Este protocolo describe un método sistemático para activar linfocitos T CD8+ vírgenes primarios de ratón mediante un enfoque de estimulación graduada del TCR, lo que permite un análisis exhaustivo de la proliferación, activación y producción de citoquinas de los linfocitos T CD8+ en diferentes intensidades de señal del TCR.
Artículo de método
Fuerza y Duración de la Señal del TCR en la Activación y Diferenciación de Linfocitos T CD8+ Primarios de Ratón: Un Enfoque Estandarizado In Vitro
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Resumen
Resumen
La intensidad y duración de la señal del receptor de células T (TCR) son determinantes críticos de la activación, proliferación y diferenciación funcional de las células T CD8⁺. Sin embargo, los modelos estandarizados in vitro que comparen sistemáticamente cómo distintas señales del TCR moldean el destino de las células T siguen siendo limitados. Este estudio presenta un método reproducible para activar células T primarias de ratón in vitro mediante anti-CD3 inmovilizado en placa y anti-CD28 soluble, suplementado con interleucina-2 (IL-2), y examina cómo la modulación de la concentración de anti-CD3 (fuerza de la señal) y el tiempo de estimulación (duración de la señal) influye en los resultados de activación de las células T. Describimos un protocolo para el aislamiento de células T naïve de ratones C57BL/6, seguido de estimulación en un rango de concentraciones de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) y tiempos (6–48 h). Realizamos análisis por citometría de flujo para evaluar la señalización temprana inducida por el TCR mediante la proteína ribosomal S6 fosforilada intracelular (p-S6) como indicador de la actividad del complejo 1 del blanco mecanicista de la rapamicina (mTORC1), y posteriormente evaluamos eventos descendentes, incluyendo marcadores de superficie de activación (CD69, CD25, ICOS, PD-1), proliferación celular mediante la dilución del colorante violeta de rastreo de proliferación (CTV) y expresión de moléculas efectoras (Granzima B, TNF-α) como indicadores de diferenciación funcional. El método proporciona una guía visual clara y paso a paso para realizar estimulaciones reproducibles de células T, permitiendo a los investigadores desentrañar cómo parámetros específicos de la señal del TCR dirigen las decisiones de destino celular. Este enfoque no solo apoya estudios mecanicistas de la activación y diferenciación de células T, sino que también ofrece una plataforma para optimizar el acondicionamiento de células T en inmunoterapia adoptiva y ensayos de sensibilización in vitro. Al integrar una demostración en video con una narración detallada del protocolo, este procedimiento mejorará la transparencia y reproducibilidad metodológica en la investigación de inmunología de células T.
Introducción
Los linfocitos T son indispensables para las respuestas inmunitarias protectoras contra patógenos y tumores. Los linfocitos T naïve se mantienen activamente en un estado de quiescencia para preservar su supervivencia y persistencia a largo plazo1. Tras la estimulación antigénica, los linfocitos T salen de la quiescencia, experimentan expansión clonal y diferenciación efectora2. La señalización a través del receptor de linfocitos T (TCR) constituye el proceso fundamental para iniciar y regular las respuestas inmunitarias adaptativas3. Tras el reconocimiento específico de moléculas de péptido-complejo mayor de histocompatibilidad (pMHC) presentadas en la superficie de células presentadoras de antígenos (APC), se desencadena una cascada de eventos de señalización, impulsando así la expansión clonal y la diferenciación funcional de los linfocitos T4,5,6.
La intensidad de la estimulación del TCR, determinada por factores clave como la afinidad, la avidez y la concentración del antígeno, desempeña un papel fundamental en regular la magnitud de la activación de los linfocitos T, la adquisición de funciones efectoras y la trayectoria de diferenciación hacia subconjuntos distintos de linfocitos T efectoras o de memoria7,8,9. Los modelos actuales in vitro para investigar la activación de linfocitos T dependiente del TCR emplean predominantemente anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos a placas o a microesferas, que proporcionan simultáneamente la ligación del TCR y señales coestimuladoras10,11. Aunque dichos sistemas se utilizan ampliamente, normalmente emplean solo una concentración única, a menudo saturante, de anticuerpo anti-CD3, lo que permite únicamente una comparación binaria de todo o nada de la activación de los linfocitos T, en lugar de captar el rango dinámico de intensidades de señal del TCR que se pueden lograr con un gradiente titulado de estímulos12,13.
El protocolo descrito aquí proporciona un sistema estandarizado y reproducible in vitro para evaluar sistemáticamente cómo diferentes intensidades del señal del TCR modulan la activación, proliferación y fenotipos funcionales de linfocitos T CD8+ primarios de ratón, utilizando gradientes titulados de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) y una concentración constante de anti-CD28 (1 µg/mL). Este enfoque se centra en la citometría de flujo multiparamétrica que permite capturar tanto la señalización temprana —mediante la proteína ribosomal S6 fosforilada intracelular (p-S6) como indicador de la actividad del complejo 1 del blanco mecanicista de la rapamicina (mTORC1)— como los resultados celulares tardíos, incluyendo la proliferación rastreada por la dilución de CTV, marcadores de superficie de activación (CD69, CD25, costimulador inducible de linfocitos T [ICOS], proteína 1 de muerte celular programada [PD-1]) y la expresión de moléculas efectoras (granzima B, factor de necrosis tumoral alfa [TNF-α]), durante un periodo de tiempo comprendido entre 6 y 48 h.
Nuestro protocolo emplea un gradiente de concentración de anticuerpos anti-CD3 inmovilizados en placa para modular con precisión la intensidad de la estimulación, imitando así la avidez diferencial de unión del TCR observada en condiciones fisiológicas. El método logra una alta eficiencia en el entrecruzamiento del TCR y una activación robusta de linfocitos T primarios en reposo. El procedimiento estandarizado de recubrimiento asegura una distribución uniforme de los anticuerpos sobre la superficie de la placa, lo que da lugar a una estimulación consistente entre las células dentro del mismo lote y una excelente reproducibilidad experimental. Este formato proporciona un enfoque rentable y operativamente sencillo para la activación de linfocitos T.
Sin embargo, deben reconocerse ciertas limitaciones de este enfoque. La estimulación mediada por anticuerpos anti-CD3/CD28 difiere notablemente del contexto fisiológico in vivo. Aunque los métodos experimentales que utilizan únicamente anticuerpos agonistas anti-CD3 y anti-CD28 para evaluar la activación de linfocitos T pueden proporcionar lecturas efectivas de la activación, no logran reproducir completamente las interacciones entre las células presentadoras de antígenos y los linfocitos T, así como el microambiente coestimulador que ocurre bajo condiciones fisiológicas14.
A pesar de estas limitaciones, este protocolo ofrece una plataforma sistemática y reproducible que sirve como una herramienta valiosa y accesible para investigar las respuestas de las células T dependientes de la intensidad de la señal del TCR y puede complementar modelos más complejos específicos del antígeno.
Protocolo
Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Militar Médica Tercera.
1. Preparación de reactivos y placas
- Preparar anti-CD3 unido a placa en PBS estéril a 0,1, 0,5, 1, 5 y 10 µg/mL.
- Añadir 50 µL de la solución de recubrimiento de anti-CD3 por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano.
- Sellar las placas con película adhesiva e incubar durante la noche a 4 °C.
- Aspirar la solución de recubrimiento y lavar cada pocillo dos veces con 200 µL de PBS estéril antes de añadir las células.
2. Aislamiento de linfocitos T CD8+ naïve del bazo de ratón
- Seleccione ratones macho C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (adquiridos de Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.) y sacrifíquelos mediante inhalación de CO2 seguida de dislocación cervical. Los ratones se mantienen en condiciones libres de patógenos específicos, con un ciclo de 12 h de luz/oscuridad y acceso libre a alimento y agua. Se utilizan al menos 3 ratones por experimento independiente.
- Realice una incisión cuidadosa en el peritoneo con tijeras quirúrgicas para exponer el bazo, sujételo y extraiga el bazo usando pinzas, y colóquelo en un recipiente de recolección que contenga RPMI 1640 preenfriado suplementado con 2% de suero bovino fetal (FBS) (R2). Mantenga el recipiente en hielo hasta la disociación.
NOTA: Recolecte todos los cadáveres animales y residuos de cultivo celular en bolsas de bioseguridad designadas y autoclave a 121 °C durante 20 min antes de desecharlos. - Retire el bazo del recipiente de recolección y transfiéralo a una placa de 60 mm que contenga 3 mL de tampón de lisis 1 × de cloruro de amonio-potasio (ACK).
- Prepare una suspensión de células individuales machacando suavemente el bazo a través de un filtro celular de 70 µm utilizando el émbolo de una jeringa de 3 mL.
- Incube la suspensión durante 1 min a temperatura ambiente (RT), luego agregue 3 mL de medio R2 preenfriado para neutralizar el tampón de lisis de cloruro de amonio-potasio (ACK).
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL y centrifugue a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
- Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 10 mL de tampón de tinción para citometría de flujo (PBS con 2% de FBS).
- Filtre la suspensión a través de un filtro celular de 70 µm hacia un tubo cónico nuevo de 15 mL, luego centrifugue nuevamente a 500 × g durante 5 min a 4 °C.
NOTA: Se debe omitir el azida sódico del tampón de tinción para citometría de flujo para preservar la viabilidad celular en ensayos funcionales. Todas las muestras deben mantenerse a 4 °C y analizarse inmediatamente. - Aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 200 µL de una mezcla de anticuerpos biotinilados por bazo de ratón (que contiene anti-CD16/32 (bloqueo Fc), anti-TER-119, anti-CD19, anti-CD4, anti-B220, anti-NK1.1, anti-Ly-6G, anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD49b, anti-CD44 y anti-F4/80).
- Incube en hielo durante 25 min, invirtiendo suavemente el tubo cada 5 min para asegurar una mezcla completa.
- Lave las células con un volumen grande de tampón de tinción para citometría de flujo, centrifugue a 500 × g durante 5 min y deseche el sobrenadante.
- Resuspenda el sedimento en el mismo volumen de tampón de tinción para citometría de flujo utilizado para la mezcla de anticuerpos biotinilados, agregue perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina a la mitad de ese volumen e incube en hielo durante 15 min, invirtiendo suavemente el tubo cada 5 min para asegurar una mezcla completa.
- Centrifugue brevemente el tubo, colóquelo en un soporte magnético durante 2–3 min y transfiera cuidadosamente el sobrenadante (células T CD8+ naïve enriquecidas) a un tubo cónico nuevo de 15 mL.
- Lave las células recolectadas una vez con tampón de tinción para citometría de flujo y centrifugue nuevamente a 500 × g durante 5 min.
- Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS (R10) para aplicaciones posteriores.
3. Marcado con colorante violeta de seguimiento de proliferación (CTV) para el seguimiento de la proliferación
- Prepare una solución de trabajo de CTV 2 × (10 µM) fresca inmediatamente antes de usar. Mezcle completamente la solución stock de CTV 5 mM (en dimetilsulfóxido [DMSO]) mediante vortex y dilúyala adicionalmente con PBS estéril para obtener una concentración final de 10 µM.
ADVERTENCIA: Manipule la solución stock de CTV (preparada en DMSO) con guantes de nitrilo en una campana extractora, ya que el DMSO facilita la absorción cutánea de compuestos tóxicos. Evite la inhalación y el contacto con la piel. - Reuspenda la mitad de los linfocitos T CD8+ vírgenes aislados en PBS preenfriado a una densidad de 8 × 107 células/mL.
- Añada rápidamente un volumen igual de la solución de trabajo de CTV 2 × (10 µM) a la suspensión celular y mezcle bien mediante pipeteo, obteniendo una concentración final de CTV de 5 µM.
- Incube las células a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 min, invirtiendo suavemente los tubos cada 5 min para asegurar una mezcla completa.
- Añada 5 volúmenes de medio de cultivo (que contenga al menos 10 % de suero bovino fetal [FBS]) a las células e incube durante 5 min en hielo para eliminar cualquier colorante libre.
- Centrifugue las células a 500 × g durante 5 min y re suspenda el sedimento en medio completo R10 recién precalentado, suplementado con anti-CD28 (concentración final: 1 µg/mL) e IL-2 (concentración final: 10 ng/mL).
- Añada 250 µL de suspensión celular (que contenga 6 × 105 células) a cada pocillo de las placas de 96 pocillos previamente recubiertas.
- Cultive las células a 37 °C con 5 % de CO₂ durante hasta 48 h.
4. Detección de CTV mediante citometría de flujo
- Recoger las células en una placa de 96 pocillos con fondo redondo a las 6, 36 y 48 h. Centrifugar a 500 × g durante 5 min y lavar dos veces con tampón de tinción para citometría de flujo.
- Para la tinción de superficie, incubar las células con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anti-CD8, colorante fijable de viabilidad y anti-CD44 durante 30 min en hielo a oscuras.
NOTA: Recoger todos los sobrenadantes que contengan anticuerpos conjugados con fluorocromos en recipientes designados para desechos, suplementados con hipoclorito de sodio al 0,5% para descontaminación, y desecharlos según los protocolos institucionales para residuos biopeligrosos. - Lavar las células dos veces con tampón de tinción para citometría de flujo y resuspender en 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo para la adquisición en citómetro de flujo.
- Adquirir las muestras en un citómetro de flujo equipado con tres láseres. Preparar tubos de control monocromáticos utilizando células marcadas para establecer los parámetros de compensación.
- Aplicar la siguiente estrategia de selección: excluir los detritos mediante la selección por dispersión directa (FSC) frente a dispersión lateral (SSC), eliminar los dobletes mediante la selección de células simples y seleccionar las células T CD8+ viables (negativas para el colorante fijable de viabilidad) para el análisis.
- Recoger al menos 1 × 104 eventos de células T CD8+ seleccionadas por muestra. Analizar los datos utilizando el software de análisis de citometría de flujo y calcular la proporción de células que han experimentado una o más divisiones mediante el módulo de análisis de proliferación.
5. Tinción de superficie e intracelular para activación y señalización
- Re-suspender la otra mitad de linfocitos T CD8+ vírgenes en R10 suplementado con anti-CD28 a 1 µg/mL e IL-2 a 10 ng/mL a una concentración de 2,4 × 106 células/mL.
- Añadir 250 µL de suspensión celular (6 × 105 células) a cada pocillo de las placas de 96 pocillos previamente recubiertas.
- Cultivar las células a 37 °C con 5 % de CO₂ durante un máximo de 48 h.
- En los puntos de tiempo indicados (6, 10, 12, 24 y 36 h), recolectar las células en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
NOTA: A las 6 h se captura la señalización temprana del TCR (p-S6) y CD69; este último se evalúa adicionalmente a las 12, 24 y 36 h para capturar su cinética completa. CD25, PD-1 e ICOS se monitorean a las 10, 12, 24 y 36 h; el punto de tiempo a las 48 h se reserva para la proliferación (Sección 4) y la detección de citoquinas (Sección 6). - Centrifugar a 500 × g durante 1 min y re-suspender el sedimento celular en 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo.
- Centrifugar a 500 × g durante 1 min y aspirar el sobrenadante. Lavar las células dos veces con 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo.
- Para la tinción de superficie, incubar las células con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anti-CD69, anti-CD25, anti-CD8, anti-PD-1, anti-ICOS y un colorante vital fijable durante 30 min en hielo y a oscuras.
- Lavar las células tres veces con tampón de tinción para citometría de flujo para eliminar los anticuerpos no unidos.
- Re-suspender el sedimento celular en 200 µL de paraformaldehído al 1 % y fijar las células a temperatura ambiente (RT) a oscuras durante 15 min.
ADVERTENCIA: Realizar todos los pasos que involucren paraformaldehído en una campana extractora para evitar la inhalación de vapores. Recoger todos los residuos líquidos que contengan fijador en un recipiente aparte marcado para eliminación de desechos químicos peligrosos. - Centrifugar a 500 × g durante 1 min y lavar una vez con tampón de tinción para citometría de flujo.
- Pre-calentar el tampón lisis/fijación 5 × a temperatura ambiente y preparar una solución de trabajo 1 × con agua destilada.
- Añadir 200 µL de la solución de trabajo (tampón lisis/fijación 1 ×) a cada pocillo e incubar las células a temperatura ambiente a oscuras durante 30 min.
- Lavar dos veces con tampón de permeabilización/lavado 1 × para tinción de epítopos fosforilados. Re-suspender el sedimento en tampón de permeabilización/lavado 1 × para tinción de epítopos fosforilados e incubar a temperatura ambiente a oscuras durante 10 min.
- Centrifugar a 500 × g durante 1 min y desechar los sobrenadantes.
- Para la tinción intracelular, incubar las células con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anti-p-S6 durante 60 min a temperatura ambiente a oscuras.
- Lavar las células tres veces con tampón de permeabilización/lavado 1 × para tinción de epítopos fosforilados.
- Para la tinción con anticuerpo secundario, incubar las células con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anticuerpo secundario anti-conejo durante 30 min en hielo y a oscuras.
- Lavar las células tres veces con tampón de permeabilización/lavado 1 × para tinción de epítopos fosforilados y una vez con tampón de tinción para citometría de flujo.
- Re-suspender el sedimento celular en 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo y adquirir las muestras en el mismo citómetro de flujo.
- Aplicar la misma estrategia de selección de eventos descrita en la Sección 4.5 y recolectar al menos 1 × 104 linfocitos T CD8+ por muestra.
- Analizar la intensidad media de fluorescencia (MFI) de cada marcador mediante software de análisis de citometría de flujo.
6. Bloqueo y detección de citoquinas intracelulares
- 5 h antes de la recolección, añada 100 µL por pocillo de R10 fresco suplementado con PMA (50 ng/mL), ionomicina (1 µg/mL), inhibidores del transporte de proteínas (monensina) (1:1000) e inhibidores del transporte de proteínas (basados en brefeldina A) (1:1000). Mezcle suavemente y devuelva las placas al incubador a 37 °C para bloquear la secreción de citoquinas y permitir la acumulación intracelular.
- En el momento deseado, recoja las células en una placa de fondo redondo de 96 pocillos.
- Centrifugue a 500 × g durante 1 min y re suspenda el botón celular en 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo.
- Centrifugue a 500 × g durante 1 min y aspire el sobrenadante. Lave dos veces con 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo.
- Para la tinción de marcadores de superficie, incube las células con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anti-CD44, anti-CD8 y colorante fijable de viabilidad durante 30 min en hielo y en la oscuridad.
- Lave tres veces con tampón de tinción para citometría de flujo para eliminar los anticuerpos no unidos.
- Permeabilice las células añadiendo 200 µL de solución de fijación y permeabilización e incube durante 30 min en hielo y en la oscuridad.
ADVERTENCIA: Realice todos los pasos que involucren la solución de fijación/permeabilización (que contiene paraformaldehído) en una campana extractora para evitar la inhalación de vapores. Recoja todos los desechos líquidos que contengan fijador en un recipiente aparte marcado para eliminación de residuos químicos peligrosos. - Centrifugue a 500 × g durante 1 min y deseche el sobrenadante en los residuos químicos peligrosos.
- Lave las células tres veces con tampón de permeabilización/lavado 1 ×.
- Para la tinción intracelular de citoquinas, incube con 50 µL de una mezcla de anticuerpos que contenga anti-TNF-α y anti-granzima B durante 30 min en hielo y en la oscuridad.
- Lave las células tres veces con tampón de permeabilización/lavado 1 × para eliminar los anticuerpos no unidos y realice un lavado final con tampón de tinción para citometría de flujo.
- Re suspenda el botón celular en 200 µL de tampón de tinción para citometría de flujo y adquiera las muestras en el mismo citómetro de flujo.
- Aplique la misma estrategia de selección de eventos descrita en la Sección 4.5 y recoja al menos 1 × 104 células T CD8+ por muestra. Analice el porcentaje de positividad y la MFI para cada marcador utilizando software de análisis de citometría de flujo.
Resultados
Para investigar los efectos de diferentes intensidades de estimulación con anti-CD3 sobre la activación de linfocitos T, aislamos esplenocitos murinos y purificamos células T CD8+ para cultivo in vitro, y luego realizamos ensayos de activación de linfocitos T y análisis citométrico por flujo. Para el análisis de datos, los linfocitos se seleccionaron inicialmente mediante una combinación de FSC-A y SSC-A, seguido del aislamiento de células simples mediante FSC-H y FSC-W, y luego SSC-H con SSC-W. Las células T CD8+ viables se seleccionaron posteriormente utilizando CD8 junto con un colorante de viabilidad fijable para análisis posteriores (Figura 1A).
Para validar que el sistema de estimulación con anticuerpos inmovilizados en placa activa eficazmente las células T in vitro, examinamos la fosforilación de la proteína ribosomal S6 (p-S6), un indicador bien establecido de la actividad de mTORC1 y un punto de convergencia para las vías PI3K-mTOR y MEK-ERK MAPK posteriores a la señalización del TCR15,16. En concordancia con estos hallazgos, observamos un aumento dependiente de la dosis en los niveles de p-S6 a las 6 h posteriores a la estimulación, a medida que aumentaban las concentraciones de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) (Figura 1B), lo que confirma que el sistema con anti-CD3 inmovilizado en placa activa el eje TCR-mTORC1-S6 de manera dependiente de la intensidad de la señal. Este evento temprano de fosforilación es consistente con la activación de vías metabólicas dependientes de mTORC1 que favorecen posteriormente la proliferación de las células T y su diferenciación efectora.
La proliferación celular se evaluó mediante citometría de flujo por dilución de CTV tras la estimulación del TCR con concentraciones crecientes de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) en tres puntos temporales posteriores a la estimulación: 6, 36 y 48 h. En el tiempo temprano de señalización a las 6 h, solo se observó una dilución proliferativa mínima en todas las condiciones de estimulación. A las 36 h, el grupo con estimulación de baja dosis (0,1 µg/mL) aún no logró inducir una expansión clonal apreciable, mientras que los grupos con dosis intermedia y alta mostraron picos bien definidos de dilución de CTV (5 y 10 µg/mL), lo que indica el inicio de la progresión del ciclo celular. A las 48 h, los fenotipos proliferativos diferenciales según la concentración de estimulación fueron más pronunciados. La estimulación débil del TCR (0,1 µg/mL) produjo solo un 1,25 % de células proliferantes y un único pico de CTV sin diluir, lo que indica una activación subóptima. La estimulación intermedia (1–5 µg/mL) indujo tres picos de división definidos, con fracciones proliferantes que aumentaron desde el 70,8 % hasta el 84,0 %. La estimulación fuerte (10 µg/mL) alcanzó la fracción proliferante más alta (89,5 %), mostrando el número máximo de generaciones de división y demostrando la detección de saturación de la proliferación (Figura 2).
A continuación, examinamos la expresión de los marcadores de activación temprana CD69 y CD25. Destacablemente, el presente estudio reveló una regulación positiva rápida y dependiente de la dosis de la expresión de CD69, basada en la intensidad de fluorescencia mediana (MFI). Bajo estimulación intermedia y fuerte (5 y 10 µg/mL), CD69 aumentó rápidamente a las 24 h, seguido de una disminución gradual entre las 24 y 36 h. Sin embargo, bajo estimulación débil (0,1, 0,5 y 1 µg/mL), CD69 aumentó progresivamente durante toda la ventana de estimulación. El perfil cinético de expresión de CD69 descrito es consistente con su papel como marcador de activación temprana de linfocitos T (Figura 3A)17. Curiosamente, observamos que la expresión de CD25 mostró un aumento progresivo de manera dependiente de la dosis y del tiempo (Figura 3B). En concordancia con investigaciones previas, la regulación positiva de CD25 fue más lenta que la de CD69, especialmente tras una estimulación óptima18,19.
Para investigar más a fondo el efecto regulador de la intensidad de la estimulación del TCR sobre la expresión de receptores inhibidores y moléculas coestimuladoras en linfocitos T CD8+, analizamos los niveles de expresión de PD-1 e ICOS. La expresión inducible de PD-1 depende de una estimulación intensa del TCR. En el grupo de estimulación de baja intensidad (0,5–1 µg/mL), PD-1 se expresó a un nivel bajo durante todo el período de estimulación. En contraste, en el grupo de estimulación de intensidad media a alta (5–10 µg/mL), la expresión de PD-1 aumentó gradualmente a partir de las 10 h y alcanzó su punto máximo a las 36 h (Figura 4A). La expresión de ICOS también aumentó proporcionalmente con la intensidad creciente de la estimulación y alcanzó su nivel máximo a 5–10 µg/mL a las 36 h (Figura 4B). Estos resultados sugieren que una estimulación intensa del TCR puede aumentar significativamente los niveles de expresión de PD-1 e ICOS.
Finalmente, examinamos la capacidad funcional de las células T estimuladas tras la reestimulación con PMA e ionomicina a las 24 h y 48 h posteriores a la estimulación. A las 24 h, cuantificamos la producción de TNF-α y granzima B y observamos que las frecuencias de células TNF-α+, granzima B+ y TNF-α+granzima B+ aumentaron gradualmente de manera dependiente de la dosis de anti-CD3 (Figura 5A, B). De forma consistente, la IMF del TNF-α y de la granzima B también mostró un incremento dependiente de la concentración y alcanzó un máximo bajo estimulación de alta intensidad (10 µg/mL) (Figura 5C), lo que refleja una diferenciación temprana hacia el fenotipo efector dependiente de la dosis y dirigida por la intensidad escalonada de la señal del TCR. Sin embargo, a las 48 h, este patrón se invirtió notablemente. Concentraciones más altas de anti-CD3 redujeron significativamente los porcentajes de células TNF-α+granzima B+ y disminuyeron los niveles de expresión de moléculas efectoras por célula.
Todos los datos mostrados son representativos de 3 experimentos independientes. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando ANOVA de una vía o de dos vías con la prueba post hoc de Tukey; los datos se representan como media ± EE. La viabilidad celular superó consistentemente el 90 %, y se adquirieron un mínimo de 1 × 104 eventos de linfocitos T CD8+ viables por muestra.
Figura 1: Activación in vitro y análisis por citometría de flujo de linfocitos T CD8+. (A) Linfocitos T CD8+ purificados a partir de esplenocitos de ratón se estimularon in vitro con concentraciones variables de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) combinadas con una concentración fija de anti-CD28 (1 µg/mL) durante 6 a 48 h, seguido de análisis por citometría de flujo de la activación celular. Se excluyeron los restos celulares mediante la selección por dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC), se excluyeron los dobletes mediante la selección de células simples, y finalmente se seleccionaron los linfocitos T CD8+ negativos para el colorante de viabilidad fijable para los análisis posteriores. (B) Fosforilación de la proteína ribosomal S6 (p-S6) en linfocitos T CD8+ a las 6 h posteriores a la estimulación con las concentraciones indicadas de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) más anti-CD28 constante (1 µg/mL). Histograma representativo (izquierda) y resumen de la intensidad media de fluorescencia (MFI, derecha). Los gráficos de citometría de flujo son representativos de 3 experimentos independientes. Los datos muestran la media ± error estándar de la media (SEM). Análisis estadístico: ANOVA unidireccional de medidas repetidas con prueba post hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Análisis de proliferación basado en el colorante violeta para el seguimiento de la proliferación (CTV) de linfocitos T CD8+ primarios de ratón bajo estimulación graduada del TCR. Los linfocitos T CD8+ marcados con CTV se estimularon in vitro con anti-CD3 en concentraciones crecientes de 0,1–10 µg/mL durante 6 a 48 h. La proliferación celular se evaluó en función de la dilución y atenuación de la fluorescencia del CTV en los linfocitos T CD8+ mediante análisis por citometría de flujo. Los histogramas muestran la distribución de la fluorescencia del CTV en cada grupo de concentración, con el porcentaje de células que han realizado una o más divisiones indicado. Los gráficos de citometría de flujo son representativos de 3 experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cinética de expresión de los marcadores tempranos de activación CD69 y CD25 en linfocitos T CD8+ tras la estimulación con anti-CD3. Los linfocitos T CD8+ vírgenes se estimularon con anti-CD3 inmovilizado en placa a las concentraciones indicadas (0,1–10 µg/mL) más anti-CD28 constante (1 µg/mL). La expresión de CD69 se midió a las 6, 12, 24 y 36 h; la de CD25 a las 10, 12, 24 y 36 h, y se analizó mediante citometría de flujo. Los paneles izquierdos muestran histogramas representativos en los puntos de tiempo indicados; los paneles derechos presentan los cambios dinámicos en la intensidad media de fluorescencia (MFI) a lo largo del tiempo. (A) CD69. (B) CD25. Los gráficos de citometría de flujo son representativos de 3 experimentos independientes. Los datos muestran la media ± error estándar de la media (SEM). Análisis estadístico: ANOVA bidireccional de medidas repetidas con prueba post hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cinética de expresión del receptor inhibitorio PD-1 y la molécula coestimuladora ICOS en linfocitos T CD8+ tras la estimulación con anti-CD3. Los linfocitos T CD8+ vírgenes se estimularon con anti-CD3 inmovilizado en placa a las concentraciones indicadas (0,1–10 µg/mL) más anti-CD28 constante (1 µg/mL). Las células se recolectaron a las 10, 12, 24 y 36 h y se analizaron mediante citometría de flujo. Los paneles izquierdos muestran histogramas representativos en los puntos de tiempo indicados; los paneles derechos presentan los cambios dinámicos en la intensidad media de fluorescencia (MFI) a lo largo del tiempo. (A) PD-1. (B) ICOS. Los gráficos de citometría de flujo son representativos de 3 experimentos independientes. Los datos muestran la media ± error estándar de la media (SEM). Análisis estadístico: ANOVA bidireccional de medidas repetidas con prueba post hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: La producción intracelular de citocinas por linfocitos T CD8+ depende de la intensidad del TCR. Los linfocitos T CD8+ vírgenes se estimularon con concentraciones crecientes de anti-CD3 (0,1–10 µg/mL) más anti-CD28 constante (1 µg/mL). A las 24 h y 48 h posteriores a la estimulación, las células se recolectaron tras una incubación de 5 h con inhibidores del transporte de proteínas (monensina y brefeldina A) en presencia de PMA e ionomicina para bloquear la secreción de citocinas y permitir la acumulación intracelular. (A) Los gráficos de contorno muestran las frecuencias de células positivas para TNF-α y granzima B en cada concentración y punto temporal indicados. Las células no estimuladas sirvieron como control negativo. (B) Las proporciones de células TNF-α+, granzima B+ y TNF-α+ granzima B+. (C) La intensidad media de fluorescencia (MFI) de TNF-α y granzima B. Los gráficos de citometría de flujo son representativos de 3 experimentos independientes. Los datos muestran la media ± error estándar de la media (SEM). Análisis estadístico: ANOVA de dos vías con medidas repetidas y prueba post-hoc de Tukey. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns, no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discusión
Este protocolo proporciona un método sistemático y reproducible para estudiar las respuestas de las células T dependientes de la intensidad de la señal del TCR. La estrategia graduada de recubrimiento con anticuerpos anti-CD3 permite un control preciso sobre la intensidad de la estimulación, lo que permite a los investigadores analizar la relación cuantitativa entre la señal de entrada del TCR y los resultados funcionales posteriores. Los puntos clave del procedimiento incluyen la purificación de células T CD8⁺ naïve, el control preciso del gradiente de concentración de recubrimiento con anti-CD3 y la normalización estricta del número de células por pocillo. Para garantizar la comparabilidad de los datos entre experimentos, también se recomienda utilizar configuraciones de instrumentos consistentes, matrices de compensación y estrategias de selección (gating), así como los mismos lotes de anticuerpos y los mismos lotes de colorantes vitales fijables, cuando sea posible. La fiabilidad de estos pasos críticos determina directamente si los resultados experimentales pueden reflejar con precisión los efectos de distintas intensidades de estimulación del TCR sobre la dinámica fenotípica de las células T.
En este protocolo, empleamos la estimulación con anticuerpos inmovilizados en placa, en la cual los anticuerpos anti-CD3 se recubren directamente sobre la superficie de la placa de cultivo para entrecruzar el complejo TCR-CD3. Este enfoque ofrece rentabilidad, distribución uniforme de los anticuerpos, variabilidad mínima entre pocillos y excelente reproducibilidad. En particular, la titulación de las concentraciones de anticuerpos de recubrimiento permite una modulación precisa y graduada de la intensidad de estimulación, una característica que distingue a este sistema de la estimulación con microesferas conjugadas, en la cual la densidad de ligandos generalmente se fija a un nivel saturante, lo que limita la modulación fina de la señal14. Sin embargo, la estimulación con anticuerpos inmovilizados induce un entrecruzamiento del TCR suprafisiológico y sostenido, que difiere fundamentalmente del acoplamiento transitorio y dependiente de la afinidad inducido por los complejos péptido-MHC en células presentadoras de antígenos. Aunque la estimulación basada en pMHC es más fisiológicamente relevante, es técnicamente exigente, requiere experiencia especializada para la producción de multímeros e implica costos considerablemente más altos. Para el aislamiento celular, empleamos selección inmunomagnética negativa, que es sencilla, rápida y rentable. Aunque proporciona una pureza menor en comparación con la citometría de flujo (FACS), evita el estrés mecánico y la marcación fluorescente que podrían comprometer el estado fisiológico de las células clasificadas20,21.
Los principales problemas que pueden surgir durante la ejecución del protocolo incluyen baja pureza en la clasificación, proliferación débil, citotoxicidad inducida por CTV, baja viabilidad tras el cultivo e tinción inconsistente. Para mejorar la baja pureza, asegúrese de mezclar adecuadamente las células con la mezcla de anticuerpos biotinilados y las microesferas recubiertas con estreptavidina, prolongue el tiempo de separación magnética si es necesario y optimice la relación microesferas-anticuerpo para cada nuevo lote de reactivo. Si se observa una proliferación mínima incluso con la concentración más alta de anti-CD3, verifique la viabilidad y la pureza (especialmente la contaminación por células CD44hi) de las células naïve aisladas, confirme el procedimiento de recubrimiento con anti-CD3 (selle las placas con película adhesiva durante la incubación nocturna a 4 °C y asegúrese de que el recubrimiento con anticuerpo sea uniforme) y valide la concentración de IL-2, ya que esta citocina es esencial para favorecer la expansión de linfocitos T. Para reducir la citotoxicidad inducida por CTV, disminuya la concentración de tinción manteniendo una resolución clara de los picos de división y asegúrese de que el paso de apagado se realice estrictamente sobre hielo durante los 5 minutos completos para eliminar el colorante libre residual22,23. Para mejorar la baja viabilidad tras el cultivo, controle la densidad celular, asegúrese de tener un volumen suficiente de medio y mantenga una técnica estéril. Si se observa tinción inconsistente o una alta variabilidad en citometría de flujo, prepare mezclas de anticuerpos como mezclas maestras, proteja todas las muestras teñidas de la luz y utilice los mismos lotes de anticuerpos y los mismos lotes de colorante de viabilidad fijable en todos los réplicas.
Sin embargo, este protocolo tiene ciertas limitaciones. Al ser un sistema in vitro, no puede reproducir el complejo microambiente tisular, las interacciones celulares ni el entorno de citoquinas de los órganos linfoides secundarios. La ventana de cultivo está limitada a 48 h, lo que restringe el análisis a eventos tempranos de activación y excluye la evaluación de la diferenciación tardía, el agotamiento o la formación de memoria. Además, el protocolo depende en gran medida de lecturas mediante citometría de flujo, lo que exige una rigurosa estandarización de los parámetros del instrumento, las matrices de compensación y las estrategias de selección de poblaciones en experimentos independientes. Asimismo, los hallazgos obtenidos con este sistema basado en anti-CD3/CD28 se derivan exclusivamente de linfocitos T CD8+ y podrían no ser directamente generalizables a los linfocitos T CD4+, cuyos umbrales de activación, requisitos de coestimulación y trayectorias de diferenciación posteriores se sabe que difieren12,24,25. Adicionalmente, el estado basal de activación de los linfocitos T puede variar entre colonias individuales de ratones debido a diferencias en la microbiota comensal, lo que constituye una fuente potencial de variabilidad entre laboratorios que debe tenerse en cuenta al interpretar resultados entre estudios.
El sistema de estimulación graduada descrito aquí permite a los investigadores ajustar la intensidad de la señal del TCR a objetivos experimentales específicos según los distintos patrones de respuesta observados en diferentes lecturas. Estos datos revelan que la elección de la concentración de anti-CD3 y del momento de recolección debe basarse en la pregunta biológica que se aborde. Para los marcadores de activación inmediatos tempranos, la regulación positiva de CD69 es detectable tan pronto como a las 6–12 h en todas las concentraciones, pero presenta una cinética distinta: las concentraciones altas (5–10 µg/mL) inducen un pico rápido seguido de una disminución, mientras que las concentraciones bajas (0,5–1 µg/mL) producen un aumento gradual y sostenido. Para los ensayos de proliferación, las concentraciones por debajo de 1 µg/mL son subóptimas y pueden servir como controles negativos internos, mientras que 5–10 µg/mL inducen de manera confiable una expansión clonal robusta, detectable mediante la dilución de CTV a las 48 h. La expresión del receptor co-inhibidor PD-1 y la molécula coestimuladora ICOS requiere una estimulación de alta intensidad (5–10 µg/mL) y alcanza su máximo a las 36 h, lo que indica que los estudios que investiguen estas moléculas deben evitar condiciones con dosis más bajas o tiempos anteriores. Para las lecturas de función efectora (TNF-α y Granzima B), la relación entre la intensidad de la estimulación y la producción de citocinas depende del tiempo y sigue un patrón bifásico distintivo. A las 24 h, la producción de moléculas efectoras aumenta proporcionalmente con la concentración de anti-CD3, siendo las dosis más altas las que inducen una mayor producción de citocinas. Sin embargo, a las 48 h, aunque los niveles absolutos de células productoras de citocinas son considerablemente más altos en todas las condiciones en comparación con las 24 h, la relación dosis-respuesta se invierte: las concentraciones de estimulación más bajas (0,5–1 µg/mL) producen frecuencias relativamente mayores de células TNF-α⁺ Granzima B⁺ que las dosis altas (5–10 µg/mL). Esta inversión sugiere que una señalización sostenida y fuerte del TCR, a pesar de promover la diferenciación efectora inicial, podría imponer una restricción relativa sobre el mantenimiento de la capacidad de producción de citocinas por célula, lo que posiblemente refleje el inicio del agotamiento inducido por la activación o de una hiporrespuesta.
En conjunto, estas observaciones empíricas posicionan nuestro protocolo como un marco de referencia que permite a los usuarios preseleccionar condiciones de estimulación basadas en puntos finales específicos posteriores, mejorando así la eficiencia del diseño experimental y la interpretabilidad de los datos. Más allá de los estudios mecanicistas básicos, este sistema también puede orientar la optimización de protocolos de expansión de linfocitos T para inmunoterapia adoptiva, donde la regulación precisa de la intensidad de la señal del TCR podría ayudar a dirigir la diferenciación hacia fenotipos efector o de memoria favorables26,27,28.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. T2394504, LY) y el Fondo de Inicio para la Investigación del Científico Jefe Lilin Ye (No. R2045, LY).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo cónico de 15 mL | Labgic | CD-002-15A | Tubo cónico estéril de centrífuga de 15 mL |
| Paraformaldehído al 4% | Beyotime | P0099 | Fijador acuoso al 4% para preservar células antes de la tinción |
| Placa de 60 mm | Labgic | 12211 | Placa de cultivo celular de 60 mm |
| Filtro celular de 70 µm | Labgic | BS-70-CS | Filtro de malla de nailon de 70 µm para preparar suspensiones celulares individuales |
| Placa de 96 pocillos de fondo redondo | Beyotime | FPT016 | Placa de 96 pocillos de fondo redondo para cultivo celular y tinción |
| Tampón de lisis ACK | Beyotime | C3702 | Tampón de lisis de glóbulos rojos basado en cloruro de amonio |
| Anti-murino CD25 | Biolegend | 101910 | Anticuerpo anti-murino CD25 conjugado con APC, clon 3C7, para citometría de flujo |
| Anti-murino CD28 | Bio X Cell | BE0015-1 | Anticuerpo anti-murino CD28 purificado, clon 37.51, para costimulación de linfocitos T |
| Anti-murino CD3 | Bio X Cell | BP0001-1 | Anticuerpo anti-murino CD3ε purificado, clon 145-2C11, para activación de linfocitos T |
| Anti-murino CD69 | BD Biosciences | 553237 | Anticuerpo anti-murino CD69 conjugado con PE para tinción del marcador de activación |
| Anti-murino CD8 | Invitrogen | 17-0081-82 | Anticuerpo anti-murino CD8a conjugado con APC, clon 53-6.7, para citometría de flujo |
| Anti-murino GZMB | Biolegend | 372212 | Anticuerpo anti-granzima B humano/murino conjugado con PerCP/Cianina5.5, clon QA16A02, para citometría de flujo intracelular |
| Anti-murino ICOS | BD Biosciences | 565886 | Anticuerpo anti-murino ICOS (CD278) conjugado con BV421 para citometría de flujo |
| Anti-murino PD-1 | Biolegend | 135220 | Anticuerpo anti-murino PD-1 (CD279) conjugado con BV605, clon 29F.1A12, para citometría de flujo |
| Anti-murino TNF-α | Invitrogen | 46-7321-82 | Anticuerpo anti-murino TNF-α conjugado con PerCP-eFluor 710, clon MP6-XT22, para citometría de flujo intracelular |
| Anti-murino/humano CD44 | Biolegend | 103030 | Anticuerpo anti-murino/humano CD44 conjugado con PE/Cianina7, clon IM7, para citometría de flujo |
| Anti-murino CD11b biotinilado | Biolegend | 101204 | Anticuerpo anti-murino CD11b conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino CD11c biotinilado | Biolegend | 117304 | Anticuerpo anti-murino CD11c conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino CD16/32 biotinilado | Biolegend | 156604 | Anticuerpo anti-murino CD16/32 conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino CD19 biotinilado | Biolegend | 115504 | Anticuerpo anti-murino CD19 conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino CD4 biotinilado | Biolegend | 100508 | Anticuerpo anti-murino CD4 conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino CD44 biotinilado | Biolegend | 103004 | Anticuerpo anti-murino CD44 conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino CD45R biotinilado | Biolegend | 103204 | Anticuerpo anti-murino CD45R/B220 conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino CD49b biotinilado | Invitrogen | 13-5971-85 | Anticuerpo anti-murino CD49b conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino F4/80 biotinilado | Biolegend | 123106 | Anticuerpo anti-murino F4/80 conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino Ly6G biotinilado | Biolegend | 127604 | Anticuerpo anti-murino Ly6G conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino NK1.1 biotinilado | Biolegend | 108704 | Anticuerpo anti-murino NK1.1 conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Anti-murino TER119 biotinilado | Biolegend | 116204 | Anticuerpo anti-murino TER-119 conjugado con biotina para agotamiento de linaje |
| Ratones C57BL/6 | Sibeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | N/A | Ratones macho de 6–8 semanas de edad utilizados para los experimentos |
| Incubadora de dióxido de carbono (CO2) | Thermo Fisher | 3120 | Incubadora de CO2 humedecida para cultivo celular de mamíferos |
| Tinte CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | Tinte fluorescente violeta para monitorear la proliferación celular |
| DMSO | Sigma | D2650 | Dietilsulfóxido; disolvente para preparar soluciones stock de reactivos |
| Anticuerpo secundario anti-IgG de burro anti-conejo (H+L) altamente adsorbido cruzadamente, Alexa Fluor™ 488 | Invitrogen | A-21206 | Anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con Alexa Fluor 488 |
| D-PBS | VivaCell Biosciences | C3590-0500 | Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco’s para lavado y preparación de reactivos |
| Suero bovino fetal (FBS) | Gibco | C11995500BT | Suplemento sérico para medio de cultivo celular de mamíferos |
| Tinte fijable de viabilidad | Invitrogen | 65-0865-14 | Tinte fijable de viabilidad para excluir células muertas durante la citometría de flujo |
| Solución de fijación y permeabilización | BD Biosciences | 51-2090KZ | Reactivo de fijación y permeabilización para tinción intracelular |
| Placa de 96 pocillos de fondo plano | Labgic | 11510 | Placa de 96 pocillos de fondo plano para cultivo celular y ensayos de estimulación |
| Citómetro de flujo | BD Biosciences | LSRFortessa-3 laser | Citómetro de flujo de tres láseres para adquisición de fluorescencia multicolor |
| Golgi Plug | BD Biosciences | 51-2301KZ | Inhibidor del transporte de proteínas basado en brefeldina A para tinción de citoquinas intracelulares |
| Golgi Stop | BD Biosciences | 51-2092KZ | Inhibidor del transporte de proteínas basado en monensina para tinción de citoquinas intracelulares |
| Sal de ionomicina de calcio | Sigma | I3909-1ML | Ionóforo de calcio utilizado con PMA para estimulación celular |
| Tampón Perm/Wash | BD Biosciences | 51-20911KZ | Tampón de permeabilización y lavado para tinción intracelular |
| Tampón Lyse/Fix Phosflow | BD Biosciences | 558049 | Tampón 5× para lisis simultánea de glóbulos rojos y fijación de leucocitos |
| Tampón Perm/Wash Phosflow I | BD Biosciences | 557885 | Tampón de permeabilización basado en metanol para tinción intracelular de fosfoproteínas |
| Anticuerpo monoclonal de conejo contra la proteína ribosomal S6 fosforilada (Ser235/236) (D57.2.2E) | Cell Signaling | 4858S | Anticuerpo monoclonal de conejo contra la proteína ribosomal S6 fosforilada (Ser235/236), clon D57.2.2E |
| PMA | Sigma | P1585-1MG | Acetato de 12-miristato 13-forbol; activador utilizado para estimulación celular ex vivo |
| Interleucina-2 recombinante de ratón | Gibco | 200-02-50UG | Interleucina-2 recombinante de ratón para cultivo y expansión de linfocitos T |
| RPMI 1640 | Life-Lab | AC01L064 | Medio Roswell Park Memorial Institute 1640 para cultivo celular de mamíferos |
| Perlas magnéticas de estreptavidina | BEAVER | 22307 | Perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina para agotamiento celular basado en anticuerpos biotinilados |
| Tampón de tinción para citometría de flujo | No especificado | No especificado | Tampón de tinción para citometría de flujo; no se proporcionó el proveedor ni la fórmula de preparación |
| Película de laboratorio Parafilm M | Amcor | PM996 | Película flexible autoadherente para sellar placas, tubos y recipientes de cultivo |
| Tampón Lyse/Fix | BD Biosciences | 558049 | Tampón 5× para lisis simultánea de glóbulos rojos y fijación de leucocitos |
| FlowJo | BD Biosciences | v10.8.1 | Software, versión 10.8.1, para análisis de datos de citometría de flujo |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
