Protocolos para la cría eficiente y el análisis funcional de la avispa endoparasitoide Asobara japonica y su hospedadora Drosophila melanogaster

Summary

El objetivo de este protocolo es facilitar el análisis funcional de las interacciones parasitoide-huésped en Asobara japonica y Drosophila melanogaster. mediante métodos de cría optimizados, un ensayo de infección de oviposición única y knockdown génico mediado por ARNi.

Abstract

El parasitismo es una interacción biológica en la que un organismo explota el cuerpo o los recursos de otro (el huésped), lo que provoca daños sustanciales o la muerte del huésped. Entre los animales parásitos, las avispas parasitoides son una de las líneas más ricas en especies, representando casi el 20% de todas las especies de insectos. En particular, las avispas endoparasitoides ovipositan directamente en los cuerpos del huésped y despliegan una amplia variedad de factores venenosos para manipular el desarrollo, la inmunidad y la fisiología del huésped. En respuesta al ataque de avispas, los hospedadores intentan eliminar los huevos parasitoides mediante mecanismos inmunitarios innatos. Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares mediante los cuales los componentes individuales del veneno modulan la biología del huésped y promueven un parasitismo exitoso siguen siendo poco comprendidos. Aquí describimos un protocolo de laboratorio estandarizado para la cría de la avispa endoparasitoide Asobara japonica y su hospedadora Drosophila melanogaster. Existen disponibles tanto cepas partenogenéticas como sexuales de A. japonica, y la cepa partenogenética muestra una alta tasa de éxito parasitaria, lo que permite un mantenimiento estable de los stocks de laboratorio para análisis genómico y ensayos de parasitismo. Se optimizó un ensayo de infección de oviposición simple y un método de eliminación genética basado en ARN de doble cadena para el análisis funcional de genes de veneno. En conjunto, estos protocolos proporcionan un marco experimental práctico para diseccionar los mecanismos moleculares subyacentes a las interacciones parasitoide-huésped y facilitarán futuras investigaciones en biología del desarrollo, inmunología y fisiología.

Introduction

El parasitismo es un estilo de vida en el que un organismo explota los recursos nutricionales de otro y está muy extendido entre los taxones. Se estima que hasta la mitad de todos los organismos conocidos presentan parasitismo en su ciclo^{de vida 1}. Entre los parásitos, las avispas parasitoides son un grupo particularmente diverso, representando aproximadamente el 20% de todos los^{insectos 2}. Explotan una amplia variedad de hospedadores artrópodos, como insectos, arañas y ácaros, y muestran una notable diversidad en sus historias de vida y estrategias^{parasitarias 3}. Estas características hacen que las avispas parasitoides sean uno de los grupos de insectos más exitosos evolutiva y ecológicamente.

Las interacciones entre parasitoides y sus hospedadores han sido ampliamente estudiadas como sistemas modelo de "carreras armamentísticas" evolutivas. En particular, las avispas endoparasitoides despliegan una amplia variedad de factores, incluyendo venenos, virus simbióticos y^{teratocitos 4,5}. Estos factores manipulan la fisiología y el desarrollo del huésped, asegurando así un desarrollo exitoso dentro del huésped. A pesar de estos avances, los mecanismos moleculares subyacentes al parasitismo siguen siendo poco comprendidos en la mayoría de las especies parasitoides. Una limitación importante es su pequeño tamaño corporal, lo que ha dificultado la identificación bioquímica de los componentes del veneno. Además, es técnicamente complicado mantener a los parasitoides y a sus hospedadores con etapas de desarrollo sincronizadas bajo condiciones de laboratorio.

Los avances recientes en la secuenciación de nueva generación y otras tecnologías ómicas permiten ahora análisis genómicos incluso en especies parasitoides muy pequeñas. Estos enfoques han abierto nuevas vías para investigar mecanismos moleculares antes inaccesibles, permitiendo estudiar las interacciones parasitoide-huésped con una resolución sin precedentes. En este contexto, nuestro laboratorio se centra en Asobara japonica Belokobylskij  (Hymenoptera: Braconidae), una especie identificada originalmente en Japón ^6,7,8. A. japonica incluye una cepa partenogenética thelytokous, en la que las hembras producen descendencia sin apareamiento. Esta función nos permite recoger cantidades sustanciales de ADN genómico genéticamente uniforme para la secuenciación del genoma^{completo 9}. Además, esta especie parasita una amplia gama de especies de Drosophila, incluido el organismo modelo D. melanogaster,  que ofrece importantes ventajas experimentales gracias a sus condiciones de cría bien establecidas y a etapas de desarrollo precisamente definidas, permitiendo ensayos de infección reproducibles y un control preciso del desarrollo^{parasitoide 10}.

Durante el parasitismo de A. japonica, una avispa hembra inyecta veneno junto con un solo huevo en una larva de mosca, dentro de la cual una larva de avispa crece junto a su huésped. Cabe destacar que A. japonica muestra una alta tasa de éxito de parasitismo en el hospedador D. melanogaster, lo que convierte a este par parasitoide-huésped en un modelo experimental muy potente. Aquí describimos protocolos para una crianza estable, un ensayo de infección con una sola oviposición y un método de knockdown génico basado en ARN doble cadena (dsRNA) en A. japonica. Estos protocolos proporcionan un marco fiable para diseccionar los mecanismos moleculares subyacentes a las interacciones parasitoide-huésped.

Protocol

Una visión general esquemática del método de crianza sincronizada para D. melanogaster y A. japonica se presenta en la Figura 1.

1. Criar la mosca de la fruta hospedadora Drosophila melanogaster en laboratorio

1. Mantén todos los animales de experimento a 25 °C y humedad relativa del 50-60% bajo un ciclo de luz y oscuridad de 12:12 h. Utiliza la cepa silvestre Oregon-R (OR) como hospedadora de A. japonica (Figura 2A).
2. Transfiere las moscas adultas a un nuevo vial de alimento que contenga un medio estándar de harina de maíz, levadura y agar (0,55% agar, Tabla 1). Etiqueta el vial con la fecha de transferencia y el nombre de la cepa "OR".
3. Elimina estas moscas adultas un día después de la transferencia para evitar un exceso de huevos en la comida. Asegúrate de que las larvas de la descendencia se alimenten en la superficie del alimento.
   NOTA: Como guía, mantener aproximadamente entre 200 y 250 huevos por vial de alimento (φ30×100 mm). Densidades más altas de huevos pueden reducir el éxito del parasitismo y aumentar la variación en el desarrollo del hospedador y de las avispas.
4. Cuatro días después del Paso 1.2, transfiere una cucharada de larvas de mosca (4 días después de la puesta del huevo, dAEL) a un nuevo frasco de alimento. Mantén estas larvas sin exposición a parasitoides durante la siguiente generación. Este procedimiento también ayuda a controlar la densidad larvaria del huésped en un vial.

2. Criar la avispa endoparasitoide Asobara japonica en laboratorio

1. Utiliza una cepa partenogenética Tokyo (TK) y una cepa sexual Iriomote-jima (IR) (Figura 2B). La primera está formada por mujeres, mientras que la segunda está formada por mujeres y machos. Los machos nacen dos a cuatro días antes que las hembras. Por lo tanto, confirmar la presencia de hembras por sus ovipositores antes de la transferencia.
2. Transfiere entre 10 y 20 avispas adultas directamente del vial de stock al frasco que contiene larvas de mosca a 4 dAEL. Etiqueta el frasco con la fecha de transferencia y el nombre de la cepa "TK" o "IR". Mantén las avispas en las mismas condiciones que en el Paso 1.1.
3. Permite que las avispas adultas oviponan en las larvas de mosca. Elimina estas avispas uno o dos días después para evitar el superparasitismo, que puede provocar la muerte del huésped. Retira las moscas adultas eclosionadas que escaparon del parasitismo 10 o más días después del Paso 2.2.
4. Dos semanas después del Paso 2.2, las avispas adultas comienzan a salir de la pupa de la mosca hospedadora. Transfiere estas avispas adultas recién cerradas a un nuevo vial de alimento con papel filtro que contenga un 25% de glucosa y una solución de vitamina C de 50 mM. Los trozos de papel filtro deben esterilizarse a 130 °C durante 2 horas. Proporcionar la solución en papel filtro promueve los comportamientos de oviposición y prolonga la vida de las avispas adultas. Nuestro enfoque para usar la vitamina C para mejorar la oviposición se inspiró en observaciones de estudios sobre Drosophila ¹¹.

3. Ensayo de infección por oviposición única

1. Sincroniza la etapa de desarrollo de las larvas de mosca utilizadas en el experimento de infección.
   1. Coloca las moscas adultas en un tubo de 50 mL que contiene una placa de agar de zumo de uva (3% agar), untada con pasta fresca de levadura y déjalas poner huevos durante 24 horas.
   2. Recoge las larvas recién eclosionadas de primer estadio en la placa de agar de zumo de uva y transfiere a un pequeño frasco (12 mL) que contenga 2-3 g de pasta alimenticia para moscas (comida para moscas mezclada con una cantidad adecuada de agua). Se colocan entre 20 y 30 larvas en el vial. Las larvas de mosca pueden crecer a 25 °C.
2. En el momento adecuado, preparar una placa de Petri de 4 cm que contenga una capa fina y uniformemente extendida de pasta alimenticia para moscas que cubra un área de aproximadamente 1,5-2,0 cm de diámetro (en adelante denominada arena de ensayo de infección). Además del ensayo de infección, prepara un nuevo vial pequeño (12 mL) que contenga la cantidad adecuada de pasta de mosca. Este frasco se utiliza para criar las larvas del huésped tras el ensayo de infección.
3. Recoge las larvas por etapas y transfiere a un recipiente que contenga agua desionizada (resistividad = 15 MΩ·cm, 25 °C). Enjuaga las larvas en el plato con una agitación suave para eliminar el resto de alimento de su cuerpo.
4. Después del enjuague, elimina suavemente el exceso de humedad de las larvas usando toallitas de papel sin pelusa, ya que el exceso de agua interfiere con el comportamiento de oviposición de las avispas en el área del ensayo de infección. Luego transfiere las larvas a la arena. Este paso incrementa la actividad larvaria durante el experimento de infección.
5. Anestesiar avispas adultas con gas CO₂ a un caudal de 5 L·^min-1 y una presión de 0,2 MPa. Luego, coloca suavemente aproximadamente tres avispas hembras en el campo del ensayo de infección. Cierra la tapa del plato y deja que se recuperen sobre la pasta de mosca.
6. Observa el comportamiento de la oviposición de estas avispas bajo un estereomicroscopio (ajuste de zoom: 10× a 15×).
   NOTA: Cuando una avispa toca el cuerpo larval de una mosca en movimiento, inserta rápidamente su ovipositor en el cuerpo de la mosca e inyecta componentes del veneno. Aunque la larva de mosca se retuerce y se agita en el cuerpo, queda inmediatamente paralizada. Posteriormente, la avispa vibra su abdomen y deposita un huevo en el cuerpo larvario del huésped, tras lo cual el ovipositor es retirado. Este comportamiento de oviposición se denomina infección.
7. Tras la infección, abre la tapa y transfiere la larva de mosca infectada al nuevo vial pequeño que contiene la pasta de alimento para moscas preparada en el Paso 3.2. Para estandarizar el momento de la infección, realiza el experimento de infección en un plazo de 15 minutos.
8. Etiqueta el vial pequeño con información experimental, como la fecha, nombre de la muestra, hora de infección y número de individuos. Estos frascos se taponan y luego se colocan en un recipiente húmedo y se mantienen a 25 °C.

4. Generación de avispas de interferencia de ARN (ARNi) mediante inyección de dsRNA

1. Sintetizar dsRNAs de 400 pb o más para un knockdown génico mediado por dsRNA (interferencia de ARN, RNAi) utilizando un sistema de síntesis de dsRNA basado en transcripción in vitro . Las muestras de ADNDd deben mantenerse entre -20 y -80 °C hasta su uso. Los protocolos detallados son los descritos anteriormente⁹.
2. Prepara una placa de Petri de 5,5 cm que contenga un 2% de agar para colocar los cuerpos de avispas. Rellena dos tercios de cada plato con agar para crear una capa gruesa de placa de agar para la inyección.
3. Coloca una toallita de papel sin pelusa humedecida con agua sobre la tapa de un plato de plástico.
4. Recoge las pupas de mosca hospedadora a los 7 días de la infección (dpi) del vial y colócalas sobre las toallitas de papel sin pelusa preparadas en el Paso 4.3. Añadir una gota de agua a la pared del vial ayuda a despegar los casquillos de las pupas de la mosca hospedadora del frasco.
5. Bajo el estereomicroscopio (ajuste de zoom: 20×), retirar la cápsula pupal de la mosca huésped y exponer el cuerpo de la avispa con pinzas. A 7 dpi, la mayoría de las avispas están en la fase pupal, en la que se distinguen las partes de cabeza, tórax y abdomen. El cuerpo de una avispa es inmóvil.
6. Colocar los cuerpos de avispa recuperados sobre la placa de agar preparada en el Paso 4.2, alineando sus ejes del cuerpo en la misma orientación. Coloca los cuerpos de 20-30 avispas con el lado dorsal hacia arriba en una o dos líneas. Elimina el exceso de humedad de la placa de agar usando una toallita de papel sin pelusa para evitar que las avispas se deslicuen.
7. Siguiendo las instrucciones del fabricante, instale el aparato de inyección y el estereomicroscopio (Figura 3A). Utiliza un sistema de microinyección equipado con una aguja capilar de vidrio que permite un control preciso del volumen y la velocidad de inyección. Coloca la placa de agar en la que las cabezas de avispa están orientadas hacia la punta de la aguja de inyección. El volumen de inyección es de 50 nL·^wasp-1 y la velocidad de inyección es de 50 nL·^seg-1 en el inyector.
8. Prepara agujas capilares de vidrio usando un extractor de agujas. La forma del capilar de vidrio se regula con la temperatura del calentador.
9. Coloca la aguja capilar de vidrio sobre el amolador de agujas en un ángulo de 30-35°. Moler la aguja hasta que la longitud de la punta alcance 0,04 mm (cuatro divisiones en la retícula ocular, Figura 3B).
10. Justo antes de la inyección, descongela el ARNds. La concentración de dsRNA es de 0,25-1 μg·^μL-1. Para la visualización, la solución de dsRNA se colorea con un colorante azul (sal diasódica de Erioglaucina, 2% peso ^volumen-1). Usando la punta de una pipeta microcargadora, rellena el capilar de vidrio con solución de ARNDd con colorante azul. 4 μL son suficientes para inyectar 30 cuerpos de avispas. Asegúrate de que no haya burbujas de aire dentro de la solución.
    NOTA: Después de cargar la solución de ARNds, golpea suavemente el lateral de la aguja con una uña para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada. Las burbujas de aire residuales pueden obstruir el flujo de la solución e interferir con la inyección exitosa.
11. Con una jeringuilla de 1 mL y una aguja, rellena la parte libre del capilar de vidrio con aceite mineral, asegurando que no queden burbujas de aire dentro del capilar.
12. Coloca la aguja capilar de cristal que contiene solución de ARNDd y aceite mineral al soporte de la aguja y luego móntala en el dispositivo de inyección.
13. Ajusta la posición de la placa de agar y la aguja capilar de vidrio en el inyector, de modo que la aguja de vidrio quede en un ángulo de 30-45° respecto a los cuerpos de las avispas (Figura 3A).
14. Inserta la aguja capilar de vidrio en el lado dorsal del cuerpo de la avispa, con el lado ligeramente lateral a la línea media dorsal. Microinyecta la solución de ARNdsd dentro del cuerpo. La solución de ARNdd inyectada es visible con el tinte  azul (Figura 3C).
15. Después de la inyección, coloca las placas de agar en un recipiente húmedo (70-80% de humedad relativa) y mantenlas en una incubadora a 25 °C durante una semana, hasta que las avispas adultas nazcan. Los cuerpos de avispa lesionados deben retirarse de la placa de agar para evitar la contaminación bacteriana.
    PUNTO DE PAUSA: En el Paso 4.6, las pupas de avispa pueden mantenerse en la placa de agar durante varias horas antes de la inyección. Las agujas pueden prepararse con antelación (Pasos 4.8 y 4.9); Sin embargo, con el tiempo tienden a obstruirse. Las agujas recién preparadas generalmente ofrecen un rendimiento de inyección más fiable.

Results

Las cepas asexual y sexual de Asobara japonica
A. japonica está ampliamente distribuida por todo Japón. Las cepas partenogenéticas de Thelytokous predominan en las islas principales, mientras que las cepas sexuales de Arrhenotokous se encuentran en las islas subtropicales, incluyendo las islas Amami-Oshima e Iriomote-jima ^8,12. En las cepas sexuales, los machos emergen unos días antes que las hembras, de modo que el momento de transferencia de los adultos es distinto entre estas cepas. La partenogénesis de Thelytokous en A. japonica se induce por la infección con Wolbachia, una bacteria endosimbiótica^{de transmisión materna 13}. La eliminación de Wolbachia mediante tratamiento antibiótico da lugar a la producción de machos ^9,14, y el trasplante de Wolbachia a cepas sexuales induce partenogénesis¹⁵. Tanto las cepas asexuales como las sexuales de A. japonica muestran un alto éxito parasitario en múltiples especies de Drosophila. Por ejemplo, pueden parasitar a D. suzukii, una plaga de frutas económicamente importante, y se consideran agentes potenciales de control biológico en^{la agricultura 16}. Entre las cepas disponibles, utilizamos principalmente la cepa TK infectada con Wolbachia para nuestros experimentos. La cepa TK muestra una mayor actividad parasitaria hacia las larvas hospedadoras en comparación con la cepa^{IR 14}, lo que la hace adecuada para análisis.

El éxito del parasitismo depende de las condiciones de cría
La tasa de éxito del parasitismo de A. japonica es generalmente alta, pero está fuertemente afectada por la condición de cría de las moscas hospedadoras. En condiciones pobres en nutrientes, el periodo de crecimiento de las larvas de mosca se prolonga y el momento de la pupariación se^{retrasa 17}. En estas condiciones, las avispas pueden no aprovechar adecuadamente los recursos del huésped ni sincronizar su desarrollo con el de los hospedadores. Para examinar esta posibilidad, criamos moscas y avispas bajo condiciones normales de levadura (1×) y pobres en levaduras (0,1×). A continuación, evaluamos el éxito del parasitismo y el momento del desarrollo (Figuras 2C, 2D). El éxito del parasitismo se calculó como la proporción de avispas adultas emergentes respecto a las larvas hospedadoras.

En condiciones normales de levaduras, la tasa de éxito del parasitismo fue del 81,7% en el ensayo de infección de oviposición única (Figura 2C, izquierda; Tabla 2). Cuando el contenido de levadura se redujo al 10% (condición pobre en levaduras), la tasa de éxito del parasitismo disminuyó al 35,0% (Figura 2C, derecha; Tabla 2). Esta reducción puede explicarse por el hecho de que aproximadamente el 50% de las larvas hospedadoras murieron tras la infección. Estos resultados sugieren que la asignación de recursos entre huésped y parasitoide se ve alterada en condiciones pobres en nutrientes.

Cabe destacar que el momento de la eclosión de las avispas no se retrasó tanto en condiciones pobres en levaduras como en condiciones normales de levadura. Mientras que el momento de la eclosión de las moscas se retrasó hasta 9 días, el de las avispas solo se retrasó hasta 4-5 días. Este resultado sugiere que la disponibilidad de nutrientes afecta principalmente al desarrollo del huésped. El momento de la eclosión es consistente tanto en moscas como en avispas bajo condiciones normales de levadura, pero no en condiciones pobres en levaduras, lo que sugiere que el desarrollo sincronizado entre parasitoides y hospedadores depende de la disponibilidad de nutrientes.

Enfoque basado en ARNi para el análisis funcional de genes venenosos
Aunque los análisis transcriptómicos y proteómicos de la glándula venenosa identifican numerosas moléculas candidatas, sigue sin estar claro cuáles de ellas son necesarias para un parasitismo exitoso. Para determinar los roles fisiológicos de estas moléculas candidatas, se requieren análisis funcionales in vivo utilizando enfoques de knockdown génico.

Recientemente informamos que el parasitismo de A. japonica induce apoptosis, autofagia y paro mitótico en los discos imaginarios de las larvas de D. melanogaster, lo que resulta en una degradación tisular severa, fenómeno denominado degradación imaginaria del disco (IDD⁾¹⁰. Para identificar las moléculas responsables de la DI, realizamos un cribado de ARNi de genes candidatos identificados a partir de análisis transcriptómicos, proteómicos y genómicos comparativos. Como resultado, se identificaron dos genes, el factor de degradación del disco imaginario (IDDF)-1 e IDDF-2. Tanto IDDF-1 como IDDF-2 contienen la Función de Dominio Desconocido 4803 (DUF4803). Cabe destacar que, tras nuestro informe inicial, un estudio independiente identificó múltiples proteínas venenosas de A. japonica (denominadas Degradación Inducida por Veneno, VID) asociadas a la IDD, todas las cuales también poseen el dominio^{DUF4803 18}.

Basándonos en estos resultados, optimizamos aún más el protocolo RNAi para mejorar la reproducibilidad y la eficiencia. En particular, el uso de Nanoject III permitió un control preciso del volumen y la velocidad de inyección, resultando en resultados de knockdown más consistentes.

Para evaluar la eficiencia del protocolo optimizado de ARNi, realizamos el knockdown de IDDF-1. En avispas adultas eclosas, el nivel de expresión de IDDF-1 disminuyó significativamente en comparación con el control (Figura 3D). Para validación funcional, realizamos ensayos de infección de una sola oviposición utilizando estas avispas de ARN y larvas de moscas hospedadoras que expresan el reportero de apoptosis GC3Ai en la región¹⁹ de la bolsa alar. Se detectó una señal GC3Ai en la bolsa del ala tras la infección con avispas de control (ARN GFP ). En cambio, la señal GC3Ai se redujo significativamente tras la infección con avispas de ARN IDDF-1 (Figuras 3E, 3F). Estos resultados son coherentes con hallazgos previos, confirmando que la función IDDF-1 está efectivamente suprimida por el ARNi.

Figura 1. Visión esquemática de los procedimientos de crianza para D. melanogaster y A. japonica. 
Los procedimientos escalonados se muestran según las etapas de desarrollo de D. melanogaster. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 2. Parasitismo por Asobara japonica. (A) Esquema de la relación de desarrollo entre D. melanogaster y su parásito A. japonica. Una avispa hembra deposita venenos y un solo huevo en una larva de mosca. Tras la eclosión, la larva de avispa se desarrolla en paralelo con la larva huésped, que posteriormente se puparia. Tras la pupariación, la avispa consume todo el cuerpo de la mosca y finalmente se eclosiona de la pupa de la mosca. (B) Avispas adultas de la cepa asexual (izquierda) y la cepa sexual (derecha) de A. japonica. Barra de escamas, 1 mm. (C) Tasa de emergencia de moscas o avispas en condiciones normales (1×) y pobres en levaduras (0,1×). Se realizaron ensayos de infección por oviposición única utilizando larvas de mosca hospedadora a los 4 días de la puesta de huevos (dAEL). n = 267 (1×, moscas), 120 (0,1×, moscas), 85 (1×, avispas) y 80 (0,1×, avispas), respectivamente. (D) Momento de ecloción de moscas y avispas bajo las dos condiciones nutricionales mostradas en (C). Se indica la proporción de adultos respecto a pupas. n = 250, 107, 61 y 41, respectivamente. La flecha negra indica el momento de la infección por avispas. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Figura 3. Procedimiento optimizado de ARN usando Nanoject III. (A) Montaje del aparato de microinyección bajo un estereomicroscopio. La aguja capilar de vidrio se colocó en un ángulo de 30-45° respecto a la placa de agar. (B) La punta de la aguja capilar de vidrio se afilaba usando una amoladora de agujas. (C) Se microinyectaba una solución teñida de azul en el cuerpo de una avispa usando una aguja capilar de vidrio. El lado anterior de la avispa está indicado por A en la imagen. P, posterior. Barra de escala, 1 mm. (D) Los niveles de expresión de IDDF-1 en avispas ARNi e IDDF-1 ARNi se cuantificaron utilizando el método delta-delta C_t . Los niveles de expresión se normalizaron a RpL32-Aj. Los datos representan la media ± DE con puntos de datos individuales (n = 5). P < 0,005 (prueba t del estudiante). (E y F) Señales de GC3Ai en los discos alares de larvas no infectadas y larvas hospedadoras a las 6 horas posteriores a la infección (hpi) tras la infección con avispas de control (ARN GFP )  o ARN IDDF-1 . Los discos alares están delineados con líneas blancas de puntillos basadas en la tinción DAPI de núcleos (1:10000, 62247; Thermo Fisher Scientific). Se cuantificó la proporción del área positiva de GC3Ai respecto al área de la bolsa del ala. P < 0,005 (ANOVA unidireccional seguida de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey). n = 11 réplicas biológicas por grupo. Barra de escala, 100 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

Componentes	Cantidad
Agua	1 L
Agar	5,5 g
Levadura	40 g
Harina de maíz	90 g
Glucosa	100 g
Ácido propiónico	3 mL
10% butil p-hidroxibenzoato en 70% EtOH	3,5 mL

Tabla 1: Componentes del medio estándar de harina de maíz, levadura y agar (alimento para moscas).

Tipo de alimento	Estado	# de individuos totales	# de individuos eclosionados o muertos				Tasa de emergencia de moscas o avispas (%)
			Fly	Avispa	Letal pupalista	Letal larval
1×	No infectados	267	248	0	2	17	92.88389513
	A. japonica infectada	120	0	98	9	13	81.66666667
0,1×	No infectados	85	38	0	23	24	44.70588235
	A. japonica infectada	80	0	28	13	39	35

Tabla 2: Número de individuos y tasas de emergencia bajo condiciones normales (1x) y pobres en levaduras (0,1x).

Nombre de la guía	Secuencia (1,75m>1,00 m)	Propósito
AjRpL32_qPCR_Fwd	CCCGTCACATGCTTCCTACT	qRT-PCR
AjRpL32_qPCR_Rev	GAATTTGCGATTCTGCATCA	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Fwd	TGGGCAATGATTGTGTGAGT	qRT-PCR
qPCR_gene007424_Rev	GCGTCCCTGTGTATCGAAGGTA	qRT-PCR
Aj_gene007424_ex1_Fwd	ATGAGCATCAAGCAAGCAGTGCTAG	Clonación de CDS
Aj_gene007424_ex10_Rev	TCAGCACCTTCTACCCGGCAAATT	Clonación CDS, plantilla de dsRNA
Aj_gene007424_RNAi_Fwd	GAGGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	Plantilla de dsRNA
T7_Aj_gene007424_ex10_Rev	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGT CAGCACCTTCCCCCGGCAAATT	Plantilla de dsRNA
T7_Aj_gene007424_ RNAi_Fwd	GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAG GAGAGTGGAAGCCAGTTGTAG	Plantilla de dsRNA
※ Estos cebadores y plantillas de dsRNA se han reportado en Kamiyama et al. 2022.
※ gene007424 significa IDDF-1.

Tabla 3: Secuencias de cebadores y plantillas de dsRNA utilizadas en este estudio.

Discussion

En este estudio, establecimos una plataforma experimental versátil para investigar las interacciones parasitoide-huésped a nivel molecular. Optimizando las condiciones de cría, un ensayo de infección con una sola oviposición y el protocolo ARNi, proporcionamos un sistema robusto para estudios funcionales de factores derivados de parasitoides. Esta plataforma facilitará futuros estudios destinados a descubrir los mecanismos por los cuales las avispas parasitoides manipulan el desarrollo del hospedador y también puede contribuir al desarrollo de estrategias biológicas de control de plagas.

La cepa TK infectada con Wolbachia de A. japonica proporciona un sistema experimental altamente reproducible para analizar el parasitismo. En muchos estudios parasitoide-huésped, los resultados experimentales suelen ser variables, con la supervivencia y el éxito parasitoide dependiendo sensiblemente de las condiciones ambientales y fisiológicas. En contraste, la cepa TK muestra un éxito consistentemente alto en el parasitismo, creando efectivamente una condición "dominante parasitoide" en la que el resultado de la infección es en gran medida uniforme. Además, como cepa partenogenética, reduce la variación experimental entre individuos debido a su origen genético uniforme. Esta reproducibilidad permite un seguimiento fiable del proceso de parasitismo y facilita análisis cuantitativos de las respuestas del huésped y factores derivados de los parasitoides.

Además, la reproducción del thelytokous facilita enormemente los análisis genómicos al permitir la generación de ADN genómico altamente homogéneo, lo cual es fundamental para un ensamblaje genómico^{de alta calidad 9}. Aunque estas cepas partenogenéticas no están disponibles en todas las especies parasitoides, nuestros resultados destacan el potencial del thelytoky inducido por Wolbachia como estrategia para mejorar los recursos genómicos. Por tanto, establecer líneas infectadas con Wolbachia en otras especies parasitoides puede ser un enfoque poderoso para ampliar los recursos genómicos y acelerar estudios moleculares comparativos entre parasitoides.

Los resultados del parasitismo están fuertemente influenciados por las condiciones nutricionales del huésped, lo que indica que las condiciones de cría son un factor determinante crítico del éxito parasitoide. Dado que el éxito del parasitismo depende de una coordinación temporal precisa con el desarrollo del huésped y la avispa, las condiciones nutricionales descontroladas probablemente interrumpan este proceso y reduzcan la reproducibilidad. Por ello, una estandarización cuidadosa de las condiciones de crianza del huésped es esencial para establecer un sistema experimental fiable que estudie las interacciones parasitoide-huésped. Además, los viales de stock de moscas deben mantenerse separados de los viales de stock de avispas, ya que la presencia de avispas reduce los comportamientos de oviposición^{de las moscas 20,21}.

Para permitir la evaluación cuantitativa de las interacciones parasitoide-huésped, ideamos un ensayo de infección de oviposición única en el que se deposita un solo huevo en cada hospedador. Este ensayo contrasta con los ensayos convencionales de infección masiva, que a menudo implican múltiples eventos de oviposición que conducen a un daño excesivo en el hospedador y mortalidad. Para promover la oviposición eficiente dentro de un periodo limitado (~15 min.), los adultos de avispa recién cerrada fueron precondicionados con una solución de glucosa y vitamina C, mejorando así la eficiencia de la oviposición y la reproducibilidad general.

Además, optimizamos el protocolo de ARNi para el análisis de función génica en avispas parasitoides. Mediante el uso del sistema de microinyección, logramos un control preciso del volumen de inyección y mejoramos la consistencia de la eficiencia del knockdown. La validación funcional usando IDDF-1 confirmó que este método suprime eficazmente la expresión génica y produce resultados fenotípicos reproducibles. Dado que los estudios transcriptómicos y proteómicos continúan identificando un gran número de factores de veneno candidatos, la disponibilidad de una plataforma funcional de cribado será esencial para determinar sus roles biológicos.

Una limitación de este protocolo de ARN es que no es adecuado para analizar genes que funcionan durante las primeras etapas del desarrollo de las avispas, ya que es técnicamente difícil inyectar ARNdd en huevos de avispas presentes dentro del cuerpo huésped. Para superar esto, establecer un sistema de cría ex vivo puede ofrecer un enfoque útil^22. Alternativamente, los enfoques de eliminación genética usando Direct Parental (DIPA)-CRISPR pueden proporcionar una estrategia complementaria, mediante la cual se inyectan reactivos en hembras adultas para generar descendencia editada por el^{genoma 23}. De hecho, este enfoque ha generado con éxito a individuos knockout génicos en el ectoparásito pupal Nasonia vitripennis inyectando reactivos en hembras adultas o en individuos en la etapa pupal^{tardía 24}. Junto con nuestro método de knockdown génico basado en ARNi, estos enfoques facilitarán análisis más completos de las funciones génicas implicadas en el proceso de parasitismo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube	Greiner Bio-One	210261	Assay de infección
1 mL syringe	TERUMO	SS-01T	Inyección de dsRNA
Agar	Daisin, Ltd.	P-700	Cría
Asnol Petri Dish φ40×13.5mm	As One Corporation	1-8549-01	Assay de infección
Asnol Petri Dish φ55×17mm	As One Corporation	1-8549-02	Inyección de dsRNA
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich Co. Llc.	861146-25G	Inyección de dsRNA
Butyl p-Hydroxybenzoate	Nacalai Tesque, Inc.	06327-15	Cría
CO2 pressure regulator	YAMATOSANGYO	YR-507F-2	Assay de infección
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	LSM700	Análisis de imagen
Corn meal	Sunny Maize Co., Ltd.	No.4M	Cría
DAPI	Thermo Fisher Scientific Inc.	PI62247	Coloración de núcleos, 1:10000
Deionized water	Millipore Inc.	ZLXEV030WW	Assay de infección
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narishige	PC-10	Inyección de dsRNA
Fiji	NA	https://fiji.sc	Análisis de imagen
Filter paper	Advantec	ITEM 526	Cría
Fly food vial	Chiyoda Science Co., Ltd.	KFB-3M	Cría
Fly food vial plug	Chiyoda Science Co., Ltd.	AS-275	Cría
Forceps	Dumont Biologie	11252-20	Disección
Freezer, -20 °C	Nihon Freezer	GS-3120HC	Almacenamiento de muestras
Freezer, -80 °C	Nihon Freezer	CLN-52UD2	Almacenamiento de muestras
Glass slides	Matsunami Glass Ind., Ltd	S7213	Assay de infección
Glucose	Showa Sangyo Co., Ltd.	No disponible	Cría
KOD Plus Neo	Toyobo	KOD-401	Síntesis de dsRNA
Incubator	Panasonic	MIR-254-PJ	Cría
Ligation high Ver.2	Toyobo	LGK-201	Síntesis de dsRNA
Micropipette Grinder	Narishige	EG-401	Inyección de dsRNA
Mineral oil	Nacalai Tesque, Inc.	23306-84	Inyección de dsRNA
Nanoject III	Drummond Scientific Company	3-000-207	Inyección de dsRNA
Nanoject Glass Capillaries	Drummond Scientific Company	3-000-203-G/X	Inyección de dsRNA
pBluescript KS (+) plasmid	No disponible	No disponible	Síntesis de dsRNA
pBluescript SK (-) plasmid	No disponible	No disponible	Síntesis de dsRNA
PrimeScript reverse Transcriptase	Takara	2680A	Síntesis de dsRNA
Propionic acid	Nacalai Tesque, Inc.	29018-55	Cría
PROWIPE	Daio Paper Corporation	2-2624-02	Assay de infección, inyección de dsRNA.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover	Toyobo	FSQ-301	qRT-PCR
RNAiso Plus reagent	Takara	9108	qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)	Sarstedt	REF 58.487	Assay de infección
Small vial plug	Chiyoda Science Co., ltd.	QD-S4	Assay de infección
Spatula	As One Corporation	6-522-02	Cría
Square petri dish	Eiken Chemical Co., Ltd.	64-2192-55, AW2000	Inyección de dsRNA
Stereomicroscope	Leica Microsystems	lvesta3 (C-Mount)	Assay de infección
Stereomicroscope	Nikon Solutions Co., Ltd.	SMZ1000	Inyección de dsRNA
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	Síntesis de dsRNA
Thermal Cycler Dice Real Time System	Takara	TP815	qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlas	Astel	G02	Síntesis de dsRNA, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix	Toyobo	QPS-201	qRT-PCR
TissueLyser II	Qiagen	No disponible	qRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic Acid	Nacalai Tesque, Inc.	03420-65	Cría
Welch's grape 100 juice	Asahi Soft drinks Co., Ltd.	32390	Assay de infección
Yeast	Asahi Group Foods, Ltd.	HB-P02	Cría