaron en placas de 6 pozos (5 × 105 células por pozo) y se mantuvieron durante la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con un 5% de CO₂ para permitir la adherencia. Posteriormente, las células fueron expuestas a la concentración óptima predeterminada de SQBJ y se extrajeron al inicio (0 h) y a las 6, 12, 24 y 48 horas después del tratamiento para determinar la respuesta dinámica de las moléculas señalizantes. Basándose en los resultados del curso temporal, se eligió el intervalo de 24 horas para ensayos mecanicistas posteriores porque mostró la respuesta de señalización más fuerte manteniendo la viabilidad celular estable. Cada punto temporal estaba representado por tres pozos triplicados, y todo el experimento se repetía de forma independiente 3 veces.
Aislamos ARN total utilizando un reactivo de extracción especializado, evaluando la concentración y calidad del rendimiento mediante un espectrofotómetro. Todas las muestras mostraron una relación de absorbancia A₂₆₀/A₂₈₀ dentro del rango de 1,8 y 2,0. Se utilizó un kit de transcripción inversa con limpiador de gDNA para transcribir el cDNA inverso de 1 μg de ARN total. El análisis PCR en tiempo real se realizó mediante un sistema cuantitativo de PCR con cebadores para PI3K, AKT, p38, JNK, ERK y el gen de referencia GAPDH. Los detalles del sistema de PCR, los reactivos y el servicio de síntesis de cebadores se detallan en la Tabla de Materiales. Los cebadores se diseñaron para regiones específicas de los genes humanos correspondientes. Protocolo qPCR: activación en caliente a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 5 s y recocido/extensión a 60 °C durante 30 s. El cálculo de la expresión del ARNm del gen objetivo se basó en el método relativo cuantitativo de PCR con el método 2-ΔΔCt .
ELISA
Los supernadantes se extrajeron y eliminaron mediante centrifugación a 1.200 × g. durante 10 minutos a 4 °C para la eliminación de restos celulares. Se evaluaron los niveles de mediadores inflamatorios (CRP, IL-6, TNF-α) e índices de estrés oxidativo (SOD, MDA, GSH) utilizando kits comerciales de ELISA siguiendo las indicaciones específicas del fabricante. Los perfiles de concentración de estos objetivos se verificaron con formulaciones de ensayos comerciales según las instrucciones de los proveedores. Cada grupo experimental constaba de tres pozos replicados, y el procedimiento se ejecutó en tres lotes de cultivo celular separados para confirmar la reproducibilidad de los datos experimentales. Brevemente, se dispensaron 100 μL de sobrenacionantes estándar o clarificados en placas de reacción prerecubiertas e incubados a 37 °C durante 90 minutos. Tras tres ciclos de lavado sucesivos, cada cavidad recibió 100 μL del anticuerpo específico de detección para una incubación de 60 minutos a 37 °C, seguida de otros tres ciclos de lavado. A continuación, se introdujo la solución sustrato (100 μL), y las muestras se protegieron de la luz durante 15 minutos antes de bloquear la reacción enzimática con 50 μL de solución de parada. La densidad óptica a 450 nm se detectaba mediante un lector de microplacas. Las concentraciones se interpolaron a partir de las curvas estándar correspondientes. Para minimizar el sesgo causado por diferencias en el número de células o los cambios inducidos por el tratamiento en la viabilidad celular, se calibraron los perfiles MDA, SOD, GSH, CRP, TNF-α e IL-6 en función del contenido proteico de cada muestra analítica, según determinó el ensayo BCA, y se expresaron como valores relativos en comparación con el grupo control.
Detección de ROS intracelulares en células GES-1 mediante sonda fluorescente DCFH-DA
Para cuantificar los niveles de especies reactivas intracelulares de oxígeno (ROS), utilizamos el indicador fluorogénico permeable a la membrana DCFH-DA. Las células extraídas se resuspendieron en RPMI-1640 sin suplemento que contenía 10 μmol/L DCFH-DA y se mantuvieron durante 20 minutos bajo condiciones estándar de cultivo (37 °C, 5% CO₂) en la oscuridad. Tras tres lavados sucesivos con medio sin suero para limpiar la sonda no unida, la intensidad de fluorescencia fue monitorizada mediante citometría de flujo con excitación de 488 nm y emisión de 525 nm. Los niveles relativos de ROS se informaron como la intensidad media de fluorescencia para cada grupo de tratamiento, normalizados al número de células viables determinados en pozos paralelos mediante el ensayo CCK-8, y expresados en relación con el grupo de control correspondiente.
Determinación del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)
Evaluamos los cambios en el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) utilizando un kit comercial de ensayo JC-1. En resumen, las células extraídas se resuspendían en una solución de trabajo JC-1 recién preparada —una mezcla de igual volumen de tinte JC-1 y tampón de tinción suministrada por el kit— hasta alcanzar una concentración final de 1 × 106 celdas/mL. Tras una incubación de 20 minutos a 37 °C en un ambiente humidificado con un 5% de CO₂, protegido de la luz para evitar blanqueamiento, la muestra se extrajo por centrifugación (800 × g., 5 minutos) y se enjuagó una vez con 1 mL de tampón de tinción JC-1 enfriado con hielo. Posteriormente, la fluorescencia se adquirió mediante citometría de flujo.
Los agregados de JC-1 (indicativos de ΔΨm intactos) se monitorizaron a través del canal FL2 usando longitudes de onda de excitación de 488 nm y emisión de 590 nm, mientras que los monómeros de JC-1 (indicativos de disipación de ΔΨm) se rastrearon mediante el canal FL1 usando ajustes de excitación de 488 nm y emisión de 525 nm. El ΔΨm se expresó como la proporción de la señal de fluorescencia roja a verde; valores descendentes indican despolarización mitocondrial.
Determinación del nivel de ATP intracelular
La funcionalidad mitocondrial se evaluó mediante cuantificación intracelular de ATP mediante un kit de ensayo de ATP. Se empleó una reacción bioluminiscente luciferina–luciferasa para determinar el contenido de ATP, que es directamente proporcional a la actividad mitocondrial. Brevemente, las células extraídas se resuspendieron en un tampón de lisis de ATP helado y se conservaron durante una ventana de lisis de 5 minutos sobre hielo. La centrifugación se realizó entonces a 12.000 × g. durante 5 minutos a 4 °C, tras lo cual 20 μL del sobrenadante liberado se transfirieron a microplacas opacas blancas de 96 pozos. Posteriormente, se introdujeron 100 μL de solución de trabajo de detección de ATP recién preparada —una mezcla de reactivo de luciferasa y sustrato de luciferina preparada siguiendo el protocolo proporcionado— en cada cavidad. La señal de luminiscencia resultante se capturaba rápidamente con un lector de microplacas de luminiscencia. Para obtener niveles relativos de ATP, los valores de luminiscencia bruta se normalizaron a las concentraciones totales individuales de proteínas sobrenadantes cuantificadas con un kit comercial de análisis de proteínas BCA, corrigiendo así las variaciones en el número celular.
Detección de apoptosis celular mediante doble tinción Annexin V/PI
La detección de células apoptóticas se realizó con una configuración comercial de ensayo de muerte celular Annexin V-FITC/PI según lo establecido por el fabricante. Tras el lavado, los pellets se resuspendieron en un tampón de unión Annexin V-FITC a una densidad celular de 1 × 106 células/mL (195 μL por muestra). Posteriormente, cada tubo independiente recibió 5 μL de Annexin V-FITC seguidos de 10 μL de solución de tinción PI. La muestra se vórtice suavemente y se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. Tras este proceso, las células apoptóticas se monitorizaron mediante un citómetro de flujo. Los canales fluorescentes respectivos facilitaron la diferenciación entre células viables (Annexin V⁻/PI⁻), células apoptóticas tempranas (Annexin V⁺/PI⁻) y células apoptóticas/necróticas tardías (Annexin V⁺/PI⁺). El porcentaje de células apoptóticas en cada grupo se cuantificó siguiendo estos parámetros de gating.
Western blot
Las membranas se incubaron durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios contra Bcl-2, Bax, Caspasa-3 escindida, AKT, p38 MAPK, JNK, ERK1/2 y GAPDH. Se seleccionaron anticuerpos según la información de validación de muestras humanas y aplicaciones de western blot. Se añadieron RRIDs para todos los anticuerpos con registros disponibles en el Registro de Anticuerpos o en el Portal RRID. Los niveles de proteína objetivo se normalizaron a GAPDH. Tras los protocolos estándar de lavado, los blots se expusieron a anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 1 hora a temperatura ambiente. Las bandas se detectaron utilizando una solución de sustrato ECL. Los valores de las bandas grises Western Blot se evaluaron utilizando software de análisis digital de imágenes.
Tinción por inmunofluorescencia
Las monocapas GES-1 se establecieron sobre llaves de vidrio dentro de placas de 24 pozos antes de los tratamientos indicados. Tras el tratamiento, se realizó la fijación utilizando paraformaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguida de permeabilización de membrana usando Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 10 minutos, y bloqueo con albúmina sérica bovina al 5% durante 30 minutos a 37 °C. Luego se transfirieron los coverslips para incubación nocturna a 4 °C, con anticuerpos primarios dirigidos a AKT, p38, JNK y ERK. Tras tres lavados consecutivos de PBS, las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con fluorescencia protegido de la luz. Se aplicó contratinción DAPI durante 5 minutos para visualizar los núcleos. Posteriormente, los abrigos se colocaron con reactivo anti-desvanecimiento, y la recogida de datos utilizó un microscopio láser confocal para determinar la distribución subcelular de las proteínas objetivo. Todas las imágenes de inmunofluorescencia se capturaron bajo los mismos parámetros de imagen utilizando una lente objetivo de 20×. Se añadieron barras de escala correspondientes a 50 μm a todas las imágenes representativas de inmunofluorescencia.
Análisis estadístico
Los valores cuantitativos se ilustran como la media ± desviación estándar (DE), originados en al menos tres ejecuciones experimentales independientes con cada muestra verificada en triplicado. Los análisis estadísticos se realizaron mediante herramientas especializadas de análisis numérico. Para determinar variaciones distintas entre múltiples cohortes, utilizamos el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) junto con la prueba post hoc de Tukey para comparaciones entre grupos. Un umbral de dos colas de P < 0,05 de significación estadística designada.
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Disección bioinformática de mecanismos mediados por SQBJ en úlceras gástricas
Para explorar cómo el SQBJ puede ejercer sus acciones farmacológicas sobre el GU, inicialmente predecimos los objetivos correspondientes a sus principales componentes bioactivos. Utilizando programación R, extrajimos y eliminamos entradas redundantes entre estos componentes bioactivos, obteniendo finalmente 411 objetivos candidatos. Posteriormente, se recolectaron dianas patológicas ligadas ...
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El objetivo principal de esta investigación fue evaluar si SQBJ, una fórmula clásica de compuesto de MTC compuesta por Panax notoginseng y Bletilla striata, posee actividad citoprotectora frente al daño epitelial de la mucosa gástrica provocado por etanol dentro de un modelo celular GES-1, con implicación de señalización relacionada con PI3K/AKT y reducciones asociadas en mediadores inflamatorios, indicadores de estrés oxidativo, disfunción mitocondrial y eventos apoptó...
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Los autores no tienen conflictos de interés que declarar.
Este estudio fue financiado por el Proyecto General del Plan de Desarrollo de Ciencia y Tecnología de la Medicina Tradicional China de la Provincia de Jiangsu (2023), Número de Proyecto: MS2023118.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Prueba de apoptosis | Kit de detección de apoptosis Annexin V-FITC/PI | Beyotime | C1062L |
| Prueba de ATP | Kit mejorado de ensayo de ATP | Beyotime | S0027 |
| Tampon | PBS | Solarbio | — |
| Reactivo para digestión celular | Tripsina-EDTA 0.25% | Gibco | 25200072 |
| Línea celular | Células epiteliales de mucosa gástrica humana GES-1 | Banco de células, Academia de Ciencias de China | SCSP-533 |
| Prueba de viabilidad celular | Reactivo CCK-8 | — | — |
| Microscopio confocal | Microscopio confocal LSM 880 | Zeiss | LSM 880 |
| Medio de cultivo | RPMI-1640 | Gibco | — |
| Kit de ELISA | Kit de ELISA de CRP humano | R&D Systems | DCPR00 |
| Kit de ELISA | Kit de ELISA de IL-6 humano | R&D Systems | DTAM00D |
| Kit de ELISA | Kit de ELISA de TNF-α humano | R&D Systems | — |
| Citómetro de flujo | FACSCalibur / FACSCanto II | BD Biosciences | — |
| Material herbal | Bletilla striata (Thunb. ex A. Murray) Rchb. f. (tuber) | Mercado de Medicina Tradicional China de Anguo | Número de comprobante BS-20240301 |
| Material herbal | Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen (raíz y rizoma) | Mercado de Medicina Tradicional China de Anguo | Número de comprobante PN-20240301 |
| Material herbal | Polvo de Sanqi Baiji San | Preparación interna | Número de comprobante SQBJ-20240301 |
| Columna HPLC | Columna ZORBAX SB-C18 | Agilent Technologies | 4.6 mm × 250 mm, 5 μm |
| Sistema HPLC | Sistema HPLC 1260 Infinity II | Agilent Technologies | 1260 Infinity II |
| Anticuerpo secundario IF | Anti-IgG de conejo conjugado con Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 |
| Microscopio invertido | Microscopio de contraste de fase invertido CKX41 | Olympus | CKX41 |
| Lector de luminiscencia | Lector de microplacas Infinite 200 PRO | Tecan | Infinite 200 PRO |
| Membrana | Membrana PVDF | Millipore | IPVH00010 |
| Lector de microplacas | Lector de microplacas iMark | Bio-Rad | iMark |
| Kit de potencial de membrana mitocondrial | Kit de ensayo JC-1 | Beyotime | C2006 |
| Tinte nuclear | DAPI | Beyotime | C1002 |
| Plataforma en línea | Plataforma de trazado bioinformática en línea | Plataforma de análisis bioinformático en línea | Plataforma en línea |
| Plataforma en línea | Plataforma de análisis de enriquecimiento basada en web | Metascape | Plataforma en línea |
| Prueba de estrés oxidativo | Kit de ensayo de GSH | Beyotime | S0052 |
| Prueba de estrés oxidativo | Kit de ensayo de MDA | Beyotime | S0131 |
| Prueba de estrés oxidativo | Kit de ensayo de SOD | Beyotime | S0109 |
| Inhibidor de PI3K | LY294002 | MCE | S1105 |
| Medicamento de control positivo | Omeprazol | MCE | HY-B0053 |
| Anticuerpo primario | AKT | Cell Signaling Technology | 4691 |
| Anticuerpo primario | Bax | Cell Signaling Technology | 5023 |
| Anticuerpo primario | Bcl-2 | Cell Signaling Technology | 15071 |
| Anticuerpo primario | Caspasa-3 cortada Asp175 | Cell Signaling Technology | 9664 |
| Anticuerpo primario | ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 4695 |
| Anticuerpo primario | GAPDH | Abcam | ab8245 |
| Anticuerpo primario | JNK / SAPK-JNK | Cell Signaling Technology | 9252 |
| Anticuerpo primario | p-AKT Ser473 | Cell Signaling Technology | 4060 |
| Anticuerpo primario | p-ERK1/2 Thr202/Tyr204 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Anticuerpo primario | p-JNK Thr183/Tyr185 | Cell Signaling Technology | 4668 |
| Anticuerpo primario | p-p38 MAPK Thr180/Tyr182 | Cell Signaling Technology | 4511 |
| Anticuerpo primario | p-PI3K p85 Tyr458 / p55 Tyr199 | Cell Signaling Technology | 4228 |
| Anticuerpo primario | p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 8690 |
| Anticuerpo primario | PI3K p85 | Cell Signaling Technology | 4257 |
| Oligo | AKT adelante | — | — |
| Oligo | AKT reverso | — | — |
| Oligo | ERK adelante | — | — |
| Oligo | ERK reverso | — | — |
| Oligo | GAPDH adelante | — | — |
| Oligo | GAPDH reverso | — | — |
| Oligo | JNK adelante | — | — |
| Oligo | JNK reverso | — | — |
| Oligo | p38 adelante | — | — |
| Oligo | p38 reverso | — | — |
| Oligo | PI3K adelante: | — | — |
| Oligo | PI3K reverso | — | — |
| Inhibidor de proteasa | PMSF | Beyotime | ST506 |
| Prueba de proteína | Kit de ensayo de proteína BCA | Beyotime | P0010 |
| Tampon de lisis de proteínas | Tampon RIPA | Beyotime | P0013B |
| Base de datos pública | DrugBank | DrugBank Online | Base de datos en línea |
| Base de datos pública | GeneCards | Instituto de Ciencias Weizmann | Base de datos en línea |
| Base de datos pública | Herencia Mendeliana en el Hombre en línea | Universidad Johns Hopkins | Base de datos en línea |
| Base de datos pública | Base de datos de compuestos PubChem | Centro Nacional de Información Biotecnológica | Base de datos en línea |
| Base de datos pública | Banco de datos de |