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Artículo de método

Preservación de la complejidad tisular In Vivo en un modelo del sistema nervioso olfativo de ratones mediante análisis en montaje completo para el estudio de la regeneración neural

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DOI:

10.3791/72036

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18 de agosto de 2026

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1Griffith Institute for Biomedicine and Glycomics, Griffith University, 2Clem Jones Centre for Neurobiology and Stem Cell Research, Griffith University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un flujo de trabajo completo para preservar la complejidad anatómica del sistema nervioso olfativo del ratón. Aquí se detalla el procedimiento completo, incluyendo la disección, la preparación del tejido y la obtención de imágenes. Este protocolo puede utilizarse para estudiar el sistema olfativo en condiciones normales o anormales, incluyendo sus condiciones naturales de reparación.

Resumen

En la era del imagenológico tridimensional (3D), se ha reconocido que la inmunohistoquímica convencional presenta limitaciones importantes en los estudios de patología y anatomía humana compleja. Al analizar únicamente cortes delgados, las estructuras más grandes y aspectos esenciales de la arquitectura tisular pueden perder detalles contextuales críticos, lo que conduce a interpretaciones incompletas o engañosas. Aunque las secciones bidimensionales (2D) han permitido una comprensión básica de la histoarquitectura, resultan insuficientes para capturar la verdadera realidad tridimensional de los tejidos biológicos.

Un número creciente de estudios en múltiples regiones anatómicas ahora adopta técnicas que aíslan unidades anatómicas completas —preparaciones en montaje plano, montaje completo o en face— combinadas con microscopía fluorescente de alta resolución. Estos enfoques permiten una visualización e interpretación más completa de la organización estructural. Esto es particularmente relevante en el sistema nervioso olfativo, donde definir los mecanismos celulares complejos que subyacen a su notable capacidad regenerativa requiere un contexto de espesor completo. Los cortes delgados conllevan el riesgo de omitir características fisiopatológicas clave que aún permanecen poco definidas.

Dadas estas limitaciones y el vacío de conocimiento sobre las interacciones celulares que impulsan la regeneración olfativa, era esencial desarrollar una técnica refinada de montaje completo capaz de preservar la complejidad del tejido en todo su grosor. Se aislaron mucosas olfativas completas como muestras de espesor total, acompañadas de un protocolo optimizado de penetración de anticuerpos. La obtención de imágenes de alta resolución (EVIDENT SpinSR) y la reconstrucción 3D permitieron una visualización precisa de las interacciones celulares in vivo.

Introducción

El sistema nervioso olfativo (ONS) representa un modelo único y bien establecido para estudiar los mecanismos de regeneración neuronal, ya que conserva la capacidad única de renovación neuronal durante toda la vida1. Sin embargo, el potencial de traslación clínica de esta capacidad neuro-reparadora sigue siendo limitado debido a importantes lagunas en nuestro conocimiento sobre el comportamiento de las células del sistema olfativo2,3,4. Las respuestas celulares y la organización anatómica del ONS, incluyendo neuronas olfativas primarias, células envolventes olfativas (OECs) y fibroblastos perineurales, han sido descritas en varios estudios con animales, basados en cortes de tejido ultradelgados (<2 µm) combinados con modelos de lesión física severa aplicados al ONS de roedores1,2. En dichos estudios, los animales generalmente se sacrificaban a los 10 días posteriores a la lesión, lo que proporciona una ventana muy reducida sobre un único momento específico del extenso y complejo proceso de remodelación del tejido durante la lesión neuronal2. Estos estudios informaron que, tras la muerte axonal, las OECs y los fibroblastos persisten como canales continuos siguiendo la trayectoria de la lesión.

Aunque informativo, debido a las numerosas limitaciones explicadas anteriormente, el enfoque utilizado proporcionó una visión conceptual de baja resolución a un nivel superficial del SNO, impidiendo en última instancia una evaluación exhaustiva de la organización celular real dentro del SNO intacto3. Como resultado, podrían haberse pasado por alto relaciones espaciales críticas.

La preservación de la estructura tisular tridimensional es esencial para un análisis anatómico y celular preciso y se ha aplicado con éxito en múltiples órganos y patologías4,5,6,7,8,9,10,11,12. Los enfoques de montaje completo se han utilizado para cartografiar la organización neural dentro de la mucosa olfativa13,14, sin embargo, la visualización de las interacciones celulares con una estructura completa del epitelio olfativo, incluyendo una lámina propia preservada, aún no se ha realizado.

En este estudio, establecemos un flujo de trabajo que utiliza un modelo murino con procesamiento de tejidos en montaje completo, inmunotinción, imágenes de alta resolución y reconstrucción tridimensional, lo que permite un análisis detallado de la arquitectura del SNO. Este protocolo fue desarrollado para llenar el vacío en los métodos publicados existentes, ya que conserva y preserva la mucosa olfativa completa, incluyendo la lámina propia, permitiendo el estudio de las interacciones intercelulares. Destacablemente, esta metodología refinada de recolección y procesamiento de tejidos puede aplicarse y combinarse con diversos modelos del sistema olfativo.

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Protocolo

Todos los experimentos que incluyeron animales y células modificadas transgénicamente se realizaron con la aprobación del Comité de Bioseguridad de la Universidad Griffith (NLRD/003/2020_var3) y del Comité de Ética Animal de la Universidad Griffith (MHIQ/04/23/AEC), de acuerdo con las directrices de la Oficina del Regulador de Tecnología Genética del Commonwealth de Australia (OGTR).

NOTA: Se utilizaron un total de 15 ratones de laboratorio adultos (8–9 semanas) de ambos sexos en el estudio. Específicamente, ratones transgénicos S100β-DsRed en los que todas las CEP expresan la proteína roja brillante DsRed bajo el control del promotor S100β. S100β forma parte de una familia más amplia de proteínas fijadoras de calcio, y comúnmente se expresa en células gliales del sistema nervioso central, como las CEP. Este modelo fue óptimo para los fines de estos experimentos, ya que permitió la localización sencilla de las poblaciones celulares diana mediante señales de fluorescencia endógenas. Los ratones transgénicos S100β-DsRed fueron generados previamente, y se ha demostrado que su uso proporciona una detección mejorada de las CEP en comparación con la inmunohistoquímica para análisis de tejidos fijados15,16,17,18.

1. Recolección de cabezas y fijación del tejido

  1. Eutanizar a los animales mediante inhalación creciente de CO2 en los puntos temporales del experimento.
  2. Asegurarse de que la muerte esté confirmada por la ausencia de reflejos corneales y de retirada plantar, seguida de dislocación cervical, o de acuerdo con el POE aprobado.
  3. Retirar toda la cabeza y las mandíbulas con tijeras.
  4. Quitar la piel del cráneo y eliminar el cartílago de la punta de la nariz para exponer la cavidad nasal y garantizar una penetración eficaz del agente fijador.
    NOTA: Se observó que este paso de cortar la parte más frontal del cartílago nasal del animal era crucial para permitir la fijación adecuada del tejido dentro de la cavidad nasal.
  5. Enjuagar rápidamente las cabezas en PBS 1× para eliminar el exceso de sangre.
  6. Fijar el tejido mediante inmersión durante la noche (12–18 h) en paraformaldehído al 4 %, durante al menos 6 h (tiempo suficiente para fijar el tejido de interés) a 4 °C en un agitador rotatorio.
    ADVERTENCIA: El paraformaldehído es un producto químico peligroso que libera vapores de formaldehído. Es tóxico por inhalación, contacto dérmico e ingestión; provoca irritación ocular, cutánea y respiratoria; y es un posible carcinógeno. Manipúlese únicamente en una campana extractora utilizando equipo de protección personal adecuado, incluyendo guantes, bata de laboratorio y protección ocular. La eliminación segura de productos químicos peligrosos y residuos biológicos generados durante el protocolo debe realizarse de acuerdo con las normativas institucionales y locales.
    ​NOTA: Durante las optimizaciones, observamos que 6 h eran suficientes para fijar el tejido de interés; sin embargo, más de 12 h probablemente causaría sobrefijación y degradación de las estructuras mucosas.
  7. Retirar las cabezas del agente fijador y lavarlas durante 3 h en PBS 1× a temperatura ambiente (20–25 °C) en un agitador rotatorio.
  8. Almacenar las cabezas en PBS fresco a 4 °C y recolectar el tejido mucoso en preparación de montaje completo dentro de las 48 h

2. Recolección de tejidos en montaje completo

  1. Realice el aislamiento del tejido bajo un microscopio.
  2. Corte las cabezas por la mitad utilizando un escalpelo, siguiendo la línea medio-sagital.
  3. Exponer el interior de la cavidad nasalFigura 1). Identifique las regiones anatómicas y recoja el tejido mucoso que recubre toda la sección anatómica (Figura 1B).
  4. Usando un cortador de hueso, rompa y retire suavemente el hueso septal que cubre parte de la cavidad mucosa.
    NOTA: Véase Figura 2A; Este paso es crucial para exponer la cavidad cóncava debajo del hueso donde los haces de axones atraviesan la pared dorsal (Figura 1B).
  5. Una vez expuesta esta área, use fórceps curvo para desprender y extraer suavemente el tejido de la pared dorsal cóncava. Levante el tejido del hueso subyacente y desprenda cuidadosamente la mucosa olfatoria restante para obtener la preparación completa intacta en montaje entero.
    NOTA: En esta etapa se requirió extrema precaución para evitar rasgar el tejido.
  6. Recolecte el tejido de interés de ambas fosas nasales: la mucosa recubre el tabique, las paredes dorsales izquierda y derecha, y la lámina cribosa de la cavidad nasal (Figura 1A, B). Recolectar tejido de ambas fosas nasales, incluyendo el tabique, las paredes dorsales y la lámina cribosa, para aislar la región anatómica que contiene las estructuras olfativas primarias (Figura 2C).
  7. Lavar los tejidos recolectados en PBS 1× y eliminar cualquier tejido no deseado, incluyendo fragmentos óseos. Almacenar los tejidos a 4 °C en PBS 1× para análisis futuros de inmunohistoquímica.
    NOTA: Si el tejido va a someterse a almacenamiento a largo plazo, se recomienda almacenarlo en una solución de PBS 1× y azida sódica al 0,001 % (p/v), a 4 °C.

3. Protocolo de tinción optimizado

NOTA: Los protocolos de tinción comúnmente utilizados suelen estar optimizados para secciones de grosor delgado a medio (por ejemplo, hasta 50 µm). Por lo tanto, fue necesario adaptar el protocolo al tejido mucho más grueso.
​Se observó que un paso crucial consistía en mantener el tejido flotando dentro de tubos Eppendorf durante todo el proceso de tinción y colocar los tubos sobre un rodillo mientras los reactivos penetraban. Por consiguiente, los pasos de tinción no se realizaron con el tejido sobre una lámina de imagen. Primero se tiñó el tejido mientras flotaba y posteriormente se montó sobre láminas de imagen. Estos detalles aseguraron que el tejido no se doblara y que los reactivos y los anticuerpos pudieran penetrar en toda la región.

  1. Retire los tejidos del almacenamiento y colóquelos en un tubo Eppendorf con solución bloqueadora (la solución a utilizar dependerá del tinción específica).
    ​NOTA: Solución bloqueadora: 3% BSA, 0.3% Triton X-100 en PBS. Otro ajuste importante fue el tiempo al que se sometió el tejido a cada coctel de reactivos y anticuerpos.
  2. Mantenga el tejido en la solución bloqueadora durante 3 h a temperatura ambiente en un agitador rotatorio.
    NOTA: Se observó que no era necesario aumentar la concentración de los anticuerpos y reactivos de tinción seleccionados (Tabla 1) si se incrementaba el tiempo de exposición en comparación con el enfoque estándar de inmuno histoquímica en secciones delgadas. Esto también minimizó el uso de reactivos de anticuerpos costosos. Las incubaciones se realizan en un tubo Eppendorf de 1,5 mL con la pestaña de sujeción de la tapa recortada para que pueda rodar en el agitador. El volumen del reactivo fue de 500 µL.
  3. Incube durante 72 h a 4°C con los anticuerpos primarios en el agitador rotatorio.
  4. Lave el tejido dos veces (1,5 h por lavado) usando PBS 1× a temperatura ambiente en el agitador rotatorio.
  5. Incube el tejido con el anticuerpo secundario (envuelto en papel de aluminio) y la tinción de núcleos durante un mínimo de 4 h a temperatura ambiente en el agitador rotatorio primero, y luego páselo a incubación nocturna (12–18 h) a 4 °C en el agitador rotatorio.
  6. Lave el tejido dos veces (1,5 h cada vez) usando PBS 1× a temperatura ambiente en el agitador rotatorio.

4. Preparación de la lámina

  1. Retire suavemente el tejido del tubo Eppendorf
  2. Bajo un microscopio, coloque el tejido sobre un portaobjetos y asegúrese de que no haya pliegues en el tejido.
    NOTA: Es posible identificar bajo el microscopio, sin ninguna fluorescencia, la orientación del tejido. El lado de la lámina propia del tejido mucoso debe colocarse sobre el portaobjetos con el epitelio hacia el vidrio del portaobjetos y la lámina propia hacia el cubreobjetos. La lámina propia puede identificarse por la presencia de haces gruesos de nervios, visibles sin tinción. Tener la orientación con la lámina propia hacia el lado del cubreobjetos y el lado del epitelio apoyado sobre el vidrio del portaobjetos facilitará tanto el proceso de tinción como el de obtención de imágenes.
  3. Cubra los portaobjetos con medio de montaje fluorescente y selle los portaobjetos.
  4. Los portaobjetos pueden almacenarse a 4 °C, tras secarlos durante la noche (12–18 h) a temperatura ambiente y en la oscuridad

5. Adquisición de imágenes y posprocesamiento

  1. Adquisición de imágenes inmunofluorescentes de baja magnificación
    1. Realice el ensamblaje automático durante la adquisición de imágenes utilizando mezcla alfa lineal.
      ​NOTA: El número de fotogramas de la pila z debe ajustarse según el grosor de la muestra para asegurar una cobertura completa del volumen del tejido.
    2. Capture campos adyacentes de vista con un solapamiento del 15 %. Adquiera imágenes en mosaico utilizando un patrón de adquisición en meandro.
    3. Ajuste el número total de secciones ópticas según el grosor del tejido.
    4. Establezca la calibración de la imagen en 215,594 nm/píxel en ambos ejes X e Y. Adquiera imágenes como pilas z utilizando un tamaño de paso z de 0,8 µm.
    5. Coloque la muestra completa montada sobre la platina del microscopio confocal. Adquiera imágenes generales utilizando un objetivo de 30x (NA 1,04).
  2. Adquisición de imágenes inmunofluorescentes de alta magnificación.
    1. Adquiera imágenes detalladas utilizando un objetivo de 60× (NA 1,5). Establezca la calibración de la imagen en 107,923 nm/píxel en ambos ejes X e Y. Adquiera imágenes en pilas z utilizando un tamaño de paso z de 0,41 µm.
    2. Ajuste el número total de secciones ópticas según el grosor del tejido. Y capture imágenes desde un único campo de visión.
      ​NOTA: No se requiere ensamblaje de imágenes para adquisiciones de 60× porque cada conjunto de datos consiste en un único campo de visión.
  3. Adquisición de imágenes de referencia histológicas
    1. Imagene secciones murinas de cabeza en plano medio-sagital teñidas con HE utilizando un microscopio de escaneo de portaobjetos bajo iluminación de campo claro.
    2. Adquiera imágenes utilizando un objetivo de 40× (NA 0,95) y una magnificación de cámara de 0,63x, lo que resulta en una magnificación efectiva de 25,2×.
    3. Confirme una calibración de píxel de 136,905 nm/píxel en ambos ejes X e Y. Y adquiera la imagen como un plano focal único.
    4. Ensamble automáticamente imágenes en mosaico utilizando un patrón de adquisición en meandro y mezcla alfa lineal.
  4. Adquisición de imágenes de referencia inmunofluorescentes generales
    1. Adquiera imágenes inmunofluorescentes complementarias generales utilizando un objetivo de 10x.
    2. Capture la muestra como una única rebanada z utilizando un solapamiento de mosaico del 0 % durante la adquisición de imágenes.
    3. Establezca la calibración de la imagen en 647,249 nm/píxel en ambos ejes X e Y. Y genere una imagen general que abarque toda la región anatómica de interés.
  5. Procesamiento de imágenes y generación de las figuras finales.
    1. Exporte los conjuntos de datos de imágenes adquiridos al software de análisis de imágenes. Genere proyecciones de intensidad máxima (MIP) a partir de los conjuntos de datos de pilas z.
    2. Seleccione regiones de interés (ROI) para análisis posteriores y preparación de figuras.
    3. Combine imágenes inmunofluorescentes generales con imágenes HE correspondientes para generar figuras de referencia anatómica. Luego, verifique el alineamiento y la correspondencia anatómica entre los conjuntos de datos de fluorescencia e histológicos antes de la preparación de figuras.
      NOTA: Todo el ensamblaje de imágenes debe realizarse automáticamente durante la adquisición de imágenes utilizando configuraciones predeterminadas del microscopio y no debe requerir procesamiento posterior adicional. En nuestro caso, la representación 3D se generó utilizando el software Imaris: se utilizó el complemento de renderizado de superficie, basado en la intensidad umbral para cada canal adquirido, para producir la reconstrucción 3D. Finalmente, las imágenes finales se compilaron en Adobe Illustrator.

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Resultados

Nuestro enfoque de montaje completo presentado aquí permitió el aislamiento y la preservación de la mucosa olfativa en su totalidad. En nuestro caso, nuestro enfoque se centró en comprender los cambios celulares y anatómicos a escalas macro (vista anatómica completa) y micro (nivel celular).

El enfoque de montaje completo nos permite recolectar tanto los compartimentos epiteliales como la lámina propia, y preservar las relaciones espaciales entre los haces de axones, las células envolventes ol...

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Discusión

Las últimas décadas han sido testigo paulatina del inicio de la era tridimensional, con numerosos enfoques innovadores que se han desarrollado en el ámbito científico. Por ejemplo, los métodos de reconstrucción tridimensional, posibles gracias al desarrollo de complejas técnicas de imagen en montaje completo combinadas con microscopios fluorescentes de alta resolución, han facilitado una mejor comprensión de varias arquitecturas tisulares en espesor completo. Estos enfoques de representación tridimensional se han utiliza...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por fondos de la Clem Jones Foundation, la Perry Cross Spinal Research Foundation y la Motor Accident Insurance Commission otorgados a JSTJ y RR, una beca del National Injury Insurance Scheme Queensland otorgada a RR y una beca de la Perry Cross Spinal Research Foundation otorgada a FO. Parte de este proyecto fue apoyado por la «Griffith University Post-Graduate Research Scholarship (GUPRS)» y la «Griffith University International Postgraduate Research Scholarship (GUIPRS)» otorgadas a FO.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichA3294-50GInmunohistoquímica
Adobe Illustratorversión 28.5
Anticuerpo anti-beta III tubulina - marcador neuronalAbcamab18207
Anticuerpo anti-PDGFR beta [APB5]Abcamab91066
bisBenzimida H 33342 trihidrocloruroSigma Aldrich14533
COBERTOR DE 24X50 MM NO. 1.5 100 PIEZASBio-strategyEPBRCS245015GPInmunohistoquímica
Anticuerpo secundario IgG de burro anti-conejo (H+L), altamente adsorbido por cruzamiento, Alexa Fluo 488Thermo FisherA-21206
Cortador de hueso Dumont n.º 15A - recubierto con epoxiDaniels Health Laboratory Products P/L11215-02Diseción de tejidos
Pinzas Dumont n.º 7 - Biología/DumostarDaniels Health Laboratory Products P/L11297-10Disección de tejidos
Anticuerpo secundario IgG de cabra anti-rata (H+L), adsorbido por cruzamiento, Alexa Fluor™ 647Thermo FisherA-21247
Software ImarisImarisversión 9.5.0Imagenología
Tijeras de disección MayoProSciTech420SSDisección de tejidos
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148-500GProcesamiento de tejidos
Solución salina tamponada con fosfato, tabletas estériles de PBS (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014Procesamiento de tejidos
Medio de montaje antidesvanecimiento ProLong GlassThermo Fisher ScientificP36980Inmunohistoquímica
Cuchilla de bisturí n.º 23Scalpel Blades Swann MortonCOS240BDisección de tejidos
Manija de bisturí n.º 4ProSciTechT134Disección de tejidos
Azida sódicaSigma-AldrichS2002-25GProcesamiento de tejidos
SacarosaChem-Supply57-50-1Procesamiento de tejidos
Portaobjetos microscópicos adhesivos TOMOProSciTechGEMS63705-09Inmunohistoquímica
Tritón X-100Sigma-AldrichX100-100mLInmunohistoquímica

Referencias

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