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Artículo de método

La metafase ADN-FISH se extiende para distinguir el ADN extracromosómico de regiones que tiñen homogéneamente en líneas celulares de cáncer humano

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DOI:

10.3791/71970

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4 de agosto de 2026

 ,  , 
1Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine

En este artículo

Resumen

Informamos de un protocolo de propagación metafásica DNA-FISH que detecta visualmente el número de copias locus y la ubicación dentro del genoma. Este enfoque permite la resolución unicelular de los estados de amplificación, específicamente en líneas celulares cancerosas que contienen ADN extracromosómico y regiones de tinción homogénea.

Resumen

La secuenciación del genoma completo identifica amplificaciones focales de ADN con resolución por pares de bases, pero no puede determinar si las secuencias amplificadas residen en ADN extracromosómico (ECN, también conocido como minutos dobles) o en regiones cromosómicas integradas de tinción homogénea (HSRs). Las propagaciones metafásicas de hibridación in situ por fluorescencia del ADN (ADN-FISH) siguen siendo el estándar de oro para distinguir estos estados de amplificación a resolución de célula única. Aquí presentamos un protocolo detallado para las propagaciones de metafase de ADN-FISH utilizando líneas celulares de cáncer humano, que abarcan cultivo celular, detención de metafase, tratamiento hipotónico, fijación, diseminación cromosómica, hibridación con sonda fluorescente e imagen por fluorescencia. El protocolo incorpora pasos intermedios de control de calidad para verificar la dispersión exitosa de los cromosómicos y optimizar la calidad de la propagación de la metafase, haciendo que el flujo de trabajo sea accesible para laboratorios sin conocimientos especializados en citogenética. Los resultados demuestran una visualización clara de los estados de amplificación de ECDNA y HSR utilizando sondas específicas del loco e ilustran artefactos técnicos comunes que pueden afectar la interpretación. Este protocolo proporciona un enfoque robusto y reproducible para estudiar la organización estructural de la amplificación de oncogenes en células cancerosas.

Introducción

El genoma humano está organizado no solo por su secuencia, sino también por su estructura, y los cambios en la secuencia o estructura pueden conducir al cáncer 1,2,3,4. La amplificación de oncogenes está presente en aproximadamente el 40% de todos los tumores, donde contribuye a la iniciación, crecimiento, metástasis y resistencia al fármaco5. En algunos casos, los oncogenes amplificados se transportan en ADN extracromosómico (ECDNA, también llamados minutos dobles), que son elementos circulares, autorreplicantes y de doble cadena que residen fuera de los cromosomaslineales 6,7,8,9. Los ecDNAs son cientos de kilobases a megabases de tamaño 10,11. Debido a la ausencia de centrómeros, se segregan asimétricamente durante la mitosis, lo que lleva a hasta 100+ copias en un solo núcleo 12,13,14,15,16,17,18. Esta segregación desigual genera variabilidad en el número de copias entre células hijas, lo que impulsa una rápida evolución tumoral y un bajo resultado para el paciente17,19.

Los ecADN existen en una relación dinámica con regiones de tinción homogénea (HSRs) (Figura 1A)8,18. Los HSR son amplificaciones focales intracromosómicas que pueden surgir mediante la reintegración de ecDNAs en un único locus en elgenoma 8,10,18,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Estos dos estados, ECDNAs y HSRs, pueden interconvertirse, revelando que la amplificación oncogénica es estructuralmenteplástica 24,25,32,33. Esta interconversión tiene relevancia terapéutica porque los ECDNAs pueden pasar al estado HSR en presencia defármacos 32,33,34,35,36,37,38. Las células que pasan por esta transición al estado HSR se volven resistentes al fármaco bajo presiónterapéutica 33. Los HSR también parecen ser más frecuentes en tumores malignos que en tumoresbenignos 39. A pesar de su relevancia clínica, ninguna estrategia aprobada por la FDA apunta al estado de HSR, en parte porque los métodos para distinguir estas estructuras de amplificación siguen infrautilizados.

Aunque los estados de ECDNA y HSR tienen consecuencias clínicas distintas, los enfoques actuales de secuenciación no pueden distinguirlos de forma fiable. La secuenciación del genoma completo (WGS) identifica ahora regiones amplificadas con resolución por par debases 40. El WGS ha sido valioso para definir la composición de secuencias de ECDNAs y HSRs, pero a costa de la resolución espacial. A diferencia de los enfoques citogenéticos tradicionales, el WGS por sí solo no puede determinar si una secuencia amplificada reside en los ecDNA o si está integrada en un cromosoma como HSR 41,42,43. Como resultado, los métodos que preservan el contexto espacial de la amplificación siguen siendo esenciales para comprender la biología de estos estados distintos.

Durante los últimos 40 años, las propagaciones metafásicas de hibridación in situ por fluorescencia del ADN (ADN-FISH) han servido como el estándar de oro para identificar y distinguir estados de amplificación de ECDNA yHSR 42,44,45,46. De hecho, los ecDNAs y HSRs fueron identificados y caracterizados por primera vez mediante análisis citogenéticos basados enmetafases 7,47. Antes del uso generalizado de sondas fluorescentes, la hibridación in situ se realizaba utilizando sondas de ADN radiomarcadas, que también se han utilizado para visualizar ECDNAs y HSRs48,49. A medida que WGS ganaba popularidad, las propagaciones de metafase ADN-FISH se volvieron menos comunes. Muchos aspectos del flujo de trabajo están dispersos a lo largo de la literatura citogenética, y los protocolos optimizados suelen mantenerse dentro de grupos de investigación individuales o laboratorios de citogenética que tratan el método comopropietario 50,51. Aquí describimos un protocolo de propagación metafásica DNA-FISH para resolver visualmente el estado de amplificación a nivel de célula única.

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Protocolo

Todos los procedimientos de cultivo celular humano se realizaron cumpliendo con las directrices institucionales.

1. Detener células en metafase usando Colcemid (N-metil-N-deacetil-colchicina)

  1. Comienza con aproximadamente 2,0 × 106–2,0 × 107 células cancerosas u otras células cultivadas. Muy pocas células producirán menos propagaciones en metafase, mientras que demasiadas células pueden resultar en una fijación insuficiente.
  2. Determinar el tiempo adecuado de incubación de Colcemid para el sistema experimental. El tiempo de incubación afecta al número de dispersiones metafásicas obtenidas y a la longitud cromosómica, y las condiciones óptimas varían según el tipo celular.
    NOTA: Tiempos de incubación más cortos resultan en menos células detenidas en metafase en el momento de la recogida. Los tiempos de incubación más largos producen más cromosomas condensados con brazos más cortos, lo que dificulta el análisis. Para líneas celulares cancerosas con un tiempo de duplicación aproximado de 24 horas, los periodos de incubación que van desde 45 minutos hasta la noche producen propagaciones metafásicas adecuadas. Optimiza el tiempo de incubación para células con tiempos de duplicación más lentos. Una incubación de 2 horas suele ser suficiente para producir un número adecuado de dispersiones metafásicas con longitudes cromosómicas adecuadas para su análisis.
  3. Calcular la cantidad de Colcemido necesaria para alcanzar una concentración final de 10 μL/mL en el medio de cultivo celular adecuado.
    NOTA: Mantener las células en crecimiento logarítmico pasándolas o sembrándolas al menos 24 horas antes de la detención metafásica. Trata las células con Colcemid cuando los cultivos alcancen una confluencia del 70%–90%.
  4. Diluye la solución de culo de Colcemid 1:1 con agua ultrapura estéril. Añade el volumen adecuado al cultivo e incuba durante 45 minutos hasta toda la noche en una incubadora de cultivo celular.

2. Cosechar células

  1. Prepara el fijador fresco de Carnoy (metanol 3:1: ácido acético). Mantén el fijador en hielo durante todo el proceso de fijación.
  2. Prepara una solución fresca de 0,075 M KCl y caliéntala en un baño maria a 37 °C.
  3. Recoge las células en un globo y registra el recuento de células. Utiliza este valor para calcular el volumen final de resuspensión.
    NOTA: Desprender las células adherentes mediante tripsinización. Transfiere las celdas de suspensión directamente a tubos centrífugos de 15 mL. Eliminar Colcemid y medios que contengan Colcemid según las directrices institucionales sobre residuos peligrosos.
  4. Lava las células con PBS.
  5. Resuspende suavemente las células en 10 mL de KCl tibio de 0,075 M y mezcla mediante inversión suave. Este tratamiento hipotónico hincha las células, permitiéndoles romperse y dispersar los cromosomas durante la preparación de las láminas.
  6. Incuba las células en un baño María a 37 °C durante 30 minutos.
  7. Añade lentamente 2 mL de fijador Carnoy's bien frío mientras mezclas suavemente la suspensión por inversión.
  8. Deja que las celdas reposen 5 minutos.
  9. Centrifuga a 500 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
  10. Aspira cuidadosamente el sobrenadante o retíralo con una pipeta.
  11. Añade lentamente 10 mL de fijador Carnoy's bien frío en incrementos de 0,5 mL mientras mezclas suavemente después de cada adición.
  12. Deja que las células permanezcan quietas 10 minutos en RT.
  13. Centrifugar a 650 × g durante 5 minutos en RT.
  14. Repite los pasos 2.10–2.13 dos veces
  15. Durante el lavado final, deja las células suspendidas en el fijador de Carnoy.
    PAUSA: Almacena la suspensión de celda fija a −20 °C o procede inmediatamente a la Sección 3.
    NOTA: Para muestras que contengan menos de aproximadamente 3 × 106 celdas, realizar la fijación en tubos microcentrífugas de 1,5 mL en lugar de tubos cónicos más grandes. Reducir los volúmenes de 0,075 M KCl y el fijador de Carnoy multiplicarse por 10 manteniendo todos los tiempos de incubación, temperaturas y condiciones de centrifugación.

3. Caída de la mesa

  1. Recupera la muestra de −20 °C y descongelala a RT.
  2. Centrifugar a 800 × g durante 7 minutos en RT.
  3. Etiqueta las láminas de cristal y colócalas sobre hielo.
  4. Utilizando el recuento de células obtenido antes de la fijación, calcula el volumen del fijador de Carnoy necesario para volver a suspender el pellet a una concentración final de aproximadamente 5 × 106 células/mL. Tras la centrifugación, retira cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta, dejando el volumen calculado del fijador por encima del pellet.
  5. Resuspende las células fijas en el fijador de Carnoy usando una pipeta P1000.
  6. Transfiere aproximadamente 300 μL de la suspensión de celda fija a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
  7. Resuspende completamente la muestra usando una pipeta P200 pipeteando varias veces arriba y abajo.
  8. Aspirar 60 μL de las células resuspendidas usando una pipeta P200.
  9. Sujeta la punta de la pipeta aproximadamente a 1 m sobre la corredera de cristal sobre hielo y apunta al centro de la lámina.
  10. Dispensa lentamente una gota de la suspensión de celda sobre el corredero.
    NOTA: Marque la ubicación de la caída en el borde del portaobjetos con un marcador resistente al etanol para facilitar la identificación en los pasos siguientes.
  11. Deja que las células se sequen sobre hielo durante 10 minutos.
  12. Coloca los portaobjetos sobre una incubadora de portaobjetos a 80 °C durante 10 minutos.
  13. Quita las correderas con unas pinzas y déjalas enfriar al tacto.
  14. Examina las láminas con un microscopio de contraste de fase con un objetivo del 10× o 20×. Confirmar la presencia de múltiples extensiones metafásicas bien dispersas sin solapamientos excesivos.

4. Pretratar el deslizamiento

  1. Prepara tarros Coplin para los pasos de lavado
    1. Prepara cada reactivo fresco: 70% de ácido acético (40 mL), PBS (40 mL), PBS (45 mL), 70% de etanol (40 mL), 85% de etanol (40 mL) y 100% de etanol (40 mL).
  2. Coloca las láminas de vidrio en ácido acético al 70% durante 2 minutos.
  3. Coloca las láminas de vidrio en 40 mL de PBS durante 30 s.
  4. Coloca las láminas de vidrio en 45 mL de PBS durante 5 minutos.
  5. Deshidrata las llaves secuenciales en un 70%, 85% y 100% etanol durante 1 minuto cada uno.
  6. Seca los deslizamientos al aire en RT durante 10 minutos.

5. Prepara la sonda

NOTA: Este protocolo utiliza sondas de ADN-FISH específicas de locus disponibles comercialmente que hibridan en una región genómica de interés.

  1. Selecciona una sonda que apunte al locus amplificado que se va a examinar. Descongela la sonda y el buffer de hibridación según las instrucciones del fabricante. Deja que la sonda alcance el RT antes de usarla.
  2. Preparar una mezcla de sonda que contenga 1 μL de sonda y 4 μL de tampón de hibridación para cada lámina de vidrio.
    NOTA: La concentración óptima de la sonda puede depender del fabricante y de la sonda. La concentración aquí especificada ha sido optimizada según las sondas utilizadas en este estudio. Sin embargo, optimiza la concentración de la sonda para cada nuevo locus.
  3. Aplica 5 μL de la mezcla de sonda/hibridación en el centro de cada punto de gota en la lámina de vidrio.
    NOTA: Las sondas son fotosensibles. Minimiza la exposición a la luz durante el resto del procedimiento guardando las láminas en un cajón oscuro entre pasos y mientras se procesan otras láminas.
  4. Coloca cuidadosamente una cubierta sobre la muestra.
  5. Sella los bordes de la capa de cobertura con cemento de goma.
  6. Coloca los portacristales en una cámara húmeda.
  7. Hibrida la sonda según el protocolo del fabricante. Permitir que la hibridación avance durante la noche (12–18 h).

6. Lavados post-hibridación, contratinción, montaje e imágenes

  1. Prepara tarros Coplin para los pasos de lavado
    1. Preparar cada reactivo fresco: 2× SSC (40 mL), 0,4× SSC (40 mL), 70% etanol (40 mL), 85% etanol (40 mL), 100% etanol (40 mL) y PBS (45 mL).
    2. Prepara y almacena el SSC como solución de stock al 20× (3 M NaCl, 0,3 M citrato de sodio, pH 7,0). Para preparar 1 L, disuelva 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato de sodio en 1 L de agua ultrapura. Diluir la culata para preparar soluciones de trabajo de 2× SSC y 0,4× SSC según sea necesario.
  2. Calienta la solución de 0,4× SSC a 72 °C en un baño marea.
  3. Retira las láminas de vidrio de la cámara húmeda y retira cuidadosamente el cemento de goma.
  4. Coloca las correderas de vidrio en 2× SSC durante 2 minutos en RT. Retira cuidadosamente las cubiertas.
  5. Coloca las láminas de cristal en un SSC precalentado a 0,4× °C durante 2 minutos.
  6. Coloca las correderas de vidrio en 2× SSC durante 1 minuto en RT.
  7. Deshidrata las llaves secuenciales en un 70%, 85% y 100% etanol durante 1 minuto cada uno.
  8. Seca los deslizadores al aire en RT durante 10 minutos en la oscuridad.
  9. Diluye 1 mg/mL de DAPI 1:1000 en PBS hasta un volumen final de 1 mL.
    NOTA: Esta alicuela puede almacenarse a 4 °C durante hasta 1 semana.
  10. Pipete 10 μL del DAPI diluido en cada lámina de vidrio en la ubicación marcada de la caída.
  11. Coloca cuidadosamente una capa de cobertura sobre la muestra para asegurar que la solución DAPI se extienda de forma uniforme.
  12. Incuba las láminas en la oscuridad durante 5–10 minutos.
  13. Coloca las láminas de cristal en PBS durante 30 s.
  14. Quita las cubiertas.
  15. Coloca las láminas de vidrio en PBS durante 2 minutos.
  16. Deshidrata el vidrio sumergiéndolos brevemente en un 70%, 85% y 100% etanol durante aproximadamente 10 segundos cada uno.
  17. Seca los deslizadores al aire en RT durante 10 minutos en la oscuridad.
  18. Añade 15 μL de medio de montaje a cada portaobjetos de cristal y luego coloca una cubierta encima.
  19. Deja que el medio de montaje se extienda uniformemente y luego seca suavemente el exceso.
  20. Sella los bordes de la funda con esmalte de uñas.
  21. Deja que el esmalte de uñas seque durante 15 minutos en tiempo de descanso en la oscuridad.
    PAUSA: Guarda las láminas a 4 °C para su almacenamiento a largo plazo.
  22. Imagina las diapositivas.
    NOTA: Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de fluorescencia invertida con un objetivo de inmersión en óleo del 60×.
  23. Recoge múltiples pilas z para cada canal de fluorescencia para capturar la señal a lo largo de toda la profundidad de la dispersión de la metafase.
  24. Descompone las pilas de imágenes utilizando un algoritmo de estimación de máxima verosimilitud para mejorar la claridad de la señal y reducir la fluorescencia desenfocada.
  25. Procesa y analiza las imágenes finales en ImageJ, y selecciona el plano focal óptimo para cada dispersión de metafase antes del análisis aguas abajo.

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Resultados

Este protocolo (Figura 1B) proporciona cromosomas metafásicos limpios, bien dispersos e intactos, adecuados para análisis citogenético, con cromosomas y señales DNA-FISH claramente visibles mediante microscopía de fluorescencia. Utilizar un microscopio de campo brillante/contraste de fase a baja magnificación (10× o 20×) es un paso importante de control de calidad para verificar que los núcleos han reventado y los cromosomas se han dispersado (

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Discusión

A pesar de sus ventajas bien establecidas, las propagaciones de metafase ADN-FISH están infrautilizadas en la era de WGS. La organización física del ADN amplificado es funcionalmente significativa, ya que puede influir en el comportamiento biológico posterior y la respuestaterapéutica 61,62,63,64. Los oncogenes amplificados focalmente pueden existir en ECDNA o ...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por NIH R00HG011467 y CPRIT RR23004 a G.S.E. La imagen para este proyecto fue apoyada por el Núcleo Integrado de Microscopía en Baylor College of Medicine con financiación del NIH (P30 DK056338, P30 CA125123, S10OD030414). Los autores agradecen al Dr. Pawel Stankiewicz sus consejos desde el principio. Los autores también agradecen al Dr. Paul Mischel (Universidad de Stanford) por proporcionar las líneas celulares GBM39ec y GBM39hsr.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
15-mL conical centrifugecualquier fuenteNACentrifugación. 
15-mL conical tubescualquier fuenteNARecolección de células.
200 proof ethanolcualquier fuenteNAPasos de lavado. 
Ácido acético, glacial, 99.7%Millipore Sigma695092Pasos de fijación de Carnoy y lavado de diapositivas.
Antifade Mounting MediumFisherScientificNC9265087Montaje de diapositivas después de la preparación completa de la diapositiva
Gabinete de seguridad biológica con salida de vacíocualquier fuenteNAAlmacenamiento de productos químicos.
Colcemid (N-metil-N-deacetil-colquicina)Millipore Sigma10295892001Se une a la tubulina, detiene las células en metafase.
Botes Coplincualquier fuenteNAPasos de lavado. 
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol)Milipore SigmaD8417-1MGTinte fluorescente de ADN.
Sonda FISH EGFR/CON7 Empire GenomicsEGFR-CHR07Sonda fluorescente específica de locus. 
Cimentación de goma Elmer'scualquier fuenteNAMantiene la cubierta del portaobjetos en su lugar durante la hibridación de sondas durante la noche.
Marcador permanente resistente al etanolcualquier fuenteNAEtiquetado de diapositivas.
Microscopio fluorescentecualquier fuenteNAImagen de diapositivas. 
Portaobjetos de vidrio, 22 x 22mmThermoFisher50-143-780Hibridación de sondas en diapositivas.
Diapositiva de vidrio, prelimpiaVWR48311-703Para dejar caer las extensiones de metafase y realizar DNA-FISH.
Incubadora de CO2 humidificadacualquier fuenteNAIncubación de células vivas.
Buffer de hibridaciónEmpire GenomicsHyb-BufferBuffer utilizado con la sonda. 
Cubito de hielocualquier fuenteNAMantener frío el fijativo de Carnoy. 
KCl (2M)ThermoFisherAM9640GHinchazón de células antes de la fijación. 
Metanol, 99.9%, grado HPLCMillipore Sigma1060351000Para fijativo de Carnoy. 
Microcentrifugadoracualquier fuenteNACentrifugación. 
Tubos de microcentrifugadoracualquier fuenteNAPara células durante la fijación y para la preparación de sondas. 
Sonda MYC / SE 8LeicaKI-10106Sonda fluorescente específica de locus. 
PBS, pH 7.4Gibco10010-023Pasos de lavado. 
Microscopio de contraste de fasecualquier fuenteNAImágenes de extensiones de metafase inmediatamente después de soltar
Puntas de pipetacualquier fuenteNAPipetado.
Cloruro de sodioMillipore SigmaS9888Para el buffer SSC.
Citrato de sodioMillipore Sigma567446Para el buffer SSC.
Agua ultrapura estérilcualquier fuenteNAPasos de lavado. 
Incubadora de diapositivas programable ThermoBritecualquier fuenteNAIncubación de diapositivas.
Pinzascualquier fuenteNAPara pasos de lavado de diapositivas. 
Baño de aguacualquier fuenteNAPara la incubación de KCl. 

Referencias

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La metafase ADN-FISH se extiende para distinguir el ADN extracromosómico de regiones que tiñen homogéneamente en líneas celulares de cáncer humano
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