Dispositivo portátil para el pretratamiento de la saliva para mejorar la detección del cortisol

Resumen

Este protocolo describe un método rápido de pretratamiento con saliva para mejorar la detección del cortisol. Se utiliza un dispositivo de filtración portátil para eliminar mucinas y otras sustancias que interfieren, preservando al tiempo el analito objetivo. La saliva pretratada muestra un flujo capilar mejorado, lo que permite un rendimiento del ensayo más consistente y reproducible.

Resumen

La detección de cortisol salival ofrece una alternativa no invasiva al análisis basado en la sangre. Sin embargo, su implementación práctica sigue limitada por la viscosidad intrínseca de la saliva y la presencia de componentes que interfieren. En particular, las mucinas y las proteínas salivales dificultan el flujo capilar y comprometen la fiabilidad de los ensayos posteriores de flujo lateral (LFA), lo que hace necesaria estrategias de pretratamiento eficaces y accesibles. Aquí presentamos un dispositivo portátil de pretratamiento de saliva, denominado SaliFilter, para la detección de cortisol en el punto de atención. El dispositivo emplea un mecanismo de filtración que elimina selectivamente componentes interferentes de alto peso molecular, permitiendo el paso de pequeñas moléculas, incluido el cortisol. Operado mediante presión manual simple, permite un procesamiento rápido de muestras (~2 min) sin necesidad de equipos externos, lo que lo hace adecuado para entornos descentralizados. El rendimiento del dispositivo fue evaluado mediante mediciones de turbidez, cuantificación de proteínas y SDS-PAGE, que confirmaron la eliminación eficiente de las proteínas mucinas y salivales. Las muestras tratadas mostraron un flujo capilar mejorado, lo que resultó en un funcionamiento estable y fiable de la LFA. El análisis cuantitativo demostró una mejor reproducibilidad de la señal, y la detección del cortisol alcanzó un límite de detección de 1,47 ng mL⁻¹ en rangos de concentración clínicamente relevantes. Este protocolo establece una estrategia eficaz de pretratamiento de saliva que mejora la sensibilidad y fiabilidad analíticas sin comprometer la integridad del analito. El enfoque propuesto ofrece una solución práctica y portátil para diagnósticos basados en saliva, con potencial de aplicación para pruebas en el punto de atención y automonitorización.

Introducción

El cortisol, una hormona glucocorticoide secretada por la corteza suprarrenal, es un biomarcador clave para evaluar el estrés fisiológico ^1,2. Puede medirse en múltiples fluidos biológicos, incluyendo suero, plasma, orina, líquido intersticial y saliva, siendo la sangre y la saliva las más utilizadas en la práctica^{clínica 3}. Aunque las mediciones basadas en sangre proporcionan información cuantitativa fiable, requieren venpuntura invasiva y personal formado, lo que limita su idoneidad para un seguimiento frecuente o longitudinal ^4,5,6. En cambio, la medición del cortisol salival ofrece una alternativa no invasiva y cómoda, permitiendo aplicaciones en el punto de atención y la^{automonitorización 7,8}. Cabe destacar que los niveles de cortisol salivales se correlacionan fuertemente con las concentraciones en sangre, lo que respalda la saliva como una muestra sustituta fiable⁹. Sin embargo, la viscosidad intrínseca de la saliva y la presencia de componentes interferentes dificultan significativamente el rendimiento analítico, lo que requiere un pretratamiento efectivo antes del^análisis 10,11,12.

Se han explorado diversas estrategias de pretratamiento para abordar estos desafíos. La centrifugación se utiliza ampliamente para eliminar componentes grandes como mucinas, proteínas y restos celulares. Sin embargo, requiere equipos de laboratorio voluminosos y múltiples pasos de procesamiento, lo que limita su aplicabilidad en entornos^{descentralizados 13,14}. La dilución con soluciones tampón puede reducir la viscosidad y mejorar el flujo de la muestra¹⁵. No obstante, al mismo tiempo reduce la concentración del analito, comprometiendo así la sensibilidad analítica. Como resultado, los enfoques existentes siguen siendo insuficientes para aplicaciones en el punto de atención, donde un procesamiento rápido y sin equipos y la preservación de los analitos objetivo son esenciales.

Para superar estas limitaciones, desarrollamos SaliFilter, un dispositivo portátil para el pretratamiento de la saliva adaptado a la detección de cortisol en el punto de atención. El dispositivo emplea un mecanismo de filtración que elimina selectivamente sustancias interferentes de alto peso molecular, permitiendo el paso de pequeñas moléculas, incluido el^{cortisol 16}. Operado manualmente, el dispositivo permite un procesamiento rápido y fácil de usar sin necesidad de instrumentación externa. Al eliminar componentes interferentes, este enfoque mejora el flujo capilar en ensayos de flujo lateral, mejorando así la fiabilidad analítica. Este protocolo describe la fabricación del dispositivo y su aplicación para un pretratamiento rápido de saliva antes de la detección del cortisol mediante ensayos de flujo lateral.

Protocolo

En este estudio se utilizó saliva humana acumulada desidentificada y obtenida comercialmente. No se reclutaron participantes humanos y no se requirió la aprobación ética institucional.

1. Preparación de muestras de saliva

1. Instruye a los participantes a abstenerse de comer o beber durante al menos 30 minutos antes de la recogida de la muestra.
2. Prepara la muestra de saliva según las instrucciones del proveedor.
   NOTA: Este estudio utilizó saliva humana agrupada disponible comercialmente para la validación a nivel de protocolo.
3. Mezcla suavemente la muestra de saliva antes de usarla para asegurar la homogeneidad.
4. Guarda las muestras de saliva a 4 °C y úsalas dentro del periodo de almacenamiento recomendado por el proveedor.

2. Preparación de la membrana recubierta de RBCM (Figura 1A)

1. Aislar el RBCM de la sangre total según un protocolo¹⁶ previamente reportado.
   1. Utiliza sangre humana entera obtenida comercialmente con anticoagulante con K2EDTA como fuente de RBCM.
   2. Centrifuga la sangre entera a 800 × g durante 5 minutos y recoge la fracción de glóbulos rojos después de retirar el plasma y la capa buffy.
   3. Lava el pellet aislado de glóbulos rojos tres veces con solución fisiológica 1× con fosfato (PBS) bien fría usando una mezcla manual suave.
   4. Suspende el pellet de glóbulos rojos lavados en PBS de 0,25× helado durante 30 minutos para inducir la hemólisis.
   5. Separa la hemoglobina libre centrifugando la suspensión lisada a 20.000 × g durante 30 minutos y recogiendo el pellet de globulo sanguíneo (RBCM).
   6. Lava la boluleta de RBCM recogida tres veces más con 0,25× PBS y guarda la boluleta de RBCM rosa pálido a −80 °C hasta que se use de nuevo.
2. Prepara una membrana de polietersulfona (PES) con un poro de 30 nm y un diámetro de 13 mm.
3. Depositar 100 μL de solución de RBCM al 2% (p/v) en un lado de la membrana PES. Extiende o dispensa suavemente la solución gota a gota hasta que toda la superficie de la membrana esté completamente humedecida.
4. Incuba la membrana a 50 °C durante 30 minutos para asegurar un recubrimiento y secado uniformes.
5. Guarda la membrana recubierta a temperatura ambiente y úsala en un plazo de 15 días tras la^{preparación 17}.
   NOTA: La caracterización detallada de la membrana PES recubierta de RBCM ha sido descrita en nuestro estudio^{anterior 16}.

3. Fabricación del dispositivo SaliFilter (Figura 1B)

1. Coloca la membrana recubierta de RBCM en el soporte del filtro designado.
2. Monta el dispositivo conectando de forma segura los componentes de entrada y salida.
3. Coloca una jeringuilla de 1 mL en la entrada del dispositivo.
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de que todos los componentes estén bien sellados para evitar fugas durante la operación.

4. Pretratamiento de la saliva

1. Carga 500 μL de saliva en la jeringuilla conectada al dispositivo SaliFilter.
2. Aplica una presión manual suave para que la muestra de saliva pase a través de la membrana (~ 2 min).
3. Recoge la saliva pretratada del enchufe.
4. Utiliza la muestra pretratada inmediatamente o guárdala a 4 °C hasta que se haga un análisis más profundo.

5. Análisis SDS-PAGE de proteínas salivales

1. Mezcla 15 μL de la muestra con 5 μL de tampón de Laemmli.
2. Carga la mezcla en pozos separados de un gel SDS-PAGE al 8%.
3. Realiza electroforesis a 150 V durante 40 minutos.
4. Tiñe el gel con azul Coomassie durante 2 horas.
5. Destiende el gel en agua destilada durante la noche.
6. Captura imágenes del gel usando un smartphone o un sistema de imagen.

6. Detección de cortisol mediante ensayo de flujo lateral (LFA)

1. Aplica 150 μL de saliva pretratada sobre la almohadilla de muestra de la tira LFA.
2. Deja que la muestra migre a lo largo de la tira durante 10 minutos.
3. Captura imágenes de los resultados de las pruebas usando un smartphone o un sistema de imagen.
4. Abre la imagen LFA en ImageJ y usa Imagen > Color > Canales Divididos para separar los canales RGB.
5. Utiliza la imagen del canal verde para el análisis de intensidad de la línea de prueba.
6. Seleccione una Región de Interés (ROI) rectangular de 100 × 10 píxeles que cubra la línea de prueba y aplique el mismo tamaño de ROI a todas las imágenes de la franja.
7. Mide el valor medio de intensidad del ROI de la línea de prueba. Selecciona una región de membrana en blanco adyacente con el mismo tamaño de ROI y mide la intensidad de fondo.
8. Calcular la intensidad normalizada de la línea de prueba de la siguiente manera: intensidad normalizada = intensidad de la línea de prueba − intensidad de fondo.

7. Análisis estadístico

1. Presenta los datos cuantitativos como media ± desviación estándar (DS), salvo que se indique lo contrario. Define las barras de error como SD.
   NOTA: En este estudio, todos los valores de N reportados representan réplicas técnicas realizadas utilizando alicuotas de saliva humana agrupada obtenida comercialmente.
2. Realizar un análisis de regresión lineal utilizando los valores normalizados de intensidad de la línea de prueba obtenidos de concentraciones de cortisol de 0–8 ng ^mL−1 y calcular el coeficiente de determinación (R²) a partir de la curva ajustada.
3. Calcular el límite de detección (LOD) usando la siguiente ecuación: LOD = 3,3 × SE / |pendiente|, donde SE es el error estándar de la intersección y y |pendiente| es el valor absoluto de la pendiente obtenida de la ecuación de regresión lineal. Utiliza el valor absoluto de la pendiente porque el LFA competitivo produce una pendiente negativa.
   NOTA: En este estudio no se realizaron pruebas estadísticas inferenciales ni se aplicaron criterios de significación.

Resultados

Un pretratamiento efectivo de la saliva requiere eliminar componentes interferentes, incluidas las mucinas y las proteínas, que comprometen el rendimiento analítico posterior. La capacidad de filtración de SaliFilter se evaluó primero comparando los cambios de turbidez con los obtenidos con kits comerciales de recolección de saliva (Figura 2A). La saliva no tratada mostró alta turbidez, mientras que las muestras tratadas con SaliFilter mostraron claridad, lo...

Discusión

Los diagnósticos basados en saliva ofrecen una alternativa no invasiva al análisis de sangre. Sin embargo, su adopción más amplia se ha visto limitada por la viscosidad intrínseca de la saliva y la presencia de componentes interferentes como mucinas y proteínas. Estos factores interrumpen el flujo guiado por capilar y comprometen el rendimiento de plataformas analíticas simples, incluidas las LFA, lo que hace necesario un pretratamiento efectivo de la muestra.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Artificial saliva	Solarbio, China	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent	Bio-Rad, USA	5000006	Para el ensayo de Bradford
Coomassie blue	Abcam, UK	ab119211	Para la visualización de bandas de proteínas
Cortisol ELISA Kit	Abcam, UK	ab154996
Cortisol LFA	In-house
Hot plate	Daihan Scientific, República de Corea)
Hydrocortisone (Cortisol)	Sigma-Aldrich, USA	PHR1014
Laemmli sample buffer	GenDEPOT, USA	L1200-001	Para la denaturación de proteínas antes de SDS-PAGE
Membrane holder	GVS Filter Technology	1220950	Soporte de 13 mm de diámetro
Mini-PROTEAN® Tetra Cell for 0.75 mm Gels	Bio-Rad, USA	1658000	Para la electroforesis en gel
Mucin	Sigma-Aldrich, USA	M2378
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA		Para el ensayo de proteínas
PES membranes	STERLITECH, USA	PES00313100	PES de 0,03 micras, membrana de 13 mm
Phosphate-buffered saline (PBS)	DUKSAN, República de Corea	LB004
Pooled Human Saliva	Innovative Research Inc., USA	IRHUSL5ML
RBCM	In-house
Resolving Gel Buffer for PAGE	Bio-Rad, USA	1610798	Para la preparación del gel de resolución
Salivette Cortisol	SARSTEDT, Alemania	51.1534.500	Kit de recolección de saliva
Stacking Gel Buffer for PAGE	Bio-Rad, USA	1610799	Para la preparación del gel de apilamiento
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, USA	SSAL-601	Kit de recolección de saliva
Syringe	koreavaccine, República de Corea)		1 mL de volumen
TEMED	Bio-Rad, USA	1610800	Para la polimerización de acrilamida