Preservación de la complejidad tisular In Vivo en un modelo del sistema nervioso olfativo de ratones mediante análisis en montaje completo para el estudio de la regeneración neural

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo completo para preservar la complejidad anatómica del sistema nervioso olfativo del ratón. Aquí se detalla el procedimiento completo, incluyendo la disección, la preparación del tejido y la obtención de imágenes. Este protocolo puede utilizarse para estudiar el sistema olfativo en condiciones normales o anormales, incluyendo sus condiciones naturales de reparación.

Resumen

En la era del imagenológico tridimensional (3D), se ha reconocido que la inmunohistoquímica convencional presenta limitaciones importantes en los estudios de patología y anatomía humana compleja. Al analizar únicamente cortes delgados, las estructuras más grandes y aspectos esenciales de la arquitectura tisular pueden perder detalles contextuales críticos, lo que conduce a interpretaciones incompletas o engañosas. Aunque las secciones bidimensionales (2D) han permitido una comprensión básica de la histoarquitectura, resultan insuficientes para capturar la verdadera realidad tridimensional de los tejidos biológicos.

Un número creciente de estudios en múltiples regiones anatómicas ahora adopta técnicas que aíslan unidades anatómicas completas —preparaciones en montaje plano, montaje completo o en face— combinadas con microscopía fluorescente de alta resolución. Estos enfoques permiten una visualización e interpretación más completa de la organización estructural. Esto es particularmente relevante en el sistema nervioso olfativo, donde definir los mecanismos celulares complejos que subyacen a su notable capacidad regenerativa requiere un contexto de espesor completo. Los cortes delgados conllevan el riesgo de omitir características fisiopatológicas clave que aún permanecen poco definidas.

Dadas estas limitaciones y el vacío de conocimiento sobre las interacciones celulares que impulsan la regeneración olfativa, era esencial desarrollar una técnica refinada de montaje completo capaz de preservar la complejidad del tejido en todo su grosor. Se aislaron mucosas olfativas completas como muestras de espesor total, acompañadas de un protocolo optimizado de penetración de anticuerpos. La obtención de imágenes de alta resolución (EVIDENT SpinSR) y la reconstrucción 3D permitieron una visualización precisa de las interacciones celulares in vivo.

Introducción

El sistema nervioso olfativo (ONS) representa un modelo único y bien establecido para estudiar los mecanismos de regeneración neuronal, ya que conserva la capacidad única de renovación neuronal durante toda la vida¹. Sin embargo, el potencial de traslación clínica de esta capacidad neuro-reparadora sigue siendo limitado debido a importantes lagunas en nuestro conocimiento sobre el comportamiento de las células del sistema olfativo^2,3,4. Las respuestas celulares y la organización anatómica del ONS, incluyendo neuronas olfativas primarias, células envolventes olfativas (OECs) y fibroblastos perineurales, han sido descritas en varios estudios con animales, basados en cortes de tejido ultradelgados (<2 µm) combinados con modelos de lesión física severa aplicados al ONS de roedores^1,2. En dichos estudios, los animales generalmente se sacrificaban a los 10 días posteriores a la lesión, lo que proporciona una ventana muy reducida sobre un único momento específico del extenso y complejo proceso de remodelación del tejido durante la lesión neuronal². Estos estudios informaron que, tras la muerte axonal, las OECs y los fibroblastos persisten como canales continuos siguiendo la trayectoria de la lesión.

Aunque informativo, debido a las numerosas limitaciones explicadas anteriormente, el enfoque utilizado proporcionó una visión conceptual de baja resolución a un nivel superficial del SNO, impidiendo en última instancia una evaluación exhaustiva de la organización celular real dentro del SNO intacto³. Como resultado, podrían haberse pasado por alto relaciones espaciales críticas.

La preservación de la estructura tisular tridimensional es esencial para un análisis anatómico y celular preciso y se ha aplicado con éxito en múltiples órganos y patologías^{4,5,6,7,8,9,10,11,12}. Los enfoques de montaje completo se han utilizado para cartografiar la organización neural dentro de la mucosa olfativa^13,14, sin embargo, la visualización de las interacciones celulares con una estructura completa del epitelio olfativo, incluyendo una lámina propia preservada, aún no se ha realizado.

En este estudio, establecemos un flujo de trabajo que utiliza un modelo murino con procesamiento de tejidos en montaje completo, inmunotinción, imágenes de alta resolución y reconstrucción tridimensional, lo que permite un análisis detallado de la arquitectura del SNO. Este protocolo fue desarrollado para llenar el vacío en los métodos publicados existentes, ya que conserva y preserva la mucosa olfativa completa, incluyendo la lámina propia, permitiendo el estudio de las interacciones intercelulares. Destacablemente, esta metodología refinada de recolección y procesamiento de tejidos puede aplicarse y combinarse con diversos modelos del sistema olfativo.

Protocolo

Todos los experimentos que incluyeron animales y células modificadas transgénicamente se realizaron con la aprobación del Comité de Bioseguridad de la Universidad Griffith (NLRD/003/2020_var3) y del Comité de Ética Animal de la Universidad Griffith (MHIQ/04/23/AEC), de acuerdo con las directrices de la Oficina del Regulador de Tecnología Genética del Commonwealth de Australia (OGTR).

NOTA: Se utilizaron un total de 15 ratones de laboratorio adultos (8–9 semanas) de ambos sexos en el estudio. Específicamente, ratones transgénicos S100β-DsRed en los que todas las CEP expresan la proteína roja brillante DsRed bajo el control del promotor S100β. S100β forma parte de una familia más amplia de proteínas fijadoras de calcio, y comúnmente se expresa en células gliales del sistema nervioso central, como las CEP. Este modelo fue óptimo para los fines de estos experimentos, ya que permitió la localización sencilla de las poblaciones celulares diana mediante señales de fluorescencia endógenas. Los ratones transgénicos S100β-DsRed fueron generados previamente, y se ha demostrado que su uso proporciona una detección mejorada de las CEP en comparación con la inmunohistoquímica para análisis de tejidos fijados^15,16,17,18.

1. Recolección de cabezas y fijación del tejido

1. Eutanizar a los animales mediante inhalación creciente de CO₂ en los puntos temporales del experimento.
2. Asegurarse de que la muerte esté confirmada por la ausencia de reflejos corneales y de retirada plantar, seguida de dislocación cervical, o de acuerdo con el POE aprobado.
3. Retirar toda la cabeza y las mandíbulas con tijeras.
4. Quitar la piel del cráneo y eliminar el cartílago de la punta de la nariz para exponer la cavidad nasal y garantizar una penetración eficaz del agente fijador.
   NOTA: Se observó que este paso de cortar la parte más frontal del cartílago nasal del animal era crucial para permitir la fijación adecuada del tejido dentro de la cavidad nasal.
5. Enjuagar rápidamente las cabezas en PBS 1× para eliminar el exceso de sangre.
6. Fijar el tejido mediante inmersión durante la noche (12–18 h) en paraformaldehído al 4 %, durante al menos 6 h (tiempo suficiente para fijar el tejido de interés) a 4 °C en un agitador rotatorio.
   ADVERTENCIA: El paraformaldehído es un producto químico peligroso que libera vapores de formaldehído. Es tóxico por inhalación, contacto dérmico e ingestión; provoca irritación ocular, cutánea y respiratoria; y es un posible carcinógeno. Manipúlese únicamente en una campana extractora utilizando equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, bata de laboratorio y protección ocular. La eliminación segura de productos químicos peligrosos y residuos biológicos generados durante el protocolo debe realizarse de acuerdo con las normativas institucionales y locales.
   ​NOTA: Durante las optimizaciones, observamos que 6 h eran suficientes para fijar el tejido de interés; sin embargo, más de 12 h probablemente causaría sobrefijación y degradación de las estructuras mucosas.
7. Retirar las cabezas del agente fijador y lavarlas durante 3 h en PBS 1× a temperatura ambiente (20–25 °C) en un agitador rotatorio.
8. Almacenar las cabezas en PBS fresco a 4 °C y recolectar el tejido mucoso en preparación de montaje completo dentro de las 48 h

2. Recolección de tejidos en montaje completo

1. Realice el aislamiento del tejido bajo un microscopio.
2. Corte las cabezas por la mitad utilizando un escalpelo, siguiendo la línea medio-sagital.
3. Exponer el interior de la cavidad nasalFigura 1). Identifique las regiones anatómicas y recoja el tejido mucoso que recubre toda la sección anatómica (Figura 1B).
4. Usando un cortador de hueso, rompa y retire suavemente el hueso septal que cubre parte de la cavidad mucosa.
   NOTA: Véase Figura 2A; Este paso es crucial para exponer la cavidad cóncava debajo del hueso donde los haces de axones atraviesan la pared dorsal (Figura 1B).
5. Una vez expuesta esta área, use fórceps curvo para desprender y extraer suavemente el tejido de la pared dorsal cóncava. Levante el tejido del hueso subyacente y desprenda cuidadosamente la mucosa olfatoria restante para obtener la preparación completa intacta en montaje entero.
   NOTA: En esta etapa se requirió extrema precaución para evitar rasgar el tejido.
6. Recolecte el tejido de interés de ambas fosas nasales: la mucosa recubre el tabique, las paredes dorsales izquierda y derecha, y la lámina cribosa de la cavidad nasal (Figura 1A, B). Recolectar tejido de ambas fosas nasales, incluyendo el tabique, las paredes dorsales y la lámina cribosa, para aislar la región anatómica que contiene las estructuras olfativas primarias (Figura 2C).
7. Lavar los tejidos recolectados en PBS 1× y eliminar cualquier tejido no deseado, incluyendo fragmentos óseos. Almacenar los tejidos a 4 °C en PBS 1× para análisis futuros de inmunohistoquímica.
   NOTA: Si el tejido va a someterse a almacenamiento a largo plazo, se recomienda almacenarlo en una solución de PBS 1× y azida sódica al 0,001 % (p/v), a 4 °C.

3. Protocolo de tinción optimizado

NOTA: Los protocolos de tinción comúnmente utilizados suelen estar optimizados para secciones de grosor delgado a medio (por ejemplo, hasta 50 µm). Por lo tanto, fue necesario adaptar el protocolo al tejido mucho más grueso.
​Se observó que un paso crucial consistía en mantener el tejido flotando dentro de tubos Eppendorf durante todo el proceso de tinción y colocar los tubos sobre un rodillo mientras los reactivos penetraban. Por consiguiente, los pasos de tinción no se realizaron con el tejido sobre una lámina de imagen. Primero se tiñó el tejido mientras flotaba y posteriormente se montó sobre láminas de imagen. Estos detalles aseguraron que el tejido no se doblara y que los reactivos y los anticuerpos pudieran penetrar en toda la región.

1. Retire los tejidos del almacenamiento y colóquelos en un tubo Eppendorf con solución bloqueadora (la solución a utilizar dependerá del tinción específica).
   ​NOTA: Solución bloqueadora: 3% BSA, 0.3% Triton X-100 en PBS. Otro ajuste importante fue el tiempo al que se sometió el tejido a cada coctel de reactivos y anticuerpos.
2. Mantenga el tejido en la solución bloqueadora durante 3 h a temperatura ambiente en un agitador rotatorio.
   NOTA: Se observó que no era necesario aumentar la concentración de los anticuerpos y reactivos de tinción seleccionados (Tabla 1) si se incrementaba el tiempo de exposición en comparación con el enfoque estándar de inmuno histoquímica en secciones delgadas. Esto también minimizó el uso de reactivos de anticuerpos costosos. Las incubaciones se realizan en un tubo Eppendorf de 1,5 mL con la pestaña de sujeción de la tapa recortada para que pueda rodar en el agitador. El volumen del reactivo fue de 500 µL.
3. Incube durante 72 h a 4°C con los anticuerpos primarios en el agitador rotatorio.
4. Lave el tejido dos veces (1,5 h por lavado) usando PBS 1× a temperatura ambiente en el agitador rotatorio.
5. Incube el tejido con el anticuerpo secundario (envuelto en papel de aluminio) y la tinción de núcleos durante un mínimo de 4 h a temperatura ambiente en el agitador rotatorio primero, y luego páselo a incubación nocturna (12–18 h) a 4 °C en el agitador rotatorio.
6. Lave el tejido dos veces (1,5 h cada vez) usando PBS 1× a temperatura ambiente en el agitador rotatorio.

4. Preparación de la lámina

1. Retire suavemente el tejido del tubo Eppendorf
2. Bajo un microscopio, coloque el tejido sobre un portaobjetos y asegúrese de que no haya pliegues en el tejido.
   NOTA: Es posible identificar bajo el microscopio, sin ninguna fluorescencia, la orientación del tejido. El lado de la lámina propia del tejido mucoso debe colocarse sobre el portaobjetos con el epitelio hacia el vidrio del portaobjetos y la lámina propia hacia el cubreobjetos. La lámina propia puede identificarse por la presencia de haces gruesos de nervios, visibles sin tinción. Tener la orientación con la lámina propia hacia el lado del cubreobjetos y el lado del epitelio apoyado sobre el vidrio del portaobjetos facilitará tanto el proceso de tinción como el de obtención de imágenes.
3. Cubra los portaobjetos con medio de montaje fluorescente y selle los portaobjetos.
4. Los portaobjetos pueden almacenarse a 4 °C, tras secarlos durante la noche (12–18 h) a temperatura ambiente y en la oscuridad

5. Adquisición de imágenes y posprocesamiento

1. Adquisición de imágenes inmunofluorescentes de baja magnificación
   1. Realice el ensamblaje automático durante la adquisición de imágenes utilizando mezcla alfa lineal.
      ​NOTA: El número de fotogramas de la pila z debe ajustarse según el grosor de la muestra para asegurar una cobertura completa del volumen del tejido.
   2. Capture campos adyacentes de vista con un solapamiento del 15 %. Adquiera imágenes en mosaico utilizando un patrón de adquisición en meandro.
   3. Ajuste el número total de secciones ópticas según el grosor del tejido.
   4. Establezca la calibración de la imagen en 215,594 nm/píxel en ambos ejes X e Y. Adquiera imágenes como pilas z utilizando un tamaño de paso z de 0,8 µm.
   5. Coloque la muestra completa montada sobre la platina del microscopio confocal. Adquiera imágenes generales utilizando un objetivo de 30x (NA 1,04).
2. Adquisición de imágenes inmunofluorescentes de alta magnificación.
   1. Adquiera imágenes detalladas utilizando un objetivo de 60× (NA 1,5). Establezca la calibración de la imagen en 107,923 nm/píxel en ambos ejes X e Y. Adquiera imágenes en pilas z utilizando un tamaño de paso z de 0,41 µm.
   2. Ajuste el número total de secciones ópticas según el grosor del tejido. Y capture imágenes desde un único campo de visión.
      ​NOTA: No se requiere ensamblaje de imágenes para adquisiciones de 60× porque cada conjunto de datos consiste en un único campo de visión.
3. Adquisición de imágenes de referencia histológicas
   1. Imagene secciones murinas de cabeza en plano medio-sagital teñidas con HE utilizando un microscopio de escaneo de portaobjetos bajo iluminación de campo claro.
   2. Adquiera imágenes utilizando un objetivo de 40× (NA 0,95) y una magnificación de cámara de 0,63x, lo que resulta en una magnificación efectiva de 25,2×.
   3. Confirme una calibración de píxel de 136,905 nm/píxel en ambos ejes X e Y. Y adquiera la imagen como un plano focal único.
   4. Ensamble automáticamente imágenes en mosaico utilizando un patrón de adquisición en meandro y mezcla alfa lineal.
4. Adquisición de imágenes de referencia inmunofluorescentes generales
   1. Adquiera imágenes inmunofluorescentes complementarias generales utilizando un objetivo de 10x.
   2. Capture la muestra como una única rebanada z utilizando un solapamiento de mosaico del 0 % durante la adquisición de imágenes.
   3. Establezca la calibración de la imagen en 647,249 nm/píxel en ambos ejes X e Y. Y genere una imagen general que abarque toda la región anatómica de interés.
5. Procesamiento de imágenes y generación de las figuras finales.
   1. Exporte los conjuntos de datos de imágenes adquiridos al software de análisis de imágenes. Genere proyecciones de intensidad máxima (MIP) a partir de los conjuntos de datos de pilas z.
   2. Seleccione regiones de interés (ROI) para análisis posteriores y preparación de figuras.
   3. Combine imágenes inmunofluorescentes generales con imágenes HE correspondientes para generar figuras de referencia anatómica. Luego, verifique el alineamiento y la correspondencia anatómica entre los conjuntos de datos de fluorescencia e histológicos antes de la preparación de figuras.
      NOTA: Todo el ensamblaje de imágenes debe realizarse automáticamente durante la adquisición de imágenes utilizando configuraciones predeterminadas del microscopio y no debe requerir procesamiento posterior adicional. En nuestro caso, la representación 3D se generó utilizando el software Imaris: se utilizó el complemento de renderizado de superficie, basado en la intensidad umbral para cada canal adquirido, para producir la reconstrucción 3D. Finalmente, las imágenes finales se compilaron en Adobe Illustrator.

Resultados

Nuestro enfoque en montaje completo presentado aquí permitió el aislamiento y la preservación de la mucosa olfativa en su totalidad. En nuestro caso, nuestro enfoque se centró en comprender los cambios celulares y anatómicos a escalas macro (vista anatómica completa) y micro (nivel celular).

El enfoque de montaje completo nos permite recolectar tanto los compartimentos epiteliales como la lámina propia, y preservar las relaciones espaciales entre los haces de axones, las células envolventes olfativas (OECs) y los fibroblastos, nuestras células de interés. Este enfoque permitió la obtención de grandes conjuntos de datos continuos que capturaron el espesor completo y la amplia superficie del tejido mucoso (Figura 3) y nos posibilitó registrar detalles de la compleja estructura celular y sus interacciones (Figura 3), así como los cambios entre condiciones intactas (n = 3) (Figura 3A, B) y dañadas (n = 12) (Figura 3C, D).

Al combinar este procedimiento optimizado de manejo y tinción de tejidos con microscopía confocal de alta resolución, pudimos obtener imágenes de regiones mucosas más amplias con un gran detalle preciso a nivel celular en toda la profundidad del tejido. La adquisición de series en Z a través de múltiples regiones adyacentes permitió la reconstrucción de dominios anatómicos extendidos sin comprometer la resolución ni la integridad de la señal (Figura 4A–F). Debido al alto nivel de detalle celular, también pudimos utilizar las series en Z adquiridas del espesor completo del tejido (Figura 4G) para generar imágenes renderizadas (Figura 4H) y comprender mejor la microarquitectura del tejido.

La determinación confiable de la orientación del tejido antes del montaje y la obtención de imágenes se logró de forma constante sin necesidad de etiquetado fluorescente. El lado de la lámina propia se identificó fácilmente mediante microscopía de campo claro por la presencia de haces nerviosos gruesos, claramente distinguibles de la capa epitelial. La estandarización de la orientación de la muestra colocando la lámina propia adyacente al cubreobjetos y la superficie epitelial contra el portaobjetos mejoró la consistencia del imagenado entre muestras y facilitó la reconstrucción tridimensional posterior. La penetración de los anticuerpos puede determinarse mediante el análisis de la señal asociada observada a lo largo del grosor del tejido. Habitualmente, esto es evidente por la ausencia de señal o por una señal que disminuye progresivamente al adentrarse más en el tejido.

La representación tridimensional realizada en Imaris permitió una visualización clara de las redes celulares complejas y de la organización axonal dentro de la mucosa intacta. La representación basada en superficies, aplicada mediante umbralización específica de intensidad por canal, generó representaciones tridimensionales precisas de la arquitectura tisular al tiempo que conservaba detalles estructurales finos.

Para la tinción y visualización, los resultados esperados incluirían una visualización clara de la señal de tinción objetivo sin pérdida anormal de la señal ni deterioro de esta a lo largo del grosor de los tejidos. La incapacidad para visualizar un objetivo teñido conocido mediante microscopía debe considerarse un resultado insatisfactorio.

Figura 1. Representación de la región anatómica con superposición del tejido de mucosa en montaje completo. (A–C). Vista sagital del interior de la fosa nasal izquierda (tinción con hematoxilina y eosina, tinción HE) del ratón (A) con superposición de la tinción en montaje completo de la mucosa de la misma región (para orientación anatómica) (B), que muestra la orientación y posición de los haces de axones en verde y los núcleos celulares en azul. Esta técnica permitió la preservación de toda la estructura anatómica: es posible distinguir claramente los haces de axones del nervio olfatorio principal (ON) y accesorio (nervios vomeronasales, VNN), así como seguir su trayecto desde el tabique hasta el bulbo olfatorio (OB), a través de la lámina cribosa (B, C). El tejido mostrado aquí fue teñido con Hoechst para los núcleos (azul) y β-III-Tubulina para los haces de axones (verde). Imágenes representativas de n = 15 preparaciones independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Vistas macroscópicas y esquemáticas del sistema olfativo. (A) Utilizando un cortador de hueso, siguiendo la línea punteada roja, se elimina el hueso septal (región amarilla). (B) Una vez expuesta la cavidad cóncava de la fosa nasal subyacente (marrón), puede recolectarse todo el tejido mucoso que se extiende desde esta región hasta la mucosa respiratoria y olfativa. (C) Representación gráfica que ilustra la continuidad de estas estructuras que se extienden desde el epitelio olfativo hasta el bulbo olfativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Vista ampliada del área anatómica obtenida mediante un protocolo de recolección e tinción en preparación completa. (A–D). Se muestran imágenes representativas de mucosas sanas y dañadas. De arriba hacia abajo, mucosa íntegra de tejido sano (n = 3) y mucosa dañada (n = 12). En el tejido sano (A), las células olfatorias envolventes (OEC) con sus morfologías bipolar alargada (A, izquierda) envuelven los haces de axones (A, centro), y los fibroblastos forman la capa externa de estas estructuras similares a túneles (A, derecha, flecha blanca). Las tres regiones de interés seleccionadas reflejan estos detalles (B). En la mucosa dañada, las OEC presentan tanto morfologías bipolares como redondeadas (C, D, izquierda, flechas blancas). Los haces de axones aparecen menos uniformes y compactos (C, D, centro, flechas blancas). Los fibroblastos aparecen ampliamente distribuidos en toda la región (C, D, derecha, flechas blancas). Barra de escala = 100 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Imágenes fluorescentes tridimensionales de preparaciones completas de mucosa. (A–H). Se obtuvieron imágenes de baja potencia de las células (A–F) y una imagen de alta potencia (G) a partir de pilas de imágenes de múltiples regiones consecutivas utilizando un microscopio SpinSR. Las células envolventes olfativas (OEC) se muestran en rojo, los fibroblastos en magenta, los axones en verde y los núcleos en azul. Las flechas indican diferentes morfologías de las OEC (A) y una capa externa de fibroblastos alrededor de los haces de axones (B y C). En D–F, las flechas resaltan similitudes en las estructuras sanas de los fibroblastos. Estas imágenes destacaron la organización espacial de los componentes celulares, que luego fueron representados mediante el software Imaris (H). Barra de escala = 50 µm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivo	Objetivo	Dilución	Condiciones de incubación	Razonamiento
Anticuerpo primario
β-III-Tubulin (Rabbit)	Axones	1:300	Durante 72 h a 4 °C, en agitador rotatorio	para permitir una penetración completa en todo el espesor
PDGFR-β (Rat)	Fibroblastos	1:100
Anticuerpo secundario
Alexa 488	Anticuerpos primarios de conejo	1:250	Envuelto en papel de aluminio, durante un mínimo de 4 h a temperatura ambiente en agitador rotatorio, luego toda la noche a 4 °C en agitador rotatorio.	El papel de aluminio evita el fotoblanqueo; la duración, temperatura y agitación inducida por el agitador permiten una buena penetración
Alexa 647	Anticuerpos primarios de rata	1:500
Núcleos
Hoechst	Núcleos celulares	1:2500

Tabla 1: Lista de anticuerpos con diluciones optimizadas para este protocolo. Esta tabla enumera los reactivos de tinción con sus dianas, diluciones y justificación para las condiciones de incubación.

Discusión

Las últimas décadas han sido testigo paulatina del inicio de la era tridimensional, con numerosos enfoques innovadores que se han desarrollado en el ámbito científico. Por ejemplo, los métodos de reconstrucción tridimensional, posibles gracias al desarrollo de complejas técnicas de imagen en montaje completo combinadas con microscopios fluorescentes de alta resolución, han facilitado una mejor comprensión de varias arquitecturas tisulares en espesor completo. Estos enfoques de representación tridimensional se han utilizado para definir diversas estructuras del cuerpo humano, como vasos sanguíneos, glándulas y tumores comunes^4,5,6,7,8,9. Además, se ha recopilado información sobre las diferencias entre estructuras patológicas y normales, por ejemplo, en cerebros completos de ratón^10,11,12. Este enfoque ha sido identificado como un paso fundamental hacia una mejor comprensión de los diversos sistemas biológicos, facilitando una comprensión más profunda de los circuitos celulares, su organización espacial estructural y funcional, y su posible contribución a las patologías humanas.

Una desventaja de las diferentes combinaciones de reconstrucción tridimensional de tejidos y obtención de imágenes es que la mayoría de los enfoques implican pasos de clarificación del tejido. Aunque este método es útil para muchos tejidos, no es adecuado para todos los tipos de tejidos^8,9,19. De hecho, los procedimientos de clarificación incluyen varios pasos de lavado, que podrían dañar potencialmente los epítopos diana e influir en las señales endógenas²⁰.

Los enfoques descritos anteriormente se han utilizado para definir muchas estructuras celulares importantes dentro de diferentes sistemas. Sin embargo, el sistema olfativo y sus estructuras de interés tienen una presencia mínima de componentes óseos a partir de los cuales podrían aislarse fácilmente; por lo tanto, en los últimos años se han probado enfoques de montaje completo que no incluyen pasos de clarificación^13,14.

Estos estudios reconocieron la importancia de definir mejor la organización de las estructuras neuronales en el sistema olfativo. Por consiguiente, su enfoque principal fue proporcionar un mapa topográfico claro de la distribución de las neuronas sensoriales olfativas basado en la expresión de diferentes marcadores¹⁴, así como revelar nuevos conocimientos sobre sus cilios peculiares¹³.

La técnica de montaje completo desarrollada y presentada aquí permite la recolección y preservación del tejido mucoso en su totalidad, abriendo la posibilidad de obtener información crucial sobre la estructura anatómica y fisiológica de este entorno, con un enfoque específico, en nuestro caso, en la relación entre las células envolventes olfativas (OEC), los fibroblastos y los haces de axones. La combinación de esta técnica refinada de aislamiento y tinción con imágenes confocales de alta resolución permitió obtener imágenes amplias que reflejan la estructura de toda la región objetivo y de sus células residentes. Específicamente, nuestra técnica refinada ofrece dos ventajas distintivas: se recolecta y procesa toda la mucosa, incluyendo la arquitectura de la lámina propia¹³, y el método más suave de preparación del tejido ayuda a preservar la anatomía a gran escala, así como las interacciones intercelulares (como las células envolventes olfativas, los axones y los fibroblastos), en comparación con otros protocolos de montaje plano¹⁴. Por esta razón, este protocolo no incluye validación frente a la tinción de cortes finos.

Como se mencionó anteriormente, las técnicas de montaje completo suelen implicar largos períodos de procesamiento de tejidos y el uso de reactivos específicos y costosos. Este método se desarrolló centrándose en un procesamiento mínimo del tejido para reducir tanto el tiempo requerido como el riesgo de dañar estructuras celulares importantes. Por lo tanto, el método optimizado representa un proceso rápido que puede realizarse utilizando reactivos comúnmente empleados para inmunohistoquímica en secciones delgadas, proporcionando una alternativa válida a los enfoques que requieren tiempos de procesamiento más largos y que no son adecuados para estructuras sin hueso, como el tejido mucoso.

La adquisición de imágenes y el posprocesamiento se pueden realizar utilizando cualquier plataforma de microscopía confocal capaz de adquirir z-stacks de alta resolución a partir de muestras de tejido grueso, con penetración láser suficiente para obtener imágenes a través de las mucosas de interés (consulte la sección de métodos para obtener más detalles sobre nuestros ajustes de adquisición y procesamiento de imágenes).

Con modificaciones adecuadas, creemos que este protocolo puede traducirse y aplicarse a otros modelos comunes de roedores. Con algunas modificaciones específicas del tejido, este método puede aplicarse a varios contextos diferentes, incluido el estudio de tejidos mucosos y submucosos del sistema respiratorio y del tracto gastrointestinal (GIT); la investigación de la organización tisular e interacciones multisistémicas dentro del sistema nervioso; el análisis de procesos inflamatorios y tejidos linfoides asociados a la mucosa (MALTs); así como la exploración de diferentes ejes multisistémicos, como el eje intestino-cerebro.

La principal ventaja de este protocolo radica en los refinamientos metodológicos que permiten obtener imágenes tridimensionales de alta calidad conservando la integridad del tejido, pero también asegurando un enfoque relativamente rápido en comparación con otras metodologías de montaje completo previamente evaluadas en el campo.

La implementación exitosa de este enfoque dependió en gran medida de un profundo conocimiento anatómico del tejido de interés. De hecho, en nuestro caso, conocer la localización esperada de los haces de axones fue esencial para minimizar la invasividad del procedimiento de recolección una vez expuesto el interior del cráneo. Este conocimiento anatómico fue crucial para poder localizar rápidamente la región y el tejido de interés y preservar la estructura general de la mucosa, lo que resalta cómo un procesamiento exitoso del tejido está intrínsecamente vinculado a una estrategia informada de recolección, y no únicamente a los pasos posteriores de procesamiento.

Como se mencionó en la sección de métodos en varias notas, múltiples ajustes técnicos fueron fundamentales para el desarrollo y la optimización de este método. Mantener el tejido flotando libremente dentro de tubos Eppendorf durante todo el proceso de tinción, combinado con una rotación continua durante la incubación con reactivos y anticuerpos, representó un paso clave frente a los protocolos más estáticos de montaje completo y de secciones delgadas. Esta mejora evitó el plegamiento del tejido y aseguró al mismo tiempo una penetración homogénea de los reactivos en toda la muestra, mejorando así la consistencia de la tinción sin necesidad de pasos innecesarios de aclarado. Además, resultó esencial una optimización cuidadosa de la duración de la incubación para cada cóctel de reactivos y anticuerpos. Es posible que este último paso deba ajustarse aún más según el tipo de anticuerpo elegido.

En conjunto, estos factores específicos resultaron en una reproducibilidad mejorada, al tiempo que redujeron el tiempo total de procesamiento y el manejo más agresivo de las muestras.

Otro paso metodológico importante fue la capacidad de determinar de manera confiable la orientación del tejido antes del montaje y del análisis de imágenes, sin necesidad de etiquetado fluorescente. El lado de la lámina propia del tejido mucoso pudo identificarse fácilmente mediante microscopía de campo claro por la presencia de haces nerviosos gruesos, claramente distinguibles del tejido epitelial circundante. Se encontró que la estandarización de la orientación de la muestra, colocando la lámina propia hacia el lado del cubreobjetos y la capa epitelial sobre el portaobjetos, facilitaba la calidad de la adquisición de imágenes. Este ajuste sencillo pero eficaz mejoró la consistencia del análisis de imágenes entre muestras y contribuyó a la calidad de las reconstrucciones tridimensionales obtenidas.

Sin embargo, existen algunas limitaciones que deben considerarse. Este protocolo no se ha probado en muchas cepas comunes de ratón ni en otras especies de roedores. De manera similar, las optimizaciones se realizaron bajo las condiciones experimentales específicas descritas anteriormente y únicamente con los paneles de anticuerpos indicados. Aunque se espera que el protocolo funcione con la mayoría de las cepas de ratón y rata, varios anticuerpos diferentes y cualquier modelo experimental que permita obtener mucosas con espesor completo, podría requerirse una optimización adicional cuidadosa. Otra limitación notable es que una sola sección en montaje completo solo puede ser marcada con un panel de anticuerpos, a diferencia de los tejidos seccionados finamente, en los que cada corte puede marcarse con un panel de anticuerpos individual y, por lo tanto, pueden evaluarse múltiples paneles diferentes de anticuerpos en tejidos seccionados finamente.

En general, estas innovaciones metodológicas demuestran cómo ajustes relativamente sencillos en el manejo de tejidos, las condiciones de tinción y la orientación de las muestras pueden mejorar sustancialmente los resultados del imagenado en montaje completo. Al evitar procesamientos extensos del tejido y pasos de aclarado, este enfoque ofrece una alternativa práctica y adaptable para el estudio de tejidos delicados y sin hueso, permitiendo aún la adquisición de datos tridimensionales detallados y a gran escala.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3294-50G	Inmunohistoquímica
Adobe Illustrator		versión 28.5
Anticuerpo anti-beta III tubulina - marcador neuronal	Abcam	ab18207
Anticuerpo anti-PDGFR beta [APB5]	Abcam	ab91066
bisBenzimida H 33342 trihidrocloruro	Sigma Aldrich	14533
COBERTOR DE 24X50 MM NO. 1.5 100 PIEZAS	Bio-strategy	EPBRCS245015GP	Inmunohistoquímica
Anticuerpo secundario IgG de burro anti-conejo (H+L), altamente adsorbido por cruzamiento, Alexa Fluo 488	Thermo Fisher	A-21206
Cortador de hueso Dumont n.º 15A - recubierto con epoxi	Daniels Health Laboratory Products P/L	11215-02	Diseción de tejidos
Pinzas Dumont n.º 7 - Biología/Dumostar	Daniels Health Laboratory Products P/L	11297-10	Disección de tejidos
Anticuerpo secundario IgG de cabra anti-rata (H+L), adsorbido por cruzamiento, Alexa Fluor™ 647	Thermo Fisher	A-21247
Software Imaris	Imaris	versión 9.5.0	Imagenología
Tijeras de disección Mayo	ProSciTech	420SS	Disección de tejidos
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Procesamiento de tejidos
Solución salina tamponada con fosfato, tabletas estériles de PBS (PBS)	Thermo Fisher Scientific	18912014	Procesamiento de tejidos
Medio de montaje antidesvanecimiento ProLong Glass	Thermo Fisher Scientific	P36980	Inmunohistoquímica
Cuchilla de bisturí n.º 23	Scalpel Blades Swann Morton	COS240B	Disección de tejidos
Manija de bisturí n.º 4	ProSciTech	T134	Disección de tejidos
Azida sódica	Sigma-Aldrich	S2002-25G	Procesamiento de tejidos
Sacarosa	Chem-Supply	57-50-1	Procesamiento de tejidos
Portaobjetos microscópicos adhesivos TOMO	ProSciTech	GEMS63705-09	Inmunohistoquímica
Tritón X-100	Sigma-Aldrich	X100-100mL	Inmunohistoquímica