Creación fiable de un modelo de aneurisma aórtico abdominal murino utilizando sensibilización con elastina y elastasa perivascular

Resumen

Este protocolo proporciona un método repetible y fiable para inducir aneurismas de la aorta abdominal (AAA) en ratones C57BL/6 mediante sensibilización con elastina y aplicación de elastasa perivascular, como un modelo AAA que incorpora un componente de sensibilización inmune.

Resumen

La degradación de la matriz lamelar elástica en la pared aórtica abdominal es una característica histopatológica de los aneurismas de la aorta abdominal (AAA). Cada vez hay más evidencia que implica la degradación de la elastina y respuestas inmunitarias relacionadas en el hospedador en la patogénesis de la AAA. Un modelado eficaz de estos procesos es importante para mejorar la comprensión y el tratamiento de esta enfermedad común. Aunque los modelos AAA anteriores han utilizado técnicas disruptoras de elastina para la inducción de aneurismas, el uso único de elastasa en muchos de estos modelos no explica la respuesta inmunitaria continua contra la elastina y sus productos de degradación (EDP). Para modelar esta respuesta inmune continua, desarrollamos un modelo que sensibiliza a ratones C57BL/6 a la EDP mediante la inyección subcutánea de EDP 7 días antes de la cirugía de inducción de aneurisma. La cirugía de inducción de aneurisma procede con la exposición de la aorta abdominal y la aplicación de elastasa tópica en el compartimento periaórtico, con la intención de exponer elastina y EDP en la aorta del ratón. Con estas partes expuestas, el animal debería generar una respuesta inmune contra estos antígenos a los que previamente estaba sensibilizado. La inyección repetida de EDP con "refuerzo" 7 días después sirve para propagar esta respuesta inmune. En este caso, describimos el protocolo para la creación fiable de AAA en ratones C57BL/6 mediante sensibilizaciones múltiples con EDP, seguida de cirugía de inducción AAA con aplicación de elastasa perivascular. Este modelo puede crearse rápidamente y a un coste moderado, induciendo > 30% de dilatación aórtica en el 82% de los ratones por videomicrometría y 73% por ecografía, y >50% de dilatación en el 64% por videomicrometría y 27% por ecografía, medida en el día 21 tras la inducción. Esta técnica también se asocia con una tasa de supervivencia intraoperatoria del 95%.

Introducción

El aneurisma de la aorta abdominal (AAA) afecta a >35 millones de personas en todo el mundo, y al 4–8% de los hombres de 65 a 80 años ^1,2. La ruptura, la complicación más devastadora de la AAA, suele producirse cuando el esfuerzo mecánico en la pared del aneurisma supera la fuerza del tejido aórtico, lo que provoca una hemorragia masiva y una tasa de mortalidad global del 80−90%^3,4. El manejo actual está orientado a la prevención, con ecografía en personas de alto riesgo y reparación quirúrgica cuando el riesgo de ruptura supera el riesgo de reparación, normalmente con un diámetro^de 5,5 cm. Sin embargo, la mayoría de los AAA son asintomáticos y muchos se diagnostican de forma^{incidental 6}. Por ello, se deben hacer esfuerzos para identificar a los pacientes de alto riesgo y desarrollar tratamientos no quirúrgicos para reducir el crecimiento de AAA y, por tanto, el riesgo de rotura.

Para desarrollar tratamientos médicos para la AAA, la patogénesis debe comprenderse mejor. Actualmente se utilizan varios modelos experimentales, incluyendo modelos en animales pequeños que emplean la infusión 7 de angiotensina^II, xenoinjertos⁸, aplicación de cloruro de^{calcio 9} y infusión¹⁰ y/o aplicación tópica de^{elastasa 11}. Cada uno de estos modelos utiliza una comprensión diferente de la base patológica de la AAA, y la mayoría han sido modificados, mejorados o combinados con otros métodos desde su inicio.

Es importante destacar que la histotología AAA demuestra la pérdida de la matriz elastina laminar normal, que también se observa en el tejido pulmonar en la enfermedad pulmonar obstructiva^{crónica 12,13}. La degradación de elastina mediante la actividad de la metaloproteinasa de la matriz proporciona un vínculo importante entre la patogénesis AAA y el tabaquismo, el factor de riesgo modificable más importante para la formación^{de AAA 12,14}. Cabe destacar la reducción de la elastina aórtica, la alteración de la fibra de elastina y el aumento de los péptidos de elastina circulante en AAA humano, que se asocian con un aumento de la distensibilidad de la pared^{AAA 15,16}. Por lo tanto, estimular la degradación de elastina es crucial para crear un modelo AAA trasladable. Los modelos AAA existentes que dependen de la degradación de la elastina, aunque efectivos, pueden complicarse por altas tasas de mortalidad animal, especialmente en modelos que utilizan canulación^{aórtica 17}, y por formación inconsistente de aneurismas, especialmente en modelos que dependen únicamente de la aplicación tópica^{de elastasa 18}. Además, todos los modelos que dependen de cirugías de inducción están sujetos a curvas de aprendizaje del operador y variaciones técnicas.

Para abordar estos problemas, aprovechamos la respuesta inmunitaria del huésped para sensibilizar a los animales a la elastina mediante la inyección de productos de degradación de elastina (EDP). Una semana después, la cirugía de inducción de aneurisma se realiza de forma estandarizada por etapas, utilizando la aplicación periaórtica de elastasa para crear partes EDP contra las que el huésped sensibilizado pueda montar una respuesta inmunitaria. La posterior sensibilización con "refuerzo" de EDP, una semana después de la cirugía de inducción, garantiza que la respuesta inmunitaria del huésped continúe. La sensibilización inmunitaria repetitiva permite una dilatación aórtica fiable. Utilizamos un modelo AAA murino debido a su menor coste, facilidad de mantenimiento, rápido desarrollo de enfermedades y coherencia técnica.

Este modelo no resulta de forma fiable en la ruptura aórtica y, por tanto, no está destinado al estudio de factores asociados a la ruptura de AAA. Sin embargo, este modelo produce de forma fiable dilatación progresiva de la aorta hasta 21 días tras la cirugía de inducción. Por ello, el modelo es más adecuado para estudiar modalidades terapéuticas que puedan reducir o revertir la dilatación aórtica a medida que se forma el aneurisma.

Protocolo

1. Ecografía por imagen

1. Prepara al ratón
   1. Coloca al ratón en la cámara de inducción de anestesia.
   2. Administrar isoflurano inhalado al 1,8−2% y oxígeno hasta que el ratón esté anestesiado. Asegúrese de que los botes de gas anestésico estén conectados al aparato anestésico para reducir la exposición del operador a anestésicos volátiles cuando se utilice isoflurano.
   3. Coloca al ratón en posición supina sobre un escenario calentado a 37 °C con la nariz del ratón colocada en el cono nasal de anestesia.
   4. Pega las extremidades traseras al escenario con cinta de etiquetado.
   5. Aplica un agente depilatorio con un aplicador con punta de algodón en el abdomen y espera 30 segundos.
   6. Elimina el vello abdominal usando una gasa de algodón de 5 cm x 5 cm.
   7. Coloca gel de transmisión de ultrasonidos calentado en el abdomen del ratón.
2. Coloca una sonda de ultrasonido de 38 MHz en el abdomen e identifica la cintura pélvica.
3. Identificar la aorta como una estructura tubular de la línea media incompresible con presión moderada dirigida hacia atrás aplicada a través de la sonda de ultrasonidos.
   NOTA: La vena cava inferior (VCI) aparecerá como una estructura luminal a la derecha del ratón respecto a la aorta y es compresible con presión moderada dirigida hacia atrás aplicada a través de la sonda de ultrasonidos.
4. Mide el diámetro anteroposterior-posterior de la aorta abdominal solo cefálade hasta el punto de bifurcación.
5. Mueve la sonda proximalmente a lo largo de la aorta e identifica la vena renal izquierda que cruza por delante de la aorta y entra en la VCI.
6. Mide el diámetro anteroposterior-posterior de la aorta abdominal justo en cauda hasta el punto donde la vena renal izquierda cruza hacia adelante con la aorta abdominal.
7. Mueve la sonda proximalmente e identifica el diafragma.
   NOTA: El diafragma puede identificarse como una banda hiperecoica justo cefálica al hígado.
8. Mide el diámetro anteroposterior-posterior de la aorta abdominal justo en cauda hasta el punto donde entra en el abdomen.
9. Coloca al ratón en su jaula o en una cesta de recuperación forrada con toallas y colocada en un escenario calentado a 37 °C.
10. Vigila al ratón hasta que salga de la anestesia.

2. Sensibilización inicial de elastina

1. Prepara los productos de degradación de elastina (EDP) mientras llevas equipo de protección personal, incluidos guantes, protección ocular y mascarillas.
   1. Obtén una formulación de elastasa pancreática murina en suspensión PBS a 0,475 unidades/mL (4,75 unidades/mg de proteína).
   2. Toma 168 μL de elastasa y añádelos a 5 mg de elastina murina. Añade otros 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a esta mezcla, luego pipeteo para mezclar.
   3. Incuba la mezcla de elastasa y elastina a 37 °C durante 20 minutos con agitación suave intermitente.
   4. Añade 632 μL de PBS frío 1X a la mezcla de elastasa y elastina.
   5. Añade 1 mL de adyuvante de Freund completo.
2. Coloca al ratón en la cámara de inducción de anestesia.
3. Administrar isoflurano inhalado al 1,8−2% y oxígeno hasta que el ratón esté anestesiado.
4. Coloca al ratón en posición prona sobre un escenario calentado a 37 °C, con la nariz del ratón colocada en el cono nasal de anestesia.
5. Inyectar 50 μL de EDP subcutáneamente en cada flanco, para un total de 100 μL de EDP en cada ratón.
6. Coloca el ratón en una cesta de recuperación forrada con toallas y colócala sobre un escenario calentado a 37 °C.
7. Vigila al ratón hasta que salga de la anestesia.

3. Preparación para la cirugía

1. Prepara los instrumentos quirúrgicos.
   1. Monta un botiquín quirúrgico con 2 pinzas dentadas, 1 pinza recta y afilada, 1 pinza con ángulos afilados, 1 clavador de aguja, tijeras, al menos 3 separadores magnéticos autoretenibles, 1 grapadora para piel y 1 tapón de botella de polipropileno.
   2. Añadir sutura trenzada con ácido poliglicólico 4-0 al kit de forma estéril justo antes de la cirugía.
   3. NOTA: También son suficientes tamaños de sutura 3-0 o 5-0.
   4. Llena la tapa de la botella de polipropileno con PBS 1X calentado y estéril.
      NOTA: Una botella de PBS estéril 1X se guarda en un calentador a 37 °C para recargar.
2. Prepara la elastasa.
   1. Diluir 27 μL de 5,1 mg/mL (≥4,0 unidades/mg de proteína) de elastasa pancreática porcina en 73 μL de 1X PBS para un volumen final de 100 μL para la cirugía en 10 ratones (10 μL/ratón).
   2. Prepara el quirófano.
   3. Autoclave un vaso de precipitados con aplicadores con punta de algodón, aplicadores con punta de algodón con punta cónica y gasas de 5 cm x 5 cm, y colocarlos junto a las bandejas quirúrgicas antes de la cirugía.
   4. Coloca un palco quirúrgico magnético sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 °C en un palco de microscopio. Cinta la almohadilla eléctrica en su lugar en el escenario del microscopio, pero deja el componente magnético sin amarre para permitir reposicionarla durante la cirugía.
   5. Coloca una almohadilla absorbente o papel de cocina sobre la almohadilla térmica. Dobla una gasa de 5 cm x 5 cm por la mitad y colócala bajo el cono nasal de anestesia.
   6. Coloca un vaso de 30 mL lleno de agente depilatorio, un vaso de 30 mL con povidona-yodo al 5%, un tubo de lubricante para los ojos, cinta quirúrgica, gasas no estériles de 5 cm x 5 cm, aplicadores no estériles con punta de algodón, hisopos de alcohol sellados de 5 cm x 5 cm, un rollo de película adhesiva para servicio de alimentos y un pulverizador con etanol al 70% cerca de la zona quirúrgica.
   7. Extrae 1,3 mg/mL de buprenorfina de liberación prolongada en una jeringuilla de 1 mL a un volumen de 75 μL por ratón, para una dosis de 3,25 mg/kg en un ratón de 30 g.
3. Prepara al ratón para la cirugía.
   1. Mide y registra el peso del ratón en gramos.
   2. Coloca al ratón en la cámara de inducción de anestesia.
   3. Administrar isoflurano inhalado al 1,8−2% y oxígeno hasta que el ratón esté anestesiado.
   4. Coloca al ratón en posición supina sobre un escenario calentado a 37 °C con la nariz del ratón colocada en el cono nasal de anestesia.
   5. Inyecta 75 μL de buprenorfina por vía subcutánea.
   6. Pega las extremidades traseras al escenario con cinta de etiquetado.
   7. Aplica un agente depilatorio con un aplicador con punta de algodón en el abdomen y espera 30 segundos.
   8. Elimina el vello abdominal usando una gasa de algodón de 5 cm x 5 cm.
   9. Aplica lubricante para los ojos del ratón.
   10. Aplica povidona-yodo en el abdomen del ratón usando una gasa de 5 cm x 5 cm y déjalo secar.
   11. Limpia el abdomen usando los hisopos de alcohol de 5 cm x 5 cm. Reaplica povidona-yodo y déjalo secar.
   12. Prueba la anestesia pellizcando el dedo del pie del ratón y asegurándote de que no haya respuesta.
   13. Coloca una lámina adhesiva de película para servicios de comida sobre la fase quirúrgica.
   14. Rocía la fase quirúrgica con etanol al 70% y déjala secar.
   15. Lávate las manos y ponte guantes quirúrgicos estériles.

4. Procedimiento quirúrgico (7 días después de la sensibilización inicial con elastina)

1. Expone la aorta abdominal.
   1. Haz una incisión cutánea con tijeras o un bisturí a lo largo de la línea media abdominal durante ~3 cm, comenzando en 0,5−1 cm cefálade hasta el pene y extendiéndose hasta 0,5 cm caudade hasta el xifoides.
   2. Sujeta la piel con pinzas dentadas y tira suavemente hacia arriba para identificar la línea alba, que aparecerá como un plano avascular entre los músculos rectos.
   3. Con tijeras, incisa la línea alba mientras sigues tirando hacia arriba sobre la piel. Ten cuidado de cortar solo la línea alba, evitando estructuras intraabdominales.
   4. Colocar separadores magnéticos auto-retenibles, uno retrayendo el lado derecho de la pared abdominal, otro retrayendo el lado izquierdo de la pared abdominal y otro retrayendo las estructuras en la parte caudal de la incisión, como la vejiga y las vesículas seminales.
   5. Usando aplicadores húmedos con punta de algodón, eviscera el intestino lejos de ti y cúbrelo con una gasa húmeda de 5 cm x 5 cm. Alternativamente, comprime el intestino con una gasa enrollada y húmeda de 5 cm en el lado izquierdo del abdomen del ratón.
      NOTA: Dependiendo de la anatomía del ratón y de la ubicación de los separadores, el intestino puede ser eviscerado o compactado en sentido contrario para una visualización óptima.
   6. Identifica la VCI y la aorta abdominal en la línea media posterior.
   7. Utilizando aplicadores con punta de algodón, entra en el retroperitoneo abriendo suavemente el plano tisular que cubre las estructuras vasculares posteriores.
      NOTA: La presión dirigida hacia atrás sobre el tejido de interés, seguida de separar las puntas de los aplicadores de algodón, aplica mayores grados de tracción. Para una tracción más suave, gira las puntas de los aplicadores de algodón en direcciones opuestas.
   8. Coloca los separadores laterales más profundo para obtener mejor tracción y visualización de la aorta.
   9. Continúe usando aplicadores con punta de algodón para separar suavemente la aorta abdominal intravental y infrarrenal, evitando la liberación de las inserciones laterales de la aorta en esta etapa.
   10. Continúa desarrollando el plano entre la VCI y la aorta hasta que se haga visible un espacio triangular entre la aorta y la CCI (Figura 1).
       NOTA: Este paso suele ser más fácil de realizar solo con caudad hacia la vena renal izquierda.
   11. Utilizando una disección roma o pinzas afiladas, libera las inserciones laterales de la aorta separando la aorta del tejido conectivo y la musculatura lumbar en la parte izquierda del ratón.
   12. Coloque las pinzas afiladas en ángulo en el espacio desarrollado entre la aorta y la VI, y abra y cierre suavemente las pinzas de forma repetida para abrir las inserciones posteriores de la aorta.
   13. Utilizando la misma técnica de apertura y cierre, se desarrolla el plano posterior a lo largo de la aorta, trabajando desde cefálade hasta caudal.
   14. Obtén una imagen micrométrica en vídeo de toda la aorta y guárdala para su análisis.
2. Aplica elastasa perivascular.
   1. Con una pipeta, vierte 10 μL de solución de elastasa a lo largo de la aorta expuesta.
      NOTA: Al diseccionar solo los tejidos medial y lateral a la aorta, emergirá una canaleta en la que se acumula la elastasa.
   2. Coloca gasas humedecidas de 5 cm x 5 cm sobre el abdomen abierto y deja que la solución de elastasa incube durante 10 minutos.
   3. Retira la compresa de gasa y rega el abdomen con PBS estéril 1X tres veces para eliminar la solución residual de elastasa.
3. Cierra el abdomen.
   1. Devuelve los órganos abdominales a sus posiciones originales. Observa y elimina cualquier torsión o torsión intestinal.
   2. Usando pinzas dentadas, despega el músculo recto y la fascia de la piel para hacer un colgajo de 0,25 cm.
   3. Cierra la fascia abdominal usando una sutura trenzada de ácido poliglicólico 4-0 (u similar) de forma sencilla, teniendo cuidado de incorporar las esquinas de la incisión y recorriendo no más de 2 mm entre mordiscos.
   4. Grapa la piel superior con 3−4 grapas.

5. Cuidados postoperatorios

1. Retira al ratón de la fase de cirugía y colócalo en una cesta de recuperación forrada con toallas y colocada sobre un escenario calentado a 37 °C.
2. Vigila al ratón hasta que salga de la anestesia.
3. Monitoriza al ratón diariamente tras la operación durante 4 días, anotando el estado general de salud y el estado de la incisión abdominal.
4. En el postoperatorio, realiza una ecografía repetida como se ha descrito anteriormente para monitorizar el crecimiento del aneurisma.
5. Quita las grapas una semana después de la cirugía o en el momento de la ecografía de la semana 1.

6. Sensibilización repetida con elastina (7 días después de la cirugía de inducción de aneurisma)

1. Realizar los mismos pasos descritos anteriormente para la sensibilización inicial de elastina preparando la solución EDP de la misma manera, con una única sustitución del adyuvante de Freund incompleto en lugar del adyuvante de Freund completo.

7. Procedimientos de extracción de tejidos

1. Toma de tejidos en el día 21 postoperatorio para varios análisis.
2. Prepara al ratón de la misma manera que se hizo en la cirugía de inducción.
3. Exponer la aorta de nuevo de la misma manera que se hizo durante la cirugía de inducción, cuidando de no dañar ninguna muestra que se vaya a recoger para análisis histológicos.
   NOTA: En este punto, el ratón habrá desarrollado cicatrices adhesivas, por lo que puede ser necesario usar más disección aguda con pinzas en lugar de disección roma.
4. Obtener imágenes de micrometría en vídeo.
5. Realizar una punción cardíaca para recoger sangre y analizarla y eutanasiar al ratón.
6. Perfunda el ratón para su análisis mientras llevas el equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, protección ocular y mascarillas.
   1. Si los tejidos están designados para un análisis de citometría de flujo (u similar), perfunde el ventrículo izquierdo con 1X PBS sin dilatador vascular a 100−120 mm Hg para un volumen de 8 mL.
   2. Si los tejidos están designados para análisis PCR, perfundir el ventrículo izquierdo con 1X PBS con dilatador vascular (0,1 mM de adenosina y 0,01 mM de nitroprusido sódico) seguido de una solución estabilizadora de ARN.
   3. Si los tejidos están designados para análisis histológicos, perfundir el ventrículo izquierdo con 1X PBS con un dilatador vascular, seguido de fosfato de formalina tamponado al 10%.
7. Extrae los tejidos deseados, cuidando de no dañar estructuralmente ningún tejido destinado al análisis histológico. Marcar la orientación con suturas o agentes de marcado.

Resultados

Un total de 28 ratones machos C57BL/6J han pasado por este protocolo quirúrgico, con una mortalidad perioperatoria por lesión de la CII (3,6%). Hubo tres mortalidades adicionales retrasadas, una de las cuales se debió a una hernia incisional y las otras dos por razones desconocidas, para una supervivencia total de 21 días del 85,7%. El tiempo medio desde la inducción de la anestesia hasta el final de la administración fue de 46,4 ± 8,0 minutos. Los ratones de cirugía simulada pasaron por...

Discusión

Desde que se describió por primera vez en ratas en 1990, el modelo AAA basado en elastasa ha sido modificado varias veces y utilizado en diversos^{animales 10,19,20,21,22,23}. Algunas de las modificaciones incluyen la canulación aórtica, que probablemente aumentará la mortalidad e introduzca un...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 mL Tuberculin Syringes	Becton Dickinson	309628
10% Buffered Formalin Phosphate	Fisher Chemical	SF100-4
70% Isopropyl Alcohol Swabs	Cardinal Health	S-16183
Angled sharp forceps	Dumont	I I25 I-35
AutoClip 9mm (Skin stapler)	MikRon	427630
Betadine	Atlantis Consumer Healthcare	67618-155-16
Cotton gauze pad	Dynarex Corporation	3223
Cotton tipped applicator	Puritan Medical Products	25-806 2WC
Elastase from porcine pancreas (≥4.0 units/mg protein)	Sigma-Aldrich	E1250	Guardado en solución acuosa a 4 °C
Elastase from mouse pancreas (4.75 units/mg protein)	Elastin Products Co., Inc.	MS838	Guardado en solución acuosa (0.1 mg en 1 mL PBS) a 4 °C
Elastin	MP Biomedicals	101636	Guardado en solución acuosa a 4 °C
Enersight Desktop Software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/enersight/
Ethiqa XR (extended release buprenorphine)	Fidelis	NDC 86084-100-30
Eye lubricant	OptixCare	Opx-4242
Flexacam i5 (Stereo)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-cameras/p/12730536-leica/
Freund’s complete adjuvant	MP Biomedicals	642851	Guardado en solución acuosa a 4 °C
Freund’s incomplete adjuvant	MP Biomedicals	642861	Guardado en solución acuosa a 4 °C
Gloves (Sterile)	Encore	7824PF
Hypodermic Needles (23 G)	Becton Dickinson	305145
Hypodermic Needles (27 G)	Becton Dickinson	305109
Isospire (Isoflurane)	Dechra Veterinary	07-894-8943
Labeling Tape	Fisher Scientific	15959
Masks	Dukal Corp.	1540
Needle driver	Scanlan	6006-36
Omnicon F/air Anesthetic Gas Canister	A.M. Bickford Inc.	80120
Press'N Seal	Glad	12587704417
RC2 Rodent Circuit Controller	VetEquip Incorporated	922100
RNAlater Stabilization solution	ThermoFisher Scientific	AM7021
Scissors	Fine Science Tools	14005-12
Skin staples (clips)	MikRon	205016
Small Rodent Warmer Heater	Stoelting	53851
Small Rodent Warmer Stage	Stoelting	53812
Stereo Microscope M60	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m80/
Straight sharp forceps	Dumont	I I 25 I-30
SurgiSuite self-retaining magnetic retractor set and stage	Kent Scientific	13-005-180
Tahoe Portable Oxygen Concentrator	Vetland Medical	595-2300A
Toothed forceps	Fine Science Tools	11043-08, 11042-08
Vevo 2100 Ultrasound	FUJIFILM Visualsonics	EDU00496
Visorb polyglycolic acid suture	CP Medical	397A
VWR Absorbents	VWR	95057-860