La extracción de sangre de la arteria de la cola en ratas bajo anestesia con isoflurano permite la recolección controlada de volúmenes de sangre relativamente grandes con bajo estrés. La recuperación rápida y la idoneidad para muestreos repetidos hacen de este método el ideal para estudios longitudinales que requieran parámetros fisiológicos confiables.
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El muestreo de sangre de la arteria caudal en ratas anestesiadas con isoflurano reduce el estrés y mejora la fiabilidad
En este artículo
Resumen
Resumen
Este método describe la toma de muestras de sangre mediante la arteria de la cola en ratas anestesiadas con isoflurano. El uso de isoflurano minimiza los movimientos defensivos, permitiendo así un procedimiento controlado y de bajo estrés tanto para el animal como para el investigador. Otras ventajas incluyen la recuperación rápida de los animales tras la extracción debido a la acción de corta duración del isoflurano, la posibilidad de obtener volúmenes de sangre relativamente grandes a partir de un único sitio de punción y la adecuación de la técnica para tomas de sangre repetidas. Además, el flujo sanguíneo arterial rápido podría reducir la probabilidad de artefactos por coagulación, aunque esto no fue evaluado específicamente en el presente estudio. Los resultados se determinaron como parte de un estudio farmacocinético. La recolección de sangre fue exitosa en todos los animales, lo que resultó en una tasa de éxito del 100 %. No se observó pérdida significativa de peso corporal 24 h después de la toma de sangre, y los animales mostraron una recuperación rápida sin signos visibles de malestar ni complicaciones relacionadas con el procedimiento. En general, este enfoque es altamente adecuado para entornos experimentales que requieren una recolección de sangre confiable y reproducible con un estrés mínimo por manipulación. Tras una breve fase de aprendizaje, el procedimiento demostró ser confiable para uso experimental rutinario. Sin embargo, se debe considerar la posible influencia de la anestesia con isoflurano sobre los parámetros de gases sanguíneos, metabólicos y endocrinos al planificar experimentos e interpretar los resultados.
Introducción
El muestreo de sangre es una técnica clave en la investigación experimental con ratas para evaluar parámetros fisiológicos y farmacocinéticos. Las técnicas recomendadas incluyen incisión de la cola, muestreo de la vena lateral de la cola, vena safena, vena sublingual, vena yugular y seno retroorbital, así como la cateterización1,2,3,4,5,6,7. Sin embargo, la elección del método depende de los resultados deseados, y cada uno tiene limitaciones inherentes.
El muestreo de la vena caudal lateral y la incisión de la cola pueden proporcionar volúmenes limitados, mientras que el muestreo retroorbital, aunque eficiente, es más invasivo, afecta la recuperación1 y conlleva riesgos de daño tisular4,8 y preocupaciones éticas. El muestreo de la vena safena requiere inmovilización y afeitado del sitio de punción2, lo cual puede inducir estrés y afectar los resultados experimentales. Además, extracciones repetidas de sangre de la vena safena pueden ser difíciles debido a la corta longitud de la vena y a la hemostasia. Lo mismo ocurre con la vena sublingual. Aunque se pueden obtener grandes volúmenes de sangre rápidamente mediante punción de la vena yugular, existe el riesgo de lesión pulmonar que puede provocar neumotórax. Asimismo, dado que la vena no es visible, la punción debe realizarse a ciegas6.
En este contexto, los métodos perfeccionados que minimizan el sufrimiento animal al tiempo que garantizan una buena calidad de la muestra están volviéndose cada vez más importantes. La toma de muestras de sangre de la arteria caudal bajo anestesia con isoflurano ofrece un enfoque de este tipo. El uso de anestesia inhalatoria de acción breve reduce el estrés por manipulación y facilita un procedimiento controlado. Además, se espera que la recolección de sangre arterial proporcione muestras de sangre de buena calidad con un riesgo reducido de artefactos por coagulación debido al flujo sanguíneo rápido. La técnica es particularmente adecuada para muestreos repetidos y diseños de estudios longitudinales, ya que los animales se recuperan rápidamente y la alteración fisiológica se minimiza. En conjunto, este método combina fiabilidad técnica con una mejora del bienestar animal y, por lo tanto, es muy adecuado para entornos experimentales que requieren mediciones sanguíneas precisas y reproducibles.
Protocolo
Todos los experimentos que involucran el método presentado fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Viena y por el Ministerio austríaco de Educación, Ciencia e Investigación.
1. Preparación
NOTA: Prepare todos los materiales necesarios antes de la anestesia para garantizar un procedimiento fluido y eficiente.
- Llene la jeringa con citrato al 3,2% (la cantidad depende de los parámetros deseados) para prevenir la coagulación de la sangre.
- Establezca el flujo de oxígeno en 0,5 L/min, dirigiéndolo hacia la cámara de inducción y la mascarilla.
- Ocluya la manguera conectada a la mascarilla para asegurar que el gas de inducción y el oxígeno se dirijan exclusivamente hacia la cámara.
- Retire la rata de la jaula y colóquela en la cámara de inducción.
- Cierre la tapa de la cámara de inducción, asegurándose de que la cola o las patas de la rata no queden atrapadas.
- Establezca el isoflurano en 3% (según el sistema de mangueras) y manténgalo hasta que el animal muestre pérdida del movimiento espontáneo y del reflejo de enderezamiento.
- Mueva suavemente la cámara hacia adelante y hacia atrás para confirmar la pérdida del reflejo de enderezamiento.
- Ocluya la manguera conectada a la caja para redirigir el gas y el oxígeno hacia la mascarilla.
- Abra la tapa de la cámara y retire la rata.
- Coloque la rata en posición supina sobre la almohadilla calefactora (38 °C), con la nariz colocada en la mascarilla (Figura 1).
- Limpie la cola con agua y séquela con papel absorbente.
- Desinfecte la cola con alcohol.
- Confirme la ausencia del reflejo interdigital pellizcando entre los dedos de la extremidad trasera de la rata y verificando la falta de respuesta de retirada.
Figura 1: Posición de la rata. La rata se coloca boca arriba con la nariz dentro de la máscara de anestesia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Muestreo de sangre
NOTA: La arteria se encuentra en el lado ventral de la cola. El sitio óptimo de punción se localiza entre la parte media y la distal de la cola. La arteria se identifica principalmente por su posición anatómica, pero en ratas con pigmentación clara (por ejemplo, Sprague Dawley), la arteria ventral de la cola ocasionalmente puede ser visible como un vaso de color azulado tenue. En este caso, la arteria ventral de la cola generalmente puede identificarse fácilmente en la base de la cola por su posición anatómica en la línea media ventral. Una vez identificada, puede seguirse su trayecto en dirección distal hasta el sitio de punción previsto.
- Siga la arteria desde proximal hasta distal.
- Oriente la bisel de la aguja hacia arriba.
- Introduzca la aguja en un ángulo de aproximadamente 30 ° (Figura 2).
- Avance la aguja cranealmente y luego paralelo a la cola (Figura 2).
- Extraiga sangre en la jeringa (Figura 2).
NOTA: Si la aguja puede avanzarse fácilmente, retire el volumen requerido de sangre de acuerdo con las directrices aplicables. Si la presión arterial es demasiado baja para la muestra, reduzca la concentración de isoflurano al 2,5 % y repita el procedimiento sin retirar la aguja del sitio de punción. Para cada extracción subsiguiente de sangre, el sitio de punción debe ubicarse cranealmente respecto al sitio anterior. - Use una torunda para presionar el sitio de inyección antes de retirar la aguja.
- Apague la anestesia gaseosa y revise el sitio de inserción.
NOTA: Una vez que haya cesado el sangrado, devuelva la rata a su jaula de origen.
Figura 2: Sitio de punción. El sitio de punción se encuentra ventralmente entre el tercio medio y el tercio distal de la cola, y la aguja debe insertarse con un ángulo de 30°. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Procesamiento de la sangre
- Vierta la sangre recolectada en un tubo.
- Guarde la sangre en hielo hasta la centrifugación.
Resultados
Los datos presentados en este artículo metodológico se obtuvieron durante un estudio farmacocinético. Solo se incluyeron ratas macho Sprague Dawley de 6 a 8 semanas de edad, con un peso corporal comprendido entre 393 g y 429 g. Se recogió una única muestra de sangre (0,3 mL) de la arteria de la cola el día 0. El peso corporal se registró inmediatamente antes de la recogida de sangre y nuevamente 24 h después de la extracción. El gas anestésico fue rápidamente exhalado, y los animales se recuperaron con rapidez. Poco después, comenzaron a alimentarse y no mostraron signos de deterioro en su bienestar general. Las ratas no presentaron signos de estrés ni de miedo al ser retiradas de la jaula para posteriores extracciones de sangre. Asimismo, no se observó comportamiento defensivo en los días posteriores al procedimiento. No hubo hematomas visibles en la cola cuando el procedimiento se realizó correctamente. Los animales no mostraron signos de dolor ni inmediatamente después de la extracción de sangre ni en los días siguientes, y los sitios de extracción en sus colas tampoco eran dolorosos al tacto. No se observó pérdida de peso corporal dentro de las 24 h posteriores a la recogida de sangre. El peso corporal medio aumentó de 409 g el día 0 a 419 g el día 1, lo que corresponde a una ganancia media de peso corporal del 2,6% ± 1,1%, lo que sugiere que el procedimiento de muestreo de sangre fue bien tolerado (Figura 3).
Figura 3: Cambio de peso corporal. Peso corporal (g) antes (d0) y 24 h después (d1) de la extracción de sangre en ratas (n = 12). No se observó pérdida de peso corporal tras la recolección de sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
La técnica de muestreo de sangre presentada en la arteria de la cola es particularmente adecuada para estudios que requieren muestreos sanguíneos repetidos o volúmenes comparativamente grandes de muestra de sangre. En comparación con el muestreo de la vena de la cola, esta técnica facilita la recolección de mayores volúmenes de sangre a partir de un único sitio de punción y puede ofrecer ventajas prácticas para muestreos repetidos, ya que la punción venosa repetida puede volverse más difícil debido a la formación de hematomas y la reducida accesibilidad de las venas. De acuerdo con las recomendaciones de Die Gesellschaft für Versuchstierkunde / Sociedad de Ciencias de Animales de Laboratorio (GV-SOLAS) y la Federación de Asociaciones Europeas de Ciencias de Animales de Laboratorio (FELASA), una única recolección de sangre no debe exceder el 10 % del volumen sanguíneo circulante, mientras que los muestreos repetidos diarios deben limitarse a aproximadamente el 1 % del volumen sanguíneo circulante por cada 24 h, seguidos de un periodo de recuperación adecuado. La técnica descrita permite obtener estos volúmenes de muestreo recomendados de manera confiable y reproducible, lo que la hace adecuada tanto para protocolos de recolección única como repetida de sangre.
Una técnica ideal de recolección de sangre debería proporcionar volúmenes suficientes de sangre para los análisis previstos, al mismo tiempo que minimiza el estrés del procedimiento y garantiza muestras de alta calidad. La recolección de sangre del plexo venoso retroorbital y de la vena sublingual puede provocar problemas de coagulación debido al traumatismo tisular8,9, lo cual sería subóptimo para estudios de coagulación. De forma similar, las técnicas por goteo, como "ordeñar" la vena de la cola, también podrían provocar coagulación inducida por el muestreo. En comparación con estos métodos de muestreo, la sangre arterial obtenida a través de la cola parece menos propensa a la coagulación prematura. Esto podría atribuirse al proceso rápido de recolección, a la ausencia de traumatismo tisular y al contacto inmediato de la sangre con citrato en la jeringa, lo cual previene eficazmente la coagulación. Otras técnicas, como la punción de la vena yugular, conllevan riesgo de daño orgánico1,6, y los procedimientos de cateterización recomendados requieren anestesia general, seguidos de cuidados posoperatorios y manejo de heridas. Es necesario realizar lavados regulares del catéter para prevenir obstrucciones, y siempre existe el riesgo de que los animales se retiren el catéter.
La recolección de sangre de la arteria caudal requiere una breve sedación, ya que los animales deben colocarse en posición supina y la punción es dolorosa, lo que hace probable la aparición de movimientos defensivos. El uso de anestesia con isoflurano minimiza los movimientos defensivos, permitiendo que el procedimiento se realice de manera controlada y eficiente. Como resultado, la extracción de sangre puede completarse rápidamente, reduciendo la carga total sobre el animal en comparación con las técnicas de punción venosa en la vena de la cola, en las que puede tardarse más tiempo en obtener la cantidad deseada de sangre. La ausencia de movimientos defensivos también disminuye la probabilidad de múltiples punciones con la aguja. Es importante destacar que los animales no perciben conscientemente el procedimiento, se recuperan rápidamente y generalmente retoman su comportamiento normal poco después de la toma de muestra1. Tras la recolección de sangre, los animales se recuperaron rápidamente de la anestesia con isoflurano y normalmente reanudaron su comportamiento habitual poco después. En el presente estudio, el peso corporal medido 24 h después de la extracción de sangre mostró un ligero aumento en comparación con los valores basales, lo que sugiere que la ingesta de alimento no se vio afectada negativamente por el procedimiento y apoya una recuperación a corto plazo sin complicaciones.
Se sabe que el isoflurano reduce la presión arterial10,11, lo cual puede complicar la toma de muestras de sangre venosa debido a una menor llenado venoso. En contraste, realizar el muestreo venoso sin anestesia requiere inmovilización1,2, lo que puede inducir un estrés significativo y potencialmente afectar los resultados experimentales. Además, el estrés provoca vasoconstricción, lo cual también puede dificultar la recolección de sangre. La presión arterial reducida también puede afectar el muestreo arterial; sin embargo, en nuestra experiencia, este problema puede gestionarse fácilmente ajustando la concentración de isoflurano, manteniendo así un flujo sanguíneo suficiente para la toma de muestras.
Sin embargo, se sabe que el isoflurano también influye en los parámetros fisiológicos, particularmente en los valores de los gases sanguíneos, debido a la depresión respiratoria12,13. El isoflurano puede afectar la función respiratoria y el intercambio de gases, alterando potencialmente los niveles arteriales de oxígeno y dióxido de carbono. Varios estudios han demostrado que el isoflurano también puede modificar parámetros metabólicos y endocrinos, incluyendo la glucosa sanguínea, el lactato, la insulina, la corticosterona y el metabolismo de lípidos14,15,16. No obstante, se ha demostrado que el isoflurano induce menos alteraciones en parámetros relacionados con el estrés que varios otros regímenes anestésicos y ofrece las ventajas de una inducción rápida, un tiempo corto de recuperación y un control preciso de la profundidad anestésica, lo que lo hace especialmente adecuado para procedimientos rutinarios de muestreo sanguíneo14. En consecuencia, se debe considerar la posible influencia del isoflurano al planificar e interpretar experimentos, ya que las muestras de sangre arterial obtenidas bajo anestesia podrían no reflejar con precisión las condiciones fisiológicas basales. Sin embargo, en estudios farmacocinéticos, estos efectos suelen tener una relevancia menor en comparación con los beneficios de obtener muestras sanguíneas reproducibles mientras se minimiza el estrés relacionado con la manipulación.
Una consideración adicional es la exposición laboral del experimentador al isoflurano. Dado que el sistema no es completamente cerrado, existe un riesgo de exposición al gas anestésico durante el procedimiento. Trabajar bajo una campana de flujo laminar o con sistemas de captación adecuados minimizaría la exposición, pero este tipo de equipo puede no estar disponible en todos los entornos experimentales.
En general, la técnica descrita representa una alternativa valiosa frente a los métodos convencionales de muestreo sanguíneo, combinando una calidad esperada del muestreo adecuada con menor estrés y condiciones de manejo mejoradas. Proporciona beneficios evidentes en términos de bienestar animal y eficiencia del procedimiento. Su idoneidad depende finalmente de la pregunta de investigación específica, pero resulta particularmente ventajosa en entornos experimentales donde son esenciales parámetros sanguíneos confiables y una perturbación fisiológica mínima.
Divulgaciones
El autor no tiene conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
El autor agradecería agradecer Katharina Tillmann por inspirarla a publicar este método.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema de anestesia | Dräger | https://www.draeger.com/en-us_us/Productfinder/Anaesthesia/Anaesthesia-Machines#products | Anestesia gaseosa |
| Vacuete con citrato (citrato sódico al 3,2 %) | Greiner Bio-One | 454332 | Anticoagulantes |
| Tubo Eppendorf de 1,5 mL | Eppendorf | 3,01,25,150 | Almacenamiento de sangre |
| Isóflurano líquido (Isospire) | Dechra | Anestesia gaseosa | |
| Aguja (25 G ´ 5/8'') | BD Microlance | 300600 | Muestreo de sangre |
| Jeringa de 1 mL (Luer tuberculina) | Chirana | CHTUB01 | Muestreo de sangre |
| Thermomaquet 2000 | Maquet | Thermomaquet 2000 | Sistema de calentamiento |
| Compresas de celulosa Zelletten de 5 cm ´ 4 cm | Lohmann&Rauscher | Hemostasia |
Referencias
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