Aislamiento de la microbiota asociada a semillas de tomate mediante germinación controlada y cultivo comparativo

Resumen

Este protocolo combina la esterilización estandarizada de la superficie de la semilla con la germinación controlada para permitir el aislamiento reproducible de la microbiota asociada a la semilla de tomate durante la transición de la semilla a la plántula. El enfoque mejora la recuperación de microorganismos cultivables que están subrepresentados en semillas secas y apoya estudios culturales comparativos durante el desarrollo temprano de plántulas.

Resumen

La esterilización superficial es un paso crítico pero a menudo poco optimizado en estudios que buscan aislar microorganismos asociados a las semillas, ya que tratamientos excesivamente agresivos pueden reducir o distorsionar poblaciones microbianas endógenas. Este protocolo presenta un enfoque reproducible para aislar microbiota asociada a semillas de tomate cultivables utilizando condiciones de esterilización superficial basadas en metodologías previamente validadas, combinadas con la germinación controlada de semillas. En lugar de definir tratamientos de esterilización universalmente óptimos, el enfoque aplica condiciones estandarizadas que pueden ajustarse según las características de las semillas, minimizando el sesgo y preservando las poblaciones microbianas endógenas.

Para mejorar la recuperación de microorganismos cultivables asociados con la transición de semilla a plántula, el protocolo incorpora un paso controlado de germinación antes del aislamiento microbiano. A diferencia de los enfoques convencionales basados en la maceración de semillas secas y no germinadas, la germinación controlada promueve la activación microbiana durante la transición de la semilla a la plántula en condiciones estériles. Análisis comparativos basados en unidades formadoras de colonias (UFC) de réplicas biológicas equivalentes, cada una compuesta por material agrupado de 3–5 semillas secas o 3–5 plántulas germinadas, revelaron un cambio notable en la comunidad cultivable tras la germinación. Los géneros que estaban débilmente representados en semillas secas se enriquecieron tras la germinación, mientras que otros taxones más abundantes en semillas secas disminuyeron en su representación relativa, lo que apoya estudios sobre las primeras interacciones planta-microbio durante el establecimiento de plántulas.

En réplicas biológicas, géneros como Stutzerimonas, Stenotrophomonas y Priestia se enriquecieron de forma consistente entre aislados recuperados de plántulas germinadas, mientras que Paenibacillus se mantuvo abundante en todas las condiciones pero mostró cambios notables en la composición a nivel de especie. Al integrar condiciones de esterilización estandarizadas con la germinación controlada y el análisis comparativo de material seco y germinado, este protocolo proporciona un marco robusto y reproducible para el aislamiento culturalista de la microbiota asociada a la semilla, con potencial relevancia funcional durante el desarrollo temprano de plántulas, y apoya estudios sobre las interacciones tempranas planta-microbio durante el establecimiento de plántulas.

Introducción

Las semillas albergan diversas comunidades microbianas compuestas por bacterias y hongos asociados tanto con tejidos internos como con superficies ^{externas 1,2,3}. Estos microorganismos son cada vez más reconocidos como componentes integrales de la biología vegetal porque pueden influir en el rendimiento de la planta desde las primeras etapas del desarrollo, incluyendo la germinación, el establecimiento de plántulas y las respuestas al estrés biótico ^{y abiótico 1,2,3}. En términos ecológicos, las semillas funcionan no solo como propágulos para la reproducción vegetal, sino también como reservorios de inóculo microbiano, lo que las convierte en un punto de entrada fundamental para entender cómo se inician y mantienen los microbiomas asociados a las plantas a lo largo del ciclo de vida^{de la planta 1,2,3}.

Los microorganismos asociados a la semilla pueden constituir el primer inóculo microbiano que encuentra la planta emergente y, por tanto, pueden contribuir al ensamblaje del microbioma durante la transición de semilla a^{plántula 1,3,4}. Este inóculo temprano puede influir en las comunidades microbianas que posteriormente colonizan raíces y otros compartimentos vegetales, con consecuencias para el establecimiento de la planta y posteriores interacciones^{planta-microbio 1,4}. Además, parte de la microbiota de la semilla puede transmitirse verticalmente a través de estructuras reproductivas como flores, óvulos y polen, permitiendo que las poblaciones microbianas persistan a lo largo de las generaciones^{4 y 5} de plantas. Esta continuidad intergeneracional sugiere que algunos microorganismos transmitidos por semillas pueden contribuir de forma constante a la aptitud y adaptación de las plantas.

Funcionalmente, los microorganismos asociados a las semillas pueden afectar al rendimiento del huésped mediante varios mecanismos, incluyendo la producción de fitohormonas, compuestos antimicrobianos y otros metabolitos bioactivos que modulan el desarrollo de las plantas o suprimen competidores y^{patógenos 5,6,7}. Las poblaciones microbianas transmitidas por semillas también parecen coexistir mediante un uso diferencial de recursos y la partición ecológica, lo que sugiere que la semilla representa un hábitat selectivo más que un recipiente pasivo de diversidad^{microbiana 7}. En conjunto, estos hallazgos apoyan la idea de que las semillas albergan poblaciones microbianas que pueden influir en el desarrollo temprano de las plantas y representan candidatos para la caracterización funcional posterior 2,3,5,7.

Para investigar microorganismos asociados a la semilla de manera funcionalmente informativa y experimentalmente manejable, es necesario recuperar poblaciones microbianas viables a partir del material semilla. En este contexto, el aislamiento microbiano proporciona acceso a microorganismos vivos que posteriormente pueden caracterizarse experimentalmente y evaluarse en ensayos posteriores relevantes para las interacciones planta–microbio. Esto es especialmente importante en sistemas de semillas, donde los microorganismos asociados a la semilla pueden contribuir al establecimiento temprano de la planta y representar candidatos para el cribado funcional y su uso aplicado futuro.

La recuperación de microorganismos asociados a la semilla es muy sensible a los procedimientos de preparación de la muestra, especialmente la esterilización superficial, el procesamiento de tejidos y la etapa de desarrollo del material muestreado. Esta sensibilidad es especialmente relevante en sistemas de semillas porque la biomasa microbiana suele ser baja, y pequeñas diferencias procedurales pueden afectar fuertemente tanto al recuento de unidades formadoras de colonias como a la composición de aislados. Entre estas variables, la esterilización superficial es una de las más críticas y difíciles de optimizar. La esterilización es necesaria para reducir la contaminación por epífitos antes del aislamiento microbiano, pero la exposición excesiva a esterilizantes puede disminuir la viabilidad o cultivabilidad de los microorganismos endógenos, mientras que una esterilización insuficiente puede permitir que los taxones asociados a la superficie dominen cultivos^{posteriores 8,9,10}. Por tanto, el objetivo de la esterilización no es maximizar la exposición química, sino aplicar el tratamiento más suave que suprima eficazmente la contaminación de origen superficial mientras preserva microorganismos internos^{recuperables 5,11}.

Dado que la eficiencia de la esterilización depende de la especie vegetal, la estructura tisular, las propiedades de la cubierta de la semilla y la comunidad microbiana asociada, los protocolos deben seleccionarse a partir de metodologías previamente validadas y luego adaptarse con cautela al sistema bajo estudio ^8,12,13. En materiales de baja biomasa, como las semillas de tomate, este equilibrio es especialmente importante: la sobreesterilización puede reducir drásticamente la recuperación microbiana, mientras que la subesterilización aumenta la probabilidad de que los contaminantes superficiales de rápido crecimiento dominen los aislados obtenidos. Por esta razón, la eficiencia de la esterilización debe verificarse de forma rutinaria en lugar de asumirla. El enchapado del agua final de enjuague proporciona un control práctico para la contaminación externa residual, pero este control siempre debe interpretarse junto con la recuperación microbiana de homogeneados de semillas o plántulas. Un protocolo que proporcione controles de enjuague estériles pero poca o ninguna microbiota interna recuperable puede ser inadecuado cuando el objetivo es el aislamiento microbiano comparativo en lugar de la descontaminación^máxima 6,8,10,14.

Por tanto, las comparaciones significativas requieren una fuerte estandarización procesal. En muestras de baja biomasa, las inconsistencias en el lavado, transferencia, homogeneización, dilución, chapado o incubación pueden alterar tanto la recuperación microbiana total como la representación aparente de taxones individuales. Esto es especialmente importante al comparar material seco y material germinado, donde la variación metodológica puede confundirse fácilmente con un cambio biológico.

Una limitación importante de muchos protocolos de microbiología de semillas es que dependen exclusivamente de semillas secas y no germinadas como material de partida. Aunque esto proporciona una referencia útil para la fracción microbiana presente antes de la activación de la semilla, puede subestimar a los microorganismos que están latentes, metabólicamente inactivos, estresados o inicialmente presentes en baja abundancia^{relativa 2,15}.

En estado seco, las semillas representan un entorno fisiológicamente tranquilo en el que tanto los tejidos hospedadores como los microorganismos asociados pueden permanecer relativamente inactivos. En consecuencia, las poblaciones microbianas recuperadas directamente de semillas secas pueden no representar completamente aquellas que se vuelven más fácilmente recuperables una vez que comienza la germinación.

Durante la germinación, las semillas sufren absorción de agua, reactivación metabólica, movilización de nutrientes y reorganización de tejidos, todo lo cual altera el entorno local disponible para los microorganismos^{asociados 11,16}. Estos cambios pueden favorecer el crecimiento microbiano, alterar la representación relativa de poblaciones microbianas y facilitar la detección o recuperación de taxones que antes eran raros o poco recuperados en semillas secas. Además, la emergencia de radiculares crea un nuevo compartimento vegetal que puede apoyar la proliferación y redistribución microbiana, haciendo de la transición de semilla a plántulas una etapa especialmente informativa para el análisis^{microbiológico 1,17}.

Por esta razón, el procesamiento paralelo de semillas secas y plántulas germinadas proporciona un diseño experimental más informativo que el análisis de semillas secas por sí solas. Las semillas secas establecen una línea base para las poblaciones cultivables presentes antes de su activación, mientras que el material germinado permite una evaluación comparativa de taxones que se vuelven más fácilmente recuperables durante el desarrollo temprano. Este enfoque es especialmente útil cuando el objetivo no es solo catalogar microorganismos recuperables, sino también identificar taxones asociados con la transición de semilla a plántula y priorizar aislados para la caracterización posterior (Figura 1).

Figura 1: Visión conceptual y procedimental del flujo de trabajo de aislamiento comparativo. (A) Representación conceptual de la condición de la semilla seca del tomate antes de la germinación. (B) Representación conceptual de la condición de la semilla germinada del tomate durante la transición de la semilla a la plántula. (C) Flujo de trabajo esquemático del protocolo, incluyendo esterilización de la superficie de la semilla, evaluación de enjuague y control, procesamiento directo de semillas secas o germinación controlada, homogeneización de réplicas biológicas agrupadas, dilución y chapado en serie, cuantificación basada en UFC, recuperación de aislamientos, identificación taxonómica y análisis comparativo de material seco y germinado. Los puntos de control críticos destacados en el flujo de trabajo incluyen la eficiencia de la esterilización, réplicas biológicas equivalentes y análisis consistentes de placas y UFC. Los paneles A y B se prepararon como ilustraciones conceptuales asistidas por IA solo para representación visual. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Dado que el protocolo está destinado a comparar la recuperación microbiana de material seco y germinado, es esencial una estricta consistencia metodológica. Todas las comparaciones deben realizarse utilizando el mismo lote de semilla, condiciones de esterilización idénticas, el mismo medio de cultivo y procedimientos equivalentes de dilución, chapado e incubación. Sin este nivel de estandarización, las diferencias aparentes entre muestras secas y germinadas pueden reflejar variaciones técnicas más que un enriquecimiento biológicamente significativo. Esto es especialmente importante en flujos de trabajo aislados, donde la fracción recuperada se forma tanto por la muestra biológica como por los efectos selectivos del propio procedimiento^{experimental 4,15}.

La replicación biológica también es indispensable. Los taxones de baja abundancia pueden variar entre lotes de semillas, y la recuperación microbiana de muestras con baja biomasa es inherentemente estocástica incluso bajo condiciones cuidadosamente controladas. Se recomienda al menos cinco réplicas biológicas independientes por condición para una comparación robusta. En este flujo de trabajo, cada réplica biológica consiste en material agrupado de 3–5 semillas secas o 3–5 plántulas germinadas procesadas como una sola muestra. Además, todas las manipulaciones tras la esterilización deben realizarse en condiciones asépticas para minimizar la contaminación secundaria y preservar la interpretabilidad del conjunto de aislados resultante.

La duración de la germinación también debe seleccionarse cuidadosamente. Debe ser lo suficientemente largo para permitir la aparición de radiculares y el desarrollo temprano de plántulas, pero no tan prolongado como para que el crecimiento posterior de las plantas introduzca una complejidad ecológica adicional no relacionada con la transición inmediata de semilla a plántula. Para el tomate, un periodo de germinación de hasta 5 días en condiciones estériles proporciona una ventana práctica en la que la plántula permanece estrechamente vinculada al entorno de la semilla, mientras que la activación y redistribución microbiana temprana ya puede producirse. Es esencial una sincronización consistente entre experimentos porque las diferencias en la etapa de desarrollo pueden influir en los patrones de recuperación microbiana. Este flujo de trabajo es más adecuado para la recuperación comparativa de microbiota cultivable de sistemas de semillas de baja biomasa cuando el objetivo es evaluar los desplazamientos asociados a la germinación bajo condiciones estandarizadas. Es menos adecuado para la estimación directa de la diversidad total del microbioma de semillas o para sistemas experimentales en los que se requieren enfoques independientes del cultivo para captar la comunidad microbiana más amplia.

El objetivo de este protocolo es proporcionar un marco reproducible para el aislamiento de la microbiota asociada a semillas de tomate cultivables mediante la integración de la esterilización estandarizada de superficies con la germinación controlada de semillas. El método permite el análisis comparativo de semillas secas y plántulas germinadas utilizando réplicas biológicas equivalentes, cada una compuesta por material agrupado de 3–5 semillas secas o 3–5 plántulas germinadas, para evaluar los desplazamientos dependientes de la germinación en la recuperación de la unidad formadora de colonias (UFC) y la composición taxonómica. Al minimizar el sesgo de esterilización y promover la recuperación microbiana durante la transición de semilla a plántula, este enfoque facilita el aislamiento de microorganismos con potencial relevancia funcional durante el desarrollo temprano de plántulas y apoya estudios posteriores de interacciones tempranas planta-microbio.

Protocolo

1. Preparación de reactivos, medios y materiales estériles

1. Prepara una solución de etanol al 70% (v:v) usando agua destilada estéril.
2. Prepara una solución de trabajo al 20% (v:v) con lejía comercial que contenga un 5% de hipoclorito de sodio disponible diluyendo 20 mL de lejía en 80 mL de agua destilada estéril.
3. Prepara agua destilada estéril para los pasos de lavado.
4. Prepara NaCl estéril al 0,45% para homogeneización y dilución en serie, y utiliza esta solución de forma constante durante todo el flujo de trabajo.
5. Preparar el medio de cultivo de agar Luria Bertani (LB) (por litro: 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl y 15 g de agar) y vierte las placas con antelación en condiciones estériles.
6. Esteriliza todos los instrumentos que entren en contacto con semillas o plántulas tras la esterilización, incluyendo pinzas, morteros, dispersores, tijeras y estantes de tubos, mediante autoclav o tratamiento aséptico validado.
7. Coloca placas de Petri estériles, tubos, puntas de pipeta y placas de cultivo dentro de una campana de flujo laminar antes de comenzar la manipulación de semillas.
   NOTA: Dado que la biomasa microbiana asociada a las semillas puede ser baja, es importante minimizar el tiempo de manipulación innecesario y tener todos los materiales listos antes de comenzar la esterilización. Los retrasos entre tratamientos químicos, lavado, chapado o preparación de germinación pueden introducir variabilidad en la recuperación. Se pueden usar buffers estériles alternativos en otros sistemas experimentales, pero un solo buffer debe mantenerse durante todo el experimento comparativo. Medios adicionales como el 2A de Reasoner (R2A) o medios selectivos pueden incluirse en flujos de trabajo culturómicos extendidos, pero el agar LB se utilizó como medio estándar para el protocolo comparativo descrito aquí.

2. Selección y asignación de semillas

1. Utiliza semillas de un solo lote de tomate para cada experimento siempre que sea posible.
   NOTA: En el flujo de trabajo representativo descrito aquí, se utilizaron semillas de tomate de un solo lote de cv. Money Maker durante cada experimento.
2. Inspecciona visualmente las semillas y descarta las que estén dañadas, visiblemente rotas o deformadas.
3. Divide las semillas en los grupos experimentales necesarios para el estudio. Como mínimo, asigna semillas a: aislamiento de semillas secas tras la esterilización, y germinación seguida del aislamiento de plántulas.
4. Si se va a probar más de una condición de esterilización, asigna semillas aleatoriamente entre tratamientos de esterilización para evitar sesgos de tratamiento causados por el tamaño o la condición de la semilla.
   NOTA: Todas las comparaciones posteriores son más sólidas cuando se basan en el mismo lote semilla procesado en paralelo. El flujo de trabajo puede adaptarse a otros genotipos o variedades de tomate, pero cualquier comparación dentro de un experimento debe realizarse utilizando un solo lote de semillas procesado en paralelo.

3. Esterilización superficial de semillas de tomate

1. Transfiere 3–5 semillas a cada tubo estéril de microcentrífuga de 2 mL dentro de una campana de flujo laminar.
2. Añade 1 mL de etanol al 70% (v:v) a cada tubo para sumergir completamente las semillas.
3. Incuba los tubos durante 5 minutos con una mezcla suave con el rotador del tubo a 25 rpm.
4. Elimina completamente el etanol usando una pipeta estéril.
5. Inmediatamente añade 1 mL de la solución de trabajo de hipoclorito de sodio al 20% (v:v) a cada tubo para sumergir completamente las semillas.
6. Incuba los tubos durante 10 minutos con una suave agitación del rotador del tubo a 25 rpm.
7. Elimina completamente la solución de hipoclorito sódico usando una pipeta estéril.
8. Lava las semillas tres veces con 1 mL de agua destilada estéril por lavado.
   1. En cada lavado, añade agua estéril, mezcla suavemente durante 30 segundos, deja que las semillas se asienten durante 30 segundos si es necesario y retira completamente la solución antes de añadir agua estéril fresca.
9. Conserva el agua final de enjuague de cada tubo para controlar la eficiencia de la esterilización.
10. Transfiere las semillas esterilizadas a placas de Petri estériles o tubos estériles, según si se procesarán inmediatamente como semillas secas o se usarán para germinación controlada.
    PRECAUCIÓN: Manipular el hipoclorito de sodio utilizando el equipo de protección individual adecuado y realizar todos los pasos conforme a los procedimientos de seguridad química institucional.
    NOTA: La secuencia de etanol-hipoclorito sódico utilizada aquí fue seleccionada como condición de trabajo estandarizada para semillas de tomate basándose en flujos de trabajo de esterilización previamente validados. Utiliza las mismas condiciones de esterilización para todas las muestras incluidas en un experimento comparativo. Si se evalúan más de un régimen de esterilización, se procesa cada tratamiento en paralelo y se evalúa la eficiencia de la esterilización de forma independiente para cada condición. Minimizar el tiempo entre el lavado final y el procesamiento aguas abajo para reducir la variabilidad en la recuperación microbiana.

4. Verificación de la eficiencia de la esterilización

1. Preparar diluciones en serie de 10 veces del agua final de enjuague en NaCl estéril al 0,45%, transfiriendo 100 μL de agua de enjuague a 900 μL de diluyente y repitiendo el mismo paso secuencialmente hasta ^10-4. Placar 100 μL de cada dilución sobre agar LB usando el mismo método de chapado aplicado a homogeneados de semillas secas y plántulas germinadas.
2. Incubar las placas a 28 °C durante 24–48 horas.
3. Inspecciona las placas para detectar crecimiento de la colonia tras la incubación.
4. Registra la presencia o ausencia de colonias para cada dilución. Si hay colonias presentes, registra el nivel de dilución, el número aproximado de colonias y la morfología visible de la colonia.
   NOTA: Utilice el mismo volumen y formato de enjuaguado durante todo el experimento para permitir la comparación directa entre los controles de enjuague y las muestras biológicas. Si no se detectan colonias en las placas de control de enjuague sin diluir o con menor dilución, se registra la muestra como sin crecimiento detectable bajo las condiciones de cultivo utilizadas.

5. Procesamiento de semillas secas (no germinadas)

1. Transfiere conjuntos agrupados de 3–5 semillas secas esterilizadas, correspondientes a una réplica biológica, a tubos estériles de microcentrífuga de 2 mL que contienen 1 mL de NaCl estéril al 0,45%.
2. Homogeneiza las semillas usando un mano estéril desechable hasta que los tejidos de la semilla estén visiblemente alterados y no queden estructuras intactas.
3. Homogenea el vórtice durante 30 segundos para resuspender las células microbianas de forma uniforme.
4. Preparar diluciones en serie de 10 veces del homogenado en NaCl estéril al 0,45% transfiriendo 100 μL de homogeneado a 900 μL de diluyente para la primera dilución y repitiendo la misma proporción secuencialmente hasta ^10-6.
5. Placa 100 μL de las diluciones seleccionadas sobre agar LB usando placado por expansión.
6. Incubar las placas a 28 °C durante 24–72 horas.
7. Selecciona las placas correspondientes al rango de dilución que produce colonias aisladas y numerables para estimar la CFU aguas abajo y aislar la recuperación.
8. Registrar el recuento total de colonias, los morfotipos visibles de colonias y cualquier diferencia en el patrón de crecimiento entre réplicas.
   NOTA: Realizar el procesamiento de semillas en seco en paralelo con muestras de plántulas germinadas utilizando el mismo medio de cultivo, esquema de dilución, volumen de placado y condiciones de incubación. El ágar LB se utilizó como medio estándar para el flujo de trabajo comparativo descrito aquí. Se pueden incorporar medios adicionales en flujos de trabajo de aislamiento extendidos cuando se requiere una recuperación más amplia de taxones de crecimiento lento.

6. Germinación axénica de semillas esterilizadas

1. Coloca las semillas esterilizadas sobre soportes de germinación estériles, como placas de agar Murashige y Skoog (MS).
2. Espacia las semillas de forma uniforme para evitar el contacto entre plántulas emergentes.
3. Sella las placas con película de sellado de laboratorio o material equivalente que reduzca la contaminación externa permitiendo la germinación normal.
4. Incubar las placas horizontalmente a 25 °C en la oscuridad.
5. Permitir que las semillas germinen en condiciones estériles hasta que el establecimiento temprano de las radiculares sea claramente visible; En el experimento representativo, esto correspondió a 5 días de incubación.
6. Revisa las placas regularmente en busca de signos de contaminación, germinación anormal o condensación excesiva.
   NOTA: Las condiciones de germinación deben mantenerse constantes entre los replicados. La variación en la duración de la germinación o en la etapa de plántulas puede alterar la recuperación microbiana independientemente del efecto estudiado. Otros soportes estériles para la germinación, como placas Phytoagar o papel filtro húmedo estéril, pueden usarse en flujos de trabajo adaptados, siempre que el soporte se mantenga constante en cada experimento. Se pueden utilizar orientaciones alternativas de placas para la incubación, dependiendo del recipiente de germinación, pero la orientación debe mantenerse constante dentro del experimento. (Punto de pausa) Las plántulas germinadas pueden mantenerse brevemente a 4 °C antes de su procesamiento si es necesario, pero se prefiere el procesamiento inmediato siempre que sea posible.

7. Aislamiento de microorganismos de plántulas germinadas

1. Recoge las plántulas germinadas usando pinzas estériles dentro de una campana de flujo laminar.
2. Transfiere el material acumulado de 3–5 plántulas germinadas, correspondientes a una réplica biológica, a tubos estériles de microcentrífuga de 2 mL.
3. Añade 1 mL de NaCl estéril al 0,45% a cada tubo.
4. Homogeneiza el material de plántulas acumulado a fondo usando un mano estéril desechable, asegurando que tanto la raíz emergente como el tejido residual de la semilla se incluyan, hasta que los tejidos se alteren visiblemente.
5. Homogenea el vórtice durante 30 segundos para liberar y resuspender las células microbianas de forma uniforme.
6. Preparar diluciones en serie de 10 veces del homogenado en NaCl estéril al 0,45% transfiriendo 100 μL de homogeneado a 900 μL de diluyente para la primera dilución y repitiendo la misma proporción secuencialmente hasta ^10-4.
7. Placa 100 μL de las diluciones seleccionadas sobre agar LB usando el sector, chapado por caída.
8. Incubar las placas a 28 °C durante 24–72 horas. Registrar el recuento total de colonias, los morfotipos visibles y las diferencias respecto a las muestras de semillas secas.
   NOTA: Defina una réplica biológica como material agrupado de 3–5 plántulas germinadas y procese todas las réplicas en paralelo usando el mismo esquema de dilución, volumen de placa, medio de cultivo y condiciones de incubación. Incluir tanto el tejido residual de la semilla como la raíz emergente en el homogenado para mantener la consistencia entre las muestras de plántulas germinadas.

8. Recuento de colonias y recuperación por aislamiento

1. Tras la incubación, selecciona las placas de dilución que producen colonias numerables y bien separadas. Utiliza placas que contengan entre 30 y 300 colonias para estimar la UFC.
2. Cuenta las colonias en las placas seleccionadas y calcula la UFC por réplica biológica usando la siguiente fórmula:
   UFC por réplica = (número de colonias × factor de dilución)/volumen chapado (mililitro)
   1. Si se utilizan más de una placa de la misma dilución, calcular el recuento medio de colonias para esa dilución antes de aplicar la fórmula.
3. Registrar la morfología de la colonia usando descriptores estandarizados, incluyendo tamaño, forma, color, borde, elevación y opacidad.
4. Selecciona colonias para aislamiento aguas abajo y así minimizar el sesgo de muestreo. Selecciona todos los morfotipos distinguibles cuando el número de colonias es bajo, o selecciona aleatoriamente varias colonias entre placas cuando el número de colonias es alto.
5. Re-colócate las colonias seleccionadas sobre placas frescas de agar LB para obtener cultivos puros.
6. Repite la reactivación hasta que cada aislado muestre una morfología uniforme de colonia en la placa.
   NOTA: Informe claramente si los valores de CFU se expresan por réplica biológica, por unidad de biomasa o utilizando otro enfoque de normalización. Si se aplican enfoques adicionales de normalización, incluyendo la normalización basada en biomasa, describe explícitamente el método de cálculo en la sección de análisis de datos.

9. Conservación de aislados purificados

1. Inocular las colonias puras en un medio de cultivo líquido de LB e incubar hasta obtener crecimiento visible.
2. Mezcla cultivo (1:1, v:v) con glicerol estéril al 80% según la práctica microbiológica estándar.
3. Guarda crioestoques a -80 °C.
4. Mantener un registro digital de cada aislado, incluyendo el origen de la muestra, número de réplica, estado (semilla seca o plántula germinada), tratamiento de esterilización, fecha de aislamiento, medio de placas, morfología de la colonia y estado de identificación aguas abajo.
   NOTA: Los metadatos precisos del aislado son esenciales si se quiere vincular los patrones de enriquecimiento a la etapa de semilla, el tratamiento o la réplica biológica.

10. Identificación molecular de aislados

1. Extrae ADN genómico de cultivos bacterianos purificados utilizando un kit de extracción de ADN bacteriano según las instrucciones del fabricante.
2. Amplificar el gen bacteriano 16S rRNA utilizando la región hipervariable V5-V8 o el gen 16S rRNA casi de longitud completa.
   1. Para la amplificación de la región V5–V8 (~700 bp), se usan cebadores 799F (5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′) y 1392R (5′- ACGGGCGGTGTRC-3′).
   2. Para la amplificación del gen de ARNr 16S casi de longitud completa (~1500 pb), se utilizan cebadores 27F (5′-AGAGTTTCCCCTGGCTCAG-3′) y 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′).
   3. Preparar cada reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un volumen final de 25 μL utilizando mezcla maestra PCR, 0,4 μM de cada cebador y 1 μL de ADN plantilla.
   4. Funcionar en un ciclador térmico bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 minutos; 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 3 segundos, recocido a 45 °C durante 30 segundos y extensión a 72 °C durante 2 minutos; seguida de una última extensión a 72 °C durante 7 minutos. Incluye un control sin plantilla en cada ejecución de PCR.
3. Verifica los productos de PCR mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% y visualiza los amplicones usando un sistema de electroforesis e imagen en gel.
4. Purifica los productos de PCR usando un kit de limpieza de PCR según las instrucciones del fabricante y presenta los amplicones purificados para la secuenciación de Sanger.
5. Comprobar la calidad, recortar y montar las secuencias resultantes cuando sea necesario.
   1. Compare cada secuencia con la base de datos de nucleótidos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) utilizando BLASTn (ajustes de megablastos para secuencias altamente similares).
   2. Utiliza el resultado mejor soportado para asignar la taxonomía. Asignar aislados al nivel de género cuando el mejor impacto muestre una cobertura adecuada de alineación y al menos un 94,5% de identidad de secuencia.
   3. Utilice asignación tentativa a nivel de especie solo cuando el mejor resultado muestre al menos un 98,7% de identidad de secuencia, alta cobertura de consulta y sin coincidencias superiores contradictorias entre especies estrechamente relacionadas.
   4. Si falla la amplificación repetida o la calidad de la secuencia es insuficiente, registra el aislamiento como No Identificado. Dado que la similitud del ARNr 16S por sí sola puede no resolver especies bacterianas estrechamente relacionadas, se trata todas las asignaciones a nivel de especie como provisionales y confírmalas mediante análisis filogenéticos o basados en el genoma cuando sea necesario.
6. Informa de la identidad aislada en la resolución taxonómica más alta soportada. Utiliza estas identificaciones para validar agrupaciones basadas en morfología y para priorizar aislamientos representativos para análisis genómicos y funcionales posteriores.
   NOTA: Este paso de identificación molecular está destinado a apoyar la clasificación de aislados y la selección de cepas representativas. No debe usarse para inferir la estructura comunitaria ni patrones cuantitativos de abundancia entre tratamientos.

11. Análisis de datos

1. Realiza el experimento con al menos cinco réplicas biológicas por condición.
   NOTA: En este flujo de trabajo, cada réplica biológica consiste en material agrupado de 3–5 semillas secas o 3–5 plántulas germinadas procesadas como una sola muestra.
2. Para cada condición, cuantifique: (i) recuperación total de UFC, (ii) número de morfotipos visibles de colonias, (iii) número de aislados purificados y (iv) composición taxonómica de la microbiota cultivable recuperada a nivel de género y, cuando sea relevante, a nivel de especie.
3. Comparar muestras de semillas secas y plántulas germinadas para evaluar los cambios dependientes de la germinación en la recuperación total y la composición taxonómica.
4. Calcula la representación relativa de cada taxón como el porcentaje del total de UFC recuperadas bajo cada condición. Calcula los cambios de pliegue usando valores absolutos de CFU.
5. Analizar datos cuantitativos utilizando un software de análisis estadístico adecuado (por ejemplo, GraphPad Prism [v11.0.2]). Informa de los datos como media ± desviación estándar (DS).
   1. Para comparaciones por pares entre muestras de semillas secas y plántulas germinadas, se utiliza una prueba t de Student de dos colas cuando los datos cumplen las suposiciones de normalidad.
   2. Cuando no se cumplen esas suposiciones, se utiliza una prueba U de Mann–Whitney. Consideremos diferencias estadísticamente significativas en p < 0,05.
6. Informa claramente si cada valor mostrado corresponde a las CFU absolutas, porcentajes relativos derivados de la CFU o cambios de plegamiento calculados a partir de valores absolutos de CFU.
   NOTA: Utilice los mismos criterios de cálculo a lo largo del estudio para permitir la comparación directa entre muestras de semillas secas y de plántulas germinadas. Al presentar la composición taxonómica, indique explícitamente si los valores se muestran a nivel de género o a nivel de especie.

12. Puntos críticos de control de calidad y resolución de problemas

1. Un enjuague final estéril no demuestra por sí solo que el régimen de esterilización seleccionado sea óptimo para el objetivo experimental. Limitar la contaminación externa mientras se preserva la recuperación de microorganismos cultivables de la fracción interna o fuertemente asociada a la semilla. Interpreta los resultados del control de enjuague junto con la recuperación microbiana de homogeneados de semillas secas y plántulas germinadas.
2. Una baja recuperación tanto de muestras secas como germinadas puede indicar sobreesterilización, homogeneización excesivamente agresiva, condiciones de cultivo inapropiadas o retraso en el procesamiento de la muestra. En estos casos, verificar que los tiempos de esterilización se aplicaron de forma consistente, confirmar que la alteración tisular fue suficiente pero no excesiva, y asegurar que la dilución, la laminación y la incubación se realizaron de inmediato y bajo las mismas condiciones en todas las muestras.
3. Una alta contaminación en los controles de enjuague, o un crecimiento excesivo rápido por un pequeño número de tipos de colonias, pueden indicar una esterilización insuficiente o contaminación introducida durante el manejo posterior a la esterilización. En estos casos, revisa el tiempo de esterilización, los pasos de lavado, el manejo aséptico y la organización de los materiales dentro de la campana laminar antes de repetir el experimento.
4. Interpretar las diferencias entre muestras secas y germinadas biológicamente solo cuando la etapa de germinación, la estructura de réplica biológica, el medio de cultivo, el esquema de dilución, el volumen de chapado y las condiciones de incubación se estandarizaron en todo el experimento.
5. Al trabajar con material semilmiente de baja biomasa, la aparente ausencia de ciertos taxones en una condición también puede reflejar una submuestreo más que una ausencia real. Por esta razón, realiza un procesamiento replicado consistente e identificación a nivel de aislamiento para interpretar de forma robusta los desplazamientos asociados a la germinación.

13. Guardar muestras para otros enfoques

1. Tras verificar la eficiencia de la esterilización y antes del placado, transfiere una alicuota adicional de 200 μL de cada homogenado de semilla seca o plántula germinada a un tubo estéril de microcentrífuga de 1,5 mL.
2. Etiqueta cada tubo con el tipo de muestra, número de réplica biológica, condición de tratamiento y fecha de recogida.
3. Congela las alicuotas inmediatamente y guárdalas a -80 °C hasta que se utilicen en análisis posteriores.
4. Utiliza el material homogeneado almacenado para enfoques complementarios como análisis basados en ADN, ensayos basados en microscopía o experimentos de confirmación que requieran la misma réplica biológica inicial.
   NOTA: Almacenar las alicuotas antes de la dilución y chapado en serie para preservar la composición original homogenada. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación preparando alícuotas separadas cuando se planifiquen múltiples análisis aguas abajo.

Resultados

Desempeño de la esterilización superficial y control de contaminación externa
La esterilización superficial utilizando condiciones estandarizadas basadas en metodologías previamente validadas resultó en una reducción efectiva de la contaminación microbiana externa, al tiempo que se preservaba la recuperación de microorganismos cultivables a partir de material derivado de las semillas. El chapado del agua de enjuague final no mostró crecimiento detectable de colonias, ...

Discusión

Los resultados presentados aquí demuestran que la integración de la esterilización estandarizada de superficies con la germinación controlada de semillas proporciona un marco sólido para el aislamiento culturómico de microbiotas asociadas a semillas. Un resultado clave de este protocolo es la capacidad de equilibrar la eliminación efectiva de contaminantes externos con la preservación de poblaciones microbianas endógenas. Este equilibrio es fundamental en estudios basados en cultivo, don...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	Sigma-Aldrich	01916-500G	Componente del medio de agar LB; 15 g/L.
Autoclave	Lab1st	SV120H	Usado para esterilizar instrumentos/materiales o validar tratamiento aséptico.
Kit de extracción de ADN bacteriano	Promocell	PK-MB708-206-100	Extracción de ADN
Configuración de conteo/registro de colonias	OCS	B079Y5W57N	Necesario para registrar UFC, morfotipos y diferencias en placas; el manuscrito no especifica el contador/modelo.
Viales de crioconservación	Sigma-Aldrich	Z359033	Implícito para el almacenamiento de cepas en glicerol a -80 °C; no se especifica explícitamente pero es necesario para el paso de preservación.
Sistema digital de registro de aislados	No especificado en el manuscrito	No aplicable	Usado para registrar metadatos de aislados: origen, réplica, condición, tratamiento de esterilización, fecha de aislamiento, medio en placa, morfología, estado de identificación.
Etanol	VWR	83813440	Usado para preparar solución de etanol al 70% v/v para la esterilización de la superficie de semillas.
Papel filtro	Fisher Scientific	11718772	Alternativa opcional de soporte de germinación.
Fórceps/Pinzas	Sigma-Aldrich	930229	Usados para transferir semillas y recolectar plántulas germinadas.
Kit de extracción de ADN genómico	PromoCell	PK-MB708-206-100	Usado para extraer ADN genómico de cultivos bacterianos purificados; no se especifica el kit/método exacto.
Glicerol, estéril 80%	VWR	24388364	Mezclado 1:1 v/v con cultivo líquido para la preparación de cepas en crioconservación.
Caperuza de flujo laminar Bio48	Faster	LAB-CAP-22	Requerida para el manejo aséptico de semillas, transferencias de esterilización y preparación de materiales estériles.
Medio de agar LB	VWR	846495000	Medio estándar utilizado para cultivo comparativo; por litro: 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl, 15 g de agar.
Tubos de microcentrifugación	Ratiolab	RATI5615000	Usados para la esterilización de semillas y procesamiento de muestras.
Medio MS	Sigma	M0404-10L	Mencionado como soporte de germinación estéril para germinación axénica.
NZYTaq II 2× Master mix	Nzytech	MB35803	Mezcla PCR para amplificación
Parafilm	Parafilm/Merck	HS234526A	Usado para sellar placas de germinación mientras se reduce la contaminación.
Platos de Petri	Labbox	PDIP-E9N-500	Usados para configuración de germinación, emplatado y manejo de semillas esterilizadas.
Fitoagar	Duchefa Biochemie	9002-18-0	Mencionado como un soporte de germinación estéril alternativo opcional.
Juego de pipetas y puntas	Merck	EP3123000918-1EA	Usados para retirar soluciones de esterilización, lavado, dilución y emplatado.
Medio de agar R2A	HI-MEDIA	M1743-500G	Medio adicional opcional para flujos de trabajo de culturomica extendida.
Cloruro de sodio, NaCl	Fisher Chemical	10040460	Usado para preparar NaCl estéril al 0.45% para homogeneización y diluciones seriadas; también parte del medio LB.
Hipoclorito de sodio	Carlo Erba	370323	Usado para preparar solución de hipoclorito de sodio al 20% v/v para la esterilización de la superficie de semillas. Corrosivo; requiere EPI.
Péstilos desechables estériles	Eppendorf	EP0030120973	Usados para homogeneización de semillas secas y plántulas germinadas.
Mezclador vortex	Fisher Scientific	15901137	Usado para resuspender células microbianas de los homogeneizados.