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Artículo de método

Apertura de la barrera hematoencefálica (BHE) controlada por ultrasonidos en un chip microfluídico de BHE-glioblastoma para estudios de administración de fármacos

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DOI:

10.3791/72041

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18 de agosto de 2026

 ,  , 
1Ningbo No.2 Hospital, 2Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Neurological Diseases, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 3Lab of Nanopharmacology Research for Neurodegeneration, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences, 4Lab of Dementia and Neurorehabilitation Research, Department of Research and Development of Science and Technology, Ningbo Institute of Life and Health Industry, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la construcción de un modelo de chip microfluídico de barrera hematoencefálica-glioblastoma (BBB-GBM). El modelo se valida para la integridad de la barrera hematoencefálica y permite investigar la apertura transitoria y en gran parte reversible de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonidos de baja intensidad, lo que posibilita la evaluación cuantitativa del transporte de nanomicelas mediado por ultrasonidos a través de la barrera hematoencefálica y la eficiencia de targeting tumoral.

Resumen

La barrera hematoencefálica (BHE) es un obstáculo importante para el tratamiento del glioblastoma (GBM), ya que restringe la entrada de la mayoría de las moléculas terapéuticas al cerebro. Las diferencias interespecíficas en la estructura y función de la BHE complican la traducción clínica de los modelos animales, lo que subraya la necesidad de plataformas in vitro de la BHE relevantes para el ser humano para evaluar la permeabilidad de fármacos en la terapia del GBM. Aquí se describe un protocolo para construir un modelo de chip microfluídico de BHE-GBM. Este modelo establece un sistema de tri-cultivo que comprende células endoteliales microvasculares cerebrales humanas (HCMECs), astrocitos primarios (ACs) y células U87-MG dentro de una plataforma microfluídica con Matrigel. La integridad de la BHE se verifica mediante tinción inmunológica continua de zónula oclusiva-1 (ZO-1) y un ensayo de permeabilidad con dextrano-FITC. Luego, se emplea ultrasonido de baja intensidad (US) (1 MHz, 1 W/cm2, 30 s) para inducir una apertura transitoria y en gran parte reversible de la BHE, permitiendo que nanomicelas dirigidas al tumor (SFN@RB@SPMs) atraviesen eficazmente la barrera y se acumulen en las células de GBM. Una característica clave de este protocolo es la integración de mediciones en tiempo real de la permeabilidad de la BHE y la administración de fármacos en un único chip sensible al ultrasonido, proporcionando una potente plataforma para desentrañar los mecanismos de administración de fármacos potenciada por ultrasonido en el GBM.

Introducción

El tratamiento del glioblastoma (GBM) está fuertemente limitado por la BBB, que restringe severamente la entrada de casi todos los agentes terapéuticos al cerebro1,2. La BBB está formada por células endoteliales no fenestradas unidas por proteínas de uniones estrechas (por ejemplo, ocludina, ZO-1), con apoyo adicional de pericitos y pies astrocíticos3. Aunque los modelos animales han proporcionado información valiosa sobre la función de la BBB, las variaciones específicas de la especie en la fisiología y el metabolismo limitan su capacidad para predecir con precisión las respuestas humanas a los fármacos4,5. Por consiguiente, los modelos humanos de la BBB fisiológicamente relevantes son indispensables para evaluar la permeabilidad de los fármacos en el tratamiento del GBM.

Los modelos tradicionales in vitro de la BHE, como el sistema de cultivo Transwell, no logran reproducir la complejidad de la BHE, incluyendo la interacción entre células, los cambios fluidicos dinámicos y el estrés cortante inducido por el flujo6. En contraste, los modelos microfluídicos de la BHE han surgido como plataformas superiores que imitan de cerca estas características similares a las in vivo7. Dichos sistemas de BHE-en-un-chip se han utilizado ampliamente para estudiar la metástasis de tumores cerebrales8, investigar la disfunción de la BHE en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer9, y evaluar el transporte de fármacos a través de la BHE10,11. Sin embargo, la mayoría de los modelos actuales de BHE-en-un-chip se utilizan principalmente para pruebas de permeabilidad de fármacos y carecen de la capacidad de incorporar estímulos físicos externos que modulen la permeabilidad de la BHE. Actualmente, la ultrasonografía focalizada (FUS) ha surgido como una estrategia prometedora para abrir transitoriamente la BHE con una recuperación considerable, permitiendo una mayor entrega de agentes terapéuticos al cerebro12,13. Estudios mecanicistas previos han demostrado que la estimulación mecánica inducida por ultrasonidos puede modular transitoriamente la función de barrera mediante la remodelación de las uniones entre células y el aumento de la permeabilidad endotelial. Por ejemplo, Silvani et al. mostraron que las fuerzas mecánicas inducidas por ultrasonidos generaron la formación reversible de brechas interendoteliales en un modelo in vitro de vaso-en-un-chip14. En consonancia con estos hallazgos, Beekers et al. demostraron que los bioefectos mecánicos mediados por ultrasonidos indujeron una apertura transitoria de los contactos entre células endoteliales, aumentando así la permeabilidad endotelial15. Más recientemente, Qiao et al. informaron que la permeabilidad de la barrera endotelial está regulada críticamente por los parámetros de exposición al ultrasonido, particularmente la duración del pulso, lo que subraya la importancia de optimizar los parámetros acústicos para lograr una modulación segura y controlable de la BHE16. A pesar de estos avances, las plataformas in vitro que permiten simultáneamente el análisis cuantitativo de la apertura de la BHE mediada por ultrasonidos y su impacto en la entrega de nanomedicamentos siguen siendo limitadas.

Para abordar esta brecha, se presenta un protocolo para construir un chip microfluídico BBB-GBM. El dispositivo microfluídico soporta un cultivo tricelular de HCMEC, AC primarias y células GBM U87-MG embebidas en Matrigel. La BBB reconstruida exhibió características estructurales y funcionales de una barrera intacta, demostrado por la localización continua de ZO-1 a lo largo de las uniones intercelulares y la difusión limitada de dextrano-FITC de 40 kDa a través de la interfaz vascular. Importante, este chip puede acoplarse con estimulación controlada de ultrasonido para inducir la apertura transitoria de la BBB, mejorando así el transporte subsiguiente y la eficiencia de targeting tumoral de nanomicelas. Mediante este sistema, se puede evaluar cuantitativamente el transporte y la eficiencia de targeting tumoral de las nanomicelas SFN@RB@SPM. En general, esta plataforma proporciona una herramienta útil para estudiar la relación entre los parámetros de ultrasonido, la modulación de la BBB con características reversibles y la entrega mejorada de nanomicelas en la terapia del GBM.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales cumplieron con las Directrices (GB/T35892-2018) para la Evaluación Ética del Bienestar de los Animales de Experimentación y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (IACUC) del Instituto de Vida y Salud de Ningbo, UCAS (Número de aprobación: GK-2023-XM-0073). Los reactivos y el equipo utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Fabricación y preparación del dispositivo de órgano sobre un chip BBB-GBM

  1. Diseño del chip y diseño de la máscara fotolitográfica
    1. Diseñe el chip utilizando software de AutoCAD.
      ​NOTA: El chip consta de tres canales microfluídicos paralelos, incluyendo un canal sanguíneo, un canal cerebral y un canal tumoral. Los anchos del canal sanguíneo y del canal tumoral son ambos de 1000 µm, mientras que el ancho del canal cerebral es de 1300 µm. La altura de los tres canales es de 150 µm, y los canales adyacentes están separados por matrices de micropilares trapezoidales con un ancho de 200 µm, que permiten la difusión molecular intercompartimental y la comunicación celular. El diseño detallado del diseño de la máscara fotolitográfica se proporciona en Supplementary Figure 1 y Supplementary Figure 2. El fotoresist SU-8 utilizado en el presente estudio es el 3050.
  2. Fabricación de un molde maestro de silicio mediante fotolitografía estándar con fotoresist SU-8.
    1. Coloque una oblea de silicio virgen sobre el platillo del centrífugo y active el vacío para inmovilizar firmemente la oblea.
    2. Dispense lentamente 10 mL de fotoresist SU-8 en el centro de la oblea.
    3. Realice un proceso de recubrimiento por centrifugado en dos etapas para obtener una capa uniforme de fotoresist: primero a 500 rpm durante 10 s, luego a 2500 rpm durante 90 s.
    4. Transfiera la oblea recubierta a una placa calefactora y realice un prehorneado a 95 °C durante 30 min para evaporar el disolvente.
    5. Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente y mida el espesor de la capa de SU-8 utilizando un medidor de espesores.
      NOTA: Para una formación óptima de la BHE, se recomienda una altura de canal de 110–150 µm. Un solo recubrimiento por centrifugado (paso 1.2.3) generalmente produce un espesor de película de 40–50 µm; por lo tanto, se requieren dos o tres procesos de recubrimiento por centrifugado para alcanzar el espesor total deseado.
  3. Patronado fotolitográfico
    1. Ajuste la intensidad de luz ultravioleta (UV) del alineador de máscaras a 14–15 mW/cm2.
    2. Alinee la máscara fotolitográfica de cromo con la oblea de silicio recubierta con SU-8 y realice la exposición UV durante 10 s.
    3. Transfiera inmediatamente la oblea de silicio a una placa calefactora para realizar un poshorneado después de la exposición bajo las siguientes condiciones: 65 °C durante 10 s, seguido de 95 °C durante 300 s.
    4. Después de que la oblea de silicio se enfríe a temperatura ambiente, sumérjala en solución reveladora (acetato de propilenglicol monometiléter, PGMEA) y permita que se revele durante 4–6 min.
    5. Enjuague la oblea con isopropanol para detener el revelado, seguido de un lavado con agua desionizada.
    6. Seque la oblea con gas nitrógeno e inspeccione las estructuras de microcanales patroneadas bajo un microscopio óptico.
      ​NOTA: Si quedan residuos de fotoresist sin revelar, repita el paso de revelado hasta que las microestructuras estén claramente definidas.
    7. Hornee el molde maestro de silicio terminado en un horno a 200 °C durante 1 h para mejorar la adhesión entre el fotoresist SU-8 y la superficie de la oblea de silicio.
  4. Fabricación del chip de PDMS
    1. Prepare el polidimetilsiloxano (PDMS) mezclando completamente el prepolímero base y el agente de curado en una proporción de 10:1 en peso (p/p) durante 30 min para obtener un prepolímero de PDMS homogéneo.
    2. Viértalo mezcla de PDMS sobre el molde maestro de silicio fabricado, asegurándose de que las microestructuras queden completamente cubiertas.
    3. Coloque el molde maestro en un desecador al vacío para desgasificar y eliminar las burbujas de aire.
    4. Transfiera el molde maestro a un horno y cúrelo a 65 °C durante 1,5–2 h.
    5. Después del curado, corte cuidadosamente la capa de PDMS a lo largo de los bordes del chip utilizando un cúter y despéllela suavemente del molde maestro de silicio.
    6. Sumerja el chip de PDMS en etanol al 70%–75% durante 30 min para una esterilización preliminar, luego enjuáguelo con agua desionizada y déjelo secar al aire.
    7. Perfore puertos de entrada y salida utilizando un punzón de biopsia de 2 mm.
  5. Enlace por plasma y ensamblaje del dispositivo
    1. Coloque el chip de PDMS y una lámina de vidrio limpia en la cámara de un limpiador por plasma, asegurándose de que el lado del PDMS con microcanales quede orientado hacia arriba.
    2. Evacúe la cámara hasta que la presión descienda por debajo de 30 Pa, luego introduzca gas oxígeno.
    3. Mantenga el flujo de oxígeno durante 90 s mientras mantiene la presión de la cámara por debajo de 40 Pa.
    4. Ajuste la potencia de Radiofrecuencia (RF) al 55% y realice el tratamiento por plasma durante 90 s para activar las superficies del PDMS y del vidrio.
    5. Lleve inmediatamente el chip de PDMS activado en contacto con la lámina de vidrio y presione suavemente para lograr un enlace irreversible.
    6. Coloque el dispositivo ensamblado en un horno a 65 °C durante 24 h para estabilizar el enlace y restaurar su hidrofobicidad.
    7. Antes de la siembra celular, esterilice el dispositivo enlazado mediante irradiación ultravioleta durante 30 min.
      NOTA: Mantenga condiciones estériles almacenando los chips esterilizados en placas de Petri selladas dentro de una cabina de seguridad biológica hasta su uso.

2. Siembra celular y establecimiento del modelo BBB-GBM

  1. Preparar los siguientes reactivos:
    1. Medio de cultivo de ACs (para el canal cerebral): medio basal DMEM/F12 que contiene 20 % de suero bovino fetal (FBS) y 1 % de penicilina/estreptomicina (P/S).
    2. Medio de cultivo de HCMECs (para el canal vascular): medio para células endoteliales (ECM) suplementado con 1 % de P/S.
    3. Medio de cultivo de células GBM (para el canal de glioma): medio basal MEM que contiene 10 % de FBS y 1 % de P/S.
    4. Reactivo de disociación celular: utilizar solución de tripsina-EDTA al 0,25 % para desprender las células adherentes.
      NOTA: La exposición prolongada a la tripsina puede reducir la viabilidad celular. Monitorear el desprendimiento celular bajo un microscopio y neutralizar rápidamente la tripsina con medio completo.
    5. Mantener todas las células (ACs, HCMECs y U87-MG) en placas de cultivo de 100 mm antes de sembrarlas en el dispositivo microfluídico.
  2. Aislamiento de ACs primarias
    1. Aislar ACs primarias de las cortezas cerebrales de ratas neonatales (día posnatal 1–3). Después de eliminar cuidadosamente las meninges y los vasos sanguíneos sobre hielo, picar el tejido cortical con tijeras quirúrgicas estériles y someterlo a digestión enzimática.
    2. Lavar la suspensión celular disociada con PBS frío, tratar con tripsina para lograr la disociación individual de las células y recoger los pellets mediante centrifugación (400 x g, 5 min, temperatura ambiente).
    3. Resuspender las células y sembrarlas en frascos de cultivo T25 que contengan medio de cultivo de ACs.
    4. Identificar las ACs mediante tinción de inmunofluorescencia para GFAP. La imagen se proporciona en la Figura Suplementaria 3.
  3. Siembra celular
    ​NOTA: Día 1 - Siembra de ACs en el canal cerebral.
    1. Introducir 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25 % en la placa de cultivo que contiene las ACs. Agitar suavemente para asegurar una cobertura uniforme.
    2. Incubar a 37 °C durante 1–2 min hasta que las células se desprendan de la placa de cultivo.
    3. Añadir 3 mL de medio de cultivo de ACs (del paso 2.1.1) para neutralizar la tripsina. Pipetear suavemente para obtener una suspensión de células individuales.
    4. Recoger la suspensión celular en un tubo cónico y centrifugar a 300 × g durante 3 min a 4 °C.
    5. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 200 µL de medio para ACs.
    6. Determinar la concentración celular mediante un contador automático de células y ajustar la densidad a 2,5 × 106 células/mL.
    7. Mezclar la suspensión de células ACs con Matrigel en una proporción 3:5 (v/v) (células ACs: Matrigel).
    8. Mediante una micropipeta, dispensar 10 µL de la mezcla de Matrigel-ACs en el canal cerebral.
      NOTA: Realizar el procedimiento de carga manteniendo el chip sobre hielo para evitar la polimerización prematura del Matrigel.
    9. Incubar el chip a 37 °C en una incubadora con 5 % de CO2 durante 30 min para permitir la polimerización del Matrigel y la estabilización celular.
      NOTA: Día 1 - Siembra de HCMECs en el canal vascular.
    10. Aplicar 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25 % e incubar a 37 °C durante aproximadamente 30 s hasta que las células se desprendan.
    11. Añadir 3 mL de medio para HCMECs (paso 2.1.2) para detener la digestión enzimática.
    12. Pipetear suavemente para generar una suspensión uniforme de células individuales.
    13. Recoger la suspensión y centrifugar a 300 × g durante 3 min a 4 °C.
    14. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 200 µL de medio para HCMECs.
    15. Contar las células y ajustar la concentración a 2 × 106 células/mL.
    16. Introducir cuidadosamente 10 µL de la suspensión de HCMECs en el canal vascular del chip.
    17. Colocar el chip de lado durante 30 min en la incubadora para favorecer la adhesión de las células endoteliales a lo largo de la pared del canal.
    18. Sembrar otros 10 µL adicionales de suspensión de HCMECs en el canal vascular para aumentar la densidad endotelial en dicho canal.
    19. Incubar el chip durante 30–60 min adicionales para permitir la adhesión de las HCMECs.
    20. Añadir 100 µL de medio de cultivo mixto a la entrada del chip.
      NOTA: El medio mixto consiste en medio para ACs y medio para HCMECs en una proporción 1:1 (v/v).
      Día 3 - Siembra de células U87-MG en el canal de glioma.
    21. Añadir 1 mL de tripsina-EDTA al 0,25 % a la placa de cultivo e incubar a 37 °C durante 1–2 min.
    22. Añadir 3 mL de medio para U87-MG (del paso 2.1.3) para finalizar la digestión.
    23. Pipetear suavemente para obtener una suspensión homogénea de células individuales.
    24. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico y centrifugar a 300 × g durante 3 min.
    25. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 200 µL de medio para U87-MG.
    26. Contar la concentración celular y ajustar la densidad a 2 × 106 células/mL.
    27. Introducir 10 µL de la suspensión de células U87-MG en el canal de glioma del chip.
    28. Incubar el chip a 37 °C con 5 % de CO2 durante 30–60 min para permitir la adhesión celular.
    29. Añadir 100 µL de medio de cultivo para U87-MG a la entrada del chip.
    30. Mantener el dispositivo microfluídico en un entorno a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 h adicionales para permitir la formación de uniones estrechas endoteliales.

3. Evaluación de la integridad de la BHE

  1. Ensayo de permeabilidad
    1. Preparar dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) con pesos moleculares de 40 kDa en medio de cultivo mixto (medio ACs: medio HCMEC = 1:1, v/v) a una concentración final de 10 µg/mL.
    2. Introducir 10 µL de la solución de FITC-dextrano en el canal vascular.
    3. Colocar el chip microfluídico sobre la platina de un microscopio de fluorescencia invertido para adquirir imágenes de fluorescencia tanto del canal vascular como del canal cerebral adyacente a intervalos de 20 min, con el fin de monitorear la difusión del dextrano a través de la barrera endotelial.
    4. Cuantificar el coeficiente de permeabilidad (Papp, cm/s) utilizando la siguiente fórmula:
      Papp (cm/s)= Ecuación para la eficiencia del proceso, que incluye Fs, Fc, Δt; fórmula matemática para investigación científica.
      Donde Papp es el coeficiente de permeabilidad aparente (cm/s), FS es la intensidad de fluorescencia en el tiempo inicial en el canal sanguíneo, FC es la intensidad de fluorescencia en el canal cerebral al final del intervalo de difusión, Δt es el tiempo de difusión (s), VT es el volumen de difusión del FITC-dextrano en el canal cerebral (cm3), y A es el área de superficie endotelial (cm2).
      NOTA: Un coeficiente de permeabilidad más bajo indica una mayor integridad de la BHE y una formación más estrecha de la barrera endotelial.
    5. Realizar el análisis de datos y las definiciones de parámetros.
      NOTA: Los valores de intensidad de fluorescencia de ambos canales, sanguíneo y cerebral, se corrigieron restando el fondo, utilizando mediciones obtenidas de regiones del chip sin células. Las ROI se definieron a ambos lados de la interfaz entre sangre y cerebro basándose en la longitud de difusión de la fluorescencia. El área de superficie endotelial (A) se calculó a partir del área de interfaz entre los canales vascular y cerebral (utilizando la separación entre dos micropilares como referencia): 200 µm × 150 µm = 30,000 µm2 = 3 × 10-6 cm2. El volumen de difusión del FITC-dextrano (VT) se derivó multiplicando la distancia de penetración de la difusión en el canal cerebral por A. Las imágenes de fluorescencia se adquirieron cada 20 min (1200 s) durante un período de 60 min; el coeficiente de permeabilidad se calculó utilizando los datos del intervalo de 20 min. Los valores de permeabilidad se calcularon a partir de tres chips independientes para cada grupo experimental. Todas las conversiones de unidades se realizaron antes de expresar la permeabilidad en cm/s.
  2. Análisis de inmunofluorescencia de ZO-1
    1. Lavar los canales microfluídicos tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar el medio de cultivo residual.
    2. Fijar las células introduciendo paraformaldehído al 4% (PFA) en los canales e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    3. Permeabilizar las células con Triton X-100 al 0,1% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente.
    4. Bloquear la unión inespecífica de anticuerpos incubando los canales con albúmina sérica bovina (BSA) al 2% en PBS durante 45 min a temperatura ambiente.
    5. Introducir el anticuerpo primario anti-ZO-1 (dilución 1:200) en los canales e incubar a 4 °C durante la noche.
    6. Lavar cuidadosamente el canal con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido.
    7. Incubar los chips con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 555 anti-conejo (dilución 1:1000) durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
    8. Contrastar los núcleos con 1 µg/mL de 4’6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 1 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
      NOTA: El DAPI es sensible a la luz y debe protegerse de la misma durante la tinción.
    9. Lavar los canales tres veces con PBS.
    10. Observar el dispositivo microfluídico utilizando un microscopio de fluorescencia invertido y un microscopio confocal de barrido láser para visualizar la localización de ZO-1 a lo largo de la unión entre células endoteliales.

4. Entrega de nanomicelas potenciada por ultrasonido a través de la BHE hacia células de GBM

  1. Estimulación con ultrasonido
    1. Retire cuidadosamente el chip de la placa de cultivo y colóquelo dentro de una cabina de seguridad biológica.
    2. Aplicar estimulación por ultrasonido utilizando un sistema terapéutico de ultrasonido equipado con un transductor de 1 MHz (área radiante efectiva: 5 cm²)2).
    3. Aplique una almohadilla acústica de grado médico de 3 mm de espesor entre la sonda de ultrasonido y la superficie del chip microfluídico para garantizar una transmisión acústica eficiente.
    4. Coloque la sonda de ultrasonido directamente encima de la región del canal vascular del dispositivo microfluídico.
      NOTA: Las burbujas de aire entre el transductor y el chip reducen significativamente la transmisión de energía acústica y deben evitarse.
    5. Establezca los parámetros de ultrasonido como sigue: ciclo de trabajo: 60 %; frecuencia: 1 MHz; intensidad: 1 W/cm2; duración de la exposición: 30 s; frecuencia de repetición de pulsos (PRF): 100 Hz. Los parámetros detallados de ultrasonido se proporcionan en Tabla suplementaria 1.
    6. Para el grupo control no tratado, coloque el transductor de ultrasonido en la misma posición, pero asegúrese de mantenerlo inactivo para servir como control simulado, garantizando procedimientos de manejo idénticos sin exposición acústica.
    7. Tras la exposición al ultrasonido, retire el acoplador y devuelva inmediatamente el chip a una placa de cultivo estéril.
    8. Añada medio de cultivo fresco a los puertos de entrada del chip.
    9. Incubar el dispositivo a 37 °C con 5% de CO2 hasta su posterior análisis.
  2. Evaluación de la modulación del BBB inducida por ultrasonido
    1. Realice la tinción de inmunofluorescencia para ZO-1 inmediatamente después del tratamiento con ultrasonido (0 h) y a las 24 h posteriores al tratamiento para evaluar los cambios en la integridad de las uniones estrechas.
    2. Siga el procedimiento de tinción por inmunofluorescencia descrito en el paso 3.2.
    3. Compare la distribución de la tinción de ZO-1 a lo largo del eje z para evaluar el efecto de la estimulación con ultrasonido en la integridad de las uniones estrechas de la BHE.
  3. Preparación y caracterización de nanomicelas SFN@RB@SPM
    1. Preparar las nanomicelas SFN@RB@SPM según el protocolo previamente establecido17. Breve descripción: se mezclaron soluciones stock del péptido anfifílico (denominado SPM, 6 mg/mL), RB (0,6 mg/mL) y SFN (6 mM) en una proporción volumétrica de 1:1:1.
    2. Coloque la mezcla en un sonicador y sométala a sonicación a 28 kHz, 25 °C durante 30 min.
    3. Dialice la mezcla (límite de peso molecular: 1000 Da) durante 48 h para eliminar RB y SFN libres.
    4. Mida el tamaño y el potencial zeta de las nanomicelas mediante dispersión dinámica de la luz (DLS). Los datos de caracterización se proporcionan en Figura suplementaria 4.
  4. Evaluación de la administración de nanomicelas estimuladas por ultrasonido y la acumulación en células de glioma
    1. Inmediatamente después de la exposición al ultrasonido, introduzca el medio de cultivo que contiene nanomicelas en el canal vascular del dispositivo microfluídico.
    2. Para evaluar el transporte de nanomicelas a través de la BHE, coloque el chip microfluídico sobre la platina de un microscopio de fluorescencia invertido y adquiera imágenes de fluorescencia del canal vascular y del canal cerebral adyacente a intervalos de 20 minutos durante un periodo de 60 minutos.
    3. Cuantifique las imágenes de fluorescencia en el canal cerebral para evaluar la permeabilidad de nanomicelas mejorada por ultrasonido.
    4. Para evaluar la acumulación de nanomicelas en células de glioma, incubar el dispositivo en condiciones estándar de cultivo (37 °C, 5% CO₂2) durante 3 h tras la exposición al ultrasonido, luego image el canal del glioma mediante un microscopio de fluorescencia para evaluar la absorción intracelular de nanomicelas.
  5. Análisis estadístico
    1. Expresar todos los datos cuantitativos como media ± error estándar de la media (SEM).
    2. Realice cada experimento con tres réplicas biológicas independientes (n = 3 chips por condición experimental). Para cada réplica biológica, se midieron al menos tres réplicas técnicas (áreas de interés por canal) para garantizar la fiabilidad de los datos.
    3. Calcule el coeficiente de permeabilidad (Paplicación, cm/s) de cada chip independiente sirvió como la unidad principal de análisis para todas las comparaciones estadísticas.
      NOTA: Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando una prueba t de Student no apareada de dos colas prueba t. Las comparaciones entre tres o más grupos se analizaron mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples. Para experimentos que involucraban dos variables independientes, se realizó un ANOVA bidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando software estadístico y de graficación. A p-valor de

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Resultados

Para recapitular el in vivo estructura de la BBB, se desarrolló un chip microfluídico de tricultivo incorporando células endoteliales microvasculares del cerebro humano (HCMECs), astrocitos primarios (ACs) y células U87-MG (denominado el "modelo de chip"). Como se muestra en Figura 1A,B, tres canales paralelos están dispuestos dentro del dispositivo: el canal vascular (izquierdo, azul), el canal cerebral relleno de Matrigel (central, rosa) y el canal tumoral (derech...

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Discusión

Este protocolo describe el establecimiento de un chip microfluídico BBB-GBM para evaluar la modulación del BBB mediada por ultrasonido y la administración de nanomicelas. En comparación con los modelos convencionales in vitro del BBB (por ejemplo, Transwell), esta plataforma microfluídica permite un cultivo conjunto espacialmente definido de células endoteliales, AC y células de glioma, lo que permite investigar el transporte de fármacos a través de una barrera hematoencefálica fisiológicamente relevante. Varios...

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Divulgaciones

Durante la preparación de este manuscrito, los autores utilizaron ChatGPT (OpenAI) únicamente para la edición y mejora del lenguaje. Los autores han revisado y editado todo el contenido asistido por inteligencia artificial y asumen toda la responsabilidad sobre la exactitud e integridad del manuscrito. No se utilizaron herramientas de inteligencia artificial para la generación de datos, el análisis ni la preparación de figuras.

Agradecimientos

Agradecemos sinceramente el financiamiento recibido de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Zhejiang (LQ24H160003), la Fundación de Investigación Científica Médica de la Provincia de Zhejiang (2024KY351), la Fundación de Ciencias Naturales de Ningbo (2023J365), el Programa de Introducción de Talentos Yongjiang (Proyecto de Talento Innovador Joven, 2021A-012-G) y el Programa de Talento Bei’An del Distrito Jiangbei, Ningbo (2023RC004).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa Fluor 555Cell Signaling Technology, Inc.4413
Anticuerpo anti-ZO-1Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.40-2200
Punzón de biopsiaZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10305130004
Albúmina sérica bovinaAbsin Bioscience Inc.9048-46-8
Contador de célulasThermo Fisher Scientific Co., Ltd.Countess TM3
Placa de cultivo celular (100 mm)Corning Inc.430167
CentrífugaBeckman Coulter, Inc.Avanti J-15R
Máscara de cromoSuzhou Chip Scientific Instrument Co.,Ltd.ZX-GBYM
Microscopio confocal de barrido láserCarl Zeiss AGZeiss LSM900
DAPIBeyotime Biotech Inc.C1002
ReveladorSuzhou Chip Scientific Instrument Co., Ltd.RCD-400
DMEM/F12ScienCell Research LaboratoriesC3130-0500
ECMScienCell Research Laboratories1001
EtilenoNingbo Zhenhai Yongfeng Chemical Plant6923193900015
Suero bovino fetalScienCell Research LaboratoriesC04001-500
Fiji (Fiji Is Just ImageJ)Proyecto de código abiertoN/A
Dextrano-FITC (40 kDa)Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.GC19938
Portaobjetos de vidrioCitotest Scientific Co., Ltd.188105W
GraphPad Prism 9.5GraphPad Software, Inc.N/A
Células endoteliales microvasculares cerebrales humanas (HCMECs)BeNa Culture CollectionBNCC337717
IncubadoraEsco Lifesciences Co., LtdCLM-170B-8-CN
Microscopio invertido de fluorescenciaNikon Instruments Inc.TS2-FL
IsopropanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80109218
MatrigelCorning Inc.354234
MEMPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PM150410
NitrógenoNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
OxígenoNingbo Baifang Gas CO., Ltd.N/A
Paraformaldehído (PFA, 4 %)Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1101-500mL
PBSScienCell Research LaboratoriesC3580-0500
PDMSCorning Inc.220777
Penicilina/estreptomicinaPricella Life Science & Technology Co., Ltd.PB180120
FotolitografíaInstitute of Optics and Electronics, Chinese Academy of SciencesURE-2000\AL
Placa calefactora para fotolitografíaSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-HP-02
Ashado por plasmaTIANKECHUANGDA Co., Ltd.PT-05-LF
Astroglia primariosN/AN/AAislados del cerebro de rata neonatal (día 1-3)
Oblea de silicioZhejiang YoungChip Technology Co., Ltd.10204040001
Centrífuga para recubrimientoSuzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.WH-SC-01
SU-8Kayaku Advanced Materials Inc.1030403002
Tritón X-100Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.9002-93-1
TripsinaScienCell Research LaboratoriesC3530-0100
Células U87-MGPricella Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0238
Dispositivo de ultrasonido Shenzhen Dongdixin Technology Co., Ltd.Sonic-Stimu Pro UT1041
Zen 3.4 (edición azul)Carl Zeiss AGN/A

Referencias

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