Ensayos simples y accesibles para la eclosión de huevos en Caenorhabditis elegans: formatos adaptables para el cribado de fármacos

Resumen

Este estudio presenta una plataforma flexible y estandarizada de ensayos de eclosión de huevos en Caenorhabditis elegans que integra múltiples formatos experimentales. El enfoque mejora la reproducibilidad, escalabilidad y accesibilidad, permitiendo una evaluación robusta de los efectos de los fármacos y procesos de desarrollo, manteniéndose al mismo tiempo rentable y fácilmente adaptable tanto para aplicaciones de investigación como para entornos educativos.

Resumen

Los ensayos de eclosión de huevos (EHA) se utilizan ampliamente para evaluar los efectos de los compuestos químicos en las primeras etapas de desarrollo de los nematodos, especialmente en la investigación antihelmíntica. Sin embargo, las metodologías existentes varían sustancialmente en formato, complejidad y reproducibilidad, y a menudo se presentan como protocolos fijos en lugar de marcos experimentales adaptables. En este estudio, establecemos una plataforma sencilla, accesible y flexible para ensayos de eclosión de huevos en Caenorhabditis elegans integrando y comparando directamente tres configuraciones experimentales: (i) incubación controlada en tubos de microcentrífuga seguida de siembra en placas de agar, (ii) exposición directa en placas de agar que contienen fármacos, y (iii) ensayos líquidos basados en múltiples pozos. Se utilizaron dos compuestos representativos para ilustrar el ensayo: uno que inhibe la eclosión de huevos y otro que no tiene efecto detectable. Cada configuración ofrece ventajas distintas en términos de control experimental, rendimiento y accesibilidad. El enfoque basado en tubos de microcentrífuga permite un control preciso de la exposición a fármacos y apoya análisis farmacológicos cuantitativos. Los ensayos basados en agar ofrecen una alternativa simplificada y de bajo coste, adecuada para la exposición continua y entornos educativos. Los formatos multipozo permiten un cribado escalable y estandarizado, coherente con las canalizaciones modernas de descubrimiento de fármacos. Al comparar directamente estos formatos, mostramos cómo las elecciones metodológicas influyen en la reproducibilidad del ensayo, la dinámica de exposición a fármacos y la interpretación biológica, especialmente en relación con factores específicos de cada etapa como el papel protector de la cáscara del huevo y la variación en el desarrollo en la expresión molecular del blanco. En conjunto, este trabajo establece los ensayos de eclosión de huevos en C. elegans como una plataforma versátil y escalable adaptable a diversas aplicaciones, incluyendo cribado antihelmíntico, evaluación toxicológica, estudios de desarrollo y laboratorios docentes, facilitando así un uso más amplio y racional de esta metodología.

Introducción

Los ensayos de eclosión de huevos (EHA) han sido desde hace tiempo establecidos como una metodología fundamental en nematología para evaluar la actividad ovicida y los efectos tempranos en el desarrollo de compuestos químicos. Originalmente desarrollados para nematodos parásitos, estos ensayos cuantifican la inhibición de la embrionación o la emergencia larvaria bajo condiciones in vitro controladas, proporcionando criterios robustos y biológicamente relevantes como el porcentaje de eclosión o el análisis concentración-respuesta (por ejemplo, EC₅₀ o IC₅₀)^{1,2,3,4,5,6,7}.

Los enfoques clásicos basados en huevos en nematodos parásitos como Haemonchus contortus y Trichostrongylus colubriformis se han utilizado ampliamente para evaluar la eficacia de fármacos sintéticos y productos naturales, así como para monitorizar la resistencia antihelmíntica 1,2,6,8,9,10 . Estas metodologías abarcan una variedad de lecturas, desde la evaluación directa de la viabilidad y eclosión del huevo hasta la evaluación del desarrollo larvario tras el cultivo fecal. En conjunto, han desempeñado un papel central en vincular la exposición a drogas con la producción reproductiva y el potencial de transmisión de parásitos. Sin embargo, estos enfoques a menudo requieren una preparación compleja de muestras de hospedadores infectados, periodos prolongados de incubación e infraestructura especializada, lo que puede limitar su accesibilidad, escalabilidad y reproducibilidad interlaboratorio.

El uso de Caenorhabditis elegans como organismo modelo ha surgido como una estrategia poderosa para superar varias limitaciones asociadas a los nematodos parásitos. Su corto ciclo de vida, su traabilidad genética, facilidad de cultivo y la conservación de objetivos moleculares clave compartidos con especies parásitas la hacen especialmente adecuada para estudios farmacológicos, toxicológicos y de desarrollo. Es importante destacar que la embriogénesis en C. elegans es rápida y altamente reproducible, lo que permite que los ensayos de viabilidad de huevos y eclosión se utilicen como lecturas cuantitativas y fiables de los procesos tempranos de desarrollo y su interrupción por parte de los xenobióticos 11,12,13,14,15,16,17.

Además, la disponibilidad de cepas mutantes bien caracterizadas ha permitido obtener conocimientos mecanicistas sobre la acción y resistencia de los fármacos. Estudios previos han demostrado que la resistencia a compuestos bioactivos puede surgir de forma dependiente de la etapa, con las etapas embrionaria y larvaria mostrando sensibilidad diferencial. Por ejemplo, las alteraciones en la señalización glutamétrica se han asociado con fenotipos resistentes en larvas, mientras que la eclosión de huevos permaneció^intacta 14,18,19,20. Esto pone de relieve la naturaleza específica de la sensibilidad a los fármacos por etapa y sugiere que las etapas embrionarias pueden implicar objetivos distintos o accesibilidad diferencial en comparación con las etapas posteriores del desarrollo.

Más allá de la parasitología, los ensayos de viabilidad de huevos en C. elegans se han vuelto cada vez más relevantes en toxicología y en el descubrimiento temprano de fármacos. Estos ensayos se han aplicado no solo para evaluar la actividad antihelmíntica, sino también para evaluar la toxicidad del desarrollo y los defectos embrionarios inducidos por fármacos, con resultados que pueden correlacionarse con perfiles de toxicidad de organismos más^{altos 15,16}. Al mismo tiempo, la presencia de la cáscara introduce importantes restricciones biológicas, ya que actúa como una barrera protectora y selectiva de permeabilidad que rodea al^{embrión 21,22}. Como resultado, algunas moléculas bioactivas pueden no llegar al embrión a pesar de mostrar actividad en etapas posteriores^{de desarrollo} 14,19,23,24. Por tanto, el acceso al embrión probablemente dependerá de las propiedades fisicoquímicas de cada compuesto, incluyendo el tamaño molecular y la polaridad. Esto puede contribuir a las diferencias entre la actividad observada en ensayos de eclosión de huevos y la de etapas posteriores del desarrollo. Esta distinción subraya la importancia de definir claramente tanto el contexto experimental como el punto final biológico que se está midiendo.

Metodológicamente, los ensayos de eclosión de huevos en Caenorhabditis elegans se han implementado utilizando una amplia gama de formatos experimentales, incluyendo incubación líquida de huevos sincronizados, exposición directa a placas de agar que contienen fármacos y ensayos basados en múltiples pozos adaptados para cribado de rendimiento medio a^{alto 11,13,14,16,19,23,24}.

Los formatos de basados en líquidos y microplacas han sido ampliamente adoptados en estudios de cribado farmacológico, ya que proporcionan condiciones de exposición homogéneas, facilitan un control preciso de las concentraciones de fármacos y permiten el análisis cuantitativo de las relaciones concentración-respuesta. Paralelamente, se han desarrollado extensamente estrategias comparables basadas en múltiples pozos para nematodos parásitos, que van desde ensayos convencionales de placas de 96 pozos hasta plataformas de ultra alto rendimiento que utilizan formatos ^4,5 de 384 ^pozos. En conjunto, estos enfoques destacan la versatilidad y escalabilidad de los ensayos de eclosión de huevos en diferentes especies de nematodos y su adaptabilidad a diversos entornos experimentales, desde estudios mecanicistas a pequeña escala hasta cribado compuesto a gran escala.

Cada formato presenta ventajas y limitaciones distintas en términos de control experimental, reproducibilidad, rendimiento y accesibilidad. Los ensayos líquidos proporcionan condiciones de exposición homogéneas y son muy adecuados para análisis farmacológicos cuantitativos, mientras que los ensayos basados en agar permiten una exposición continua durante todo el desarrollo, pero introducen variabilidad relacionada con la difusión y biodisponibilidad del fármaco. Los formatos multipozo, a su vez, permiten la paralelización y la reducción del consumo de reactivos, alineándose con las estrategias modernas de cribado.

A pesar de su uso generalizado, los ensayos de eclosión de huevos suelen presentarse como protocolos fijos en lugar de como un marco metodológico flexible. Las comparaciones directas entre formatos son escasas, y la orientación para seleccionar la configuración más adecuada para aplicaciones específicas, que van desde estudios mecanicistas hasta cribado o entornos docentes de alto rendimiento, sigue siendo limitada.

En este estudio, proponemos una plataforma sencilla, accesible y adaptable para ensayos de eclosión de huevos en C. elegans, integrando y comparando tres configuraciones experimentales: (i) incubación controlada en tubos de microcentrífuga seguida de siembra en placas de agar, (ii) exposición directa en placas de agar que contienen fármacos, y (iii) ensayos líquidos basados en múltiples pozos.

Al evaluar sistemáticamente estas configuraciones, pretendemos establecer un marco práctico que destaque los compromisos entre control experimental, simplicidad y escalabilidad. Esta perspectiva integrada une las metodologías parasitológicas clásicas con los enfoques modernos de cribado basados en modelos, posicionando los ensayos de eclosión de huevos no como una única técnica estandarizada, sino como una plataforma versátil adaptable a diversos contextos de investigación, incluyendo el descubrimiento de antihúminas, la evaluación toxicológica, la biología del desarrollo y aplicaciones educativas.

Protocolo

1. Cepas y cultura de Caenorhabditis elegans

1. Utilizar la cepa tipo salvaje N2 (Bristol) y/o la cepa transgénica PD4251 (ccIs4251; dpy-20(e1282)) para desarrollar y validar la metodología^25,26. PD4251 expresa GFP, facilitando la visualización y posibles aplicaciones de imagen cuando es necesario, mientras muestra respuestas de eclosión y desarrollo de huevos indistinguibles de las observadas en la cepa tipo N2 salvaje bajo las condiciones experimentales utilizadas en este^{estudio 27}.
2. Obtén cepas (por ejemplo, cepa silvestre de tipo N2) del Centro Genético de Caenorhabditis (CGC), apoyado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los Institutos Nacionales de Salud (P40 OD010440).
3. Mantener las lombrices bajo condiciones estándar de laboratorio a 18–25 °C en placas de agar de Medio de Crecimiento de Nematodos (NGM) recién preparadas, sembradas con Escherichia coli OP50 como fuente de alimento. Prepara NGM disolviendo 16 g de agar, 3 g de NaCl y 2,5 g de bactopeptona en 975 mL de agua destilada o ultrapura. Esteriliza mediante autoclave. Tras enfriar el medio a 55 °C, añadir soluciones estériles de tampón de fosfato potásico (25 mL, 1 M, pH 6,0), CaCl₂ (1 mL, 1 M), MgSO₄ (1 mL, 1 M) y colesterol (1 mL, 5 mg/mL en etanol absoluto). Mezcla bien y vierte los platos en condiciones estériles.
4. Realizar el manejo, propagación y mantenimiento rutinarios siguiendo los procedimientos establecidos descritos en WormBook y estudios^relacionados 24,26,28,29. Mantener a las lombrices en condiciones de ausencia de inanición asegurando la disponibilidad continua de alimento bacteriano y evitando platos saturados. Mantén los cultivos dentro del rango de temperatura recomendado (18–25 °C) y evita condiciones excesivamente secas, ya que pueden acelerar la deshidratación del agar.
5. Consideraciones generales antes de comenzar el ensayo
   1. Definir todos los parámetros experimentales con antelación, incluyendo la temperatura (18–25 °C), el tiempo de incubación (4–8 h), la humedad (50–70%) y los procedimientos de manipulación.
   2. Prepara todos los materiales antes de comenzar el ensayo para asegurar el momento adecuado y la coordinación del flujo de trabajo.
   3. Mantener condiciones experimentales consistentes en todas las réplicas para minimizar la variabilidad.

2. Preparación de compuestos de prueba y controles

1. Prepara todos los compuestos frescos el día del experimento. Disolver en tampón M9 (22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO₄) o agua destilada estéril, dependiendo de la compatibilidad del compuesto y las condiciones del^{ensayo 30,31}.
   NOTA: La elección del medio acuoso puede influir en la actividad de compuestos en los ensayos de C. elegans . Por ejemplo, compuestos como la serotonina pueden mostrar diferentes concentraciones efectivas cuando se preparan en agua destilada estéril frente a la de M9. Por lo tanto, tanto la compatibilidad del vehículo como la respuesta biológica deben evaluarse empíricamente durante la optimización del ensayo. Además, para compuestos con baja solubilidad acuosa, se pueden utilizar vehículos adecuados como el dimetilsulfóxido (DMSO) o el etanol. Las concentraciones finales del disolvente deben mantenerse bajas (normalmente por debajo del 0,2% v/v) para evitar la toxicidad. Estudios previos en C. elegans informaron que concentraciones de DMSO de hasta el 0,5% producen efectos mínimos bajo condiciones estándar^{de laboratorio 17}.
2. Prepara al menos cinco concentraciones por compuesto para permitir la construcción de curvas concentración-respuesta y la estimación de valores IC₅₀ o IC₉₀ . Utiliza una dilución en serie con pasos de concentración de 2 a 3 como punto de partida, y ajusta el rango final de concentración según la potencia, solubilidad y respuesta experimental esperada de cada compuesto.
   NOTA: Si los compuestos de prueba son sensibles a la luz, todos los pasos de preparación deben realizarse bajo luz tenue para evitar su degradación. Esto incluye la preparación de soluciones de material, diluciones y placas de agar que contienen fármacos. Siempre que sea posible, los platos deben cubrirse con papel de aluminio y almacenarse en la oscuridad. De manera similar, las placas multipozo deben mantenerse cubiertas (por ejemplo, con papel de aluminio o tapas opacas) durante la incubación. Se recomienda usar recipientes cerrados o cámaras húmedas que limiten la exposición a la luz para mantener la estabilidad del compuesto durante todo el experimento.
3. Incluir los siguientes controles en cada experimento: control solo con tampón (M9 o agua) y control con vehículo (por ejemplo, DMSO o etanol a la misma concentración utilizada en los tratamientos).
   NOTA: La elección del disolvente es fundamental. El DMSO y el etanol se utilizan comúnmente porque disuelven compuestos hidrofóbicos mientras permanecen biocompatibles a bajas concentraciones. Se pueden considerar enfoques alternativos, como Tween 20 o ciclodextrinas, para mejorar la solubilidad. Las soluciones farmacológicas deben usarse inmediatamente después de la preparación, ya que la estabilidad puede variar a lo largo del tiempo y afectar a su reproducibilidad.

3. Obtención sincronizada de huevos de C. elegans

NOTA: El aislamiento de los huevos de C. elegans ha sido ampliamente descrito en estudios^{previos 29,32}. Aquí se resumen los pasos principales, incorporando modificaciones menores para optimizar la recuperación de huevos limpios y libres de residuos, adecuados para ensayos de eclosión.

1. Colección de gusanos grávidos
   1. Comienza con 3–5 placas NGM que contienen cultivos confluentes de adultos^{grávidos 25,26}. Prefiere placas que contengan grandes cantidades de gusanos grávidos y huevos visibles, lo que indica reproducción activa, evitando cultivos sobrepoblados o hambrientos. En esta etapa normalmente no se determinan los recuentos exactos de gusanos, ya que los protocolos de aislamiento de huevos en C. elegans suelen depender de cultivos reproductivos confluyentes en lugar de conteos precisos de animales. Como referencia general, cada placa de 60 mm debería contener varios cientos de adultos grávidos.
   2. Añade agua destilada a cada plato y lava suavemente las lombrices en un tubo cónico de 15 mL. Evita raspar la superficie del agar para minimizar los residuos.
   3. Centrifugar a 266 × g a 3 minutos (18–25 °C) para pelletar las lombrices. Elimina las bacterias que contienen el sobrenadante.
   4. Quita el sobrenadante y repite el paso de lavado tres veces. Resuspende el pellet suavemente cada vez para mejorar la eliminación de bacterias residuales.
2. Aislamiento de huevos mediante blanqueamiento
   1. Resuspende el pellet de lombrices en una solución blanqueadora recién preparada (1,2% NaOCl y 0,5 M NaOH; volumen final 5 mL). Prepara la solución inmediatamente antes de usarla para asegurar la actividad.
      NOTA: Las muestras correctamente blanqueadas se definieron como preparaciones en las que los cadáveres adultos fueron alterados/digeridos mientras que los huevos intactos permanecieron morfológicamente normales y viables. Se identificaron muestras sobreblanqueadas por huevos dañados o lisados, morfología anormal del huevo, tasas reducidas de eclosión o ausencia de larvas viables tras la^{incubación 25}.
   2. Agita vigorosamente el tubo para promover la disolución de los cuerpos adultos y la liberación de los óvulos. Mezclar continuamente durante la incubación para asegurar una exposición uniforme.
   3. Vigila la reacción de cerca y no superes los 5 minutos. Comprueba visualmente: los cuerpos adultos deben estar mayormente disueltos mientras los huevos permanecen intactos.
   4. Monitoriza la reacción de cerca y detenla a los 5 minutos añadiendo agua destilada fría y estéril (preferiblemente a 10 °C) hasta un volumen final de 14 mL. No permitas que la incubación exceda este tiempo para evitar daños por los huevos.
   5. Tapa el tubo y invierte suavemente varias veces para diluir rápidamente la solución blanqueadora. Realiza este paso sin demora para preservar la viabilidad del óvulo.
   6. Centrifugar a 266 × g durante 3 minutos (18–25 °C) y descartar cuidadosamente el sobrenadante.
   7. Lava la pellet de huevo tres veces con agua destilada estéril para eliminar completamente la lejía residual. Asegura una resuspensión completa entre lavados. Resuspende los huevos en 5 mL de agua tampón M9 o estéril.
      NOTA: El blanqueamiento de hermafroditas grávidas produce una preparación de huevos estéril adecuada para ensayos sincronizados. En ausencia de alimento, las larvas eclosionadas entran en paro de desarrollo L1 y reanudan el desarrollo de forma sincrónica al alimentarse.
3. Paso de purificación (flotación con sacarosa)
   1. Realiza este paso si se ven restos de gusano tras el blanqueo.
   2. Prepara una solución de sacarosa al 30% diluyendo una solución estéril de stock de sacarosa al 60% (por ejemplo, mezcla volúmenes iguales: 5 mL de sacarosa al 60% con 5 mL de agua destilada).
   3. Añade la solución de sacarosa al pellet y mezcla suavemente por inversión. Evita el vórtice.
      NOTA: Dado que este paso de purificación es breve y seguido de pasos inmediatos de lavado para eliminar la sacarosa residual, no se observaron efectos detectables sobre la viabilidad del huevo en las condiciones utilizadas en este estudio. En cambio, la eliminación de restos de gusanos mejora sustancialmente la visualización de los huevos, la precisión del conteo y la uniformidad de la exposición al fármaco entre muestras.
   4. Centrifugar a 266 × g durante 5 minutos (18–25 °C).
   5. Identifica la ponedora de huevos como un anillo blanco fino en la parte superior de la solución. Recoge inmediatamente 4 mL del huevo que contiene sobrenadante moviendo cuidadosamente la punta de la pipeta a lo largo del anillo.
   6. Realiza este paso rápidamente, ya que los huevos comienzan a hundirse poco después de la centrifugación debido a la gravedad.
   7. Transfiere el sobrenadante recogido a un tubo limpio que contenga agua destilada estéril. Lava los huevos dos veces con agua fría y estéril para eliminar la sacarosa residual.
      NOTA: Este paso es opcional pero muy recomendable. Eliminar los restos mejora la precisión de visualización y conteo de los huevos, y asegura una exposición más uniforme a los compuestos de prueba al evitar que los huevos queden atrapados en material residual de lombrices.
4. Preparación de la solución de caldo de huevo
   1. Mezcla la suspensión de huevos suavemente antes de muestrear, ya que los huevos sedimentan rápidamente.
   2. Coloca tres gotas de 20 μL sobre una lámina y cuenta los huevos bajo un estereomicroscopio.
   3. Calcula la media y ajusta la concentración a 50–100 huevos por 100 μL usando el tampón M9. Mezcla de nuevo antes de hacer la alicitación para mantener la distribución uniforme.
   4. Aclarar el volumen requerido de suspensión de huevos para cada condición experimental según el protocolo seleccionado.

4. Formatos de ensayo de eclosión de huevos

1. Exposición a corto plazo a huevos en tubos microcentrífugas (formato de alto control)
   NOTA: Esta configuración experimental se basa en los procedimientos²⁵ previamente descritos, con adaptaciones para mejorar el control sobre las condiciones de exposición y la reproducibilidad.
   1. Preparación de placas de agar para ensayos de eclosión de huevos
      1. Preparar placas de agar libres de fármacos usando solo agar y agua destilada (1,7 g de agar en 100 mL de agua). No añadas nutrientes ni bacterias, ya que el objetivo es evaluar la eclosión de los huevos sin interferencias de fuentes de alimento. Vierte aproximadamente 3 mL de agar por cada placa de Petri de 35 mm para mantener una profundidad constante de agar entre experimentos.
      2. Prepara los platos entre 12 y 24 horas antes de usarlos. Evita exceder esta ventana temporal, ya que el secado excesivo reduce la viabilidad de los huevos y afecta al movimiento larval.
      3. Divide cada placa en cuatro cuadrantes tras la solidificación para facilitar el conteo.
      4. Guarda los platos a 8–10 °C en condiciones selladas para evitar la deshidratación. Deja que las placas se equilibren a temperatura ambiente antes de usarlas.
   2. Transfiere 500 μL de suspensión de huevos a un tubo microcentrífuga de 1,5 mL para cada condición. Mezcla suavemente entre los pasos de pipeteo para evitar la sedimentación de los huevos, ya que los huevos se asientan rápidamente por gravedad. Mantener una suspensión homogénea es fundamental para asegurar un número de huevos comparable en distintas condiciones.
   3. Añadir 500 μL de solución de tratamiento o control correspondiente a la suspensión de huevos de 500 μL. Incubar a 22 °C durante 4–8 horas. Define el tiempo de incubación con antelación y mantenlo constante entre los experimentos (por ejemplo, 6 horas), ya que las variaciones en este tiempo afectan directamente a la exposición a drogas.
      NOTA: Prepare las soluciones de tratamiento a 2 veces la concentración final deseada para que la dilución tras mezclar con la suspensión de huevos dé la concentración final de trabajo deseada.
   4. Mantener una agitación suave y continua durante la incubación utilizando un rotador tubular (por ejemplo, rotación vertical de 5–20 rpm) o una plataforma de balanceo. Asegúrese de que los tubos permanezcan en movimiento constante para evitar la sedimentación de huevos y promover una exposición uniforme. Este paso es fundamental, ya que las condiciones estáticas conducen a la acumulación de óvulos y a una exposición heterogénea a fármacos.
   5. Centrifugar los tubos a 3.420 × g durante 3 minutos (18–25 °C) después de la incubación. Identifica el perdigón, que aparece como un pequeño depósito blanco en la pared del tubo. Orienta los tubos de forma constante (por ejemplo, marca un lado) antes de la centrifugación para facilitar la rápida localización de los pellets y evitar pérdidas accidentales durante la extracción del sobrenadante.
   6. Retira el sobrenadante con cuidado sin mover la bola. Lava los huevos tres veces con tampón M9 para eliminar el compuesto residual. Resuspende el último pellet en 240 μL de buffer M9.
   7. Placar la suspensión sobre placas de agar dispensando 20 μL por cuadrante. Usa tres placas por condición. Deja que las gotas se sequen completamente antes de mover o invertir las placas para evitar el desplazamiento de huevos por la superficie.
      NOTA: Comienza con un volumen total de suspensión de huevos mayor del estrictamente requerido para compensar la pérdida de huevos durante los pasos de lavado y asegura un tamaño de muestra final suficiente para el emplatado y el conteo. Para simplificar el procedimiento y reducir el uso de placas de agar, especialmente en entornos educativos, transfiere los huevos resuspendidos directamente a una placa multipozo en lugar de a placas de agar. Ajusta el volumen final a 200 μL por pozo y llena los pozos no utilizados con agua estéril para minimizar la evaporación.
2. Exposición directa al huevo en placas de agar que contienen fármacos
   1. Prepara una solución de agar que contenga solo agar y agua destilada estéril (1,7 g de agar en 100 mL). Calienta hasta que esté completamente disuelta y mantén la solución en forma líquida. Deja que el agar se enfríe hasta 50–55 °C antes de añadir cualquier compuesto y controla la temperatura con un termómetro de laboratorio. Este paso es fundamental para preservar la estabilidad del compuesto y asegurar una incorporación homogénea, como se describió^{anteriormente 28}. Preparar al menos cinco concentraciones por compuesto para permitir el análisis concentración-respuesta y la estimación de IC₅₀ .
      NOTA: No añadas fuentes de alimento bacteriano. En ausencia de alimento, las larvas eclosionadas entran en paro sincronizado del desarrollo L1, impidiendo la progresión a las etapas larvales posteriores durante el periodo^{de ensayo 26,33}.
   2. Añade el volumen adecuado de solución de fármacos o control del vehículo al agar enfriado. Mezclar suavemente mediante inversión lenta para asegurar una distribución homogénea. Evita el vórtice o agitaciones vigorosas para evitar la formación de burbujas.
   3. Inmediatamente vierte aproximadamente 3 mL de agar en placas de Petri de 35 mm. Trabaja de forma constante para mantener una temperatura y un grosor de placa constantes. Prepara al menos 3–5 placas por condición.
   4. Almacenamiento y manejo de placas de la siguiente manera: Permitir que las placas se solidifiquen a temperatura ambiente sobre una superficie plana. Placas de almacenamiento invertidas para evitar que la condensación llegue a la superficie del agar.
   5. Prepara el experimento: sembra 50–100 huevos directamente sobre las placas de agar. Mantener parámetros experimentales constantes, incluyendo temperatura, tiempo de incubación, humedad y momento de preparación de la placa. Utiliza al menos cinco concentraciones para el análisis concentración-respuesta.
      NOTA: Prepare los platos entre 12 y 24 horas antes de su uso. Evita el secado excesivo, ya que puede afectar la viabilidad de los huevos y el movimiento larval. Envuelve los platos para reducir la deshidratación y protegerlos de la luz al trabajar con compuestos fotosensibles. Guarda los platos en un ambiente limpio, preferiblemente humidificado (por ejemplo, un recipiente sellado con papel húmedo) para minimizar la variabilidad.
3. Ensayo de eclosión de huevos en placas multipozo (formato de rendimiento medio a alto)
   NOTA: Este formato se utiliza ampliamente tanto en estudios de C. elegans como en estudios de nematodos parásitos para cribado de rendimiento medio a alto, permitiendo la evaluación paralela de múltiples compuestos y concentraciones bajo condiciones estandarizadas.
   1. Preparación de placas de pozo y diseño experimental: Utilizar placas de 96 pozos (o un formato alternativo según las necesidades de rendimiento). Preparar la disposición de las placas con antelación y definir las concentraciones de fármacos (organizadas en columnas), réplicas (en filas) y controles, incluyendo controles solo de tampón (M9 o agua) y de vehículos (por ejemplo, DMSO o etanol en la misma concentración final utilizada en los tratamientos).
      NOTA: Utilice placas transparentes de fondo plano multipozo para permitir la visualización directa y el conteo en cada pozo bajo iluminación LED transmitida con un estereomicroscopio. Los huevos y las larvas de L1 eclosionadas se cuantifican directamente en los pozos sin pasos de transferencia, minimizando la pérdida de muestras y el manejo de artefactos.
   2. Precarga cada pozo con el volumen adecuado de solución o control del fármaco. Utiliza volúmenes iguales en todos los pozos.
   3. Adición de suspensión de huevo
      1. Prepara una suspensión de huevos bien homogeneizada con una concentración definida (véase la Sección 2).
      2. Añade un volumen igual de suspensión de huevos a cada pozo que contenga la solución farmacéutica. Utiliza un volumen final de 200 μL por pozo.
      3. Ajusta la densidad de huevos a al menos 30 huevos por pozo (idealmente 30–100). No superes los 100 huevos por pozo, ya que el hacinamiento complica considerablemente la cuantificación manual. Los huevos individuales se vuelven difíciles de distinguir, mientras que las larvas móviles de L1 nadan activamente por el pozo, reduciendo la precisión del conteo y aumentando la variabilidad experimental.
      4. Mezcla suavemente la suspensión de huevos antes de dispensar para asegurar una distribución uniforme.
   4. Carga la matrícula con cuidado. Evita introducir burbujas de aire. Pipetea de forma constante y cambia las puntas entre condiciones para evitar la contaminación cruzada. Golpea suavemente la placa para asegurarte de que todo el contenido se asiente en el fondo de los pozos.
   5. Condiciones de incubación: Incubar la placa a 20–22 °C bajo condiciones controladas y húmedas, durante un total de 24 horas desde el aislamiento del huevo.
      NOTA: Minimizar la variabilidad evitando el uso de pozos exteriores o rellenándolos con amortiguador para reducir la evaporación. Incuba placas en una cámara humidificada (por ejemplo, un recipiente sellado con papel húmedo) y protége de la luz al trabajar con compuestos fotosensibles. Evita movimientos innecesarios durante la incubación. Mantener un momento consistente de preparación de huevos y exposición a fármacos en todas las réplicas, ya que las variaciones pueden afectar la etapa de desarrollo y la interpretación de datos.

5. Evaluación y recuento

1. Evalúa la eclosión del huevo 24 horas después del aislamiento, asegurando que las condiciones de control hayan alcanzado la eclosión completa por debajo de la temperatura definida. Calcula este punto temporal desde el momento de la recogida de los óvulos para permitir un desarrollo embrionario suficiente. Considera cualquier huevo que quede sin eclosionar en esta etapa como afectado por el tratamiento.
2. Examina muestras bajo un estereomicroscopio. Para cada condición (placas de agar o placas multipozo), cuantifiquen el número de huevos sin eclosionar y el número de larvas L1 eclosionadas.
3. Escanea toda el área de observación, incluyendo los bordes de las placas y los límites de los pozos, ya que las larvas móviles de L1 pueden distribuirse de forma desigual y acumularse en estas regiones.
   NOTA: Realizar conteo directo bajo un estereomicroscopio para una evaluación rápida sin equipo adicional. Mantener una densidad de huevos consistente en todas las condiciones, utilizar al menos 3–5 réplicas técnicas por condición y realizar un mínimo de tres experimentos independientes utilizando diferentes preparaciones de huevos para asegurar comparaciones fiables.

6. Adquisición y documentación de imágenes

1. Toma imágenes usando un estereomicroscopio equipado con una cámara digital. Para placas de agar, registrar cada cuadrante; Para placas multipozo, registra cada pozo individual. Asegúrate de que todas las áreas estén capturadas, incluidos los bordes de las placas y los límites de los pozos, donde las larvas puedan acumularse.
   NOTA: Los oculares y objetivos estándar de 10x, que varían de 0,6x a 5x (aumento total de 6x a 50x), son ampliamente utilizados y permiten una visualización clara tanto de los huevos como de las larvas L1 dentro del área de conteo. Utiliza iluminación LED transmitida. Mantener ajustes constantes de adquisición de la cámara (brillo, exposición y contraste) en todas las condiciones experimentales para garantizar una calidad de imagen consistente y una comparación fiable entre muestras.
2. Utiliza el software de adquisición adecuado para capturar imágenes. Procesa y analiza imágenes usando software de análisis de imágenes. Mantener parámetros de análisis idénticos en todas las condiciones experimentales, incluyendo brillo, contraste, aumento, la misma área/campo de adquisición y criterios de conteo.
3. Cuantifica el número de huevos sin eclosionar y larvas de L1 a partir de las imágenes adquiridas. Considera que las larvas eclosionaron solo cuando han salido completamente de la cáscara del huevo. Los huevos que contienen larvas parcialmente emergidas deben clasificarse como no eclosionados. Aplicar criterios de clasificación idénticos en todas las condiciones experimentales.
4. Incubar placas o placas multipozo durante 12–24 horas adicionales a 16–18 °C para evaluar si la inhibición observada de la eclosión de huevos es reversible. Bajo las condiciones experimentales definidas, los huevos que quedan sin eclosionar en esta etapa se consideran afectados por el tratamiento.

7. Análisis de datos

1. Calcular la inhibición de la eclosión de huevos como:
   Fracción de huevos no eclosionados = (Número de huevos no eclosionados) / (número total de huevos + larvas)
2. Realiza al menos 3–5 experimentos independientes usando diferentes lotes de huevos. Expresa los datos como media ± desviación estándar (media ± SD).
3. Genera curvas concentración-respuesta usando regresión no lineal y determina los valores de IC₅₀ .
4. Realizar comparaciones estadísticas entre condiciones usando la prueba t de Student y definir la significación estadística en p < 0,05.
5. Analizar los datos utilizando el software estadístico adecuado.

8. Aplicación de ensayos de eclosión de huevos utilizando trans-cinnamaldehído y acetato de linalilo

NOTA: Este estudio no se centra en un compuesto específico, sino que utiliza agentes representativos para ilustrar cómo cada formato experimental puede implementarse, controlarse e interpretarse bajo condiciones comparables. El trans-cinnamaldehído (TCA) fue seleccionado como compuesto ilustrativo porque ya se ha caracterizado previamente y produce consistentemente una inhibición robusta y reproducible de la eclosión de huevos a través de las tres configuraciones de ensayo presentadas aquí. Es importante destacar que el propósito de incluir TCA era demostrar la implementación del protocolo y el comportamiento representativo de concentración-respuesta, en lugar de establecer potencia relativa o rendimiento comparativo entre formatos.

1. Montaje experimental y preparación de compuestos
   1. Preparar las placas de agar (3 mL por plato de 35 mm) con 12–24 horas de antelación utilizando un medio solo de agar (1,7% en agua destilada). Etiqueta las placas, divídelas en cuatro cuadrantes para facilitar el conteo, guárdalas en condiciones selladas para evitar la deshidratación y equilibralas a temperatura ambiente antes de su uso.
   2. Preparar soluciones frescas de material trans-cinnamaldehído (TCA) en DMSO y diluirlas en agua estéril o agar para obtener ocho concentraciones finales (0,05–0,7 mM). Mantén la concentración final de DMSO por debajo del 0,2% en todas las condiciones. Incluye agua, agar y/o DMSO como controles negativos y de vehículos, respectivamente.
   3. Prueba acetato lineal a 5 mM como control de compuesto negativo para evaluar la capacidad del ensayo para discriminar entre compuestos activos e inactivos bajo condiciones experimentales idénticas.
   4. Prepara suspensiones sincronizadas de huevos como se ha descrito anteriormente y ajusta la densidad a 50–100 huevos por 100 μL. Utiliza volúmenes iguales y números de huevos comparables en todos los formatos para asegurar la consistencia entre condiciones.
2. Aplicación de formatos experimentales utilizando un compuesto de referencia
   1. Exposición a corto plazo en tubos microcentrífugas (formato de alto control)
      1. Mezclar 500 μL de suspensión de huevo con 500 μL de solución de tratamiento que contenga entre 0,05 y 0,7 mM de TCA. Incubar los tubos durante 6 horas a 18–20 °C y mantener el tiempo de incubación de forma constante en todos los experimentos.
      2. Mantén los tubos bajo una agitación suave y continua usando un rotador durante la incubación.
      3. Centrifugar los tubos a 3.420 × g durante 3 minutos (18–25 °C) tras la exposición y retirar cuidadosamente el sobrenadante. Lava los huevos tres veces con agua destilada para eliminar los compuestos residuales y limita la exposición durante el periodo de incubación definido.
      4. Resuspende el pellet final en agua destilada de 240 μL y placa la suspensión sobre placas de agar a 20 μL por cuadrante usando tres placas por condición. Incubar las placas a 16–18 °C durante 24 horas tras el aislamiento del huevo.
   2. Exposición directa a placas de agar que contienen fármacos
      1. Prepara placas de agar que contengan fármacos añadiendo soluciones de TCA a agar enfriado a 50–55 °C y mezclando suavemente para asegurar una distribución homogénea. Vierte aproximadamente 3 mL de agar por placa y prepara las placas entre 12 y 24 horas antes de su uso.
      2. Semillas de huevos directamente sobre la superficie de las placas con densidades comparables a las usadas en otros formatos (50–100 huevos por 100 μL). No realices los pasos de lavado en esta configuración.
      3. Incubar las placas a 16–18 °C hasta 24 horas después del aislamiento del huevo.
   3. Ensayo de placas multipozo (formato de rendimiento medio a alto)
      1. Precarga las placas de 96 pocillos con soluciones y controles farmacológicos. Añadir suspensiones de huevos para obtener un volumen final de 200 μL por pozo y una densidad de 50–100 huevos por pozo.
      2. Asegurar una distribución homogénea durante la carga evitando burbujas y manteniendo volúmenes consistentes entre pozos. Incubar las placas a 20–22 °C en condiciones húmedas durante 24 horas tras el aislamiento del huevo.
3. Adquisición y cuantificación de imágenes
   1. Evalúa la eclosión del huevo 24 horas después del aislamiento, una vez completada la eclosión bajo condiciones de control. Cuenta el número de huevos no eclosionados y larvas de L1 bajo un estereomicroscopio para cada condición. Examina cuidadosamente los bordes de las placas y los límites de los pozos, ya que las larvas pueden acumularse en estas regiones.
   2. Obtén imágenes utilizando un estereomicroscopio equipado con una cámara digital para fines de documentación. Registrar cada cuadrante para placas de agar e imaginar sistemáticamente cada pozo para placas multipozo. Utiliza software de análisis de imágenes cuando sea necesario para soportar la cuantificación.
   3. Incubar las placas durante 12–24 horas adicionales tras la adquisición de la imagen para evaluar si la inhibición observada de la eclosión es reversible.
   4. Realizar todos los experimentos utilizando al menos tres réplicas biológicas independientes.

Resultados

El TCA produjo una inhibición clara dependiente de la concentración de la eclosión de huevos en todos los formatos experimentales, como se muestra en la Figura 1. Se presentan curvas representativas concentración-respuesta para cada configuración de ensayo: tubos de microcentrífuga (Figura 1A), exposición directa en placas de agar (Figura 1B) y placas multipozo (Figura 1C

Discusión

Este estudio presenta una plataforma sencilla y adaptable para ensayos de eclosión de huevos en Caenorhabditis elegans, estructurada en torno a tres formatos experimentales complementarios que difieren en control, dinámica de exposición y escalabilidad. En lugar de definir un único protocolo óptimo, nuestros resultados apoyan la idea de que los ensayos de eclosión de huevos deben considerarse un marco metodológico flexible adaptable a objetivos experimentales específicos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bacteriological Agar	Britania	B0101406	should be prepared fresh (1.7 gr in 100 mL H2O)
Bleach solution	N/A	N/A	1.2 % (v/v) NaOH and 0.5 M NaOH
Centrifuge	ThermoScientific.	Sorvall ST16R.
Centrifuge	BiofugePICO to eppendorf tube	Heraeus 75003235
Digital camera	ToupCam	TP605100A	Industrial digital camera. Adjustabe focal length USB 2.0
DMSO	BioBasic	RAS#7-68-5	MW: 78,13
Linalil Acetate	SIGMA	No.CAS: 115-95-7	should be prepared fresh
Lysogeny broth (LB) medium	N/A	N/A	10 g Bacto-tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl to 1 L destilled water
M9 Buffer	N/A	N/A	3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g  NaCl, 0,25 g MgSO4 to 1 L destilled water
Mini Rotator	BioSan	Bio RS-24
Nematode Growth Medium (NGM)	N/A	N/A	3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g  Bacto-Peptone to 1 L destilled water. Sterilize by autoclaving. Supplemented 1 mL cholesterol (5 mg/mL),  1 mL CaCl2 (1 M), 25 mL potassium phosphate buffer (1 M, pH 6.0) and 1 mL  MgSO4 (1 M)
Petri Dish (3 - 5 mm)	ThermoScientific. Nunclon DeltaSurface	153066
Petri Dish (90 mm x 15 mm)	ExtraGene	1026160305	For laboratory use only, Polystyrene.
Pipette	Fisherbrand	N/A
SigmaPlot 12.0	Systat Software	N/A	Version 12.0
Stereomicroscope	ARCANO	ZTX-T 1:4 LED	Trinocular stereomicroscope (10x–40x total magnification; LED incident and transmitted illumination)
Sucrose	Laboratorio Cicarelli	Art 841	60 % (v/v) sucrose
Tissue culture plate 96 well	Biofil	TCP 012096	Polystyrene, Low Evaporation Lid.
ToupView	ToupTek Photonics	N/A
Transcinnamaldehyde (TCA)	Santa Cruz Biotechnology	J1712	Should be prepared fresh