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Artículo de método

Fuerza y Duración de la Señal del TCR en la Activación y Diferenciación de Linfocitos T CD8+ Primarios de Ratón: Un Enfoque Estandarizado In Vitro

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DOI:

10.3791/71979

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25 de agosto de 2026

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1Guangdong Province Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 2Institute of Immunology, Third Military Medical University, 3Institute for Immunology and Pathogenesis, College of Basic Medicine, Chongqing Medical University, 4Center for Immune Ageing and Rejuvenation, Department of Rheumatology and Immunology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un método sistemático para activar linfocitos T CD8+ vírgenes primarios de ratón mediante un enfoque de estimulación graduada del TCR, lo que permite un análisis exhaustivo de la proliferación, activación y producción de citoquinas de los linfocitos T CD8+ en diferentes intensidades de señal del TCR.

Resumen

La intensidad y duración de la señal del receptor de células T (TCR) son determinantes críticos de la activación, proliferación y diferenciación funcional de las células T CD8⁺. Sin embargo, los modelos estandarizados in vitro que comparen sistemáticamente cómo distintas señales del TCR moldean el destino de las células T siguen siendo limitados. Este estudio presenta un método reproducible para activar células T primarias de ratón in vitro mediante anti-CD3 inmovilizado en placa y anti-CD28 soluble, suplementado con interleucina-2 (IL-2), y examina cómo la modulación de la concentración de anti-CD3 (fuerza de la señal) y el tiempo de estimulación (duración de la señal) influye en los resultados de activación de las células T. Describimos un protocolo para el aislamiento de células T naïve de ratones C57BL/6, seguido de estimulación en un rango de concentraciones de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) y tiempos (6–48 h). Realizamos análisis por citometría de flujo para evaluar la señalización temprana inducida por el TCR mediante la proteína ribosomal S6 fosforilada intracelular (p-S6) como indicador de la actividad del complejo 1 del blanco mecanicista de la rapamicina (mTORC1), y posteriormente evaluamos eventos descendentes, incluyendo marcadores de superficie de activación (CD69, CD25, ICOS, PD-1), proliferación celular mediante la dilución del colorante violeta de rastreo de proliferación (CTV) y expresión de moléculas efectoras (Granzima B, TNF-α) como indicadores de diferenciación funcional. El método proporciona una guía visual clara y paso a paso para realizar estimulaciones reproducibles de células T, permitiendo a los investigadores desentrañar cómo parámetros específicos de la señal del TCR dirigen las decisiones de destino celular. Este enfoque no solo apoya estudios mecanicistas de la activación y diferenciación de células T, sino que también ofrece una plataforma para optimizar el acondicionamiento de células T en inmunoterapia adoptiva y ensayos de sensibilización in vitro. Al integrar una demostración en video con una narración detallada del protocolo, este procedimiento mejorará la transparencia y reproducibilidad metodológica en la investigación de inmunología de células T.

Introducción

Los linfocitos T son indispensables para las respuestas inmunitarias protectoras contra patógenos y tumores. Los linfocitos T naïve se mantienen activamente en un estado de quiescencia para preservar su supervivencia y persistencia a largo plazo1. Tras la estimulación antigénica, los linfocitos T salen de la quiescencia, experimentan expansión clonal y diferenciación efectora2. La señalización a través del receptor de linfocitos T (TCR) constituye el proceso fundamental para iniciar y regular las respuestas inmunitarias adaptativas3. Tras el reconocimiento específico de moléculas de péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) presentadas en la superficie de células presentadoras de antígenos (APC), se desencadena una cascada de eventos de señalización, impulsando así la expansión clonal y la diferenciación funcional de los linfocitos T4,5,6.

La intensidad de la estimulación del TCR, determinada por factores clave como la afinidad, la avidez y la concentración del antígeno, desempeña un papel fundamental en regular la magnitud de la activación de los linfocitos T, la adquisición de funciones efectoras y la trayectoria de diferenciación hacia subconjuntos distintos de linfocitos T efectoras o de memoria7,8,9. Los modelos actuales in vitro para investigar la activación de linfocitos T dependiente del TCR emplean predominantemente anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a placas o a microesferas, que proporcionan simultáneamente la ligación del TCR y señales coestimuladoras10,11. Aunque dichos sistemas se utilizan ampliamente, normalmente emplean solo una concentración única, a menudo saturante, de anticuerpo anti-CD3, lo que permite únicamente una comparación binaria de todo o nada de la activación de los linfocitos T, en lugar de captar el rango dinámico de intensidades de señal del TCR que se pueden lograr con un gradiente titulado de estímulos12,13.

El protocolo descrito aquí proporciona un sistema estandarizado y reproducible in vitro para evaluar sistemáticamente cómo diferentes intensidades del señal del TCR modulan la activación, proliferación y fenotipos funcionales de linfocitos T CD8+ primarios de ratón, utilizando gradientes titulados de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) y una concentración constante de anti-CD28 (1 µg/mL). Este enfoque se centra en la citometría de flujo multiparamétrica que permite capturar tanto la señalización temprana —mediante la proteína ribosomal S6 fosforilada intracelular (p-S6) como indicador de la actividad del complejo 1 del blanco mecanicista de la rapamicina (mTORC1)— como los resultados celulares tardíos, incluyendo la proliferación rastreada por la dilución de CTV, marcadores de superficie de activación (CD69, CD25, costimulador inducible de linfocitos T [ICOS], proteína 1 de muerte celular programada [PD-1]) y la expresión de moléculas efectoras (granzima B, factor de necrosis tumoral alfa [TNF-α]), durante un periodo de tiempo comprendido entre 6 y 48 h.

Nuestro protocolo emplea un gradiente de concentración de anticuerpos anti-CD3 inmovilizados en placa para modular con precisión la intensidad de la estimulación, imitando así la avidez diferencial de unión del TCR observada en condiciones fisiológicas. El método logra una alta eficiencia en el entrecruzamiento del TCR y una activación robusta de linfocitos T primarios en reposo. El procedimiento estandarizado de recubrimiento asegura una distribución uniforme de los anticuerpos sobre la superficie de la placa, lo que da lugar a una estimulación consistente entre las células dentro del mismo lote y una excelente reproducibilidad experimental. Este formato proporciona un enfoque rentable y operativamente sencillo para la activación de linfocitos T.

Sin embargo, deben reconocerse ciertas limitaciones de este enfoque. La estimulación mediada por anticuerpos anti-CD3/CD28 difiere notablemente del contexto fisiológico in vivo. Aunque los métodos experimentales que utilizan únicamente anticuerpos agonistas anti-CD3 y anti-CD28 para evaluar la activación de linfocitos T pueden proporcionar lecturas efectivas de la activación, no logran reproducir completamente las interacciones entre las células presentadoras de antígenos y los linfocitos T, así como el microambiente coestimulador que ocurre bajo condiciones fisiológicas14.

A pesar de estas limitaciones, este protocolo ofrece una plataforma sistemática y reproducible que sirve como una herramienta valiosa y accesible para investigar las respuestas de las células T dependientes de la intensidad de la señal del TCR y puede complementar modelos más complejos específicos del antígeno.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Militar Médica Tercera.

1. Preparación de reactivos y placas

  1. Preparar anti-CD3 unido a placa en PBS estéril a 0,1, 0,5, 1, 5 y 10 µg/mL.
  2. Añadir 50 µL de la solución de recubrimiento de anti-CD3 por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano.
  3. Sellar las placas con película adhesiva e incubar durante la noche a 4 °C.
  4. Aspirar la solución de recubrimiento y lavar cada pocillo dos veces con 200 µL de PBS estéril antes de añadir las células.

2. Aislamiento de linfocitos T CD8+ naïve del bazo de ratón

  1. Seleccione ratones macho C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (adquiridos de Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) y sacrifíquelos mediante inhalación de CO2 seguida de dislocación cervical. Los ratones se mantienen en condiciones libres de patógenos específicos, con un ciclo de 12 h de luz/oscuridad y acceso libre a alimento y agua. Se utilizan al menos 3 ratones por experimento independiente.
  2. Realice una incisión cuidadosa en el peritoneo con tijeras quirúrgicas para exponer el bazo, sujételo y extraiga el bazo usando pinzas, y colóquelo en un recipiente de recolección que contenga RPMI 1640 preenfriado suplementado con 2% de suero bovino fetal (FBS) (R2). Mantenga el recipiente en hielo hasta la disociación.
    NOTA: Recolecte todos los cadáveres animales y residuos de cultivo celular en bolsas de bioseguridad designadas y autoclave a 121 °C durante 20 min antes de desecharlos.
  3. Retire el bazo del recipiente de recolección y transfiéralo a una placa de 60 mm que contenga 3 mL de tampón de lisis 1 × de cloruro de amonio-potasio (ACK).
  4. Prepare una suspensión de células individuales machacando suavemente el bazo a través de un filtro celular de 70 µm utilizando el émbolo de una jeringa de 3 mL.
  5. Incube la suspensión durante 1 min a temperatura ambiente (RT), luego agregue 3 mL de medio R2 preenfriado para neutralizar el tampón de lisis de cloruro de amonio-potasio (ACK).
  6. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL y centrifugue a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
  7. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 10 mL de tampón de tinción para citometría de flujo (PBS con 2% de FBS).
  8. Filtre la suspensión a través de un filtro celular de 70 µm hacia un tubo cónico nuevo de 15 mL, luego centrifugue nuevamente a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: Se debe omitir el azida sódico del tampón de tinción para citometría de flujo para preservar la viabilidad celular en ensayos funcionales. Todas las muestras deben mantenerse a 4 °C y analizarse inmediatamente.
  9. Aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 200 µL de una mezcla de anticuerpos biotinilados por bazo de ratón (que contiene anti-CD16/32 (bloqueo Fc), anti-TER-119, anti-CD19, anti-CD4, anti-B220, anti-NK1.1, anti-Ly-6G, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD49b, anti-CD44 y anti-F4/80).
  10. Incube en hielo durante 25 min, invirtiendo suavemente el tubo cada 5 min para asegurar una mezcla completa.
  11. Lave las células con un volumen grande de tampón de tinción para citometría de flujo, centrifugue a 500 × g durante 5 min y deseche el sobrenadante.
  12. Resuspenda el sedimento en el mismo volumen de tampón de tinción para citometría de flujo utilizado para la mezcla de anticuerpos biotinilados, agregue perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina a la mitad de ese volumen e incube en hielo durante 15 min, invirtiendo suavemente el tubo cada 5 min para asegurar una mezcla completa.
  13. Centrifugue brevemente el tubo, colóquelo en un soporte magnético durante 2–3 min y transfiera cuidadosamente el sobrenadante (células T CD8+ naïve enriquecidas) a un tubo cónico nuevo de 15 mL.
  14. Lave las células recolectadas una vez con tampón de tinción para citometría de flujo y centrifugue nuevamente a 500 × g durante 5 min.
  15. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS (R10) para aplicaciones posteriores.

3. Marcado con colorante violeta de seguimiento de proliferación (CTV) para el seguimiento de la proliferación

  1. Prepare una solución de trabajo de CTV 2 × (10 µM) fresca inmediatamente antes de usar. Mezcle completamente la solución stock de CTV 5 mM (en dimetilsulfóxido [DMSO]) mediante vortex y dilúyala adicionalmente con PBS estéril para obtener una concentración final de 10 µM.
    ADVERTENCIA: Manipule la solución stock de CTV (preparada en DMSO) con guantes de nitrilo en una campana extractora, ya que el DMSO facilita la absorción cutánea de compuestos tóxicos. Evite la inhalación y el contacto con la piel.
  2. Reuspenda la mitad de los linfocitos T CD8+ vírgenes aislados en PBS preenfriado a una densidad de 8 × 107 células/mL.
  3. Añada rápidamente un volumen igual de la solución de trabajo de CTV 2 × (10 µM) a la suspensión celular y mezcle bien mediante pipeteo, obteniendo una concentración final de CTV de 5 µM.
  4. Incube las células a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 min, invirtiendo suavemente los tubos cada 5 min para asegurar una mezcla completa.
  5. Añada 5 volúmenes de medio de cultivo (que contenga al menos 10 % de suero bovino fetal [FBS]) a las células e incube durante 5 min en hielo para eliminar cualquier colorante libre.
  6. Centrifugue las células a 500 × g durante 5 min y re suspenda el sedimento en medio completo R10 recién precalentado, suplementado con anti-CD28 (concentración final: 1 µg/mL) e IL-2 (concentración final: 10 ng/mL).
  7. Añada 250 µL de suspensión celular (que contenga 6 × 105 células) a cada pocillo de las placas de 96 pocillos previamente recubiertas.
  8. Cultive las células a 37 °C con 5 % de CO₂ durante hasta 48 h.

4. Detección de CTV mediante citometría de flujo

  1. Recoger las células en una placa de 96 pocillos con fondo redondo a las 6, 36 y 48 h. Centrifugar a 500 × g durante 5 min y lavar dos veces con tampón de tinción para citometría de flujo.
  2. Para la tinción de superficie, incubar las células con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anti-CD8, colorante fijable de viabilidad y anti-CD44 durante 30 min en hielo a oscuras.
    NOTA: Recoger todos los sobrenadantes que contengan anticuerpos conjugados con fluorocromos en recipientes designados para desechos, suplementados con hipoclorito de sodio al 0,5% para descontaminación, y desecharlos según los protocolos institucionales para residuos biopeligrosos.
  3. Lavar las células dos veces con tampón de tinción para citometría de flujo y resuspender en 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo para la adquisición en citómetro de flujo.
  4. Adquirir las muestras en un citómetro de flujo equipado con tres láseres. Preparar tubos de control monocromáticos utilizando células marcadas para establecer los parámetros de compensación.
  5. Aplicar la siguiente estrategia de selección: excluir los detritos mediante la selección por dispersión directa (FSC) frente a dispersión lateral (SSC), eliminar los dobletes mediante la selección de células simples y seleccionar las células T CD8+ viables (negativas para el colorante fijable de viabilidad) para el análisis.
  6. Recoger al menos 1 × 104 eventos de células T CD8+ seleccionadas por muestra. Analizar los datos utilizando el software de análisis de citometría de flujo y calcular la proporción de células que han experimentado una o más divisiones mediante el módulo de análisis de proliferación.

5. Tinción de superficie e intracelular para activación y señalización

  1. Re-suspender la otra mitad de linfocitos T CD8+ vírgenes en R10 suplementado con anti-CD28 a 1 µg/mL e IL-2 a 10 ng/mL a una concentración de 2,4 × 106 células/mL.
  2. Añadir 250 µL de suspensión celular (6 × 105 células) a cada pocillo de las placas de 96 pocillos previamente recubiertas.
  3. Cultivar las células a 37 °C con 5 % de CO₂ durante un máximo de 48 h.
  4. En los puntos de tiempo indicados (6, 10, 12, 24 y 36 h), recolectar las células en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
    NOTA: A las 6 h se captura la señalización temprana del TCR (p-S6) y CD69; este último se evalúa adicionalmente a las 12, 24 y 36 h para capturar su cinética completa. CD25, PD-1 e ICOS se monitorean a las 10, 12, 24 y 36 h; el punto de tiempo a las 48 h se reserva para la proliferación (Sección 4) y la detección de citoquinas (Sección 6).
  5. Centrifugar a 500 × g durante 1 min y re-suspender el sedimento celular en 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo.
  6. Centrifugar a 500 × g durante 1 min y aspirar el sobrenadante. Lavar las células dos veces con 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo.
  7. Para la tinción de superficie, incubar las células con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anti-CD69, anti-CD25, anti-CD8, anti-PD-1, anti-ICOS y un colorante vital fijable durante 30 min en hielo y a oscuras.
  8. Lavar las células tres veces con tampón de tinción para citometría de flujo para eliminar los anticuerpos no unidos.
  9. Re-suspender el sedimento celular en 200 µL de paraformaldehído al 1 % y fijar las células a temperatura ambiente (RT) a oscuras durante 15 min.
    ADVERTENCIA: Realizar todos los pasos que involucren paraformaldehído en una campana extractora para evitar la inhalación de vapores. Recoger todos los residuos líquidos que contengan fijador en un recipiente aparte marcado para eliminación de desechos químicos peligrosos.
  10. Centrifugar a 500 × g durante 1 min y lavar una vez con tampón de tinción para citometría de flujo.
  11. Pre-calentar el tampón lisis/fijación 5 × a temperatura ambiente y preparar una solución de trabajo 1 × con agua destilada.
  12. Añadir 200 µL de la solución de trabajo (tampón lisis/fijación 1 ×) a cada pocillo e incubar las células a temperatura ambiente a oscuras durante 30 min.
  13. Lavar dos veces con tampón de permeabilización/lavado 1 × para tinción de epítopos fosforilados. Re-suspender el sedimento en tampón de permeabilización/lavado 1 × para tinción de epítopos fosforilados e incubar a temperatura ambiente a oscuras durante 10 min.
  14. Centrifugar a 500 × g durante 1 min y desechar los sobrenadantes.
  15. Para la tinción intracelular, incubar las células con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anti-p-S6 durante 60 min a temperatura ambiente a oscuras.
  16. Lavar las células tres veces con tampón de permeabilización/lavado 1 × para tinción de epítopos fosforilados.
  17. Para la tinción con anticuerpo secundario, incubar las células con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anticuerpo secundario anti-conejo durante 30 min en hielo y a oscuras.
  18. Lavar las células tres veces con tampón de permeabilización/lavado 1 × para tinción de epítopos fosforilados y una vez con tampón de tinción para citometría de flujo.
  19. Re-suspender el sedimento celular en 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo y adquirir las muestras en el mismo citómetro de flujo.
  20. Aplicar la misma estrategia de selección de eventos descrita en la Sección 4.5 y recolectar al menos 1 × 104 linfocitos T CD8+ por muestra.
  21. Analizar la intensidad media de fluorescencia (MFI) de cada marcador mediante software de análisis de citometría de flujo.

6. Bloqueo y detección de citoquinas intracelulares

  1. 5 h antes de la recolección, añada 100 µL por pocillo de R10 fresco suplementado con PMA (50 ng/mL), ionomicina (1 µg/mL), inhibidores del transporte de proteínas (monensina) (1:1000) e inhibidores del transporte de proteínas (basados en brefeldina A) (1:1000). Mezcle suavemente y devuelva las placas al incubador a 37 °C para bloquear la secreción de citoquinas y permitir la acumulación intracelular.
  2. En el momento deseado, recoja las células en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
  3. Centrifugue a 500 × g durante 1 min y re suspenda el botón celular en 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo.
  4. Centrifugue a 500 × g durante 1 min y aspire el sobrenadante. Lave dos veces con 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo.
  5. Para la tinción de marcadores de superficie, incube las células con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anti-CD44, anti-CD8 y colorante fijable de viabilidad durante 30 min en hielo y en la oscuridad.
  6. Lave tres veces con tampón de tinción para citometría de flujo para eliminar los anticuerpos no unidos.
  7. Permeabilice las células añadiendo 200 µL de solución de fijación y permeabilización e incube durante 30 min en hielo y en la oscuridad.
    ADVERTENCIA: Realice todos los pasos que involucren la solución de fijación/permeabilización (que contiene paraformaldehído) en una campana extractora para evitar la inhalación de vapores. Recoja todos los desechos líquidos que contengan fijador en un recipiente aparte marcado para eliminación de residuos químicos peligrosos.
  8. Centrifugue a 500 × g durante 1 min y deseche el sobrenadante en los residuos químicos peligrosos.
  9. Lave las células tres veces con tampón de permeabilización/lavado 1 ×.
  10. Para la tinción intracelular de citoquinas, incube con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anti-TNF-α y anti-granzima B durante 30 min en hielo y en la oscuridad.
  11. Lave las células tres veces con tampón de permeabilización/lavado 1 × para eliminar los anticuerpos no unidos y realice un lavado final con tampón de tinción para citometría de flujo.
  12. Re suspenda el botón celular en 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo y adquiera las muestras en el mismo citómetro de flujo.
  13. Aplique la misma estrategia de selección de eventos descrita en la Sección 4.5 y recoja al menos 1 × 104 células T CD8+ por muestra. Analice el porcentaje de positividad y la MFI para cada marcador utilizando software de análisis de citometría de flujo.

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Resultados

Para investigar los efectos de diferentes intensidades de estimulación con anti-CD3 sobre la activación de linfocitos T, aislamos esplenocitos murinos y purificamos células T CD8+ para cultivo in vitro, y luego realizamos ensayos de activación de linfocitos T y análisis citométrico por flujo. Para el análisis de datos, los linfocitos se seleccionaron inicialmente mediante una combinación de FSC-A y SSC-A, seguido del aislamiento de células simples mediante FSC-H y FSC-W, y luego SSC-H con SSC-W. Las células T ...

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Discusión

Este protocolo proporciona un método sistemático y reproducible para estudiar las respuestas de las células T dependientes de la intensidad de la señal del TCR. La estrategia graduada de recubrimiento con anticuerpos anti-CD3 permite un control preciso sobre la intensidad de la estimulación, lo que permite a los investigadores analizar la relación cuantitativa entre la señal de entrada del TCR y los resultados funcionales posteriores. Los puntos clave del procedimiento incluyen la purificación de células T CD8⁺ naïve, el...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. T2394504, LY) y el Fondo de Inicio para la Investigación del Científico Jefe Lilin Ye (No. R2045, LY).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo cónico de 15 mLLabgicCD-002-15ATubo cónico estéril de centrífuga de 15 mL
Paraformaldehído al 4%BeyotimeP0099Fijador acuoso al 4% para preservar células antes de la tinción
Placa de 60 mmLabgic12211Placa de cultivo celular de 60 mm
Filtro celular de 70 µmLabgicBS-70-CSFiltro de malla de nailon de 70 µm para preparar suspensiones celulares individuales
Placa de 96 pocillos de fondo redondoBeyotimeFPT016Placa de 96 pocillos de fondo redondo para cultivo celular y tinción
Tampón de lisis ACKBeyotimeC3702Tampón de lisis de glóbulos rojos basado en cloruro de amonio
Anti-murino CD25Biolegend101910Anticuerpo anti-murino CD25 conjugado con APC, clon 3C7, para citometría de flujo
Anti-murino CD28Bio X CellBE0015-1Anticuerpo anti-murino CD28 purificado, clon 37.51, para costimulación de linfocitos T
Anti-murino CD3Bio X CellBP0001-1Anticuerpo anti-murino CD3ε purificado, clon 145-2C11, para activación de linfocitos T
Anti-murino CD69BD Biosciences553237Anticuerpo anti-murino CD69 conjugado con PE para tinción del marcador de activación
Anti-murino CD8Invitrogen17-0081-82Anticuerpo anti-murino CD8a conjugado con APC, clon 53-6.7, para citometría de flujo
Anti-murino GZMBBiolegend372212Anticuerpo anti-granzima B humano/murino conjugado con PerCP/Cianina5.5, clon QA16A02, para citometría de flujo intracelular
Anti-murino ICOSBD Biosciences565886Anticuerpo anti-murino ICOS (CD278) conjugado con BV421 para citometría de flujo
Anti-murino PD-1Biolegend135220Anticuerpo anti-murino PD-1 (CD279) conjugado con BV605, clon 29F.1A12, para citometría de flujo
Anti-murino TNF-αInvitrogen46-7321-82Anticuerpo anti-murino TNF-α conjugado con PerCP-eFluor 710, clon MP6-XT22, para citometría de flujo intracelular
Anti-murino/humano CD44Biolegend103030Anticuerpo anti-murino/humano CD44 conjugado con PE/Cianina7, clon IM7, para citometría de flujo
Anti-murino CD11b biotiniladoBiolegend101204Anticuerpo anti-murino CD11b conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino CD11c biotiniladoBiolegend117304Anticuerpo anti-murino CD11c conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino CD16/32 biotiniladoBiolegend156604Anticuerpo anti-murino CD16/32 conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino CD19 biotiniladoBiolegend115504Anticuerpo anti-murino CD19 conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino CD4 biotiniladoBiolegend100508Anticuerpo anti-murino CD4 conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino CD44 biotiniladoBiolegend103004Anticuerpo anti-murino CD44 conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino CD45R biotiniladoBiolegend103204Anticuerpo anti-murino CD45R/B220 conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino CD49b biotiniladoInvitrogen13-5971-85Anticuerpo anti-murino CD49b conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino F4/80 biotiniladoBiolegend123106Anticuerpo anti-murino F4/80 conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino Ly6G biotiniladoBiolegend127604Anticuerpo anti-murino Ly6G conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino NK1.1 biotiniladoBiolegend108704Anticuerpo anti-murino NK1.1 conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Anti-murino TER119 biotiniladoBiolegend116204Anticuerpo anti-murino TER-119 conjugado con biotina para agotamiento de linaje
Ratones C57BL/6Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.N/ARatones macho de 6–8 semanas de edad utilizados para los experimentos
Incubadora de dióxido de carbono (CO2)Thermo Fisher3120Incubadora de CO2 humedecida para cultivo celular de mamíferos
Tinte CellTrace VioletInvitrogenC34557Tinte fluorescente violeta para monitorear la proliferación celular
DMSOSigmaD2650Dietilsulfóxido; disolvente para preparar soluciones stock de reactivos
Anticuerpo secundario anti-IgG de burro anti-conejo (H+L) altamente adsorbido cruzadamente, Alexa Fluor™ 488InvitrogenA-21206Anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con Alexa Fluor 488
D-PBSVivaCell BiosciencesC3590-0500Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco’s para lavado y preparación de reactivos
Suero bovino fetal (FBS)GibcoC11995500BTSuplemento sérico para medio de cultivo celular de mamíferos
Tinte fijable de viabilidadInvitrogen65-0865-14Tinte fijable de viabilidad para excluir células muertas durante la citometría de flujo
Solución de fijación y permeabilizaciónBD Biosciences51-2090KZReactivo de fijación y permeabilización para tinción intracelular
Placa de 96 pocillos de fondo planoLabgic11510Placa de 96 pocillos de fondo plano para cultivo celular y ensayos de estimulación
Citómetro de flujoBD BiosciencesLSRFortessa-3 laserCitómetro de flujo de tres láseres para adquisición de fluorescencia multicolor
Golgi PlugBD Biosciences51-2301KZInhibidor del transporte de proteínas basado en brefeldina A para tinción de citoquinas intracelulares
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZInhibidor del transporte de proteínas basado en monensina para tinción de citoquinas intracelulares
Sal de ionomicina de calcioSigmaI3909-1MLIonóforo de calcio utilizado con PMA para estimulación celular
Tampón Perm/WashBD Biosciences51-20911KZTampón de permeabilización y lavado para tinción intracelular
Tampón Lyse/Fix PhosflowBD Biosciences558049Tampón 5× para lisis simultánea de glóbulos rojos y fijación de leucocitos
Tampón Perm/Wash Phosflow IBD Biosciences557885Tampón de permeabilización basado en metanol para tinción intracelular de fosfoproteínas
Anticuerpo monoclonal de conejo contra la proteína ribosomal S6 fosforilada (Ser235/236) (D57.2.2E)Cell Signaling4858SAnticuerpo monoclonal de conejo contra la proteína ribosomal S6 fosforilada (Ser235/236), clon D57.2.2E
PMASigmaP1585-1MGAcetato de 12-miristato 13-forbol; activador utilizado para estimulación celular ex vivo
Interleucina-2 recombinante de ratónGibco200-02-50UGInterleucina-2 recombinante de ratón para cultivo y expansión de linfocitos T
RPMI 1640Life-LabAC01L064Medio Roswell Park Memorial Institute 1640 para cultivo celular de mamíferos
Perlas magnéticas de estreptavidinaBEAVER22307Perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina para agotamiento celular basado en anticuerpos biotinilados
Tampón de tinción para citometría de flujoNo especificadoNo especificadoTampón de tinción para citometría de flujo; no se proporcionó el proveedor ni la fórmula de preparación
Película de laboratorio Parafilm MAmcorPM996Película flexible autoadherente para sellar placas, tubos y recipientes de cultivo
Tampón Lyse/FixBD Biosciences558049Tampón 5× para lisis simultánea de glóbulos rojos y fijación de leucocitos
FlowJoBD Biosciencesv10.8.1Software, versión 10.8.1, para análisis de datos de citometría de flujo

Referencias

  1. De Boer RJ, Yates AJ. Modeling T cell fate. Annu Rev Immunol. 2023;41:513–32.
  2. Chapman NM, Boothby MR, Chi H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nat Rev Immunol. 2020;20(1):55–70.
  3. Liu D, et al. Key links in the physiological regulation of the immune system and disease induction: T cell receptor-CD3 complex. Biochem Pharmacol. 2024;227:116441.
  4. Mariuzza RA, Agnihotri P, Orban J. The structural basis of T-cell receptor (TCR) activation: an enduring enigma. J Biol Chem. 2020;295(4):914–25.
  5. Smith-Garvin JE, Koretzky GA, Jordan MS. T cell activation. Annu Rev Immunol. 2009;27:591–619.
  6. Brownlie RJ, Zamoyska R. T cell receptor signalling networks: branched, diversified and bounded. Nat Rev Immunol. 2013;13(4):257–69.
  7. Au-Yeung BB, et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 2014;15(7):687–94.
  8. Daniels MA, et al. Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling. Nature. 2006;444(7120):724–9.
  9. Snook JP, Kim C, Williams MA. TCR signal strength controls the differentiation of CD4+ effector and memory T cells. Sci Immunol. 2018;3(25):eaas9103.
  10. Flaherty S, Reynolds JM. Mouse naïve CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into T cell subsets. J Vis Exp. 2015;(98):e52739.
  11. Trickett A, Kwan YL. T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads. J Immunol Methods. 2003;275(1–2):251–5.
  12. Kaech SM, Wherry EJ, Ahmed R. Effector and memory T-cell differentiation: implications for vaccine development. Nat Rev Immunol. 2002;2(4):251–62.
  13. Gottschalk RA, et al. Distinct NF-κB and MAPK activation thresholds uncouple steady-state microbe sensing from anti-pathogen inflammatory responses. Cell Syst. 2016;2(6):378–90.
  14. Gjergjova F, et al. A fine-tuned comprehensive overview of antibody-driven ex vivo assays for primary murine T cell activation. J Immunol Methods. 2026;548:114055.
  15. Rosenlehner T, et al. Reciprocal regulation of mTORC1 signaling and ribosomal biosynthesis determines cell cycle progression in activated T cells. Sci Signal. 2024;17(859):eadi8753.
  16. Salmond RJ, Emery J, Okkenhaug K, Zamoyska R. MAPK, phosphatidylinositol 3-kinase, and mammalian target of rapamycin pathways converge at the level of ribosomal protein S6 phosphorylation to control metabolic signaling in CD8 T cells. J Immunol. 2009;183(11):7388–97.
  17. Motamedi M, Xu L, Elahi S. Correlation of transferrin receptor (CD71) with Ki67 expression on stimulated human and mouse T cells: the kinetics of expression of T cell activation markers. J Immunol Methods. 2016;437:43–52.
  18. Kalia V, et al. Prolonged interleukin-2Ralpha expression on virus-specific CD8+ T cells favors terminal-effector differentiation in vivo. Immunity. 2010;32(1):91–103.
  19. Caruso A, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry. 1997;27(1):71–6.
  20. Sutermaster BA, Darling EM. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 2019;9(1):227.
  21. Llufrio EM, Wang L, Naser FJ, Patti GJ. Sorting cells alters their redox state and cellular metabolome. Redox Biol. 2018;16:381–7.
  22. Quah BJ, Parish CR. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 2012;379(1–2):1–14.
  23. Lemieszek MB, Findlay SD, Siegers GM. CellTrace Violet flow cytometric assay to assess cell proliferation. Methods Mol Biol. 2022;2508:101–14.
  24. Whitmire JK, Ahmed R. Costimulation in antiviral immunity: differential requirements for CD4+ and CD8+ T cell responses. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):448–55.
  25. Seder RA, Darrah PA, Roederer M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):247–58.
  26. Carbone F, et al. Cellular and molecular signaling towards T cell immunological self-tolerance. J Biol Chem. 2024;300(4):107134.
  27. Daniels MA, Teixeiro E. TCR signaling in T cell memory. Front Immunol. 2015;6:617.
  28. Knudson KM, et al. Cutting edge: the signals for the generation of T cell memory are qualitatively different depending on TCR ligand strength. J Immunol. 2013;191(12):5797–801.

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